Poli(N-Isopropylacrylamide)-Pyrrole Nanocomposites Terpicu Cahaya Terpicu Dekat untuk Terapi Kanker Kemo-fototermal

Bahan dan Metode

Materi

NIPAM, T,N -methylenebisacrylamide (MBA), kalium persulfat (KPS, 99%), N-(3-Dimethylaminopropyl)-N -etilkarbodiimida hidroklorida (EDC) dan N -Hydroxysuccinimide (NHS) dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Polivinilpirolidon (PVP) dan pirol (98%) diperoleh dari Alfa Aesar (Ward Hill, MA, USA). AAc dibeli dari Dae Jung Chemicals &Materials. Co.Ltd (Korea). FA-PEG-amina (FA-PEG-NH₂ , MW:5 kDa) disediakan oleh Nanocs, Inc. (New York, NY, USA). Doksorubisin hidroklorida (Dox) diperoleh dari Tokyo Chemical Industry. Co.Ltd (Tokyo, Jepang). Semua bahan kimia dan bahan digunakan secara komersial tanpa pemurnian lebih lanjut.

Sintesis ppy-Decorated PNIPAM-AAc Nanoparticle

PNIPAM termo-responsif yang dikopolimerisasi dengan nanopartikel AAc disintesis menurut laporan sebelumnya [15]. 1,13 g monomer NIPAM, 0,077 g MBA dan 0,136 g AAc dilarutkan dalam 100 mL air deionisasi dan ditambahkan ke dalam labu alas bulat leher tiga 250 mL. Setelah 30 menit, suhu reaksi dinaikkan menjadi 80 °C dan pengadukan kuat selama 1 jam. Untuk menginduksi polimerisasi, KPS (1,5 mg) ditambahkan ke dalam campuran, diikuti dengan pengadukan selama 4 jam. Campuran didialisis terhadap membran dialisis 12–14 kDa berat molekul cut off (MWCO) dalam air deionisasi selama 7 hari untuk menghilangkan monomer yang tidak bereaksi, inisiator, ion yang dapat dibuang dan nanopartikel PNIPAM-AAc diperoleh dengan pengeringan beku selama 48 jam. Untuk memfungsikan efek fototermal, ppy didekorasi menjadi nanopartikel PNIPAM-AAc [25]. PVP (50 dan 100 mg) dan monomer pirol (50 dan 100 μL) ditambahkan dengan cepat dalam 10 mg/mL larutan PNIPAM-AAc dan diaduk selama 12 jam pada suhu kamar. Kemudian, KPS (3,4 mg) dimasukkan ke dalam larutan PNIPAM-AAc dan diaduk selama 14 jam. PNIPAM-AAc berhias ppy disentrifugasi tiga kali dengan akuades. PNIPAM-ppy-5 dan PNIPAM-ppy-10 diperoleh dengan pengeringan beku selama 48 jam.

Sintesis Nanokomposit PNIPAM-ppy Bertarget Kanker

Untuk mendapatkan nanokomposit PNIPAM-ppy target kanker (PNIPAM-ppy-FA), 10 mg PNIPAM-ppy dilarutkan dalam fosfat buffer saline (PBS, 10 mL, pH 5,5) dan diultrasonik selama 5 menit. EDC (15 mg, 0,078 mmol) dan NHS (15 mg, 0,13 mmol) ditambahkan ke dalam larutan PNIPAM-ppy. Setelah 1 jam, FA-PEG-NH₂ (5 mg) ditambahkan dan juga diaduk selama semalam. FA-PEG-NH yang tidak bereaksi₂ , EDC dan NHS dalam larutan PNIPAM-ppy dihilangkan dengan membran dialisis (MWCO 6–8 kDa) dan nanokomposit PNIPAM-ppy-FA diliofilisasi selama 48 jam.

Sintesis Nanokomposit PNIPAM-ppy-FA Berisi Obat Antikanker

10 mg PNIPAM-ppy-FA dilarutkan dalam air deionisasi dan diultrasonik selama 5 menit. 0,5 mg/mL Dox ditambahkan dalam tetes ke larutan PNIPAM-ppy-FA, diaduk dengan kuat pada suhu kamar. Dox yang tidak dimuat dihilangkan dengan sentrifugasi (14.000 rpm, 10 menit) dan dimurnikan dengan air deionisasi. PNIPAM-ppy-FA (Dox@PNIPAM-ppy-FA) yang dimuat Dox diperoleh dengan pengeringan beku selama 48 jam.

Karakterisasi NIR dan Nanokomposit PNIPAM-ppy-FA Termo-Responsif

Mikroskop elektron transmisi (TEM, JEOL-2100F, JEOL, Japan) digunakan untuk mengkarakterisasi ukuran, morfologi, dan distribusi nanokomposit PNIPAM-ppy-FA. Untuk pengukuran TEM, sampel disiapkan dengan menempatkan setetes larutan sampel dalam air deionisasi (konsentrasi:1 g/L) ke dalam kisi tembaga 200 mesh yang dilapisi karbon. Distribusi ukuran dan muatan permukaan nanokomposit PNIPAM-ppy-FA, yang dilarutkan ke dalam air deionisasi dan diultrasonikasi selama 5 menit, diukur dengan menggunakan Zetasizer Nano Z (Malvern Instruments, UK). Modifikasi permukaan dan ikatan kimia nanokomposit PNIPAM-ppy-FA dikonfirmasi oleh spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FT-IR). Spektrum FT-IR direkam pada pelet KBr dengan menggunakan instrumen Nicolet iS50 (Thermo Fisher Scientific, Inc., USA) dalam kisaran 400–4000 cm ⁻¹ pada resolusi 4 cm ⁻¹ . Sifat optik dan kapasitas pemuatan Dox dalam nanokomposit PNIPAM-ppy-FA diamati dengan spektroskopi UV–Vis (UV 1800, Shimazu, Jepang).

Sifat Fototermal dan Fotostabilitas NIR dan Nanokomposit PNIPAM-ppy-FA Termo-Responsif

Properti fototermal nanokomposit PNIPAM-ppy-FA yang dimuat Dox (Dox@PNIPAM-ppy-FA) dievaluasi dengan mendeteksi perubahan suhu secara real-time. Dox@PNIPAM-ppy-FA dilarutkan dalam larutan berair dengan konsentrasi berbeda 0,05, 0,1, dan 0,2 mg/mL dan diiradiasi selama 20 menit menggunakan laser NIR 808 nm (MDL-N-808, CNI Optoelectronics Tech. Co. Ltd., China) dengan kepadatan daya 2 W/cm ² . Pengaruh kerapatan daya laser NIR dipelajari dengan penyinaran laser NIR selama 20 menit dengan kerapatan daya 1, 2, dan 3 W/cm ² , masing-masing. Selanjutnya, untuk menyelidiki stabilitas fototermal terhadap laser NIR, larutan Dox@PNIPAM-ppy-FA (0,1 mg/mL) diekspos selama 15 menit dan mengikuti proses pendinginan alami selama lima kali. Selama penyinaran laser NIR, suhu larutan Dox@PNIPAM-ppy-FA diukur dengan termokopel yang dihubungkan dengan termometer digital (DTM-318, Tecpel Co., Taiwan) setiap 60 dtk selama 15 mnt.

NIR dan Pelepasan Obat Termo-Responsif dari Nanokomposit PNIPAM-ppy-FA

Untuk mempelajari profil pelepasan Dox dengan respons-termo, larutan Dox@PNIPAM-ppy-FA (1 mg/mL) disiapkan ke dalam vial 5 mL dan kemudian diaduk pada 25, 37, dan 50 °C. Pada waktu pelepasan yang ditentukan (0–72 jam), supernatan dari setiap sampel dikumpulkan dengan sentrifugasi dan diganti dengan media segar dengan volume yang sama. Jumlah Dox yang dilepaskan dari nanokomposit PNIPAM-ppy-FA diperkirakan dengan pengukuran spektroskopi UV–Vis pada 480 nm. Selain itu, perilaku pelepasan Dox melalui larutan Dox@PNIPAM-ppy-FA yang ditanggapi rangsangan laser NIR (1 mg/mL) diaduk dengan kuat pada suhu 37°C dan disinari selama 10 menit pada titik waktu yang telah ditentukan (1, 2, 3 , 4, dan 5 jam). Sebagai kontrol, digunakan larutan Dox@PNIPAM-ppy-FA tanpa penyinaran laser NIR. Dox yang dirilis ditentukan dengan metode yang disebutkan di atas.

Analisis Sitotoksisitas Nanokomposit PNIPAM-ppy-FA

Sitotoksisitas nanokomposit PNIPAM-ppy-FA termasuk PNIPAM-ppy-FA dan Dox@PNIPAM-ppy-FA diverifikasi dengan menggunakan uji MTT. Sel A549 dan MDA-MB-231 diunggulkan dalam pelat 96-sumur dengan kepadatan 1 × 10 ⁴ sel per sumur dalam 200 µL media RPMI 1640 yang mengandung 10% FBS dan 1% penisilin-streptomisin dan diinkubasi pada suhu 37 °C di bawah atmosfer yang dilembabkan dengan 5% CO₂ . Setelah 1 hari, 200 L nanokomposit PNIPAM-ppy-FA dengan berbagai konsentrasi (20–100 L) direaksikan ke setiap sel dan cawan diinkubasi selama 24 jam. Sel dicuci dengan DPBS dan media kemudian diganti dengan media segar dengan agen MTT (0,5 mg/mL). Setelah inkubasi lain selama 4 jam, media dipindahkan dengan hati-hati dan 200 µL DMSO ditambahkan ke setiap sumur untuk melarutkan kristal formazan ungu yang terinternalisasi. Penyerapan diukur pada 595 nm menggunakan pembaca pelat mikro iMark™ (Bio-rad, Hercules, CA, USA).

Analisis Serapan Seluler Nanokomposit PNIPAM-ppy-FA

Untuk mengevaluasi kemampuan penargetan sel kanker spesifik nanokomposit PNIPAM-ppy-FA, sel A549 dan MDA-MB-231 diunggulkan dalam pelat 8-sumur (ibidi, Munich, Jerman) dengan kepadatan 2 × 10 ⁴ sel/mL dan diinkubasi selama 24 jam. Sel-sel tersebut kemudian diinkubasi dengan nanokomposit PNIPAM-ppy-FA (60 µg/mL) selama 6 jam. Selanjutnya, sel dicuci dua kali dengan DPBS untuk menghilangkan nanokomposit yang tersisa dan difiksasi dengan paraformaldehida 4% selama 15 menit. Setelah perlakuan 0,1% Triton-X selama 15 menit pada suhu kamar, sel akhirnya diwarnai dengan Alexa Fluor 488 phalloidin (1:200, Invitrogen, USA) selama 1 hari pada 4°C dan 4,6-diamidino-2- phenylindole (DAPI, Thermo Fisher Scientific, USA) masing-masing selama 10 menit. Gambar serapan seluler diamati dengan menggunakan mikroskop pemindaian laser confocal (CLSM, LSM 710, Carl Zeiss, Jerman).

Efek Antikanker yang Ditingkatkan dari Nanokomposit PNIPAM-ppy-FA melalui Iradiasi Laser NIR

Kemanjuran terapeutik yang ditingkatkan menggunakan NIR dan PNIPA-ppy-FA termo-responsif pada sel kanker payudara diselidiki dengan uji MTT. MDA-MB-231 (1 × 10 ⁴ sel/mL) diunggulkan ke piring 96-sumur dan diinkubasi selama 24 jam. Sel-sel kemudian dicuci dengan nanokomposit DPBS dan PNIPAM-ppy-FA dan Dox@PNIPAM-ppy-FA pada berbagai konsentrasi (20, 40, 60, 80 dan 100 μg/mL) ditambahkan ke setiap sumur dengan cara yang bergantung pada konsentrasi. . Setelah diinkubasi selama semalam, media dibuang, dilanjutkan dengan penambahan media segar. Untuk kelompok penyinaran laser NIR, sel diperlakukan dengan 5 W/cm ² selama 5 mnt. Kemudian, MDA-MB-231 dicuci dengan DPBS dan media segar termasuk larutan MTT ditambahkan. Setelah 4 jam, media dipindahkan dengan hati-hati dan 200 L DMSO ditambahkan ke masing-masing sumur. Terakhir, absorbansi pada 595 nm diukur dengan pembaca pelat mikro iMark™ untuk menentukan viabilitas sel. Sebagai metode lain untuk mengamati efek terapeutik kanker, pengujian hidup dan mati dilakukan. PNIPAM-ppy-FA dan Dox@PNIPAM-ppy-FA (60 μg/mL) dimasukkan ke dalam MDA-MB-231. Setelah 24 jam, MDA-MB-231 diekspos dengan atau tanpa penyinaran laser NIR (5 W/cm ² , 5 menit) dan diwarnai dengan calcein AM dan etidium homodimer-1. Setelah 30 menit, sel dicuci beberapa kali dengan DPBS. Gambar hidup/mati diperoleh dengan menggunakan mikroskop fluoresensi terbalik (Olympus Ix73, Jepang).

Hasil dan Diskusi

Sintesis dan Karakterisasi NIR dan Nanokomposit PNIPAM-ppy Bertarget Kanker Termos-Responsif

Untuk generasi nanokomposit berbasis PNIPAM termo-responsif, nanopartikel PNIPAM-AAc dibuat dengan metode polimerisasi radikal [15]. Untuk mengontrol LCST melalui iradiasi laser NIR, ppy ditutupi oleh reaksi polimerisasi dalam PNIAPM-AAc yang disiapkan. Kanker yang ditargetkan PNIPAM-ppy-FA disintesis dengan konjugasi kimia FA-PEG-NH₂ dengan gugus karboksil pada PNIPAM-AAc. Menurut gambar TEM pada Gambar. 1a, morfologi, ukuran, dan dispersi PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy dan PNIPAM-ppy-FA diamati. PNIPAM-AAc yang disiapkan menunjukkan bentuk homogen dengan diameter rata-rata 274,32 ± 11,62 nm. Setelah dekorasi ppy, PNIPAM-ppy dan PNIPAM-ppy-FA menunjukkan kesamaan ukuran dengan 275.99 ± 11.41 dan 285.77 ± 17.92 nm. Ukuran PNIPAM-ppy-FA Dox-loaded sedikit meningkat dari 285,77 ± 17,92 menjadi 290,73 ± 12,28 nm, menunjukkan bahwa obat antikanker dimuat dalam nanokomposit PNIPAM-ppy-FA [26]. Menariknya, dibandingkan dengan PNIPAM-AAc, keberadaan ppy dalam nanokomposit PNIPAM-ppy-FA jelas ditunjukkan oleh bintik-bintik hitam kecil. Selain itu, karena rantai PEG, nanokomposit PNIPAM-ppy-FA terdispersi dengan baik dalam larutan berair tanpa agregasi [27]. Diameter hidrodinamik rata-rata PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA, dan Dox@PNIPAM-ppy-FA diukur dengan analisis DLS (File tambahan 1:Gbr. S1). Diameter PNIPAM-AAc, PNIPAM -ppy, PNIPAM-ppy-FA, dan Dox@PNIPAM-ppy-FA masing-masing adalah 432, 450,7, 468,6, dan 486,7 nm. Karena metode analisis yang berbeda, diameter masing-masing nanokomposit lebih besar daripada diameter TEM, tetapi ukuran partikel dan distribusi nanokomposit PNIPAM-ppy-FA menunjukkan tren yang sama.

a Gambar TEM nanokomposit PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA, dan Dox@PNIPAM-ppy-FA. b Analisis LCST dari Dox@PNIPAM-ppy-FA oleh DLS. c Diameter rata-rata PNIPAM-AAc dan Dox@PNIPAM-ppy-FA bergantung pada kondisi suhu yang berbeda (pada 25 °C, 37,5 °C, dan 50 °C)

Untuk menyelidiki pengaruh ppy terpolimerisasi ke dalam PNIPAM-AAc, nilai LCST dari PNIPAM-AAc dan Dox@PNIPAM-ppy-FA diukur dengan suhu yang berbeda (Gbr. 1b). Dibandingkan dengan pekerjaan kami sebelumnya [15], LCST dari Dox@PNIPAM-ppy-FA sedikit menurun dibandingkan dengan PNIPAM-AAc (42 °C). Perbedaan ini dapat disebabkan oleh pengurangan gugus karboksil pada PNIPAM-AAc karena polimerisasi ppy dan ligan penargetan kanker terkonjugasi [28]. Selanjutnya, kami memantau perubahan ukuran partikel tergantung pada suhu pada Gambar. 1c. Untuk ini, diameter PNIPAM-AAc dan Dox@PNIPAM-ppy-FA diukur dalam rentang suhu dari 25 hingga 50 °C. Saat suhu dinaikkan, PNIPAM-AAc berkurang dari 436 menjadi 177 nm. Selain itu, ukuran Dox@PNIPAM-ppy-FA sangat berkurang dari 630 menjadi 420 nm, menunjukkan bahwa dekorasi ppy dalam nanokomposit PNIPAM tidak terlalu memengaruhi aplikasi DDS terkontrol dan termo-responsif [27].

Nilai potensial zeta dari PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA, dan Dox@PNIPAM-ppy-FA menampilkan perubahan permukaan nanokomposit sebelum dan sesudah modifikasi (Gbr. 2a). Potensi zeta PNIPAM-AAc adalah 37.1 ± 1.61 mV karena adanya gugus karboksil pada AAc [29]. Nilai PNIPAM-ppy dan PNIPAM-ppy-FA meningkat menjadi 29.6 ± 0.96 dan 15.6 ± 0.26 mV, menunjukkan bahwa polipirol bermuatan positif dan FA-PEG-NH₂ berhasil diperkenalkan dalam nanokomposit PNIPAM-ppy-FA [27]. Karena Dox bermuatan negatif, potensi zeta Dox@PNIPAM-ppy-FA berubah menjadi lebih banyak muatan negatif (− 28.6 ± 0.23 mV). Seperti ditunjukkan pada Gambar. 2b, sintesis PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, dan PNIPAM-ppy-FA yang berhasil dikonfirmasi dengan spektroskopi FT-IR. Spektrum PNIPAM-AAc menunjukkan puncak vibrasi regangan C-N dan CH₂ antara 1100 dan 1200 cm ⁻¹ dan puncak C=O, N–H dan COOH diamati pada 1545, 1645 dan 1750 cm ⁻¹ , yang termasuk dalam PNIPAM-AAc [15]. Polipirol dalam PNIPAM-ppy dan PNIPAM-ppy-FA menunjukkan puncak tambahan pada 935 dan 1050 cm ⁻¹ diamati [30]. Dalam spektrum PNIPAM-ppy-FA, puncak getaran baru muncul pada 1107 dan 2880 cm ⁻¹ , yang dikaitkan dengan C-O-C dari rantai PEG. Hasil ini menunjukkan keberhasilan konjugasi kimia FA-PEG-NH₂ [31]. Namun, ligan penargetan FA tidak terdeteksi oleh FT-IR, karena strukturnya mirip dengan PEG. Untuk mengkonfirmasi keberadaan FA dalam nanokomposit PNIPAM, PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, dan PNIPAM-ppy-FA dilakukan dengan spektroskopi UV–Vis (Gbr. 2c). Sementara spektrum PNIPAM-AAc dan PNIPAM-ppy (tanpa FA) tidak menunjukkan puncak serapan apa pun, PNIPAM-ppy-FA menunjukkan puncak tambahan pada 280 nm, yang khas pada FA [32]. Hasil ini mendukung bahwa molekul FA dicangkokkan pada nanokomposit berbasis PNIPAM.

a Analisis potensi zeta PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA, dan Dox@PNIPAM-ppy-FA. b Spektrum FT-IR PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, dan PNIPAM-ppy-FA. c Spektrum UV–Vis dari PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA, dan Dox@PNIPAM-ppy-FA

Sifat Fototermal Nanokomposit PNIPAM-ppy-FA melalui Iradiasi Laser NIR

Untuk menggunakan nanokomposit berbasis PNIPAM untuk terapi fototermal, sifat optik nanokomposit PNIPAM-ppy-FA diperiksa dengan spektroskopi UV-Vis. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2c, PNIPAM-AAc tidak menunjukkan absorbansi di wilayah NIR (λ = 700–1000 nm). Namun, spektrum PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA, dan Dox@PNIPAM-ppy-FA jelas menunjukkan serapan yang kuat dalam kisaran yang sama karena nanopartikel ppy terpolimerisasi. Hasil absorbansi ini menunjukkan bahwa nanokomposit PNIPAM-ppy-FA dapat mengubah cahaya NIR menjadi panas [26]. Selanjutnya, kami mengevaluasi properti fototermal nanokomposit PNIPAM-ppy-FA dengan iradiasi laser NIR (Gbr. 3). Untuk mengoptimalkan efek fototermal, PNIPAM-FA (tanpa pirol), PNIPAM-ppy-5-FA (ppy 50 μL), dan PNIPAM-ppy-10-FA (ppy 100 μL) disiapkan pada konsentrasi yang sama (0,1 mg/mL ) dan kemudian terkena penyinaran laser NIR 808 nm dengan kepadatan 2 W/cm ² selama 20 mnt (Gbr. 3a). Suhu PNIPAM-ppy-10-FA meningkat menjadi 14,5 °C, 2 kali lebih tinggi dari PNIPAM-ppy-5-FA. Sebagai kontrol, PNIPAM-FA tanpa ppy diiradiasi, tetapi peningkatan suhu dapat diabaikan (2,4°C). Oleh karena itu, kami memilih PNIPAM-ppy-10-FA untuk menyelidiki eksperimen fototermal tambahan. Untuk mengamati perubahan suhu berdasarkan konsentrasi, laser NIR disinari ke PNIPAM-ppy-FA pada konsentrasi yang berbeda (0,05, 0,1, dan 0,2 mg/mL). Pada Gbr. 3b, bergantung pada konsentrasi, suhu masing-masing meningkat menjadi 10, 14,5, dan 18 °C. Selanjutnya, larutan PNIPAM-ppy-FA (0,1 mg/mL) disinari dengan berbagai kepadatan daya laser (1–3 W/cm ² ) pada Gbr. 3c. Seperti yang diharapkan, kenaikan suhu nanokomposit sangat tergantung pada kekuatan laser. Selanjutnya, kami mengamati stabilitas fototermal nanokomposit PNIPAM-ppy-FA pada Gambar. 3d. Meskipun penyinaran laser NIR dilakukan berulang-ulang setidaknya 5 kali, suhu terus meningkat hingga 33 °C, menunjukkan bahwa nanokomposit PNIPAM-ppy-FA adalah pembawa nano yang cocok sebagai terapi fototermal.

Kinerja fototermal nanokomposit PNIPAM-ppy-FA. a Analisis suhu Dox@PNIPAM-ppy-5-FA dan Dox@PNIPAM-ppy-10-FA di bawah iradiasi laser NIR 808 nm (2 W/cm ² ). b Analisis suhu perbedaan konsentrasi Dox@PNIPAM-ppy-FA di bawah iradiasi NIR 808 nm (2 W/cm ² ). c Efek fototermal Dox@PNIPAM-ppy-FA dengan berbagai kepadatan daya (1, 2, dan 3 W/cm ² ). (D) Kurva suhu Dox@PNIPAM-ppy-FA selama lima siklus hidup/mati menggunakan penyinaran laser NIR (2 W/cm ² )

NIR dan Pelepasan Obat Responsif Termal dari Nanokomposit PNIPAM-ppy-FA

Untuk mengevaluasi profil pelepasan obat melalui NIR dan respons panas, kami menganalisis sifat enkapsulasi dan pelepasan nanokomposit Dox@PNIPAM-ppy-FA. Awalnya, kami mengukur spektrum penyerapan UV–Vis dari PNIPAM-ppy-FA yang mengandung obat dan puncak penyerapan yang kuat diamati di dekat 480 nm (Gbr. 2c). Hasil ini menunjukkan bahwa Dox berhasil dimuat ke dalam nanokomposit PNIPAM-ppy-FA. Efisiensi pemuatan Dox nanokomposit PNIPAM-ppy-FA dihitung hingga 15% menggunakan kurva kalibrasi Dox (data tidak ditampilkan). Pada Gambar 4a, profil rilis Dox dari PNIPAM-ppy-FA dipelajari pada suhu yang berbeda. Kami mengamati perilaku pelepasan Dox selama 72 jam pada 25 °C, 37 °C, dan 50 °C dan pelepasan kumulatif Dox dari PNIPAM-ppy-FA masing-masing adalah 15%, 42%, dan 67%. Karena LCST dari PNIPAM-ppy-FA sedikit menurun hingga 42 °C, pelepasan kumulatif pada suhu tubuh ditemukan relatif lebih tinggi daripada suhu kamar. Sejumlah besar Dox dilepaskan, namun, Dox yang dilepaskan tidak mempengaruhi efisiensi terapeutik, karena nanokomposit Dox@PNIPAM-ppy-FA dapat diinternalisasi hanya dalam sel-sel positif reseptor folat, seperti yang dijelaskan sebelumnya [26, 32]. Di atas LCST (50 °C), jumlah Dox dari nanokomposit PNIAPM-ppy-FA dilepaskan empat kali lebih tinggi dari suhu kamar, menunjukkan bahwa nanokomposit PNIPAM-ppy-FA dapat digunakan dalam sistem pelepasan obat terkontrol melalui respons termal. Selain itu, kami menyelidiki perilaku pelepasan yang dipicu oleh cahaya NIR dari nanokomposit PNIPAM-ppy-FA pada Gambar. 4b. Solusi Dox@PNIAPM-ppy-FA (1 mg/mL) terpapar laser NIR (3 W/cm ² ) penyinaran selama 10 menit dan operasi ini diulang setiap 1 jam. Selama 6 jam, jumlah total Dox melalui penyinaran laser NIR mencapai 35%, sedangkan profil pelepasan Dox tanpa penyinaran laser NIR menunjukkan sekitar 5% dan 15% (25 °C dan 37 °C). Hasil ini menunjukkan bahwa iradiasi laser NIR menghasilkan suhu yang lebih tinggi daripada LCST nanokomposit dan menginduksi pelepasan Dox dari nanokomposit PNIPAM-ppy-FA.

a Profil rilis Dox kumulatif dari Dox@PNIPAM-ppy-FA melalui thermo-response dan b 808 nm iradiasi laser NIR

Analisis Sitotoksisitas dan Serapan Seluler Nanokomposit PNIPAM-ppy-FA

Menurut literatur, sitotoksisitas nanokomposit PNIPAM-ppy-FA diselidiki terhadap sel kanker paru-paru dan payudara (File tambahan 1:Gbr. S2) [33, 34]. Terlepas dari konsentrasi sampel, setelah inkubasi dengan PNIPAM-ppy-FA selama 24 jam, kedua viabilitas sel diamati (> 85%). Oleh karena itu, nanokomposit PNIPAM-ppy-FA kami tidak menunjukkan sitotoksisitas sebagai pembawa nano untuk aplikasi penghantaran obat [35, 36]. Untuk menyelidiki apakah PNIPAM-ppy-FA dapat secara selektif mengirimkan ke sel kanker, kami memeriksa sinyal fluoresen nanokomposit PNIPAM-ppy-FA intraseluler menggunakan mikroskop pemindaian laser confocal (File tambahan 1:Gambar. S3). Perilaku serapan seluler dari PNIPAM-ppy-FA dan Dox@PNIPAM-ppy-FA dievaluasi dalam garis sel reseptor folat negatif (A549) dan positif (MDA-MB-231) [37]. Setelah menginkubasi sel kanker payudara MDA-MB-231 dengan Dox@PNIPAM-ppy-FA, fluoresensi merah yang kuat diamati, menunjukkan bahwa Dox@PNIAPM-ppy-FA diinternalisasi ke dalam lisosom sel MDA-MB-231. Secara konstan, ketika PNIPAM-ppy-FA dan Dox@PNIPAM-ppy-FA diperlakukan dengan sel A549, sinyal Dox tidak diamati. Gambar confocal ini menunjukkan bahwa nanokomposit PNIAPM-ppy-FA dapat secara selektif diinternalisasi ke dalam sel kanker yang diekspresikan reseptor folat melalui jalur endositosis yang dimediasi reseptor seperti yang dijelaskan sebelumnya [38, 39].

Efek Antikanker Kemo-Fototermal dari NIR dan Nanokomposit Termo-Responsif PNIPAM-ppy-FA

Untuk mengkonfirmasi kemanjuran terapi kombinasi in vitro nanokomposit PNIPAM-ppy-FA, nanokomposit PNIPAM-ppy-FA dievaluasi pada sel MDA-MB-231 dengan atau tanpa iradiasi laser NIR dan viabilitas sel dievaluasi dengan uji MTT pada Gambar. 5a . Untuk terapi fototermal, sel kanker payudara MDA-MB-231 dengan PNIPAM-ppy-FA diinkubasi selama 12 jam dan kemudian diekspos ke laser NIR (5 W/cm ² , 5 menit). Viabilitas sel sel kanker payudara MDA-MB-231 menurun hingga 70-90% tergantung pada konsentrasi PNIPAM-ppy-FA. Untuk mengkonfirmasi satu-satunya efek kemoterapi, nanokomposit PNIPAM-ppy-FA yang dimuat Dox diperlakukan. Kami mengamati bahwa viabilitas berkurang hingga 50% karena pelepasan Dox dari nanokomposit, sesuai dengan profil pelepasan pada Gambar. 4. Menariknya, setelah iradiasi laser NIR dalam sel MDA-MB-231 dengan nanokomposit Dox@PNIPAM-ppy-FA, viabilitas sel secara dramatis menurun hingga 24%, yang lebih tinggi daripada kelompok kontrol (PNIPAM-ppy-FA dengan iradiasi laser NIR, Dox@PNIPAM-ppy-FA tanpa iradiasi laser NIR). Hasil ini menunjukkan efek sinergi yang optimal dari terapi kombinasi kemo-fototermal yang dimediasi iradiasi laser NIR. Selain itu, untuk secara langsung mengamati efisiensi terapeutik dalam sel kanker, uji hidup/mati dilakukan pada Gambar 5b. Sebagai kelompok kontrol, kami mengamati kelangsungan hidup hanya sel MDA-MB-231 dengan atau tanpa penyinaran laser NIR (5 W/cm ² , 5 menit) dan sebagian besar sel menunjukkan fluoresensi hijau (sel hidup). Ini menunjukkan bahwa iradiasi laser NIR tidak terbukti mempengaruhi viabilitas sel. Selain itu, sel MDA-MB-231 dengan PNIPAM-ppy-FA di bawah iradiasi laser NIR menunjukkan beberapa fluoresensi merah (sel mati), menunjukkan efek terapi fototermal yang disebabkan dari nanokomposit PNIPAM-ppy-FA. Meskipun tidak ada iradiasi laser NIR dalam sel MDA-MB-231 dengan Dox@PNIPAM-ppy-FA, beberapa fluoresensi merah sporadis diamati, menunjukkan kemoterapi. Selanjutnya, ketika sel MDA-MB-231 diperlakukan dengan nanokomposit dan iradiasi laser NIR, sebagian besar sel kanker menunjukkan sedikit fluoresensi merah [39, 40]. Hasil ini mendukung efek terapeutik sinergis dari terapi kemo-fototermal melalui penyinaran laser NIR dan nanokomposit Dox@PNIPAM-ppy-FA termo-responsif.

a Analisis kuantitatif viabilitas sel kanker payudara MDA-MB-231 yang diobati dengan PNIPAM-ppy-FA dan Dox@PNIPAM-ppy-FA dengan konsentrasi berbeda dan dengan atau tanpa penyinaran laser NIR 808 nm. b Gambar fluoresensi uji hidup/mati dalam sel MDA-MB-231 setelah perawatan nanokomposit PNIPAM-ppy-FA dan Dox@PNIPAM-ppy-FA (60 μg/mL) dengan atau tanpa iradiasi laser NIR. Sel hidup dan mati diwarnai dengan Calcein AM (hijau) dan Ethidium homodimer-1 (merah). Bilah skala adalah 200 μm

Kesimpulan

Kami telah berhasil membangun NIR yang ditargetkan untuk kanker dan nanokomposit PNIPAM-ppy-FA termo-responsif untuk terapi kombinasi kemo-fototermal. Untuk menginduksi pelepasan terkontrol dan efek fototermal melalui iradiasi laser NIR 808 nm, nanopartikel ppy didekorasi secara seragam pada PNIPAM-AAc dengan metode polimerisasi. PNIPAM-ppy-FA Dox-loaded menunjukkan efek fototermal dan fotostabilitas yang signifikan. Lebih lanjut, Dox@PNIPAM-ppy-FA menunjukkan sifat yang menguntungkan dari transisi termosensitif pada kondisi yang berbeda dan pelepasan obat dari nanokomposit PNIPAM-ppy-FA dapat dikontrol oleh cahaya NIR dan respons termo. Studi in vitro memverifikasi bahwa nanokomposit PNIPAM-ppy-FA menunjukkan biokompatibilitas yang sangat baik dan peningkatan kemanjuran terapeutik terhadap sel kanker payudara. Kemanjuran antikanker yang ditingkatkan melalui nanokomposit ini berkontribusi pada alasan berikut:(1) serapan seluler spesifik nanokomposit dalam endositosis yang dimediasi reseptor folat, (2) akumulasi pelepasan Dox dari PNIPAM-ppy-FA melalui NIR dan respons panas, dan (3 ) efek terapi sinergis dengan kombinasi kemo-fototermal. Oleh karena itu, nanokomposit PNIPAM-ppy-FA kami berpotensi digunakan sebagai pembawa nano multi-fungsi untuk pendekatan terapeutik sinergis terhadap berbagai jenis kanker dengan efek samping yang berkurang.

Ketersediaan data dan materi

Data dan analisis dalam karya saat ini tersedia dari penulis terkait atas permintaan yang wajar.

Singkatan

PTT:

Terapi fototermal

NIR:

Inframerah dekat

FA:

Asam folat

FA-PEG-NH₂ :

Amina FA-PEG

LCST:

Turunkan suhu larutan kritis

PNIPAM:

Poli(T -isopropilakrilamida)

ppy:

Polipirol

TEM:

Mikroskop transmisi

UV–Vis:

Spektroskopi ultraviolet–tampak

Polyaniline Nanoskein:Metode Sintetis, Karakterisasi, dan Penginderaan Redoks Peningkatan Penyerapan Optik dalam Sel Surya Tandem Perovskite/Si dengan Array Lubang Nano