Grafena Oksida dalam Komposit dengan Nanopartikel Perak Mengurangi Sitotoksisitas Fibroblas dan Sel Endotel dari Nanoplatform Antibakteri
Abstrak
Permukaan antibakteri yang dilapisi dengan bahan nano, termasuk nanopartikel perak, dianggap sebagai agen antimikroba alternatif yang efektif yang dapat digunakan sebagai pengganti antibiotik dan bahan kimia. Namun, laporan potensi toksisitas bahan ini menimbulkan pertanyaan tentang keamanan penggunaannya dalam aplikasi biomedis. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengurangi sitotoksisitas sel manusia dari foil poliuretan berlapis nanopartikel perak dengan mengomplekskan nanopartikel perak dengan graphene oxide. Aktivitas antimikroba dari nanoplatform yang dilapisi dengan nanopartikel perak, graphene oxide dan komposit nanopartikel perak dan graphene oxide dinilai dengan Salmonella enteritidis . Sitotoksisitas dianalisis dengan analisis viabilitas dan morfologi fibroblas manusia, sel endotel vena umbilikalis manusia (HUVECs) dan membran korioallantoik embrio ayam. Selain itu, tingkat sintesis protein inflamasi diperiksa untuk fibroblas yang dikultur pada nanoplatform yang berbeda. Nanoplatform yang dilapisi dengan nanopartikel perak dan komposit graphene oxide menunjukkan sifat antibakteri terkuat, meskipun nanoplatform yang dilapisi hanya dengan nanopartikel perak atau graphene oxide juga menghasilkan penurunan S. enteritidis pertumbuhan. Lebih lanjut, nanoplatform yang dilapisi dengan nanopartikel perak dan komposit graphene oxide menunjukkan stimulasi imunologis yang terbatas dan secara signifikan mengurangi sitotoksisitas terhadap fibroblas, HUVECs dan membran korioallantoik embrio ayam dibandingkan dengan nanoplatform yang hanya dilapisi dengan nanopartikel perak, karena stabilitas yang lebih tinggi dari nanomaterial dalam nanokomposit.
Pengantar
Bahan dengan permukaan antibakteri telah banyak dieksplorasi untuk digunakan dalam pengobatan dan industri biomedis [1]. Nanomaterial dianggap sebagai agen antimikroba alternatif yang efektif yang dapat digunakan sebagai pengganti antibiotik dan agen kimia [2]. Nanopartikel perak (AgNPs) paling sering digunakan karena sifat antibakterinya [3]. Namun, nanopartikel yang menunjukkan aktivitas antimikroba, termasuk AgNPs, terutama pada konsentrasi yang lebih tinggi, dapat menjadi racun bagi sel manusia dan mungkin mempengaruhi kesehatan manusia [4, 5]. Oleh karena itu, dalam industri biomedis, aplikasi material dengan permukaan yang dilapisi material nano menimbulkan pertanyaan tentang keamanan dan toksisitasnya.
Salah satu cara yang mungkin untuk meminimalkan potensi toksisitas bahan nano adalah dengan membatasi mobilitasnya tanpa mengubah sifat antimikrobanya. Bahan nano yang melekat kuat yang digunakan pada permukaan antibakteri yang tidak terlepas dari bahan mengurangi toksisitasnya bagi sel manusia [6]. Salah satu metode pelapisan permukaan yang efektif dengan nanopartikel adalah teknologi ultrasonik [7]. Gelombang ultrasonik menyebabkan perubahan struktural pada nanomaterial, mengakibatkan deagglomeration atau aglomerasi, tergantung pada nanomaterial [8]. Teknologi ultrasonik juga dapat digunakan untuk sintesis nanokomposit dari bahan yang berbeda, termasuk ion logam dan nanopartikel [9,10,11]. Sonikasi telah digunakan untuk perakitan berbagai nanomaterial, termasuk dekorasi serpihan graphene oxide (GO) dengan AgNPs dan nanopartikel lainnya [12].
Mekanisme aktivitas antibakteri nanopartikel bervariasi antara berbagai jenis nanopartikel; namun, proses utama yang bertanggung jawab atas sifat antimikroba nanopartikel adalah sebagai berikut:interaksi langsung dengan komponen sel dan proses tidak langsung termasuk oksidasi komponen sel dan gangguan proses oksidoreduktif [3]. Aktivitas antibakteri AgNP dihasilkan dari gangguan langsung membran sel bakteri oleh AgNPs dan pelepasan ion Ag+, menginduksi sintesis spesies oksigen reaktif (ROS), dan runtuhnya potensial membran plasma, yang menyebabkan penipisan ATP intraseluler. ,14,15]. GO dapat menjadi sitotoksik bagi sel bakteri karena sintesis ROS dan imobilisasi sel langsung pada permukaan GO [16, 17], yang disebabkan oleh kapasitas adsorpsi yang tinggi dari nanokomposit GO dan GO [18, 19].
Namun, toksisitas nanopartikel tidak hanya diamati pada sel bakteri. Umumnya, sel manusia kurang rentan terhadap nanopartikel daripada bakteri karena skalanya yang lebih besar, dan mekanisme perbaikan dan pertahanannya yang efektif, tetapi sitotoksisitas telah diamati, terutama pada konsentrasi tinggi. Toksisitas AgNP dalam studi in vitro terjadi pada konsentrasi dengan urutan yang sama, meskipun mereka dapat bervariasi secara substansial untuk sistem biologis atau organisme yang berbeda yang lebih kompleks [20]. Toksisitas AgNPs untuk organisme multiseluler seringkali lebih rendah karena perbedaan struktural dan fisiologisnya, seperti jaringan seluler khusus, termasuk sel epitel [21]. Biokompatibilitas GO untuk sel manusia tergantung pada konsentrasi dan morfologi lembaran. Pada konsentrasi yang lebih tinggi, GO dapat menyebabkan penetrasi membran plasma dan peningkatan sintesis ROS [22,23,24].
Dalam penelitian kami sebelumnya, kami menunjukkan bahwa nanoplatform yang terdiri dari nanokomposit AgNP dan GO (Ag-GO) memiliki efisiensi antimikroba yang tinggi terhadap bakteri (Escherichia coli , Staphylococcus aureus dan Staphylococcus epidermidis ) dan ragi patogen (Candida albicans ), yang terkait dengan peningkatan sintesis ROS dan perforasi membran plasma [25]. Ag-GO menunjukkan aktivitas antibakteri yang lebih tinggi daripada nanoplatform AgNP atau GO, karena aktivitas gabungan dari kedua bahan nano. Di sini, kami berhipotesis bahwa foil poliuretan yang dilapisi dengan nanokomposit Ag-GO akan memiliki toksisitas yang lebih rendah terhadap fibroblas, sel endotel vena umbilikalis manusia (HUVECs) dan model in vivo alternatif—membran korioallantoik embrio ayam—daripada foil yang hanya dilapisi dengan AgNP.
Hasil
AgNPs dan GO Membentuk Nanokomposit dalam Hidrokoloid
Analisis mikroskop elektron transmisi (TEM) digunakan untuk mengevaluasi morfologi nanomaterial dan interaksinya dalam komposit Ag-GO (Gbr. 1). AgNPs adalah nanopartikel bulat yang memiliki ukuran rata-rata sekitar 55 nm. Selain itu, gambar TEM menunjukkan adhesi nanopartikel perak ke GO (Gbr. 1e). Pengamatan ini di mana dikonfirmasi lebih lanjut dalam analisis potensi zeta. Potensi zeta Ag-GO menunjukkan bahwa hidrokoloid tidak stabil segera setelah sonikasi, tetapi stabil setelah 24 h (potensi zeta:15.68 dan 27.7 mV, masing-masing; Tabel 1). Sebaliknya, hidrokoloid AgNP tidak stabil baik segera setelah sonikasi dan setelah 24 jam, sedangkan hidrokoloid GO cukup stabil dan tidak berubah secara signifikan setelah 24 jam (potensi zeta:31.11 mV dan 28.42 mV, masing-masing). Selain itu, analisis hamburan cahaya dinamis (DLS) menunjukkan bahwa Z -ukuran rata-rata AgNP adalah 93.1 nm, GO adalah 1485.0 nm dan Ag-GO adalah 1157.0 nm. Distribusi ukuran AgNP menunjukkan tiga puncak yang terkait dengan pembentukan aglomerat, sedangkan distribusi ukuran GO dan Ag-GO menunjukkan satu puncak (Gbr. 1b, d, f).
Morfologi nanopartikel dan distribusi ukuran. Gambar mikroskop elektron transmisi a nanopartikel perak, c grafena oksida dan e nanopartikel perak dan komposit graphene oxide. Distribusi ukuran b nanopartikel perak, d grafena oksida dan f nanopartikel perak dan komposit oksida graphene
Spektrum Raman dan spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FT-IR) digunakan untuk mengkarakterisasi fitur struktural GO (Gbr. 2). Gambar 2a menunjukkan dekonvolusi D, G, dan D’ GO. Posisi pita D adalah 1347 cm
− 1
dan pita G 1578 cm
− 1
; rasio ID/IG adalah 1,34. Analisis FT-IR mengungkapkan puncak lebar yang diamati pada ~ 3500 cm
− 1
, yang ditugaskan terutama untuk air dan gugus hidroksil. Puncaknya sekitar 1600 cm
− 1
ditugaskan untuk ikatan C=C yang ada dalam karbon grafit. Puncak lain yang diamati pada spektrum FT-IR menunjukkan bahwa GO kaya akan gugus yang mengandung ikatan C=O (terutama gugus karboksil), puncaknya sekitar 1720 cm
− 1
dan 915 cm
− 1
, epoksi (C–O–C) dengan puncak yang terlihat sekitar 1200 cm
− 1
, dan ikatan C–H (puncaknya sekitar 2800 cm
− 1
).
Analisis fitur struktural oksida graphene. a Spektrum Raman dari graphene oxide dengan dekonvolusi yang diusulkan dari D, G dan D’. b Spektroskopi inframerah transformasi Fourier (ATR, reflektansi total yang dilemahkan) spektrum grafena oksida dengan penetapan gugus fungsi
AgNP-, GO- dan Ag-GO-Coated Foil Berkurang Salmonella enteritidis Pertumbuhan
Aktivitas antibakteri dari nanoplatform GO, AgNP dan Ag-GO diuji dengan S. enteritidis . Inkubasi bakteri pada foil yang dilapisi dengan nanomaterial pada 37 °C selama 24 jam mengakibatkan penurunan pertumbuhan (Gbr. 3). S terkuat. enteritidis penghambatan pertumbuhan diamati pada nanoplatform Ag-GO. Namun, baik nanoplatform AgNP dan GO juga mengakibatkan penurunan S. enteritidis pertumbuhan. Perbandingan gambar mikroskop elektron (SEM) dari bakteri yang diinkubasi pada platform nano Ag-GO dengan kelompok kontrol menunjukkan penurunan jumlah S. enteritidis sel. Selain itu, bakteri melekat pada nanoplatform dan menunjukkan perubahan morfologis, yang menunjukkan adanya gangguan pada membran sel mereka.
Nanoplatform yang dilapisi dengan nanopartikel perak dan graphene oxide menurunkan viabilitas S. enteritidis. Memindai gambar mikroskop elektron a kontrol S. enteritidis bakteri dan bS. enteritidis diinkubasi pada nanoplatform perak berlapis nanopartikel dan graphene oxide, setelah inkubasi pada 37 °C selama 24 h. c Kelangsungan hidup S. enteritidis setelah inkubasi pada nanoplatform selama 24 jam dinilai dengan uji PrestoBlue. Nilai dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi (n = 3, setiap percobaan dalam rangkap tiga). Signifikansi statistik ditunjukkan oleh superskrip yang berbeda (ANOVA satu arah; P < 0,05). Singkatan:C, grup kontrol (foil tanpa nanopartikel); AgNPs, nanoplatform dilapisi dengan nanopartikel perak; GO, nanoplatform dilapisi dengan graphene oxide; Ag-GO, nanoplatform yang dilapisi dengan komposit graphene oxide dan nanopartikel perak; RU, unit relatif
Toksisitas AgNP Dihambat oleh GO dalam Nanoplatform Berlapis Komposit Ag-GO
Toksisitas nanoplatform diselidiki dengan inkubasi langsung fibroblas dan HUVECs selama 24 jam pada nanoplatform dan foil yang tidak dilapisi (Gbr. 4). Ada perbedaan yang signifikan antara kelangsungan hidup fibroblas dan HUVECs pada nanoplatform yang berbeda (P = 0,0003 dan P = 0,0156, sesuai). Nanoplatform GO tidak mengubah viabilitas fibroblas, dibandingkan dengan viabilitas sel yang diinkubasi pada foil yang tidak dilapisi. Demikian pula, tidak ada dampak signifikan GO pada kelangsungan hidup HUVEC. Namun, pelapisan dengan AgNP menghasilkan penurunan 40-50% dari viabilitas fibroblas dan HUVEC. Viabilitas sel fibroblas dan HUVECs tidak berubah ketika mereka diinkubasi pada platform nano yang dilapisi dengan nanokomposit Ag-GO, menunjukkan penghambatan toksisitas AgNP. Morfologi sel pada foil yang tidak dilapisi menunjukkan morfologi khas fibroblas yang tumbuh dalam kondisi kultur 2D (Gbr. 4a). Sel yang diinkubasi pada foil berlapis AgNP menunjukkan agregasi sel yang intensif. Morfologi sel pada nanoplatform berlapis GO- dan Ag-GO menunjukkan penurunan kecenderungan aglomerasi dan penyebaran sel.
Nanoplatform yang dilapisi dengan graphene oxide menurunkan sitotoksisitas nanopartikel perak. Morfologi fibroblas yang dikultur pada a nanoplatform tidak berlapis, b nanoplatform berlapis nanopartikel perak, c nanoplatform berlapis grafena oksida, d nanopartikel perak dan nanoplatform berlapis komposit graphene oxide. Morfologi dinilai dengan mikroskop cahaya menggunakan kontras fase dengan perbesaran × 200. Fibroblas (e ) dan HUVEC (f ) viabilitas setelah 24 jam inkubasi pada nanoplatform ditentukan menggunakan uji PrestoBlue. Nilai dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi (n = 3, setiap percobaan dalam rangkap tiga). Signifikansi statistik ditunjukkan oleh superskrip yang berbeda (ANOVA satu arah; P < 0,05). Singkatan:HUVECs, sel endotel vena umbilikalis manusia; C, kelompok kontrol (foil tanpa nanopartikel); AgNPs, nanoplatform dilapisi dengan nanopartikel perak; GO, nanoplatform dilapisi dengan graphene oxide; Ag-GO, nanoplatform yang dilapisi dengan komposit graphene oxide dan nanopartikel perak; RU, unit relatif
Toksisitas nanoplatform juga dievaluasi menggunakan membran chorioallantoic embrio ayam (Gbr. 5). Nanoplatform diinkubasi langsung pada membran chorioallantoic, dan morfologinya di tempat kontak diperiksa setelah 48 h. AgNPs menyebabkan perubahan morfologi pada membran chorioallantoic, sedangkan dalam kasus nanoplatform GO dan Ag-GO, morfologi sebanding dengan kelompok kontrol (Gbr. 5b). Membran chorioallantoic, setelah inkubasi pada nanoplatform AgNP, menunjukkan penurunan jumlah pembuluh kapiler, menunjukkan toksisitas langsung ke sel endotel dan mesenkim.
Grafena oksida menurunkan perubahan morfologi membran chorioallantoic yang disebabkan oleh nanopartikel perak. Morfologi membran chorioallantoic embrio ayam setelah 48 h inkubasi dengan nanoplatform. a Kelompok kontrol (foil tanpa nanopartikel), b nanoplatform dilapisi dengan nanopartikel perak, c nanoplatform dilapisi dengan graphene oxide, d nanoplatform dilapisi dengan komposit graphene oxide dan nanopartikel perak
AgNPs Menurunkan Pelepasan Interleukin 6 dan 8
Susunan antibodi digunakan untuk menganalisis konten media sel dari 40 protein inflamasi yang disintesis oleh fibroblas (Gbr. 6). Protein inflamasi utama yang dilepaskan oleh fibroblas adalah interleukin 8 (IL-8; Gbr. 6, titik:E5, F5) dan interleukin 6 (IL-6; Gbr. 6, titik:E8, F8). Nanoplatform AgNP dan Ag-GO secara signifikan menurunkan tingkat pelepasan IL-8, sedangkan nanoplatform GO tidak memiliki efek seperti itu. Selain itu, baik platform nano GO dan Ag-GO menurunkan tingkat pelepasan faktor perangsang koloni granulosit-makrofag (GM-CSF; Gbr. 6, titik:G5, H5). Nanoplatform GO dan Ag-GO juga menyebabkan peningkatan level pelepasan tumor necrosis factor beta (TNF-β; Gbr. 6, titik:A9, B9). Menariknya, nanoplatform AgNP, GO dan Ag-GO secara signifikan menurunkan tingkat pelepasan IL-6. Tingkat pelepasan protein lain yang dianalisis tidak berubah. Peta larik dengan daftar semua sitokin yang dianalisis disertakan dalam File tambahan 1:Gambar S1.
Analisis susunan antibodi dari pelepasan sitokin inflamasi fibroblas setelah 24 jam inkubasi. a Kelompok kontrol (foil tanpa nanopartikel), b nanoplatform dilapisi dengan nanopartikel perak, c nanoplatform dilapisi dengan graphene oxide, d Ag-GO nanoplatform dilapisi dengan komposit graphene oxide dan nanopartikel perak. Nanoplatform AgNP dan Ag-GO menurunkan tingkat pelepasan IL-8 (titik:E5, F5). Baik platform nano GO dan Ag-GO menurunkan sintesis GM-CSF (titik:G5, H5). Selain itu, platform nano GO dan Ag-GO menyebabkan peningkatan sintesis TNF-β (titik:A9, B9). Nanoplatform AgNP, GO dan Ag-GO menurunkan tingkat pelepasan IL-6 (titik:E8, F8). Peta susunan lengkap tersedia di File tambahan 1
Diskusi
Dalam aplikasi biomedis, keamanan bahan nano yang digunakan dalam bahan antimikroba sama pentingnya dengan efisiensinya dalam membunuh bakteri. Dalam penelitian ini, kami menunjukkan bahwa bahan pelapis dengan GO dapat secara efisien menurunkan toksisitas bahan nano. Foil poliuretan yang dilapisi dengan AgNPs dan GO (Ag-GO) tidak hanya meningkatkan sifat antimikrobanya, tetapi juga menurunkan toksisitasnya dalam sel manusia.
Spektroskopi Raman digunakan untuk menganalisis fitur struktural oksida graphene. Pita G dalam spektrum Raman sesuai dengan sp
2
bahan berbasis karbon hibridisasi [26]. Puncak D terkait dengan cacat atau gangguan kisi karena pengikatan gugus fungsi oksigen [27]. Intensitas pita D dikaitkan dengan ukuran sp
2
domain dalam pesawat [26]. Pita tambahan D' muncul dari cacat yang ada pada struktur grafit bahan karbon. Rasio ID/IG (dihitung dari intensitas pita D dan G) dapat digunakan untuk mengkarakterisasi ketidakteraturan struktur grafit dalam bahan karbon. Seperti yang ditunjukkan, GO memiliki struktur yang sangat tidak teratur karena banyak gugus fungsi dalam struktur yang terbentuk selama oksidasi bubuk grafit [28].
Spektrum FT-IR dari grafena oksida yang dikumpulkan dalam mode ATR mengungkapkan bahwa GO memiliki banyak gugus fungsi yang ada dalam struktur, termasuk gugus karboksil dan epoksi, puncaknya sekitar 1720 cm
− 1
dan 915 cm
− 1
, epoksi (C–O–C) dengan puncak yang terlihat sekitar 1200 cm
− 1
, dan ikatan C–H (puncaknya sekitar 2800 cm
− 1
). Analisis FT-IR sesuai dengan pengukuran XPS yang dilakukan untuk GO di mana juga kelompok hidroksil, karboksil, epoksi dan karbonil diidentifikasi [29].
Pelapisan bahan nano dilakukan dengan teknologi ultrasonik, yang telah dikonfirmasi sebagai metode yang efektif untuk melapisi berbagai bahan dengan zat antibakteri dan fungisida, termasuk AgNPs [30, 31]. Gelombang ultrasonik memanfaatkan fenomena kavitasi dengan menghasilkan dan meruntuhkan gelembung kavitasi, menghasilkan energi dan tekanan tinggi [32]. Nanomaterials dipercepat untuk kecepatan tinggi bertabrakan dengan bahan dilapisi dan disimpan di permukaan [33]. Namun, efektivitas deposisi nanomaterial dapat ditingkatkan tidak hanya dengan menggunakan metode pelapisan yang tepat, tetapi juga dengan membuat komposit dengan nanomaterial yang lebih mudah menempel pada permukaan. GO adalah bahan nano yang disukai untuk membuat komposit yang stabil dengan bahan nano dan permukaan yang berbeda. Karena strukturnya yang unik, dengan atom karbon dalam pola heksagonal dengan banyak gugus fungsi yang mengandung oksigen dalam jarak dekat, termasuk gugus karboksil dan hidroksil, GO cenderung membentuk ikatan kovalen atau interaksi elektrostatik [34]. Biasanya, komposit nanopartikel GO disintesis dengan menempelkan ion logam atau nanopartikel logam ke permukaan GO melalui interaksi elektrostatik atau kovalen. Selain itu, reduksi ion logam dan/atau GO dilakukan untuk membentuk ikatan kovalen [35]. Komposit Ag-GO telah dibuat menggunakan ultrasonikasi dengan reduksi in situ dari Ag
+
[36, 37], serta deposisi AgNPs [12]. Dalam laporan kami sebelumnya, kami menunjukkan bahwa metode ultrasonik dapat digunakan untuk mensintesis nanoplatform berlapis Ag-GO pada foil poliuretan [25]. Namun, sonikasi tidak hanya menyebabkan pelapisan foil poliuretan dengan bahan nano, tetapi juga pada pembentukan komposit Ag-GO. Pembentukan komposit Ag-GO, bahkan sebelum pelapisan foil, dapat menghasilkan stabilitas AgNP yang lebih besar setelah pelapisan.
Dalam penelitian kami, fibroblas dan HUVECs digunakan untuk studi sitotoksisitas diikuti dengan analisis membran chorioallantoic embrio ayam. Fibroblas kulit dianggap sebagai model yang baik untuk studi iritasi kulit dibandingkan dengan analisis in vivo [38], sedangkan sel endotel, termasuk sitotoksisitas HUVEC, sering dipelajari karena kemungkinan kontak langsung nanopartikel dalam aplikasi biomedis dan sensitivitas sel-sel ini terhadap nanopartikel [ 39, 40]. Membran chorioallantoic embrio ayam merupakan alternatif model in vivo untuk model hewan pengerat untuk berbagai studi toksikologi termasuk studi toksikologi material dan toksikologi akut [41, 42].
Fibroblas dan HUVEC memiliki viabilitas yang lebih tinggi ketika ditanam di Ag-GO daripada nanoplatform berlapis AgNP. Selain itu, nanoplatform AgNP menyebabkan perubahan morfologi pada membran chorioallantoic, sedangkan dalam kasus nanoplatform GO dan Ag-GO, morfologi sel sebanding dengan kelompok kontrol. Penurunan toksisitas pada platform nano Ag-GO dapat dihasilkan dari efek gabungan dari stabilitas AgNP yang lebih tinggi di kompleks dengan GO dan deposisi AgNP yang lebih baik di platform nano. Toksisitas sel hewan seringkali lebih parah setelah nanopartikel memasuki sel melalui penetrasi langsung atau endositosis [43]. Endositosis nanopartikel bergantung pada ukuran dan bentuk. Partikel dan komposit yang lebih besar diambil hingga tingkat yang lebih rendah daripada partikel yang berukuran sekitar 45 nm [44]. Hubungan yang paling mencolok antara endositosis dan bentuk atau ukuran bahan nano adalah karakteristik untuk nanotube dinding karbon. Nanotube dengan panjang kurang dari 1 μm secara efektif menembus membran plasma melalui difusi langsung, sedangkan jalur fagositosis atau endositosis menginternalisasi nanotube dan aglomerat yang lebih panjang [45]. Baru-baru ini, nanokomposit Ag-GO terbukti diinternalisasi oleh makrofag J774, sekitar 60% lebih sedikit dari AgNP. Namun, karena Ag-GO menginduksi lebih banyak ROS, toksisitas keseluruhan untuk sel lebih tinggi [46]. Selain itu, analisis kinetik dari internalisasi nanopartikel yang bergantung pada bentuk menunjukkan bahwa nanopartikel berukuran sferis umumnya terinternalisasi jauh lebih cepat daripada partikel datar [47]. Selanjutnya, toksisitas nanopartikel untuk sel manusia biasanya bergantung pada ukuran, di mana partikel yang lebih kecil menunjukkan sifat sitotoksik yang lebih kuat. Dalam studi tentang sitotoksisitas AgNP yang bergantung pada ukuran untuk RAW, 264,7 makrofag dan nanopartikel fibroblas L929 memiliki viabilitas yang lebih rendah setelah perawatan dengan AgNPs 20-nm daripada setelah perawatan dengan nanopartikel yang lebih besar (80, 113 nm) [13]. Oleh karena itu, peningkatan ukuran komposit Ag-GO dan penurunan kemampuan sel untuk menyerap nanopartikel yang dihasilkan dari deposisi stabil ke permukaan dapat menjadi alasan untuk kelangsungan hidup HUVEC dan fibroblas yang diamati lebih tinggi yang dikultur pada platform nano Ag-GO.
Nanoplatform AgNP dan Ag-GO secara signifikan menurunkan tingkat pelepasan IL-8 oleh fibroblas. Nanoplatform GO dan Ag-GO menyebabkan peningkatan pelepasan TNF-β. Selain itu, nanoplatform AgNP, GO dan Ag-GO menurunkan pelepasan IL-6. Menariknya, perubahan dalam sintesis protein proinflamasi oleh fibroblas terkait dengan inkubasi sel pada platform nano yang dilapisi dengan AgNPs atau GO. Tingkat sintesis sel yang diinkubasi pada Ag-GO tidak berbeda dari yang diinkubasi pada nanoplatform yang dilapisi hanya dengan satu bahan nano ini, menunjukkan bahwa aktivitas biologis tidak berubah setelah sintesis komposit. Fibroblas penting dalam proses inflamasi dan remodeling dengan memulai respon inflamasi dan mempercepat peralihan dari inflamasi akut ke perbaikan jaringan [48, 49]. Oleh karena itu, analisis sekresi fibroblas dari sitokin inflamasi penting untuk memprediksi respon imunologis terhadap nanoplatform. Baik IL-6 dan IL-8 adalah salah satu sitokin inflamasi kunci yang, setelah disintesis oleh fibroblas, mengarah pada aktivasi respon imunologi [50, 51]. Tingkat sintesis keratinosit epidermis manusia dari IL-6 menurun setelah pengobatan dengan AgNPs [52]. Demikian pula, penghambatan pelepasan IL-6 oleh AgNPs ditunjukkan dalam sel Jurcat dan melibatkan jalur MAPK. AgNPs juga menurunkan tingkat sintesis tumor necrosis factor alpha (TNF-α) [53]. TNF-α dan, sangat mirip dalam struktur dan fungsi, TNF- adalah sitokin inflamasi yang penting selama fase inflamasi akut. Meskipun sel imun terutama bertanggung jawab untuk pelepasan protein tersebut selama fase akut inflamasi, fibroblas dan sel yang berbeda terlibat dalam sintesis sitokin inflamasi selama proses awal penyembuhan luka [54]. Aktivitas untuk menginduksi TNF-α setelah pengobatan dengan GO ditunjukkan menggunakan makrofag RAW264.7 [55], yang menunjukkan stimulasi imunologis. Namun, dalam penelitian kami, tingkat pelepasan sebagian besar protein proinflamasi yang dianalisis tidak berubah setelah sel dikultur pada platform nano GO dan Ag-GO. Oleh karena itu, analisis ini menunjukkan bahwa nanoplatform GO dan Ag-GO memiliki biokompatibilitas yang baik dan tidak boleh menyebabkan reaksi imunologis yang kuat.
Kesimpulan
Kesimpulannya, hasil yang disajikan menunjukkan bahwa nanoplatform yang dilapisi dengan komposit Ag-GO telah menunjukkan penghambatan pertumbuhan yang lebih kuat dari S. enteritidis daripada nanoplatform berlapis AgNP dan GO. Selain itu komposit Ag-GO secara signifikan mengurangi sitotoksisitas terhadap fibroblas, HUVECs dan membran korioallantoik embrio ayam, dibandingkan dengan nanoplatform yang dilapisi dengan AgNPs. Viabilitas sel fibroblas dan HUVECs tidak berubah ketika mereka diinkubasi pada platform nano yang dilapisi dengan nanokomposit Ag-GO, menunjukkan penghambatan toksisitas AgNP. Hasil ini, bersama dengan stimulasi imunologis yang rendah, menunjukkan bahwa GO dapat digunakan untuk pengurangan sitotoksisitas bahan nano yang berbeda dalam nanokomposit. Selanjutnya, hasil menunjukkan bahwa nanoplatform Ag-GO dapat dipertimbangkan untuk digunakan dalam aplikasi biomedis. Namun, studi tambahan diperlukan untuk mengevaluasi platform nano Ag-GO untuk aplikasi tertentu, termasuk pembalut luka.
Bahan dan Metode
Persiapan dan Karakterisasi Nanoplatform yang Dilapisi dengan Nanomaterial
Nanoplatform terbuat dari foil poliuretan berlapis nanopartikel disiapkan seperti yang dijelaskan sebelumnya [25]. Foil poliuretan berbentuk persegi (15 × 15 mm, tebal 0,05 mm) ditutupi dengan suspensi AgNPs (HydroSilver1000, Amepox, ódź, Polandia) yang disintesis dengan reaksi reduksi kimia dengan adanya polivinil alkohol yang dikembangkan oleh Amepox dan/atau GO yang disintesis oleh metode Hummers yang dimodifikasi. Sepuluh gram bubuk grafit dicampur dengan 230 ml asam sulfat pekat (98%) (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) pada suhu di bawah 10 °C. Selanjutnya, 4,7 g natrium nitrat (Sigma-Aldrich) dan 30 g kalium permanganat (Sigma-Aldrich) ditambahkan ke dalam campuran grafit, sambil menjaga suhu di bawah 10 °C. Kemudian, campuran dipanaskan hingga 30 °C dan diaduk selama 2 jam. Selanjutnya, 100 ml air ditambahkan dan campuran diperlakukan dengan 10 ml hidrogen peroksida. GO dimurnikan dengan penyaringan dan dicuci dengan air deionisasi sampai pH filtrat mencapai 6,5. Suspensi GO, AgNPs dan komposit AgNPs dan GO (Ag-GO) disiapkan dalam air deionisasi. Selama pelapisan, konsentrasi bahan nano adalah sebagai berikut:GO, 200 mg/l; AgNP, 100 mg/l; Ag-GO, 200 mg/l; dan AgNP, 100 mg/l. Pelapisan nanopartikel dilakukan menggunakan tanduk ultrasonik (klakson Ti, 13 mm, efisiensi 60%, 20 kHz; Sonics &Materials, Inc., Newtown, CT, USA) pada suhu 30 ± 1 °C. Sampel tertutup disiram dalam air deionisasi dan dikeringkan dalam kondisi steril. Karakterisasi nanoplatform dengan mikroskop elektron pemindaian (SEM), mikroskop gaya atom (AFM) dan mikroskop gaya lateral (LFM) telah dilaporkan sebelumnya, menunjukkan platform nano hampir seluruhnya ditutupi dengan bahan nano [25].
Nanomaterials yang digunakan untuk mendapatkan nanoplatforms dicitrakan menggunakan mikroskop elektron transmisi (TEM). Gambar TEM diperoleh menggunakan mikroskop JEM-1220 (JEOL, Tokyo, Jepang) pada 80 kV dengan kamera 11-megapiksel Morada (Olympus Corporation, Tokyo, Jepang). Sampel disiapkan dengan menempatkan tetesan hidrokoloid ke jaringan tembaga berlapis formvar (Agar Scientific, Stansted, UK), yang dibiarkan mengering sebelum pengamatan.
Spektrum Raman dikumpulkan menggunakan spektrometer Renishaw inVia dengan sumber laser 532 nm (Wotton-under-Edge, UK). Untuk menghindari pemanasan sampel, daya laser dijaga tetap rendah (0,3 mW, dikalibrasi pada sampel). Mode pemetaan Raman digunakan dengan area pemindaian sekitar 10 × 10 μm, berisi 25 spektrum). Setiap spektrum terdiri dari dua pita utama, pita G (~ 1578 cm
− 1
) dan pita D (~ 1347 cm
− 1
), di fit menggunakan bentuk garis Lorentzian. Pengukuran FT-IR dilakukan menggunakan spektrometer Nicolet iS10 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) dalam mode reflektansi total yang dilemahkan pada kristal berlian. Suspensi oksida graphene dikeringkan pada permukaan polietilen pada suhu kamar untuk membuat foil tipis GO. Spektrum dikumpulkan dalam kisaran 400–4000 cm
− 1
.
Zeta potential measurements of GO (20 mg/l), AgNPs (10 mg/l) and Ag-GO (GO 20 mg/l and AgNPs 10 mg/l) were carried out with a Nano-ZS90 Zetasizer (Malvern Instruments, Malvern, UK) at 25 °C, using the Smoluchowski approximation. Nanomaterials were sonicated for 30 min and zeta potential was immediately measured. Subsequently, nanomaterials were left for 24 h at room temperature and the zeta potential was measured again. Each measurement was repeated at least seven times after 60 s of stabilisation at 25 °C.
The hydrodynamic diameter of nanoparticles in water and their size distribution were measured with dynamic light scattering (DLS) using a Nano-ZS90 Zetasizer (Malvern). Similar to for the zeta potential analysis, GO (20 mg/l), AgNPs (10 mg/l) and Ag-GO (GO 20 mg/l and AgNPs 10 mg/l) were sonicated for 30 min and left for 24 h at room temperature. Each sample was measured at least seven times at 25 °C.
Bacterial Cultivation
Salmonella enteritidis subspecies enterica serovar Enteritidis (ATCC 13076) was obtained from LGC Standards (Łomianki, Poland). The bacteria were grown on tryptic soy agar (Merck Millipore, Darmstadt, Germany). The bacteria, grown on agar plates, were harvested by gently washing the plates with sterile distilled saline solution. To calculate the number of bacteria in the cell suspension, the optical density of the suspensions at 600 nm (OD600) was measured using a spectrophotometer (Helios Epsilon, Unicam, Milwaukee, WI, USA). A calibration curve was prepared by performing serial tenfold dilutions of bacterial suspensions of a known optical density, up to 10
− 5
. After 24 h of incubation at 37 °C, the number of formed colonies was enumerated and the number of colony-forming units (CFU) of the original bacterial suspension was calculated.
Bacteria Viability Assay
Viability was evaluated using a PrestoBlue Cell Viability Assay (Thermo Fisher Scientific). Bacteria were cultured onto foils coated with GO, AgNPs and Ag-GO, located on inserts inserted into six-well plates (200 μl MH broth with 5 × 10
3
CFU per foil) and incubated for 24 h. Subsequently, 90 μl of each sample was transferred to 96-well plates and 10 μl of PrestoBlue reagent was added to each well and incubated for an additional 2 h at 37 °C. The optical density of each well was recorded at 570 nm using a microplate reader (Infinite M200, Tecan, Durham, NC, USA). Bacteria viability was expressed as the relative value after substitution of the absorbance from the blank samples. Experiments were repeated three times.
Scanning Electron Microscopy Analysis
Bacteria were incubated on foils with Ag-GO and a sterile cover glass. Bacteria cultures (100 μl, 10
6
CFU/ml) were incubated on foils and a cover glass for 24 h at 37 °C. All samples were dried and covered with gold. Cells were fixed with 2.5% glutaraldehyde in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2) and contrasted with 1% osmium tetroxide (Sigma-Aldrich) and 1% carbohydrazide (Sigma-Aldrich). Subsequently, cells were dehydrated in increasing concentrations of hexylene glycol (Sigma-Aldrich). Drying was performed using a Polaron CPD 7501 critical point dryer (Quorum Technologies, Laughton, UK). Finally, the samples were imaged with a SEM (FEI Quanta 200, Tokyo, Japan) at an acceleration voltage of 15 kV.
Human Cell Lines
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs; catalogue number:C0035C) and human fibroblasts (catalogue number:C0135C) were obtained from Thermo Fisher Scientific. HUVECs were maintained on low-serum Medium 200 basal media supplemented with Large Vessel Endothelial Supplement (Thermo Fisher Scientific) and 1% penicillin/streptomycin (Thermo Fisher Scientific), whereas fibroblasts were cultured in low-serum Medium 106 (Thermo Fisher Scientific) supplemented with Low Serum Growth Supplement (Thermo Fisher Scientific) and 1× penicillin/streptomycin (Thermo Fisher Scientific). Cells were maintained at 37 °C in a humidified atmosphere of 5% CO2 /95% air.
To analyse biological interactions, the nanoplatforms were put into six-well plates. After detachment from the cell culture flask, HUVECs or fibroblasts were placed directly on the nanoplatform with 100 μl of growth media. To avoid the media drying during incubations, plates were kept in humidity chambers.
Analysis of Nanoplatform Toxicity to HUVECs and Fibroblasts
To analyse HUVEC and fibroblast viability on the nanoplatforms, cells were cultured in the droplet directly on the nanoplatforms or uncoated foil (1 × 10
4
cells in 100 μl growth media). After 24 h of incubation, cell viability was analysed using a PrestoBlue assay (Thermo Fisher Scientific). PrestoBlue reagent was incubated with assessed cells for 2 h in a cell culture incubator. Subsequently, 50 μl of growth media with PrestoBlue reagent was transferred to a 96-well plate where fluorescence (excitation λ = 560 nm, emission λ = 590 nm) was analysed using a Tecan Infinite 200 microplate reader (Tecan, Durham, USA). Cell viability was expressed as the relative value after substitution of the fluorescence from blank samples. Experiments were repeated three times.
Fibroblast morphology was observed using an inverted optical microscope (Olympus Corporation) using phase contrast. Fibroblasts were seeded in 35-mm diameter Petri dishes directly on the nanoplatforms (1 × 10
4
cells in 100 μl growth media). Images were taken after 24 h of incubation.
Chorioallantoic Membrane Assay
Fertilised eggs from Ross 308 hens were obtained from a certified hatchery and kept for 4 days at 12 °C. The eggs were cleaned, sterilised with UVC light and divided into four groups (4 × 20 eggs). Embryos were incubated at standard conditions (temperature 37 °C, humidity 60% and turned once per hour). At 8 days of embryonic development, small holes (1 cm
2
) were made in the shell above the air space, the inner membrane was gently striped off and the nanoplatforms were placed on the chicken embryo chorioallantoic membrane. Subsequently, chicken embryos were incubated for the next 48 h, when nanoplatforms were cut out with the chorioallantoic membrane that was directly below the nanoplatform. The chorioallantoic membrane on the nanoplatforms was imaged using a stereoscopic microscope (SZX10, Olympus Corporation).
Antibody Array Analysis
An analysis of inflammation cytokines in fibroblast growth medium was performed using an antibody array (Abcam, Cambridge, UK; catalogue number ab134003). Fibroblast cells (1 × 10
4
) were incubated on nanoplatforms coated with AgNPs, GO, Ag-GO and uncoated foil with 100 μl of media. After 24 h, 80 μl of growth medium was collected. For each experimental group, the growth medium from six foils was used for analysis. Pooled growth medium from the six experiments was centrifuged (1600 rpm for 5 min), and 500 μl of growth media was diluted in 500 μl of PBS. Therefore, 1 ml of diluted growth media was used per each analysed membrane. The assay was performed in accordance with the manufacturer’s instructions. Diluted growth media was incubated with the membranes for 24 h at 4 °C. Subsequently, antibodies conjugated with biotins were added and incubated for the next 24 h at 4 °C. In the next step, the membranes were incubated with streptavidin conjugated with horseradish peroxidase for 2 h at room temperature. Membranes were visualised after the addition of the provided horseradish peroxidase substrate using a ChemiDoc imaging system (Bio-Rad, Hercules, USA).
Analisis Statistik
Data were analysed using one-way analysis of variance with GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Differences between groups were tested with Tukey’s HSD post hoc tests. Results are shown as means with standard deviations. Differences at P < 0.05 were considered significant.
Ketersediaan Data dan Materi
The datasets used and/or analysed during the current study are available from the corresponding author on reasonable request.
Singkatan
Ag-GO:
Composite of silver nanoparticles and graphene oxide
