Nanopartikel Teranostik Foto-Kemo Targeting Tumor Tinggi Efisiensi: Albumin Serum Manusia Termuat Artesunate dan Terkonjugasi ICG

Abstrak

Kami melaporkan platform teranostik spesifik tumor yang menggabungkan empat agen yang disetujui klinis—artesunate (Arte), albumin serum manusia (HSA), asam folat (FA), dan indosianin hijau (ICG)—ke dalam satu nanopartikel (FA-IHA NPs). Nanopartikel ini menunjukkan stabilitas foto- dan fisikokimia yang luar biasa. ICG memberikan fluoresensi inframerah dekat (NIR) untuk citra dan memberikan kemampuan terapi fototermal (PTT) dan fotodinamis (PDT) di bawah satu laser 808 nm. Secara bersamaan, radiasi 808 nm memicu peluncuran Arte yang terkontrol, yang memperkuat efikasi kemoterapeutik. Studi in vitro dan in vivo menunjukkan penyerapan sel yang cepat dan akumulasi selektif tumor, yang diverifikasi oleh mikroskopi konfokal dan citra NIR pada tikus xenograft HepG2. Sesi radiasi NIR tunggal (808 nm, 1 W/cm²) yang digabungkan dengan FA-IHA NPs sepenuhnya menekan pertumbuhan tumor tanpa rekursi. Temuan ini menetapkan FA-IHA NPs sebagai platform yang menjanjikan untuk translasi klinis terapi foto-kemo yang dipandu citra.

Latar Belakang

Terapi foto-kemo yang dipandu citra (IGPC) telah muncul sebagai strategi yang menarik untuk onkologi personal, yang menikmati lokalisasi tumor yang tepat dengan perawatan multimodal sambil meminimalkan kerusakan kolateral (1–4). Platform IGPC yang berhasil harus: (i) multifungsi, mengintegrasikan modalitas diagnostik dan terapeutik; (ii) kompatibel biologis, stabil, dan selektif terhadap tumor (5–8). Citra fluoresensi, karena sensitivitas tinggi dan resolusi waktu yang menguntungkan, umum digunakan untuk panduan real-time (9–16).

Terapi fototermal (PTT) dan terapi fotodinamis (PDT) dapat disatukan di bawah radiasi NIR, yang menghantar kalor dan spesies reaktif oksigen (ROS) untuk mengablasi sel tumor (17–19). Namun, monoterapi sering kali gagal melenyapkan sisa penyakit, yang mengarah pada rekursi (17–19). Kemoterapi konvensional menawarkan sitotoksisitas sistemik tetapi menderita non-spesifik dan toksisitas yang terkait (20–22). Dengan demikian, IGPC, yang menggabungkan terapi foto terlokal dengan kemoterapi yang ditargetkan, menjanjikan untuk mengatasi keterbatasan ini.

Nanomedisin telah menghasilkan berbagai IGPC teranostik, termasuk indosianin hijau (ICG), nanopartikel berbasis logam, nanomaterial karbon, dan sistem polimerik (23–27). ICG, pigmen NIR yang disetujui FDA, banyak digunakan klinis untuk output jantung, fungsi hati, dan angiografi oftalmologi (28–29). Serapannya yang kuat pada 800 nm memfasilitasi PTT-PDT yang efisien. Namun, ICG bebas tidak stabil, dengan cepat menghilang dari sirkulasi, meludah diri, dan tidak memiliki spesifik tumor (31–32). Enkapsulasi dalam pengemasan seperti misel, polimer, atau nanostruktur protein telah meningkatkan performanya, namun kebutuhan akan komposit berbasis ICG yang lebih kompatibel biologis dan ditargetkan masih ada (33–34).

Di sini, kami merancang agen IGPC target tumor dengan menghubungkan kovalen FA dan ICG ke nanopartikel HSA, sekaligus mengenkapsulasi Arte—senyawa antimalaria alami dengan aktivitas antikanker yang terbukti terhadap kanker hati, paru, dan payudara (35). Konstruksi FA-IHA NPs yang dihasilkan memanfaatkan penyerapan reseptor yang diarus oleh FA, kompatibilitas biologis yang baik HSA, dan daya dukungan terapeutik ganda ICG dan Arte. Konstruksi multifungsi ini menawarkan citra NIR, PTT-PDT, dan pengiriman obat kontol, yang memosisikannya sebagai platform serbaguna untuk translasi klinis.

Metode

Bahan

Reagen meliputi EDC, NHS, dan Arte (≥ 99%) dari Sigma-Aldrich; DAPI dan CCK-8 dari Aladdin; NH₂-PEG₂₀₀₀-COOH dan NH₂-PEG₂₀₀₀-FA dari Xi’an Ruixi; DMEM dan PBS dari Gibco; ICG-NHS dari Dojindo. Semua bahan kimia digunakan sebagaimana adanya.

Sintesis dan Karakterisasi FA-IHA NPs

Arte dilarutkan dalam DMSO, kemudian ditambahkan ke 15 mL air. HSA (10 mg) diperkenalkan dan diaduk selama 3 jam pada suhu ruang, diikuti oleh silang-pengikat dengan 150 µL gluteraldehida 0,5%. Campuran didialisis terhadap air destilasi (MWCO 8–12 kDa) selama 24 jam untuk menghasilkan Arte-HSA yang termuat Arte. Aktivasi grup karboksil HSA dengan EDC/NHS diikuti oleh konjugasi dengan NH₂-PEG₂₀₀₀-FA (3 jam, 4 °C) dan kemudian penempelan ICG-NHS (30 menit, suhu ruang). Final FA-ICG-HSA@Arte (FA-IHA NPs) difurnirkan oleh dialisis 24 jam dalam air deionisasi. Efisiensi pemuatan Arte dan ICG diukur oleh spektroskopi UV-vis (pemuatan % = W₁/W₂ × 100%).

Morfologi dievaluasi oleh TEM (Hitachi). Ukuran hidrodinamis dan potensi zeta diukur oleh DLS (Malvern Zetasizer). Spektra absorpsi direkam pada spektrofotometer UV-vis Shimadzu. Respons fototermal diukur menggunakan laser CW 808 nm (1 W/cm²) dengan suhu dipantau oleh termokopel Fluke. Stabilitas foto dan kelanggan fluoresensi dievaluasi selama 5 siklus dan 30 hari, masing-masing.

Peluncuran Arte yang Dipicu oleh Suhu dan pH

FA-IHA NPs (50 µg/mL) diinkubasi pada pH 6,5, pH 7,4, dan pH 6,5 + NIR (808 nm, 1 W/cm², pulsa 1 menit) selama 36 jam. Peluncuran Arte diukur oleh UV-vis pada 287 nm dalam sobrenatan.

Deteksi Produksi Oksigen Tunggal

DPBF (15 µL) dicampur dengan 1 mL ICG atau FA-IHA NPs 10 µg/mL dan diiradiasi (808 nm, 1 W/cm², 5 menit). Penurunan absorbansi pada 410 nm seiring waktu mencerminkan generasi oksigen tunggal.

Budidaya Sel dan Penyerapan Selular

Sel HepG2 (ATCC) dibudidayakan dalam DMEM dengan 10% FBS, 1% penstrepstreptomisin pada 37 °C, 5% CO₂. Untuk studi penyerapan, sel diinkubasi dengan ICG bebas, IHA NPs, atau FA-IHA NPs (0,05 mg/mL ICG) selama 6 jam, dicuci, diwarnai, diwarnai DAPI, dan diimajing oleh mikroskopi konfokal. Sitometri alir mengukur tingkat internalisasi.

Generasi ROS Intrakelular

Sel HepG2 (2 × 10⁵ sel/mL) diobati dengan PBS, Arte, FA-HA-NPs, ICG bebas, IHA-NPs, atau FA-IHA NPs selama 12 jam, kemudian diiradiasi (808 nm, 1 W/cm², 5 menit). DCFH-DA (5 µg/mL) ditambahkan selama 30 menit, diikuti sitometri alir dan mikroskopi fluoresensi untuk menilai tingkat ROS.

Terapi Foto-Kemo Kombinasi Tumor In Vitro

Sel HepG2 (2 × 10⁴ sel/well) diobati dengan ICG bebas, Arte, IHA NPs, atau FA-IHA NPs (Arte 0–30 µg/mL) selama 6 jam, kemudian diiradiasi (808 nm, 1 W/cm², 5 menit) atau dibiarkan tidak diobati. Keberadaan sel diukur oleh CCK-8 setelah 24 jam. Pewarnaan hidup/mati (calcein-AM/PI) mengonfirmasi sitotoksisitas melalui citra konfokal.

Model Hewan dan Citra Fluoresensi In Vivo

Tikus Balb/c nude (n=5) diinjeksikan subkutan dengan 1 × 10⁶ sel HepG2. Citra IVIS Spectrum (Caliper) melacak fluoresensi NIR pada 10 menit, 6 jam, 12 jam, 24 jam, dan 48 jam setelah injeksi vena ekor ICG bebas, IHA NPs, atau FA-IHA NPs.

Terapi Foto-Kemo Kombinasi Tumor In Vivo

Tikus diacak menjadi enam grup (n=5): PBS, Arte, FA-IHA NPs, ICG + NIR, IHA + NIR, FA-IHA + NIR (dosis Arte sama). Radiasi NIR (808 nm, 1 W/cm², 5 menit) diterapkan pada hari 0 dan hari 2. Volume tumor dicatat setiap 4 hari dan diekspresikan relatif terhadap basis. Setelah perawatan, organ utama diambil untuk histologi H&E.

Hasil dan Pembahasan

Sintesis dan Karakterisasi FA-IHA NPs

Gambar 1 secara skematik menggambarkan desain dan alur kerja terapeutik FA-IHA NPs. Nanopartikel dirakit melalui metode sederhana dan kompatibel biologis, mengintegrasikan ICG untuk citra dan terapi foto NIR, dan Arte untuk aksi kemoterapeutik.

Mikroskopi elektron transmisi mengungkapkan partikel bola monodispers (~131,2 nm). Pencitraan cahaya dinamis mengonfirmasi diameter hidrodinamis 131 ± 2,3 nm di seluruh air, PBS, dan medium sel, dengan potensi zeta yang stabil –29,2 ± 1,13 mV. Ukuran tetap tidak berubah selama 7 hari, yang menunjukkan stabilitas koloidal yang kuat yang diberikan oleh lapisan PEG dan HSA. Spektra UV-vis menampilkan puncak khas Arte dan ICG, mengonfirmasi pemuatan yang berhasil (Arte 98,6 ± 3,1 %, ICG 56,9 ± 2,4 %). Spektra fluoresensi cocok dengan ICG bebas, mengonfirmasi properti fotofisik yang terpelihara.

Evaluasi fototermal menunjukkan bahwa FA-IHA NPs (konten ICG sama) meningkatkan suhu sekitar 36 °C dalam 5 menit di bawah radiasi 808 nm (1 W/cm²), sementara ICG bebas menunjukkan kenaikan yang sama dan air hampir tidak meningkat (<4 °C). Uji stabilitas foto menunjukkan bahwa FA-IHA NPs mempertahankan absorbansi selama lima siklus radiasi, sedangkan ICG bebas kehilangan intensitas, yang menekankan efek pelindung dari konjugasi kovalen dan enkapsulasi HSA/PEG. Kelanggan fluoresensi selama 30 hari pada 4 °C menunjukkan penurunan 28 % untuk FA-IHA NPs versus penurunan 88 % untuk ICG bebas, yang menunjukkan stabilitas foto yang lebih baik.

Uji DPBF menunjukkan bahwa FA-IHA NPs menghasilkan 58 % hasil oksigen tunggal standar dalam 5 menit paparan NIR, melebihi ICG bebas (35 %). Peningkatan ini mencerminkan efek sinergi dari duoterapi foto.

Di bawah kondisi asam (pH 6,5) dan radiasi NIR, peluncuran Arte dari FA-IHA NPs meningkat dari 11,6 % (pH 7,4) menjadi 68,4 % (pH 6,5 + NIR). Dua pemicu—expansi termal HSA dan perubahan muatan permukaan yang diarus oleh proton—memfasilitasi peluncuran obat yang terkontrol (37–38).

Penyerapan Sel dan Deteksi ROS Intrakelular

Citra konfokal mengungkapkan fluoresensi ICG merah yang mencolok dalam sel HepG2 yang diobati dengan FA-IHA NPs, melebihi ICG bebas dan IHA NPs. Sitometri alir mengukur tingkat penyerapan 52,3 % untuk FA-IHA NPs, jauh lebih tinggi daripada IHA NPs (25,2 %) dan ICG bebas (3,9 %)—indikasi jelas dari penargetan reseptor yang diarus oleh FA (39–41).

Produksi ROS, yang dievaluasi dengan DCFH-DA, secara signifikan lebih tinggi dalam sel yang diobati FA-IHA NPs setelah 5 menit radiasi NIR dibandingkan semua grup lain, mengonfirmasi aktivitas fotodinamis yang ditingkatkan (Gambar 6a,b).

Terapi Foto-Kemo Kombinasi Tumor In Vitro

FA-IHA NPs mencapai kenaikan suhu tertinggi (~31 °C) di antara semua perawatan setelah 5 menit paparan NIR, yang berkaitan dengan performa fototermal yang superior (Gambar 7a). Tanpa radiasi, Arte, IHA NPs, dan FA-IHA NPs menunjukkan sitotoksisitas bergantung konsentrasi, sedangkan ICG bebas tidak aktif. Setelah radiasi, keberadaan sel menurun secara dramatis dalam grup FA-IHA NPs, yang dikaitkan dengan efek sinergi chemo-fototermal. Pewarnaan ganda calcein-AM/PI mengonfirmasi kematian sel yang hampir lengkap dalam FA-IHA NPs + NIR, sedangkan grup lain masih mempertahankan sel hidup (Gambar 7d).

Citra Fluoresensi In Vivo

Citra IVIS mengungkapkan fluoresensi seluruh tubuh yang kuat dalam 10 menit setelah injeksi semua formulasi. Fluoresensi tumor mencapai puncak pada 24 jam, dengan FA-IHA NPs menunjukkan sinyal tertinggi pada setiap titik waktu, yang mengonfirmasi akumulasi tumor yang diarus oleh FA (Gambar 8b). Analisis organ ex vivo pada 24 jam menunjukkan penyerapan hati yang dominan di semua grup, yang konsisten dengan jalur pembersihan hati (Gambar 8c).

Terapi Foto-Kemo Kombinasi Tumor In Vivo

Citra termal pada 24 jam setelah injeksi di bawah radiasi NIR menunjukkan kenaikan suhu terbesar (~22,1 °C) untuk FA-IHA NPs, yang mengonfirmasi konversi fototermal yang potente (Gambar 9a,b). Dua sesi radiasi (hari 0 dan hari 2) mengarah pada regresi tumor lengkap dalam grup FA-IHA + NIR, tanpa rekursi selama 90 hari dan tingkat kelangsungan hidup 100 %, sedangkan semua grup lain gagal mencapai penekanan yang berkelanjutan (Gambar 9c,d). Pemeriksaan histologis tidak menunjukkan patologi organ yang signifikan dalam grup FA-IHA + NIR, yang menekankan toksisitas sistemik yang dapat diabaikan (Gambar 10).

Kesimpulan

Kami telah merancang nanopartikel teranostik multifungsi yang secara kovalen menghubungkan FA dan ICG sambil mengenkapsulasi Arte dalam HSA. FA-IHA NPs menunjukkan stabilitas koloidal dan fototermal yang kuat, mempertahankan fluoresensi NIR, dan melepaskan Arte pada radiasi NIR. Penargetan reseptor yang diarus oleh FA menghasilkan penyerapan selular yang tinggi dan akumulasi tumor, yang memungkinkan seranggan sinergi fototermal-fotodinamis-kemoterapeutik yang melenyapkan tumor in vitro dan in vivo tanpa rekursi. Hasil ini memosisikan FA-IHA NPs sebagai platform yang sangat menjanjikan untuk translasi klinis terapi foto-kemo yang dipandu citra dan ditargetkan tumor.

Singkatan

Arte:

Artesunate

FA:

Asam folat

HSA:

Albumin serum manusia

ICG:

Indosianin hijau

NIR:

Inframerah dekat

PDT:

Terapi fotodinamis

PEG:

Polietilena glikol

PTT:

Terapi fototermal