Nanokomposit PNIPAM-Pirrol Responsif NIR Ter target untuk Terapi Sinergi Kemio-Fototermal Kanker Payudara

Abstrak

Terapi kombinasi berdasarkan nanokomposit multifungsi telah dianggap sebagai pendekatan yang menjanjikan untuk meningkatkan efektivitas terapi kanker. Di sini, kami melaporkan nanokomposit multifungsi berbasis poli(N-isopropilakrilamida) (PNIPAM) ter target untuk terapi sinergi kemio-fototermal terhadap sel kanker payudara. Untuk meningkatkan suhu transisi, asam akrilat (AAc) ditambahkan dalam proses sintesis PNIPAM, menunjukkan bahwa suhu kritis solusi rendah intrinsik berubah menjadi 42 °C. Untuk menghasilkan efek fototermal di bawah sinar laser inframerah dekat (NIR) (808 nm), nanopartikel pirrol (ppy) secara seragam dihiasi dalam PNIPAM-AAc. Asam folat (FA), sebagai ligand target kanker, berhasil dikonjugasi pada grup karbohil berlebih dalam jaringan PNIPAM. Pelepasan obat nanokomposit PNIPAM-ppy-FA secara efisien dipicu sebagai respons terhadap perubahan suhu oleh sinar laser NIR. Kami juga mengonfirmasi bahwa PNIPAM-ppy-FA internalisasi ke dalam sel kanker payudara MDA-MB-231 melalui endositosis reseptor folat dan secara signifikan meningkatkan efektivitas terapi kanker dengan kombinasi perlakuan efek kemio-fototermal. Oleh karena itu, pekerjaan kami mendorong eksplorasi lebih lanjut agen nanokarier multifungsi untuk pendekatan terapeutik sinergis terhadap berbagai jenis sel kanker.

Pendahuluan

Sistem pengiriman obat (DDS) adalah salah satu metode ampuh untuk menyediakan senyawa farmasial untuk mencapai efek terapeutik dalam terapi kanker [1]. Meskipun tujuan DDS adalah untuk menyampaikan obat aktif dan mengakumulasi di area yang diinginkan, DDS konvensional seringkali diiringi oleh efek samping yang parah dan efisiensi terapeutik yang tidak efisien [2, 3]. Untuk mengatasi hambatan ini, berbagai nanokarier yang memiliki kemampuan merespons stimuli internal atau eksternal spesifik termasuk suhu, cahaya, pH, medan listrik, oksidasi–reduksi, aktivitas enzim, dan konsentrasi antigen telah dikembangkan untuk DDS lanjutan dan digunakan untuk menginduksi pelepasan obat yang sosten dan terkontrol [4,5,6].

Salah satu dari berbagai stimuli, nanokarier responsif suhu adalah pendekatan yang ampuh untuk meningkatkan perawatan kanker, karena obat dalam nanopartikel dapat dilepaskan pada suhu tertentu [7]. Selain itu, keuntungan nanopartikel responsif suhu dapat digabungkan dengan stimuli lain untuk menginduksi pemusnahan kanker yang lengkap [8, 9]. Sebagai nanopartikel responsif suhu, poli(N-isopropilakrilamida) (PNIPAM) telah menerima perhatian paling banyak, karena ia menunjukkan transisi fase pada suhu kritis solusi rendah (LCST) sekitar 32 °C [10, 11]. Di bawah LCST, seluruh jaringan polimer dalam PNIPAM ada dalam keadaan bengkak karena ikatan hidrogen. Di sisi lain, PNIPAM bertransisi ke keadaan hidrofobik dan ikatan hidrogen berkurang, yang mengakibatkan keruntuhan jaringan polimer di atas LCST [12, 13]. Dibandingkan dengan nanopartikel lain, nanokarier berbasis PNIPAM memiliki keuntungan efisiensi enkapsulasi obat yang tinggi, kapasitas pelepasan obat yang terkontrol, dan kompatibilitas biologis yang baik [14]. Namun, karena pelepasan obat spontan pada suhu tubuh, nanokarier berbasis PNIPAM tidak cukup untuk digunakan dalam DDS lanjutan. Untuk mengatasi ini, penelitian sebelumnya menambahkan asam organik (misalnya, asam vinil asetat, asam akrilat, dan asam allyl asetat) dalam proses sintesis PNIPAM, yang mengakibatkan pengurangan efek samping oleh pelepasan obat yang berkelanjutan [15].

Akhir-akhir ini, sejumlah studi telah difokuskan pada pendekatan terapeutik baru yang integrasi dua atau lebih stimuli nanopartikel yang dipicu untuk meningkatkan efektivitas terapi kanker [16,17,18]. Misalnya, terapi fototermal (PTT) menunjukkan beberapa keuntungan, seperti kontrol cahaya yang presisi pada tumor, penetrasi non-invasif, dan toksisitas rendah pada sel normal [19, 20]. Untuk menggabungkan nanopartikel dengan PTT, agen fototermal (misalnya, nanoroda emas, nanoribuan karbon, pirrol (ppy), dan oksida grafen) harus dienkapsulasi secara seragam ke dalam nanopartikel berbasis PNIPAM [21,22,23]. Penelitian sebelumnya memfabrikasi nanoroda emas dilapisi silika mesopor dengan cangkang PNIPAM responsif suhu dan pH serta lebih menjelajahi aplikasi terapi kanker in vivo [24]. Namun, nanokomposit berbasis PNIPAM ini memerlukan proses sintesis multi-tahap. Selain itu, karena nanokomposit tidak memiliki moiety target terhadap sel kanker tertentu, itu dapat menyebabkan efek samping yang serius pada organ lain atau jaringan normal. Dalam laporan kami sebelumnya, kami mengembangkan sistem pelepasan obat yang dikontrol dua arah menggunakan properti responsif suhu dan pH PNIPAM [15]. Nanogel PNIPAM dikopolimerisasi dengan kandungan asam akrilat (AAc) untuk kontrol LCST yang efisien. Untuk meningkatkan targeting kanker dan efektivitas terapi, kami mengembangkan terapi kombinasi target kanker menggunakan efek kemio dan fototermal (Scheme 1). Ketika suhu naik oleh sinar laser NIR, obat dari nanokomposit PNIPAM responsif suhu dilepaskan dan efek fototermal kemudian diaktifkan. Karena asam folat (FA) yang dikonjugasi, nanokomposit berbasis PNIPAM menunjukkan efektivitas terapeutik yang signifikan ditingkatkan terhadap sel kanker payudara MDA-MB-231.

Bahan dan Metode

Bahan

NIPAM, N,N′-metilenbisakrilamida (MBA), persulfat kalium (KPS, 99%), N-(3-Dimetilaminopropil)-N′-etilkarbodiimida hidroklorida (EDC) dan N-Hidroksisuksinimida (NHS) dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, AS). Polivinilpirrolidon (PVP) dan pirrol (98%) diperoleh dari Alfa Aesar (Ward Hill, MA, AS). AAc dibeli dari Dae Jung Chemicals & Materials. Co. Ltd (Korea). FA-PEG-amin (FA-PEG-NH₂, MW: 5 kDa) disediakan oleh Nanocs, Inc. (New York, NY, AS). Hidroklorida doksorubisin (Dox) diperoleh dari Tokyo Chemical Industry. Co. Ltd (Tokyo, Jepang). Semua bahan kimia dan bahan secara komersial digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut.

Sintesis Nanopartikel PNIPAM-AAc yang Dihiasi ppy

Ko-polimer PNIPAM responsif suhu dengan AAc disintesis sesuai dengan laporan sebelumnya [15]. 1,13 g monomer NIPAM, 0,077 g MBA, dan 0,136 g AAc dilarutkan dalam 100 mL air deionis dan dimasukkan ke dalam kolong bundar tiga leher 250 mL. Setelah 30 menit, suhu reaksi ditingkatkan ke 80 °C dan diaduk keras selama 1 jam. Untuk menginduksi polimerisasi, KPS (1,5 mg) ditambahkan ke dalam campuran, diikuti dengan pengadukan selama 4 jam. Campuran dialisis terhadap membran dialisis dengan batas bobot molekuler (MWCO) 12–14 kDa dalam air deionis selama 7 hari untuk menghilangkan monomer, inisiasi, ion yang tidak perlu, dan nanopartikel PNIPAM-AAc diperoleh dengan freeze-drying selama 48 jam. Untuk fungsionalisasi efek fototermal, ppy dihiasi ke dalam nanopartikel PNIPAM-AAc [25]. PVP (50 dan 100 mg) dan monomer pirrol (50 dan 100 μL) dengan cepat ditambahkan ke dalam larutan PNIPAM-AAc 10 mg/mL dan diaduk selama 12 jam pada suhu kamar. Kemudian, KPS (3,4 mg) dimasukkan ke dalam larutan PNIPAM-AAc dan diaduk tambahan selama 14 jam. PNIPAM-AAc yang dihiasi ppy diisentrifugasi tiga kali dengan air tisu. PNIPAM-ppy-5 dan PNIPAM-ppy-10 diperoleh dengan freeze-drying selama 48 jam.

Sintesis Nanokomposit PNIPAM-ppy Target Kanker

Untuk mendapatkan nanokomposit PNIPAM-ppy target kanker (PNIPAM-ppy-FA), 10 mg PNIPAM-ppy dilarutkan dalam larutan penyangga fosfat (PBS, 10 mL, pH 5,5) dan diultrasonikasi selama 5 menit. EDC (15 mg, 0,078 mmol) dan NHS (15 mg, 0,13 mmol) ditambahkan ke dalam larutan PNIPAM-ppy. Setelah 1 jam, FA-PEG-NH₂ (5 mg) ditambahkan dan diaduk tambahan selama malam hari. FA-PEG-NH₂, EDC, dan NHS yang tidak bereaksi dalam larutan PNIPAM-ppy dihapus dengan membran dialisis (MWCO 6–8 kDa) dan nanokomposit PNIPAM-ppy-FA di-freeze-drying selama 48 jam.

Sintesis Nanokomposit PNIPAM-ppy-FA yang Dimuat Obat Antikanker

10 mg PNIPAM-ppy-FA dilarutkan dalam air deionis dan diultrasonikasi selama 5 menit. 0,5 mg/mL Dox ditambahkan secara titik ke dalam larutan PNIPAM-ppy-FA, diaduk keras pada suhu kamar. Dox yang tidak dimuat dihapus dengan sentrifugasi (14.000 rpm, 10 menit) dan difurnir dengan air deionis. PNIPAM-ppy-FA yang dimuat Dox (Dox@PNIPAM-ppy-FA) diperoleh dengan freeze-drying selama 48 jam.

Karakterisasi Nanokomposit PNIPAM-ppy-FA Responsif NIR dan Thermo

Mikroskop elektron transmisi (TEM, JEOL-2100F, JEOL, Jepang) digunakan untuk mengkarakterisir ukuran, morfologi, dan distribusi nanokomposit PNIPAM-ppy-FA. Untuk pengukuran TEM, sampel disiapkan dengan menempatkan titik larutan sampel dalam air deionis (konsentrasi: 1 g/L) pada grid tembaga 200 mesh yang dilapisi karbon. Ukuran distribusi dan muatan permukaan nanokomposit PNIPAM-ppy-FA, yang dilarutkan dalam air deionis dan diultrasonikasi selama 5 menit, diukur dengan Zetasizer Nano Z (Malvern Instruments, Inggris). Modifikasi permukaan dan ikatan kimia nanokomposit PNIPAM-ppy-FA dikonfirmasi oleh spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FT-IR). Spektra FT-IR direkam pada pelet KBr dengan menggunakan instrumen Nicolet iS50 (Thermo Fisher Scientific, Inc., AS) dalam rentang 400–4000 cm⁻¹ dengan resolusi 4 cm⁻¹. Properti optik dan kapasitas muatan Dox dalam nanokomposit PNIPAM-ppy-FA diamati dengan spektroskopi UV–Vis (UV 1800, Shimazu, Jepang).

Properti Fototermal dan Stabilitas Foto Nanokomposit PNIPAM-ppy-FA Responsif NIR dan Thermo

Properti fototermal nanokomposit PNIPAM-ppy-FA yang dimuat Dox (Dox@PNIPAM-ppy-FA) dievaluasi dengan mendeteksi perubahan suhu secara real-time. Dox@PNIPAM-ppy-FA dilarutkan dalam larutan air dengan konsentrasi yang berbeda 0,05, 0,1, dan 0,2 mg/mL dan diiradiasi selama 20 menit menggunakan sinar laser NIR 808 nm (MDL-N-808, CNI Optoelectronics Tech. Co. Ltd., Tiongkok) dengan kepadatan daya 2 W/cm². Pengaruh kepadatan daya sinar laser NIR diteliti dengan iradiasi sinar laser NIR selama 20 menit dengan kepadatan daya 1, 2, dan 3 W/cm², masing-masing. Selain itu, untuk menyelidiki stabilitas fototermal terhadap sinar laser NIR, larutan Dox@PNIPAM-ppy-FA (0,1 mg/mL) diekspos selama 15 menit dan diikuti oleh proses pendinginan alami lima kali. Selama iradiasi sinar laser NIR, suhu larutan Dox@PNIPAM-ppy-FA diukur dengan termokopel yang terhubung ke termometer digital (DTM-318, Tecpel Co., Taiwan) setiap 60 detik selama 15 menit.

Pelepasan Obat Responsif NIR dan Thermo Nanokomposit PNIPAM-ppy-FA

Untuk mempelajari profil pelepasan Dox oleh respons termal, larutan Dox@PNIPAM-ppy-FA (1 mg/mL) disiapkan dalam vial 5 mL dan kemudian diaduk pada 25, 37, dan 50 °C. Pada waktu pelepasan yang ditentukan (0–72 jam), supiran setiap sampel dikumpulkan dengan sentrifugasi dan diganti dengan volume yang sama dari medium segar. Jumlah Dox yang dilepaskan dari nanokomposit PNIPAM-ppy-FA diestimasi dengan pengukuran spektroskopi UV–Vis pada 480 nm. Selain itu, perilaku pelepasan Dox melalui stimuli sinar laser NIR larutan Dox@PNIPAM-ppy-FA (1 mg/mL) diaduk keras pada 37 °C dan diiradiasi selama 10 menit pada titik waktu yang ditentukan (1, 2, 3, 4, dan 5 jam). Sebagai kontrol, larutan Dox@PNIPAM-ppy-FA tanpa iradiasi sinar laser NIR digunakan. Dox yang dilepaskan ditentukan dengan metode yang sama sebelumnya.

Analisis Sistotoksisitas Nanokomposit PNIPAM-ppy-FA

Sistotoksisitas nanokomposit PNIPAM-ppy-FA termasuk PNIPAM-ppy-FA dan Dox@PNIPAM-ppy-FA diverifikasi dengan menggunakan uji MTT. Sel A549 dan MDA-MB-231 ditanam dalam plate 96-lubang dengan kepadatan 1 × 10⁴ sel per lubang dalam 200 µL medium RPMI 1640 yang mengandung 10% FBS dan 1% penitsin–streptomisin dan diinkubasi pada 37 °C di bawah atmosfer lembap dengan 5% CO₂. Setelah 1 hari, 200 µL nanokomposit PNIPAM-ppy-FA dengan berbagai konsentrasi (20–100 µL) diberikan ke setiap sel dan plate diinkubasi selama 24 jam. Sel dicuci dengan DPBS dan medium diganti dengan medium segar yang mengandung agen MTT (0,5 mg/mL). Setelah inkubasi tambahan selama 4 jam, medium dihilangkan dengan hati-hati dan 200 µL DMSO ditambahkan ke setiap lubang untuk melarutkan kristal formazan ungu yang diinternalisasi. Absorpsi diukur pada 595 nm menggunakan pembaca microplate iMark™ (Bio-rad, Hercules, CA, AS).

Analisis Pengambilan Seluler Nanokomposit PNIPAM-ppy-FA

Untuk mengevaluasi kemampuan targeting terhadap sel kanker spesifik nanokomposit PNIPAM-ppy-FA, sel A549 dan MDA-MB-231 ditanam dalam plate 8-lubang (ibidi, Munich, Jerman) dengan kepadatan 2 × 10⁴ sel/mL dan diinkubasi selama 24 jam. Sel kemudian diinkubasi dengan nanokomposit PNIPAM-ppy-FA (60 µg/mL) selama 6 jam. Selanjutnya, sel dicuci dua kali dengan DPBS untuk menghilangkan sisa nanokomposit dan dipertetapkan dengan paraformaldehida 4% selama 15 menit. Setelah perlakuan Triton-X 0,1% selama 15 menit pada suhu kamar, sel akhirnya diwarnai dengan Alexa Fluor 488 phalloidin (1:200, Invitrogen, AS) selama 1 hari pada 4 °C dan 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Thermo Fisher Scientific, AS) selama 10 menit, masing-masing. Citra pengambilan seluler diamati dengan menggunakan mikroskop skanning laser konfokal (CLSM, LSM 710, Carl Zeiss, Jerman).

Efek Antikanker yang Ditingkatkan Nanokomposit PNIPAM-ppy-FA melalui Iradiasi Sinar Laser NIR

Efektivitas terapeutik yang ditingkatkan menggunakan PNIPA-ppy-FA responsif NIR dan termo pada sel kanker payudara diselidiki dengan uji MTT. MDA-MB-231 (1 × 10⁴ sel/mL) ditanam pada plate 96-lubang dan diinkubasi selama 24 jam. Sel kemudian dicuci dengan DPBS dan nanokomposit PNIPAM-ppy-FA dan Dox@PNIPAM-ppy-FA dengan berbagai konsentrasi (20, 40, 60, 80 dan 100 μg/mL) ditambahkan ke setiap lubang dengan cara bergantung pada konsentrasi. Setelah inkubasi selama malam hari, medium dihilangkan, diikuti dengan penambahan medium segar. Untuk kelompok iradiasi sinar laser NIR, sel dirawat dengan 5 W/cm² selama 5 menit. Kemudian, MDA-MB-231 dicuci dengan DPBS dan medium segar yang termasuk larutan MTT ditambahkan. Setelah 4 jam, medium dihilangkan dengan hati-hati dan 200 μL DMSO ditambahkan ke setiap lubang. Akhirnya, absorpsi pada 595 nm diukur oleh pembaca microplate iMark™ untuk menentukan kelangsungan sel. Sebagai metode lain untuk pengamatan efek terapeutik kanker, uji live/dead dilakukan. PNIPAM-ppy-FA dan Dox@PNIPAM-ppy-FA (60 μg/mL) diberikan ke MDA-MB-231. Setelah 24 jam, MDA-MB-231 diekspos dengan atau tanpa iradiasi sinar laser NIR (5 W/cm², 5 min) dan diwarnai dengan calcein AM dan etidium homodimer-1. Setelah 30 menit, sel dicuci beberapa kali dengan DPBS. Citra live/diperoleh dengan menggunakan mikroskop fluoresensi terbalik (Olympus Ix73, Jepang).

Hasil dan Pembahasan

Sintesis dan Karakterisasi Nanokomposit PNIPAM-ppy Ter target Kanker Responsif NIR dan Thermo

Untuk pembentukan nanokomposit berbasis PNIPAM responsif termo, nanopartikel PNIPAM-AAc dibuat dengan metode polimerisasi radikal [15]. Untuk mengontrol LCST melalui iradiasi sinar laser NIR, ppy ditutupi dengan reaksi polimerisasi dalam PNIAPM-AAc yang telah disiapkan. PNIPAM-ppy-FA target kanker disintesis dengan mengonjugasi kimia FA-PEG-NH₂ pada grup karbohil dalam PNIPAM-AAc. Menurut citra TEM dalam Gambar 1a, morfologi, ukuran, dan dispersei PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, dan PNIPAM-ppy-FA diamati. PNIPAM-AAc yang telah disiapkan menunjukkan bentuk homogen dengan diameter rata-rata 274,32 ± 11,62 nm. Setelah dekorasi ppy, PNIPAM-ppy dan PNIPAM-ppy-FA menunjukkan ukuran serupa dengan 275,99 ± 11,41 dan 285,77 ± 17,92 nm. Ukuran PNIPAM-ppy-FA yang dimuat Dox meningkat sedikit dari 285,77 ± 17,92 menjadi 290,73 ± 12,28 nm, yang menunjukkan bahwa obat antikanker dimuat dalam nanokomposit PNIPAM-ppy-FA [26]. Menariknya, dibandingkan dengan PNIPAM-AAc, kehadiran ppy dalam nanokomposit PNIPAM-ppy-FA jelas ditunjukkan oleh titik hitam kecil. Selain itu, karena rantai PEG, nanokomposit PNIPAM-ppy-FA terdistribusi dengan baik dalam larutan air tanpa agregasi [27]. Diameter hidrodinamis rata-rata PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA, dan Dox@PNIPAM-ppy-FA diukur dengan analisis DLS (Berkas Tambahan 1: Gambar S1). Diameter PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA, dan Dox@PNIPAM-ppy-FA adalah 432, 450,7, 468,6, dan 486,7 nm, masing-masing. Karena metode analisis yang berbeda, diameter setiap nanokomposit lebih besar dari TEM, tetapi ukuran partikel dan distribusi nanokomposit PNIPAM-ppy-FA menunjukkan tren yang serupa.

Untuk menyelidiki pengaruh pty polimerisasi ke dalam PNIPAM-AAc, nilai LCST PNIPAM-AAc dan Dox@PNIPAM-ppy-FA diukur dengan suhu yang berbeda (Gambar 1b). Dibandingkan dengan pekerjaan kami sebelumnya [15], LCST Dox@PNIPAM-ppy-FA sedikit menurun dibandingkan dengan PNIPAM-AAc (42 °C). Perbedaan ini mungkin disebabkan oleh pengurangan grup karbohil dalam PNIPAM-AAc karena pty polimerisasi dan konjugasi ligand target kanker [28]. Selanjutnya, kami memantau perubahan ukuran partikel tergantung pada suhu dalam Gambar 1c. Untuk ini, diameter PNIPAM-AAc dan Dox@PNIPAM-ppy-FA diukur dalam rentang suhu dari 25 hingga 50 °C. Seiring bertambahnya suhu, PNIPAM-AAc menurun dari 436 menjadi 177 nm. Selain itu, ukuran Dox@PNIPAM-ppy-FA sangat berkurang dari 630 menjadi 420 nm, yang menunjukkan bahwa pty yang dihiasi dalam nanokomposit PNIPAM tidak sangat mempengaruhi aplikasi sistem pengiriman obat yang terkontrol dan responsif termo [27].

Nilai potensial zeta PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA, dan Dox@PNIPAM-ppy-FA menampilkan perubahan permukaan nanokomposit sebelum dan setelah modifikasi (Gambar 2a). Potensial zeta PNIPAM-AAc adalah −37,1 ± 1,61 mV karena grup karbohil dalam AAc [29]. Nilai PNIPAM-ppy dan PNIPAM-ppy-FA meningkat menjadi −29,6 ± 0,96 dan −15,6 ± 0,26 mV, yang menunjukkan bahwa pirrol bermuatan positif dan FA-PEG-NH₂ berhasil diperkenalkan dalam nanokomposit PNIPAM-ppy-FA [27]. Karena Dox bermuatan negatif, potensial zeta Dox@PNIPAM-ppy-FA berubah menjadi muatan negatif yang lebih banyak (−28,6 ± 0,23 mV). Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 2b, sintesis yang berhasil PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, dan PNIPAM-ppy-FA dikonfirmasi oleh spektroskopi FT-IR. Spektrum PNIPAM-AAc menunjukkan puncak getaran stretch C-N dan CH₂ antara 1100 dan 1200 cm⁻¹ dan puncak C=O, N–H, dan COOH diamati pada 1545, 1645, dan 1750 cm⁻¹, yang termasuk PNIPAM-AAc [15]. Pirrol dalam PNIPAM-ppy dan PNIPAM-ppy-FA menunjukkan puncak tambahan pada 935 dan 1050 cm⁻¹ yang diamati [30]. Dalam spektrum PNIPAM-ppy-FA, puncak getaran baru muncul pada 1107 dan 2880 cm⁻¹, yang disebabkan oleh C–O–C rantai PEG. Hasil ini menunjukkan konjugasi kimia yang berhasil FA-PEG-NH₂ [31]. Namun, ligand target FA tidak terdeteksi oleh FT-IR karena strukturnya mirip dengan PEG. Untuk mengonfirmasi kehadiran FA dalam nanokomposit PNIPAM, PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, dan PNIPAM-ppy-FA dilakukan dengan spektroskopi UV–Vis (Gambar 2c). Sementara spektrum PNIPAM-AAc dan PNIPAM-ppy (tanpa FA) tidak menunjukkan puncak serapan, PNIPAM-ppy-FA menunjukkan puncak tambahan pada 280 nm, yang khas untuk FA [32]. Hasil ini mendukung bahwa molekul FA diangkut pada nanokomposit berbasis PNIPAM.

Properti Fototermal Nanokomposit PNIPAM-ppy-FA melalui Iradiasi Sinar Laser NIR

Untuk menggunakan nanokomposit berbasis PNIPAM untuk terapi fototermal, properti optik nanokomposit PNIPAM-ppy-FA diperiksa dengan spektroskopi UV–Vis. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 2c, PNIPAM-AAc tidak menunjukkan serapan apa pun pada wilayah NIR (λ = 700–1000 nm). Namun, spektrum PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA, dan Dox@PNIPAM-ppy-FA jelas menunjukkan serapan kuat pada rentang yang sama karena nanopartikel pty yang polimerisasi. Hasil serapan ini menunjukkan bahwa nanokomposit PNIPAM-ppy-FA dapat mengubah cahaya NIR menjadi panas [26]. Selanjutnya, kami mengevaluasi properti fototermal nanokomposit PNIPAM-ppy-FA dengan iradiasi sinar laser NIR (Gambar 3). Untuk mengoptimalkan efek fototermal, PNIPAM-FA (tanpa pirrol), PNIPAM-ppy-5-FA (ppy 50 μL), dan PNIPAM-ppy-10-FA (ppy 100 μL) disiapkan pada konsentrasi yang sama (0,1 mg/mL) dan kemudian diekspos pada iradiasi sinar laser NIR 808 nm dengan kepadatan 2 W/cm² selama 20 menit (Gambar 3a). Suhu PNIPAM-ppy-10-FA meningkat hingga 14,5 °C, yang 2 kali lebih tinggi dari PNIPAM-ppy-5-FA. Sebagai kontrol, PNIPAM-FA tanpa ppy diiradiasi, tetapi suhu hanya meningkat sedikit (2,4 °C). Oleh karena itu, kami memilih PNIPAM-ppy-10-FA untuk menyelidiki eksperimen fototermal tambahan. Untuk mengamati perubahan suhu berdasarkan konsentrasi, sinar laser NIR diiradiasi ke PNIPAM-ppy-FA pada konsentrasi yang berbeda (0,05, 0,1, dan 0,2 mg/mL). Dalam Gambar 3b, tergantung pada konsentrasi, suhu meningkat hingga 10, 14,5, dan 18 °C, masing-masing. Selain itu, larutan PNIPAM-ppy-FA (0,1 mg/mL) diiradiasi dengan berbagai kepadatan daya laser (1–3 W/cm²) dalam Gambar 3c. Seperti yang diharapkan, kenaikan suhu nanokomposit sangat bergantung pada daya laser. Selanjutnya, kami mengamati stabilitas fototermal nanokomposit PNIPAM-ppy-FA dalam Gambar 3d. Meskipun iradiasi sinar laser NIR dilakukan berulang kali setidaknya 5 kali, suhu terus meningkat secara stabil hingga 33 °C, yang menunjukkan bahwa nanokomposit PNIPAM-ppy-FA adalah nanokarier yang cocok untuk terapi fototermal.

Pelepasan Obat Responsif NIR dan Termal dari Nanokomposit PNIPAM-ppy-FA

Untuk mengevaluasi profil pelepasan obat melalui respons NIR dan termal, kami menganalisis properti enkapsulasi dan pelepasan nanokomposit Dox@PNIPAM-ppy-FA. Awalnya, kami mengukur spektrum serapan UV–Vis nanokomposit yang dimuat obat dan puncak serapan kuat diamati di sekitar 480 nm (Gambar 2c). Hasil ini menunjukkan bahwa Dox berhasil dimuat dalam nanokomposit PNIPAM-ppy-FA. Efisiensi muatan Dox nanokomposit PNIPAM-ppy-FA dihitung sebesar 15% menggunakan kurva kalibrasi Dox (data tidak ditampilkan). Dalam Gambar 4a, profil pelepasan Dox dari PNIPAM-ppy-FA diteliti pada suhu yang berbeda. Kami mengamati perilaku pelepasan Dox selama 72 jam pada 25 °C, 37 °C, dan 50 °C dan pelepasan kumulatif Dox dari PNIPAM-ppy-FA adalah 15%, 42%, dan 67%, masing-masing. Karena LCST PNIPAM-ppy-FA menurun sedikit menjadi 42 °C, pelepasan kumulatif pada suhu tubuh ditemukan relatif lebih tinggi dari suhu kamar. Jumlah besar Dox dilepaskan, namun Dox yang dilepaskan tidak mempengaruhi efisiensi terapeutik, karena nanokomposit Dox@PNIPAM-ppy-FA dapat diinternalisasi hanya pada sel yang positif reseptor folat, seperti yang telah dijelaskan sebelumnya [26, 32]. Di atas LCST (50 °C), jumlah Dox dari nanokomposit PNIAPM-ppy-FA dilepaskan empat kali lebih tinggi dari suhu kamar, yang menunjukkan bahwa nanokomposit PNIPAM-ppy-FA dapat digunakan dalam sistem pelepasan obat yang terkontrol melalui respons termal. Selain itu, kami menyelidiki perilaku pelepasan yang dipicu oleh cahaya NIR nanokomposit PNIPAM-ppy-FA dalam Gambar 4b. Larutan Dox@PNIAPM-ppy-FA (1 mg/mL) diekspos pada sinar laser NIR (3 W/cm²) selama 10 menit dan operasi ini diulang setiap 1 jam. Selama 6 jam, jumlah total Dox melalui iradiasi sinar laser NIR mencapai 35%, sedangkan profil pelepasan Dox tanpa iradiasi sinar laser NIR menunjukkan sekitar 5% dan 15% (25 °C dan 37 °C). Hasil ini menunjukkan bahwa iradiasi sinar laser NIR menghasilkan suhu yang lebih tinggi dari LCST nanokomposit dan menginduksi pelepasan Dox dari nanokomposit PNIPAM-ppy-FA.

Analisis Sistotoksisitas dan Pengambilan Seluler Nanokomposit PNIPAM-ppy-FA

Menurut literatur, sistotoksisitas nanokomposit PNIPAM-ppy-FA diselidiki terhadap sel kanker paru dan payudara (Berkas Tambahan 1: Gambar S2) [33, 34]. Terlepas dari konsentrasi sampel, setelah inkubasi dengan PNIPAM-ppy-FA selama 24 jam, kelangsungan kedua sel diamati (> 85%). Oleh karena itu, nanokomposit PNIPAM-ppy-FA kami tidak menunjukkan sistemtoksisitas sebagai nanokarier untuk aplikasi pengiriman obat [35, 36]. Untuk menyelidiki apakah PNIPAM-ppy-FA dapat secara selektif mengirimkan ke sel kanker, kami memeriksa sinyal fluoresensi nanokomposit PNIPAM-ppy-FA seluler menggunakan mikroskop skanning laser konfokal (Berkas Tambahan 1: Gambar S3). Perilaku pengambilan seluler PNIPAM-ppy-FA dan Dox@PNIPAM-ppy-FA dievaluasi pada sel garis sel negatif reseptor folat (A549) dan positif (MDA-MB-231) [37]. Setelah inkubasi sel kanker payudara MDA-MB-231 dengan Dox@PNIPAM-ppy-FA, fluoresensi merah kuat diamati, yang menunjukkan bahwa Dox@PNIAPM-ppy-FA diinternalisasi ke dalam lisosom sel MDA-MB-231. Di sisi lain, ketika PNIPAM-ppy-FA dan Dox@PNIPAM-ppy-FA diberikan pada sel A549, sinyal Dox tidak diamati. Citra konfokal ini menunjukkan bahwa nanokomposit PNIAPM-ppy-FA dapat secara selektif diinternalisasi ke dalam sel kanker yang overexpresi reseptor folat melalui jalur endositosis yang dimediatkan oleh reseptor seperti yang telah dijelaskan sebelumnya [38, 39].

Efek Antikanker Kemio-Fototermal Nanokomposit PNIPAM-ppy-FA Responsif NIR dan Thermo

Untuk mengonfirmasi efektivitas terapi kombinasi in vitro nanokomposit PNIPAM-ppy-FA, nanokomposit PNIPAM-ppy-FA dievaluasi pada sel MDA-MB-231 dengan atau tanpa iradiasi sinar laser NIR dan kelangsungan sel dievaluasi dengan uji MTT dalam Gambar 5a. Untuk terapi fototermal, sel kanker payudara MDA-MB-231 dengan PNIPAM-ppy-FA diinkubasi selama 12 jam dan kemudian diekspos pada sinar laser NIR (5 W/cm², 5 menit). Kelangsungan sel kanker payudara MDA-MB-231 menurun menjadi 70–90% tergantung pada konsentrasi PNIPAM-ppy-FA. Untuk mengonfirmasi efek kemoterapi saja, nanokomposit PNIPAM-ppy-FA yang dimuat Dox diberikan. Kami mengamati bahwa kelangsungan menurun menjadi 50% karena pelepasan Dox dari nanokomposit, yang sesuai dengan profil pelepasan dalam Gambar 4. Menariknya, setelah iradiasi sinar laser NIR pada sel MDA-MB-231 dengan nanokomposit Dox@PNIPAM-ppy-FA, kelangsungan sel secara dramatis menurun hingga 24%, yang lebih tinggi dari kelompok kontrol (PNIPAM-ppy-FA dengan iradiasi sinar laser NIR, Dox@PNIPAM-ppy-FA tanpa iradiasi sinar laser NIR). Hasil ini menunjukkan efek sinergi optimal dari terapi kombinasi kemio-fototermal yang dimediatkan oleh iradiasi sinar laser NIR. Selain itu, untuk mengamati secara langsung efisiensi terapeutik dalam sel kanker, uji live/dead dilakukan dalam Gambar 5b. Sebagai kelompok kontrol, kami mengamati kelangsungan hanya sel MDA-MB-231 dengan atau tanpa iradiasi sinar laser NIR (5 W/cm², 5 min) dan sebagian besar sel menunjukkan fluoresensi hijau (sel hidup). Ini menunjukkan bahwa iradiasi sinar laser NIR tidak secara jelas mempengaruhi kelangsungan sel. Selain itu, sel MDA-MB-231 dengan PNIPAM-ppy-FA di bawah iradiasi sinar laser NIR menunjukkan beberapa fluoresensi merah (sel mati), yang menunjukkan efek terapi fototermal yang disebabkan oleh nanokomposit PNIPAM-ppy-FA. Meskipun tidak ada iradiasi sinar laser NIR pada sel MDA-MB-231 dengan Dox@PNIPAM-ppy-FA, beberapa fluoresensi merah berseliweran diamati, yang menunjukkan kemoterapi. Terlepas dari itu, ketika sel MDA-MB-231 dirawat dengan nanokomposit dan iradiasi sinar laser NIR, sebagian besar sel kanker menunjukkan beberapa fluoresensi merah [39, 40]. Hasil ini mendukung efek terapeutik sinergis terapi kemio-fototermal melalui iradiasi sinar laser NIR dan nanokomposit Dox@PNIPAM-ppy-FA responsif termo.

Kesimpulan

Kami telah berhasil membangun nanokomposit PNIPAM-ppy-FA target kanker responsif NIR dan termo untuk terapi kombinasi kemio-fototermal. Untuk menginduksi pelepasan yang terkontrol dan efek fototermal melalui iradiasi sinar laser NIR 808 nm, nanopartikel pty secara seragam dihiasi pada PNIPAM-AAc dengan metode polimerisasi. PNIPAM-ppy-FA yang dimuat Dox menunjukkan efek fototermal dan stabilitas foto yang signifikan. Selain itu, Dox@PNIPAM-ppy-FA menunjukkan properti transisi termosensitif yang baik pada kondisi yang berbeda dan pelepasan obat dari nanokomposit PNIPAM-ppy-FA dapat dikontrol oleh cahaya NIR dan respons termo. Studi in vitro memverifikasi bahwa nanokomposit PNIPAM-ppy-FA menunjukkan kompatibilitas biologis yang baik dan efektivitas terapeutik yang ditingkatkan terhadap sel kanker payudara. Efektivitas terapeutik antikanker yang ditingkatkan melalui nanokomposit ini berkontribusi pada alasan berikut: (1) pengambilan seluler spesifik nanokomposit melalui endositosis yang dimediatkan oleh reseptor folat, (2) pelepasan Dox yang terakumulasi dari PNIPAM-ppy-FA melalui NIR dan respons termo, dan (3) efek terapeutik sinergis oleh kombinasi kemio-fototermal. Oleh karena itu, nanokomposit PNIPAM-ppy-FA kami dapat berpotensi digunakan sebagai nanokarier multifungsi untuk pendekatan terapeutik sinergis terhadap berbagai jenis kanker dengan efek samping yang lebih kecil.

Ketersediaan data dan bahan

Data dan analisis dalam pekerjaan saat ini tersedia dari penulis tanggung jawab atas permintaan yang wajar.

Singkatan

PTT:

Terapi fototermal

NIR:

Inframerah dekat

FA:

Asam folat

FA-PEG-NH₂ :

FA-PEG amine

LCST:

Suhu kritis solusi rendah

PNIPAM:

Poli(N-isopropilakrilamida)

ppy:

Pirrol

TEM:

Mikroskop transmisi

UV–Vis:

Spektroskopi Ultraviolet–Visible