Memulihkan microRNA-499-5p Melindungi Tikus Cedera Paru Akibat Sepsis Melalui Targeting Sox6

Bahan dan Metode

Kepatuhan dengan Standar Etika

Semua percobaan hewan sejalan dengan Panduan Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium dari National Institutes of Health. Protokol tersebut diizinkan oleh Komite Etika Eksperimen Hewan dari Rumah Sakit Kota Weihai, Fakultas Kedokteran Cheeloo, Universitas Shandong.

Hewan Eksperimen

Tikus BABL/c bebas patogen spesifik jantan sehat (berusia 6-8 minggu, beratnya 18-22 g) dibeli dari pusat hewan percobaan Universitas Shandong (Shandong, Cina). Lingkungan diatur pada 24 ± 2 °C dengan 12 siklus terang-gelap secara bergantian. Tikus diperlakukan dengan akses gratis ke makanan aseptik dan air steril. Eksperimen dimulai setelah pemberian pakan adaptif selama 7 hari.

Pembuatan Model Cedera Paru Akibat Sepsis oleh Cecal Ligation and Puncture (CLP) pada Mencit

Tikus secara acak dibagi menjadi 2 kelompok:kelompok palsu (n = 8) dan kelompok model. Tikus dipuasakan selama 12 jam sebelum operasi dan kemudian dibius dengan 1% natrium pentobarbital (70 mg/kg) dengan injeksi intraperitoneal. Efek anestesi diamati; pernapasan dan detak jantung tikus diperhatikan. Kepala dan tungkai mencit difiksasi dalam posisi terlentang, dan kulit perut disiapkan dan didesinfeksi dengan bola kapas iodophor. Tikus pada kelompok model diperlakukan dengan sayatan memanjang (1,0 cm) di segmen tengah garis median perut, rongga perut dibuka, dan sekum ditarik keluar dari rongga perut menghindari melukai pembuluh mesenterika. Itu diikat dengan benang sutra 1-0 di 1/2 ujung sekum, dan sekum ditusuk di margin kontralateral mesenterium dengan jarum tusukan No. 16. Sejumlah isi usus yang tepat diekstrusi, sekum dimasukkan kembali, dan sayatan dijahit. Setelah rongga perut dibuka, mencit dalam kelompok sham dikeluarkan sekum saja, kemudian sekum dimasukkan kembali. Tikus disuntik secara subkutan dengan 1 mL larutan natrium klorida 0,9% pasca operasi, dipisahkan dalam kandang dan diberi makan secara rutin.

In Vivo Transfection

Sebelum pemodelan, tikus dikelompokkan menjadi 7 kelompok (n = 8):grup model, grup agomir miR-499-5p, grup kontrol negatif agomir (NC), grup RNA (si)-Sox6 kecil yang mengganggu, grup si-NC, agomir miR-499-5p + overekspresi (oe)-Grup Sox6 dan miR-499-5p agomir + oe-NC grup. Satu jam sebelum pemodelan, mencit diberi perlakuan sesuai dengan pengelompokannya. Mencit dibius dengan natrium pentobarbital 1% secara injeksi intraperitoneal, kemudian difiksasi dengan posisi terlentang dengan kemiringan 45°, dan lidah mencit dipindahkan ke sisi mulut yang lain untuk memastikan patensi saluran pernapasannya. Kulit anterior leher mencit didesinfeksi dan dipotong untuk memperlihatkan trakea. Kompleks transfeksi (50 L) diserap oleh microsampler (diteteskan sesuai dengan kelompoknya, jumlah yang sama dari phosphate-buffered saline (PBS) diteteskan ke dalam kelompok model) dan kemudian secara perlahan diteteskan ke dalam trakea. Setelah transfeksi, mencit diputar secara vertikal dan kompleks transfeksi terdistribusi penuh ke dalam paru-paru [15]. Selama proses transfeksi, diamati pernapasan dan detak jantung tikus. Jika terjadi henti napas dan henti jantung, transfeksi segera dihentikan, dan saluran pernapasan tidak terhalang. Transfeksi dilanjutkan ketika napas dan detak jantung tikus stabil. MiR-499-5p agomir dan NC-nya serta plasmid Sox6 yang sesuai dibeli dari Shanghai GenePharma Co., Ltd. (Shanghai, Cina). Setelah transfeksi, mencit dipisahkan dalam kandang dan diberi makan selama 1 hari, kemudian di-eutanasia. Mencit dibius dengan natrium pentobarbital 1% secara injeksi intraperitoneal, difiksasi dalam posisi terlentang dan kemudian di-eutanasia dengan venaseksi aorta abdominalis. Kulit mencit didesinfeksi secara lokal, rongga dada dibuka, trakea dan bronkus utama kanan diligasi, bronkus utama kanan dicabut, dan paru-paru kanan diangkat. Lobus bawah paru kanan ditempatkan dalam formalin netral 10% untuk pemeriksaan patologis, lobus tengah dengan cepat ditimbang untuk menghitung berat basah (W) dan dipanggang pada suhu 56℃, dan berat kering (D) dihitung setelah 72 jam, sehingga rasio W/D dihitung. Lobus kanan atas disimpan dalam nitrogen cair untuk deteksi mRNA dan protein. Paru-paru kiri dicuci tiga kali dengan 0,4 mL normal saline, dan sekitar 1 mL cairan lavage bronchoalveolar (BALF) dikumpulkan, dipindahkan ke tabung Eppendorf (EP) 1,5 mL dan ditempatkan di atas es. BALF disentrifugasi pada 1500 rpm selama 5 menit dan dipindahkan ke tabung EP baru, kemudian disimpan pada -80℃ untuk mendeteksi faktor inflamasi.

Selain itu, tikus dibagi menjadi 3 kelompok (n = 10/grup):grup palsu, grup model dan grup agomir miR-499-5p (50 L miR-499-5p agomir ditanamkan ke dalam trakea 1 jam sebelum operasi). Tingkat kelangsungan hidup dipantau setiap 12 jam, secara total selama 7 hari. Status kelangsungan hidup tikus dalam 7 hari diamati, dan toksisitas miR-499-5p ditentukan [16].

Skor Pewarnaan Hematoxylin–Eosin (H&E) dan Cedera

Jaringan paru-paru disiapkan menjadi bagian parafin, diwarnai dengan H&E dan diamati di bawah mikroskop optik. Cedera paru dinilai (kongesti alveolar, perdarahan, infiltrasi atau agregasi neutrofil di rongga alveolar atau dinding pembuluh darah, penebalan dinding alveolar dan/atau pembentukan membran hialin) oleh sistem penilaian patologis untuk cedera paru yang dikeluarkan oleh American Thoracic Society. 0 poin menunjukkan tidak ada atau lesi yang sangat ringan; 1 poin menunjukkan lesi ringan; 2 poin menunjukkan lesi sedang; 3 poin menunjukkan lesi parah; 4 poin menunjukkan lesi yang sangat parah. Skor total dari empat item mewakili skor total cedera paru [17].

Pewarnaan dan Skor Masson

Jaringan paru-paru dibuat menjadi bagian parafin (4 m) dan diperlakukan dengan pewarnaan Masson [18]. Serat kolagen, mukus, dan tulang rawan berwarna biru, sitoplasma, otot, selulosa dan glial berwarna merah, dan inti sel berwarna biru kehitaman. Dalam sistem penilaian Ashcroft semikuantitatif [19], 0 poin menunjukkan paru-paru normal; 1 poin menunjukkan penebalan fibrosa ringan pada dinding alveolus atau bronkus; 3 poin menunjukkan penebalan moderat dinding alveolar atau bronkiolus tanpa kerusakan pada struktur paru-paru; 5 poin menunjukkan fibrosis yang memburuk disertai dengan kerusakan struktur paru-paru, membentuk pita atau massa serat; 7 poin menunjukkan kerusakan struktur paru yang parah dan area fibrosis yang luas, membentuk pita serat atau gumpalan; 8 poin menunjukkan semua kemasan fibrosa regional.

Terminal Deoxynucleotidyl Transerase-Mediated Deoxyuridine Triphosphate-Biotin Nick End-Labeling (TUNEL) Pewarnaan

Apoptosis jaringan paru diuji dengan kit TUNEL (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Jerman) dan diamati dengan mikroskop optik. Sel-sel apoptosis diwarnai coklat di nukleus. Indeks apoptosis menunjukkan persentase sel TUNEL-positif [20].

Imunohistokimia

Bagian jaringan paru-paru dideparafinisasi dengan xilena, diinkubasi dengan hidrogen peroksida 3% dan diblokir dengan serum kambing. Kemudian, Caspase-3 (ab13847, 1:500), Caspase-9 (ab32539, 1:250) dan SOX6 (ab30455, 1:500, semuanya dari Abcam, MA, USA) digunakan sebagai antibodi untuk bagian imunostain. Mikroskop optik (Leica Microsystems, IL, USA) digunakan untuk menangkap gambar yang kemudian dianalisis dengan perangkat lunak Image Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Rockville, MA, USA) [21].

Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR)

Kit OMEGA (Solarbio science &technology Co., Ltd., Beijing, China) diadopsi untuk ekstraksi RNA total dalam jaringan paru-paru dan penentuan konsentrasi RNA. DNA komplementer (cDNA) disusun oleh transkripsi balik sejalan dengan Kit Sintesis cDNA RevertAid First Strand (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA). Primer dirancang oleh Invitrogen (Carlsbad, CA, USA), seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1. Reaksi PCR dilakukan sesuai dengan kit FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) (Roche). Eksperimen dianalisis secara kuantitatif dengan 2 ^−△△Ct metode. U6 adalah kontrol pemuatan miR-499-5p, dan GAPDH adalah parameter internal gen lain [22].

Analisis Western Blot

Protein total dikumpulkan menggunakan buffer lisis uji radio-imunopresipitasi untuk merawat jaringan paru-paru. Konsentrasi protein total diukur dengan metode asam bicinchoninic. Sampel protein (30 g) diproses dengan elektroforesis gel natrium dodesil sulfat poliakrilamida 10%, dipindahkan ke membran polivinilidena fluorida, diblokir dengan susu bubuk skim 5% dan direaksikan dengan antibodi primer Sox6 (ab30455, 1:1000, Abcam), Caspase -3 (9661, 1:1000, Teknologi Pensinyalan Sel, MA, AS), Caspase-9 (9502, 1:1000, Teknologi Pensinyalan Sel), faktor nekrosis tumor-α (TNF-α, ab6671, 1:1000, Abcam ), interleukin-1β (IL-1β, 16806-1-AP, 1:500, Proteintech, USA), IL-6 (ab6672, 1:1000, Abcam) dan GAPDH (sc-32233, 1:1000, Santa Cruz Bioteknologi, Inc., CA, AS). Kemudian, membran diinkubasi dengan antibodi sekunder (1:2000) dan dikembangkan dengan peningkatan chemiluminescence [23].

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Tingkat IL-1β, IL-6 dan TNF-α di BALF ditentukan oleh ELISA kit (Boster, Hubei, China). Penentuan kolorimetri dilakukan pada 450 nm.

Deteksi Indeks Stres Oksidatif

Jaringan paru-paru dalam nitrogen cair ditimbang dan diencerkan dalam proporsi tertentu garam di bawah kondisi suhu rendah, kemudian dihomogenkan dan disentrifugasi pada 4℃, 3000 r/min selama 20 menit pada suhu rendah, dan supernatan diambil untuk penentuan. Aktivitas myeloperoxidase (MPO) diuji dengan kit deteksi MPO (NanJing JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, China), dan malondialdehid (MDA), superoksida dismutase (SOD), glutathione peroksidase (GSH-Px) dan katalase (CAT) diuji oleh kit yang disediakan oleh JianCheng Bioengineering Institute.

Pengujian Gen Pelapor Luciferase Ganda

Sox6 mungkin merupakan gen target miR-499-5p yang diprediksi oleh situs web biologis (http://www.targetscan.org/vert_72/). Ada empat situs pengikatan antara miR-499-5p dan Sox6 mRNA 3′untranslated region (UTR). Vektor pmiR-RB-REPORT-Sox6 wild type (WT) dan pmiR-RB-REPORT-Sox6 mutant type (MUT) dibuat oleh Guangzhou RiboBio Co., Ltd. (Guangdong, China), dan plasmid reporter luciferase yang sesuai adalah dihasilkan. Sel TC-1 (sel epitel paru tikus, 1 × 10 ⁵ sel/sumur, Shanghai Yiyan biologis technology Co., Ltd., Shanghai, China) diunggulkan dalam pelat 24-sumur, dan ditransfeksi dengan miR-499-5p agomir atau agomir-NC, pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT atau pmiR-RB-LAPORAN-Sox6 MUT melalui Lipofectamine2000. Sistem uji gen reporter luciferase ganda (Promega, WI, USA) diterapkan untuk mengukur aktivitas luciferase.

Analisis Statistik

Semua data dianalisis dengan perangkat lunak SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA). Data pengukuran disampaikan dengan mean ± standar deviasi. Perbandingan antara dua kelompok dilakukan oleh t uji, perbandingan antara beberapa kelompok dinilai dengan analisis varians satu arah (ANOVA), dan uji post hoc Tukey digunakan untuk perbandingan berpasangan setelah analisis ANOVA. Kurva kelangsungan hidup dibuat dengan metode Kaplan-Meier. P nilai < 0,05 menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik.

Hasil

Rasio W/D dan Sox6 Meningkat Sementara miR-499-5p Menurun pada Jaringan Paru Tikus Cedera Paru Akibat Sepsis

Toksisitas miR-499-5p diuji pada tikus untuk mendeteksi waktu kelangsungan hidup tikus septik. Hasil menunjukkan (Gbr. 1a) tingkat kelangsungan hidup dalam 7 hari tikus dalam kelompok palsu adalah 100%, dan tikus septik berkurang. Tingkat kelangsungan hidup tikus septik setelah pengobatan miR-499-5p ditingkatkan. Hasil rasio W/D jaringan paru-paru menunjukkan bahwa (Gbr. 1b):versus kelompok palsu, rasio W/D meningkat pada kelompok model (P < 0,05). Dibandingkan dengan kelompok agomir NC dan kelompok si-NC, rasio W/D berkurang pada kelompok agomir miR-499-5p dan kelompok si-Sox6 (keduanya P < 0,05). Rasio W/D secara nyata meningkat pada kelompok miR-499-5p agomir + oe-Sox6 relatif terhadap kelompok miR-499-5p agomir + oe-NC (P < 0.05).

Rasio W / D dan Sox6 meningkat sementara miR-499-5p menurun pada jaringan paru-paru tikus cedera paru yang diinduksi sepsis. a Kurva kelangsungan hidup tikus yang dibuat oleh Kaplan-Meier. b Rasio W/D jaringan paru pada masing-masing kelompok. c Ekspresi miR-499-5p dalam jaringan paru-paru tikus. d Ekspresi mRNA Sox6 dalam jaringan paru-paru tikus. e Pita protein Sox6 dengan analisis western blot. f Ekspresi protein Sox6 dalam jaringan paru-paru tikus. g Sox6 imunohistokimia jaringan paru-paru tikus. (a) P < 0,05 versus kelompok palsu. (b) P < 0,05 versus kelompok agomir NC. (c) P < 0,05 versus kelompok si-NC. (d) P < 0,05 versus grup agomir + oe-NC miR-499-5p agomir + oe-NC. Data pengukuran digambarkan sebagai mean ± standar deviasi, dan data dinilai dengan ANOVA satu arah diikuti dengan uji post hoc Tukey

Ekspresi MiR-499-5p dan Sox6 terdeteksi dan kami menemukan bahwa (Gbr. 1c–f):berbeda dengan grup palsu, miR-499-5p berkurang dan Sox6 meningkat pada grup model (keduanya P < 0,05). Sehubungan dengan kelompok agomir NC, miR-499-5p meningkat dan Sox6 menurun pada kelompok agomir miR-499-5p (keduanya P < 0,05). Dibandingkan dengan kelompok si-NC, Sox6 tertekan pada kelompok si-Sox6 (P < 0,05). Dibandingkan dengan kelompok miR-499-5p agomir + oe-NC, Sox6 meningkat secara dramatis pada kelompok miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (P < 0.05).

Kandungan protein Sox6 dalam jaringan paru-paru tikus septik ditentukan oleh imunohistokimia (Gbr. 1g). Diamati bahwa dibandingkan kelompok palsu, ekspresi protein Sox6 meningkat pada kelompok Model (P < 0,05); dibandingkan dengan kelompok agomir NC dan kelompok si-NC, ekspresi protein Sox6 yang lebih rendah diperiksa pada kelompok agomir miR-499-5p dan kelompok si-Sox6 (keduanya P < 0,05); relatif terhadap kelompok miR-499-5p agomir + oe-NC, ekspresi protein Sox6 ditingkatkan pada kelompok miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (P < 0.05).

MiR-499-5p yang Dipulihkan atau Depleted Sox6 Mengurangi Patologi Jaringan Paru, Mengurangi Skor Cedera Paru, Serat Kolagen dan Derajat Fibrosis Paru pada Cedera Paru Akibat Sepsis Tikus

Hasil pewarnaan HE menunjukkan bahwa (Gbr. 2a):pada kelompok palsu, struktur jaringan paru-paru utuh, septum alveolar pada dasarnya bermanifestasi tanpa edema atau peradangan, dan rongga alveolar bersih. Dalam model, kelompok agomir NC, si-NC dan miR-499-5p agomir + oe-Sox6, eksudasi, edema dan perdarahan dapat dilihat di sebagian besar rongga alveolar jaringan paru-paru, dan infiltrasi masif sel inflamasi terlihat di interstisial paru. Dalam kelompok miR-499-5p agomir, si-Sox6 dan miR-499-5p agomir + oe-NC, lesi jaringan paru berkurang dibandingkan dengan kelompok model.

MiR-499-5p yang dipulihkan atau Sox6 yang terkuras meredakan patologi jaringan paru-paru, mengurangi skor cedera paru-paru, serat kolagen, dan tingkat fibrosis paru pada tikus cedera paru yang diinduksi sepsis. a Hasil pewarnaan HE pada jaringan paru mencit. b Skor cedera jaringan paru mencit pada masing-masing kelompok. c Pewarnaan Mason jaringan paru-paru pada tikus. d Skor fibrosis paru tikus di setiap kelompok. (a) P < 0,05 versus kelompok palsu. (b) P < 0,05 versus kelompok agomir NC. (c) P < 0,05 versus kelompok si-NC. (d) P < 0,05 versus grup agomir + oe-NC miR-499-5p agomir + oe-NC. Data pengukuran digambarkan sebagai mean ± standar deviasi, dan data dinilai dengan ANOVA satu arah diikuti dengan uji post hoc Tukey

Skor cedera paru-paru tikus dan hasil skor Ashcroft semikuantitatif menunjukkan bahwa (Gbr. 2b,d):dalam kaitannya dengan kelompok palsu, skor cedera paru-paru dan tingkat fibrosis paru jelas meningkat pada kelompok model (P < 0,05). Dibandingkan kelompok agomir NC dan kelompok si-NC, skor cedera paru dan derajat fibrosis paru berkurang pada kelompok miR-499-5p agomir dan si-Sox6 (keduanya P < 0,05). Berbeda dengan kelompok miR-499-5p agomir + oe-NC, skor cedera paru dan derajat fibrosis paru meningkat secara nyata pada kelompok miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (P < 0.05).

Hasil pewarnaan Masson mengungkapkan bahwa (Gbr. 2c):pada kelompok palsu, jaringan paru-paru tikus mengandung sejumlah kecil serat kolagen biru. Dalam model, kelompok agomir NC, si-NC dan miR-499-5p agomir + oe-Sox6, serat kolagen meningkat. Pada kelompok miR-499-5p agomir, kelompok si-Sox6 dan kelompok miR-499-5p agomir + oe-NC, serat kolagen menurun dibandingkan kelompok model.

MiR-499-5p atau Depleted Sox6 yang Dipulihkan Mengurangi Sel Positif TUNEL, Ekspresi Protein Caspase-3 dan Caspase-9 di Jaringan Paru-paru Tikus Cedera Paru Akibat Sepsis

Western blot, pewarnaan TUNEL dan hasil imunohistokimia menunjukkan bahwa (Gbr. 3a-f):nukleus normal berwarna biru dan nukleus apoptosis berwarna coklat dalam berbagai warna. Dibandingkan kelompok palsu, sel positif TUNEL, ekspresi protein Caspase-3 dan Caspase-9 ditingkatkan pada kelompok model (semua P < 0,05). Dibandingkan kelompok agomir NC dan si-NC, sel positif TUNEL, ekspresi protein Caspase-3 dan Caspase-9 berkurang pada agomir miR-499-5p dan kelompok si-Sox6 (semua P < 0,05). Dibandingkan kelompok miR-499-5p agomir + oe-NC, sel positif TUNEL, ekspresi protein Caspase-3 dan Caspase-9 meningkat pada kelompok miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (semua P < 0.05).

MiR-499-5p yang dipulihkan atau Sox6 yang terkuras mengurangi sel positif TUNEL, ekspresi protein Caspase-3 dan Caspase-9 dalam jaringan paru-paru tikus cedera paru yang diinduksi sepsis. a Sel TUNEL positif dalam jaringan paru-paru tikus. b Jumlah sel TUNEL positif dalam jaringan paru-paru tikus. c Imunohistokimia Caspase-3 dan Caspase-9 pada jaringan paru-paru mencit; d Rerata nilai OD Caspase-3 dan Caspase-9 pada jaringan paru mencit. e Pita protein Caspase-3 dan Caspase-9 di jaringan paru-paru tikus. f Ekspresi protein Caspase-3 dan Caspase-9 pada jaringan paru-paru mencit pada masing-masing kelompok. (a) P < 0,05 versus kelompok palsu. (b) P < 0,05 versus kelompok agomir NC. (c) P < 0,05 versus kelompok si-NC. (d) P < 0,05 versus grup agomir + oe-NC miR-499-5p agomir + oe-NC. Data pengukuran digambarkan sebagai mean ± standar deviasi, dan data dinilai dengan ANOVA satu arah diikuti dengan uji post hoc Tukey

MiR-499-5p atau Depleted Sox6 yang Dipulihkan Menurunkan Kandungan TNF-α, IL-1β dan IL-6 pada BALF dan Jaringan Paru-paru akibat Cedera Paru Akibat Sepsis Tikus

Itu ditampilkan oleh ELISA dan hasil uji Western blot bahwa (Gbr. 4a-g):konten TNF-α, IL-1β dan IL-6 meningkat pada kelompok model relatif terhadap kelompok palsu (semua P < 0,05). Dibandingkan kelompok agomir NC dan si-NC, kandungan TNF-α, IL-1β dan IL-6 menurun pada agomir miR-499-5p dan kelompok si-Sox6 (semua P < 0,05). Dibandingkan dengan grup miR-499-5p agomir + oe-NC, konten TNF-α, IL-1β, dan IL-6 dinaikkan dalam grup miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (semua P < 0.05).

MiR-499-5p yang dipulihkan atau Sox6 yang terkuras mengurangi kandungan TNF-α, IL-1β dan IL-6 dalam BALF dan jaringan paru-paru tikus cedera paru yang diinduksi sepsis. a Kandungan TNF-α pada BALF mencit pada masing-masing kelompok. b Kandungan IL-1β pada BALF mencit pada masing-masing kelompok. c Kandungan IL-6 pada BALF mencit pada masing-masing kelompok. d pita protein TNF-α, IL-1β dan IL-6 pada jaringan paru-paru mencit pada masing-masing kelompok. e ekspresi protein TNF-α pada jaringan paru mencit pada masing-masing kelompok. f ekspresi protein IL-1β pada jaringan paru-paru mencit pada masing-masing kelompok. G ekspresi protein IL-6 pada jaringan paru-paru mencit pada masing-masing kelompok. (a) P < 0,05 versus kelompok palsu. (b) P < 0,05 versus kelompok agomir NC. (c) P < 0,05 versus kelompok si-NC. (d) P < 0,05 versus grup agomir + oe-NC miR-499-5p agomir + oe-NC. Data pengukuran digambarkan sebagai mean ± standar deviasi, dan data dinilai dengan ANOVA satu arah diikuti dengan uji post hoc Tukey

MiR-499-5p yang Dipulihkan atau Depleted Sox6 Meningkatkan Aktivitas SOD, CAT, dan GSH-Px serta Mengurangi Konten MDA dan MPO di Jaringan Paru-Paru Akibat Sepsis Tikus Cedera Paru

Hasil deteksi indeks stres oksidatif menunjukkan bahwa (Gbr. 5a-e):versus kelompok palsu, aktivitas SOD, CAT dan GSH-Px terganggu sementara konten MDA dan MPO meningkat pada kelompok model (semua P < 0,05). Dibandingkan agomir NC dan grup si-NC, aktivitas SOD, CAT, dan GSH-Px meningkat sementara konten MDA dan MPO berkurang pada agomir miR-499-5p dan grup si-Sox6 (semua P < 0,05). Dibandingkan grup miR-499-5p agomir + oe-NC, aktivitas SOD, CAT, dan GSH-Px ditekan sementara konten MDA dan MPO ditingkatkan dalam grup miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (semua P < 0.05).

MiR-499-5p yang dipulihkan atau Sox6 yang terkuras meningkatkan aktivitas SOD, CAT, dan GSH-Px serta mengurangi kandungan MDA dan MPO dalam jaringan paru-paru tikus cedera paru yang diinduksi sepsis. a Aktivitas SOD di jaringan paru-paru tikus. b Kandungan MDA pada jaringan paru-paru mencit. c Aktivitas GSH-Px di jaringan paru-paru tikus. d Aktivitas CAT pada jaringan paru masing-masing kelompok mencit. e Kandungan MPO dalam jaringan paru-paru tikus. (a) P < 0,05 versus kelompok palsu. (b) P < 0,05 versus kelompok agomir NC. (c) P < 0,05 versus kelompok si-NC. (d) P < 0,05 versus grup agomir + oe-NC miR-499-5p agomir + oe-NC. Data pengukuran digambarkan sebagai mean ± standar deviasi, dan data dinilai dengan ANOVA satu arah diikuti dengan uji post hoc Tukey

miR-499-5p Langsung Menargetkan ke Sox6

Kami memperkirakan melalui situs web bioinformatika TargetScan bahwa ada situs pengikatan yang ditargetkan antara miR-499-5p dan SOX4/6. Menggunakan RT-qPCR, ditemukan bahwa dibandingkan dengan kelompok palsu, ekspresi SOX2/4/6 meningkat pada kelompok model, dan ekspresi SOX6 meningkat sebagian besar (semua P < 0,05); versus kelompok agomir NC, kelompok agomir miR-499-5p menunjukkan tidak ada perubahan dalam ekspresi SOX2 sementara menunjukkan penurunan ekspresi SOX4, sebagian besar menurunkan SOX6 (File tambahan 1:Gambar. S1a, b). Oleh karena itu, kami akhirnya memilih SOX6 sebagai gen target miR-499-5p. Situs web prediksi biologis (http://www.targetscan.org/vert_72/) mengungkapkan bahwa miR-499-5p dapat menargetkan Sox6 (Gbr. 6a). Uji gen reporter luciferase ganda menunjukkan bahwa (Gbr. 6b) versus kelompok kontrol, aktivitas luciferase jelas dihancurkan setelah vektor pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT dan agomir miR-499-5p ditransfusikan bersama ke dalam sel TC-1 (P ( P> 0.05), menunjukkan bahwa miR-499-5p dapat secara langsung berikatan dengan Sox6 3′UTR WT, dan kemudian menghambat aktivitas luciferase.

miR-499-5p secara langsung menargetkan ke Sox6. a Hubungan target antara miR-499-5p dan Sox6 didasarkan pada situs web biologis. b Hasil verifikasi uji gen reporter luciferase ganda. *P < 0,05 versus kelompok meniru NC. Data pengukuran digambarkan sebagai mean ± standar deviasi, dan perbandingan antara dua kelompok dilakukan dengan t tes

Diskusi

Sepsis adalah penyebab kritis dari syok dan sindrom disfungsi organ multipel, di antaranya ALI adalah komplikasi organ yang paling sering dan signifikan [24]. ALI yang diinduksi sepsis muncul tidak hanya paling awal, insiden tertinggi, tetapi juga berkembang pesat, tingkat kematian tinggi, dan tidak ada terapi yang efektif saat ini [25]. Sebuah penelitian sebelumnya telah menyatakan bahwa up-regulasi miR-218 melemahkan sekresi faktor inflamasi dan mencegah cedera paru yang diinduksi sepsis [26]. Juga, mempromosikan tingkat miR-146a dapat mengurangi peradangan pada ALI [27] dan pemulihan miR-125b meningkatkan kelangsungan hidup tikus dengan ALI dan menekan peradangan [28]. Meskipun penelitian telah menyoroti peran miRNA dalam cedera paru-paru, mekanisme terperinci miR-499-5p pada cedera paru yang diinduksi sepsis hampir tidak diselidiki, jadi kami fokus pada miR-499-5p untuk menemukan potensi terapeutiknya pada sepsis yang diinduksi. ALI. Juga, sebuah penelitian telah memberikan bukti bahwa peningkatan Sox6 terlibat dalam apoptosis jantung yang diinduksi sepsis [10]. Efforts should be made to deeply understand sepsis-induced lung injury. We aim to discuss the protective effect of miR-499-5p targeting Sox6 on sepsis-induced lung injury mice.

The W/D ratio of lung tissues was calculated in our study, and the expression of Sox6 and miR-499-5p in mouse lung tissues was assessed. The results showed that W/D ratio and Sox6 were increased while miR-499-5p was decreased in lung tissues of sepsis-induced lung injury mice. A recent study has proposed that miR-499-5p expression in patients with mild sepsis, severe sepsis and septic shock was dramatically decreased relative that in normal controls [9]. Another study has presented that miR-499-5p expression was markedly declined in non-small cell lung cancer (NSCLC) tissues and linked to poor clinical outcomes [29]. It is reported that the Sox6 expression was raised in lung cancer tissues in comparison with normal tissues [30]. Similarly, a previous study has revealed that the expression of Sox6 was remarkably elevated in the kidney tissues of mice with diabetic kidney disease [31]. Our study also presented that miR-499-5p directly targeted to Sox6. An important finding was that Sox6 is a target gene of miR-499 [10]. Another study provided data of that Sox6 was a target gene of miR-499-5p, and restoration of miR-499-5p suppressed the expression of Sox6 [32]. However, the target relation of miR-499-5p and Sox6 in lung tissues of sepsis-induced mice has not been uncovered yet.

In addition, it was revealed that restored miR-499-5p or depleted Sox6 alleviated lung tissues pathology, reduced lung injury score, collagen fibers and the degree of pulmonary fibrosis, and reduced TUNEL positive cells, Caspase-3 and Caspase-9 protein expression in lung tissues of sepsis-induced lung injury mice. It has been previously suggested that up-regulating miR-499-5p suppresses cell proliferation and promotes apoptosis in vivo and in vitro of NSCLC [29]. Another study has verified that restoring miR-499-5p and depleting Sox6 attenuated hypoxia/re-oxygenation-induced cell apoptosis and reduced Caspase-3 expression [32]. It was presented that down-regulating Sox6 alleviates the pathological injury and represses neuronal apoptosis in hippocampal tissues of Alzheimer’s disease [33]. Moreover, a study revealed that depletion of Sox6 inhibited high glucose-induced cell apoptosis and renal interstitial fibrosis in mouse renal mesangial cells [31]. Another study demonstrated that low expression of Sox6 declined the activity of Caspase-3 and the percentage of apoptotic cells in mouse P19CL6 cells [34]. In addition, we verified that restored miR-499-5p or depleted Sox6 declined TNF-α, IL-1β and IL-6 contents in BALF and lung tissues of sepsis-induced lung injury mice. Xia dkk. illuminated that TNF-α and IL-6 levels were dramatically raised in sepsis-induced lung injury mice [35]. A study has demonstrated that low expression of Sox6 declines the inflammatory reaction in hippocampal tissues of Alzheimer’s disease [33]. Another result in this study implied that restored miR-499-5p or depleted Sox6 raised SOD, CAT and GSH-Px activities as well as reduced MDA and MPO contents in lung tissues of sepsis-induced lung injury mice. It was presented that CLP-induced ALI was featured by inflammation in morphology, enhanced W/D ratio, raised protein concentration in BALF, higher level of MPO and MDA contents as well as lower level of SOD, GSH-Px and CAT activities in lungs after CLP [36]. It was suggested that the activity of SOD and CAT were decreased in sepsis-induced ALI in mice [37]. Furthermore, a study reported that the overexpressed miR-499-5p and low expressed Sox6 decreased the level of MDA [32].

Conclusion

In conclusion, we found that high expression of miR-499-5p can attenuate the apoptosis of lung tissues cells and inhibit inflammation of sepsis-induced lung injury mice via depleting Sox6, which may have important therapeutic implications in the treatment of sepsis-induced lung injury. Nevertheless, clinical researches are needed to detect the efficacy for the treatment of sepsis-induced lung injury.

Ketersediaan data dan materi

Tidak berlaku.

Peningkatan Fluoresensi Bergantung Plasmon Jarak dari Submonolayer Rhodamin 6G oleh Nanopartikel Emas Nanopartikel:Pendekatan Baru untuk Meningkatkan Diagnosis dan Perawatan Kanker