Peningkatan Efek Penggabungan Asam Klorogenat pada Nanopartikel Selenium dalam Menghambat Amiloid Agregasi dan Pembentukan Spesies Oksigen Reaktif In Vitro
Abstrak
Deposisi plak amiloid-β (Aβ) dan pembentukan spesies oksigen reaktif neurotoksik (ROS) adalah tanda patologis yang signifikan dari penyakit Alzheimer (AD). Di sini, strategi baru dilaporkan untuk menggabungkan sifat penyerapan Aβ yang unik dari nanopartikel selenium dengan agen antioksidan alami asam klorogenat (CGA) untuk membentuk CGA@SeNPs. Evaluasi biologis in vitro mengungkapkan bahwa CGA dapat membersihkan ROS yang diinduksi oleh agregat Aβ40, tetapi tidak menghambat agregasi Aβ40 dan kerusakan membran sel yang juga disebabkan oleh agregat Aβ40. Menariknya, CGA@SeNPs menunjukkan peningkatan efek penghambatan pada agregasi Aβ40 dan, yang lebih penting, melindungi sel PC12 dari kematian sel yang diinduksi oleh agregasi Aβ. Dipercaya bahwa CGA@SeNPs lebih efisien daripada CGA dalam mengurangi racun Aβ40 dalam penggunaan jangka panjang.
Latar Belakang
Penyakit Alzheimer (AD) adalah penyakit neurodegeneratif progresif ireversibel yang ditandai dengan gangguan kognitif progresif dan hilangnya saraf [1]. Sekarang diterima secara luas bahwa akumulasi plak amiloid ekstraseluler di otak adalah fitur patologis yang umum pada AD [2, 3]. Plak tersebut mengandung misfolding dan agregasi protein amiloid-β (Aβ) [4]. Meskipun peran pasti dari protofibril atau oligomer A dalam patogenesis AD tidak sepenuhnya dipahami, mengumpulkan bukti menunjukkan bahwa kebanyakan dari mereka adalah spesies beracun yang bertanggung jawab untuk disfungsi neuron dan kematian [5,6,7,8]. Selain itu, agregat Aβ sudah ada di otak pasien AD. Agregat ini akan terus membentuk neurotoxin reactive oxygen species (ROS), yang akan memicu serangkaian kerusakan komponen seluler seperti DNA, lipid, dan protein serta menyebabkan stres oksidatif pada AD [9]. Kerusakan pada neuron biasanya mengakibatkan defisit pembelajaran dan memori. Oleh karena itu, diperkirakan bahwa penghambatan agregasi amiloid dan pembentukan spesies oksigen reaktif dapat menjadi target terapi yang menjanjikan untuk mencegah atau mengurangi patologi AD.
Nanomaterial memiliki sifat fisikokimia yang unik seperti ukuran yang kecil, luas permukaan yang besar, dan reaktivitas yang tinggi. Baru-baru ini, penelitian telah menekankan bahwa dengan modifikasi permukaan yang tepat, nanopartikel (NP) dapat digunakan sebagai alat untuk penghantaran obat, pencitraan, dan aplikasi terapeutik pada AD [10,11,12]. Umumnya, NP memiliki luas permukaan yang besar yang membawa kapasitas adsorpsi yang besar. Secara khusus, Aβ dapat mengikat beberapa NP untuk memperlambat proses fibrilasi Aβ. Misalnya, pengikatan monomer Aβ pada polioksometalat akan menurunkan konsentrasi monomer bebas dan menggeser kesetimbangan menjauh dari fibrilasi [13]. Di antara bahan nano ini, nanopartikel selenium (SeNPs) menampilkan beberapa fitur yang membuatnya sangat cocok untuk aplikasi biomedis, seperti persiapan dan stabilitas lurus ke depan. Selenium adalah elemen jejak penting, yang memainkan peran penting dalam regulasi redoks seluler, detoksifikasi, dan perlindungan sistem kekebalan [14]. Oleh karena itu, dibandingkan dengan senyawa selenium anorganik dan organik, SeNPs memiliki biokompatibilitas yang lebih baik, dan toksisitas yang lebih rendah [15]. Saat ini, modifikasi permukaan NP memfasilitasi afinitas pengikatan antara NP dan Aβ dan membantu memperbaiki sifat biokimia molekul terkonjugasi. Penelitian kami sebelumnya menemukan bahwa kapasitas anti-amiloid dari SeNPs dapat ditingkatkan lebih lanjut dengan mencangkokkan peptida anti-amiloid (LPFFD) ke permukaan SeNP [12]. Namun, sebagian besar penelitian ini tidak berfokus pada kemampuan anti-oksidasi NP setelah modifikasi permukaan.
Asam klorogenik (CGA) adalah komponen polifenol utama dalam buah-buahan seperti apel, pir, dan beri dan sangat melimpah dalam kopi [16]. CGA memiliki sejumlah sifat farmakologis, seperti anti-kanker, anti-inflamasi, dan anti-bakteri [16]. Terutama, CGA memiliki aktivitas anti-oksidatif dan neuroprotektif, yang memungkinkan aplikasi untuk mengobati penyakit Alzheimer [17, 18]. Namun, efek CGA pada agregasi Aβ tidak pernah dilaporkan. Selain itu, penggunaan CGA dibatasi oleh bioavailabilitas dan stabilitasnya yang rendah, dan hanya sepertiga CGA yang diserap dari saluran pencernaan yang mencapai sirkulasi darah [19]. Sejumlah penelitian telah melaporkan bahwa karena ukuran NP yang kecil, mereka dapat memasuki aliran darah secara langsung melalui inhalasi, konsumsi, dan transportasi melalui sirkulasi ke banyak organ. Oleh karena itu, untuk mengatasi masalah ini, kami telah mengeksplorasi pengikatan CGA ke SeNPs (CGA@SeNPs) untuk meningkatkan kemanjuran terapi potensial CGA. Dalam konteks ini, tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyelidiki potensi kemanjuran terapi CGA@SeNPs dalam agregasi anti-Aβ dan anti-oksidasi. Sejauh pengetahuan kami, tidak ada laporan sebelumnya tentang penggunaan CGA@SeNPs untuk terapi AD.
Metode/Eksperimental
Bahan dan Garis Sel
Aβ40 disintesis di GL Biochem Ltd. (Shanghai, Cina). Selenium dioksida (Na2 SeO3 ), NaBH4 , thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT), thioflavine T, dan 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) berasal dari Sigma (St. Louis, MO, USA). CGA dibeli dari Aladdin (Shanghai, Cina). Media Elang (DMEM) Dulbecco yang dimodifikasi, serum janin sapi (FBS), dan serum kuda diperoleh dari Gibco (Life Technologies AG, Swiss). Sel PC12 (pheochromocytoma tikus, Koleksi Kultur Tipe Amerika) dikultur dalam media DMEM yang dilengkapi dengan 5% FBS dan 10% serum kuda pada 37 °C dalam 5% CO2 lingkungan yang dilembabkan pada suhu 37 °C.
Persiapan CGA@SeNP
Pertama, larutan stok 25 mM CGA, 0,1 M Na2 SeO3 , dan 0,1 M NaBH4 disiapkan. Kemudian, 200 μL alikuot Na2 SeO3 larutan dicampur dengan volume CGA yang bervariasi, dan rasio konsentrasi reaktan Na2 SeO3 untuk CGA adalah 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, dan 1:8. Setelah itu, 200 μL 0,1 M NaBH4 ditambahkan ke dalam campuran dan diaduk selama 30 menit. Warna larutan berubah menjadi merah. Kelebihan CGA dan Na2 SeO3 dihilangkan dengan dialisis. Kami menemukan bahwa rasio konsentrasi terbaik Na2 SeO3 ke CGA adalah 1:6.
Karakterisasi CGA@SeNP
CGA@SeNPs yang telah disiapkan dicirikan oleh mikroskop elektron transmisi (TEM; Hitachi, H-7650), spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FT-IR; spektrometer Equinox 55 IR), dan spektroskopi UV-vis (Carry 5000 spektrofotometer). Distribusi ukuran ditentukan oleh penganalisis partikel Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Limited). Fluoresensi nanopartikel dilakukan dengan spektrofluorometer JASCO FP6500 (λ mis =350 nm).
H2 O2 Uji Generasi
Radikal hidroksil, 2, 29-azinobis-(asam 3-etilbenzotiazolin-6-sulfonat) (ABTS
+
), dan aktivitas pemulungan anion superoksida dari CGA dan CGA @ SeNP dianalisis dengan kit komersial (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Cina). Daya reduksi sampel diukur sebagai berikut:2 mL CGA atau CGA@SeNPs diinkubasi dengan 2 mL buffer fosfat (0,2 mol/L, pH 6,6) dan 2 mL K3 Fe(CN)6 (1%, dengan /v ) pada 50 °C selama 20 mnt. Setelah itu, reaksi dihentikan dengan menambahkan 2,5 mL asam trikloroasetat (10%, w /v ) dan disentrifugasi pada 3000 rpm selama 10 menit. Dua mililiter supernatan dicampur dengan 2 mL air suling dan 1 mL FeCl3 (0,1%, dengan /v ) pada suhu kamar selama 10 menit. Akhirnya, absorbansi diukur pada 700 nm. Vitamin c (Vc) digunakan sebagai kontrol positif dalam uji aktivitas anti-oksidasi.
H2 O2 generasi di Aβ40 dianalisis dengan DCFH-DA. Larutan stok DCFH-DA (1 mM) dibeli dari Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, China). Empat mikromolar horseradish peroxidase (HRP) disiapkan dalam buffer (20 mM Tris-HCl/150 mM NaCl, pH 7,4). Larutan sampel yang mengandung 35 μM Aβ40 dengan atau tanpa 20, 40, dan 60 μg/mL CGA@SeNPs/CGA diinkubasi pada suhu 37 °C selama 3 hari. Askorbat (10 μM) ditambahkan ke setiap sampel dan selanjutnya diinkubasi selama 1 jam. Analisis sampel dilakukan dengan menambahkan DCFH-DA (20 μL, 100 μM) dan HRP (2 μL, 0,04 μM) ke dalam larutan sampel (10 μL). Spektrum fluoresensi dengan panjang gelombang eksitasi dan emisi 488 dan 525 nm diukur dengan spektrofluorometer JASCO FP6500.
Pengukuran Fluoresensi T thioflavin
Kinetika fibrilasi Aβ40 dideteksi dengan menggunakan pewarna tioflavin T (ThT). Secara singkat, 35 μM Aβ40 diinkubasi dengan 20, 40, dan 60 μg/mL CGA@SeNPs/CGA pada 37 °C dari 0 hingga 5 hari. Setiap hari, 50 L larutan diambil dan ditambahkan ke dalam 200 L larutan ThT (15 M ThT dalam 50 mM PBS, pH 7,4). Kemudian, eksitasi ThT adalah 440 nm, dan panjang gelombang emisi 490 nm dicatat.
TEM
Morfologi Aβ40 dengan ada atau tidak adanya CGA@SeNPs/CGA diamati oleh TEM (Hitachi, H-7650). Sampel disiapkan dengan cara yang sama seperti pada uji fluoresensi ThT. Setelah 3 hari inkubasi, 10 μL larutan sampel terlihat pada kisi tembaga berlapis karbon selama 10 menit. Kemudian, setiap kisi diwarnai dengan 1,5% (w /v ) asam fosfotungstat (pH 7,4) dan dibiarkan kering.
Pengikatan nanopartikel ke Aβ40 juga dikonfirmasi oleh TEM. Pertama, 35 μM Aβ40 diinkubasi selama 3 hari untuk memformat serat. Kemudian, 20 g/mL nanopartikel ditambahkan ke dalam larutan yang telah diinkubasi sebelumnya dan diinkubasi lagi selama 6 jam. Setelah itu, sampel ini diperiksa pada TEM.
Pengukuran Hamburan Cahaya Resonansi
Hamburan cahaya resonansi (RSL) diukur menurut metode Yu et al. [20] dengan beberapa modifikasi. Sejumlah dispersi Aβ40 diencerkan menjadi 1 mL dengan H2 O, sedangkan konsentrasi akhir CGA@SeNPs bervariasi dari 0,05 hingga 0,45 μg/mL. Campuran diinkubasi selama 10 menit. Intensitas RLS direkam pada fluorospektrofotometer Cary Eclipse (Agilent technology, USA) dengan memindai monokromator eksitasi dan emisi secara sinkron (Δλ = 0 nm) antara 200 dan 800 nm. Lebar celah eksitasi dan emisi disetel ke 5 nm.
Uji Sitotoksisitas
Viabilitas sel dianalisis dengan menggunakan uji MTT. Sel-sel PC12 dilapisi dengan kepadatan 5000 sel per sumur pada pelat 96-sumur dalam media segar tanpa FBS. Aβ (35 μM) diinkubasi bersama dengan atau tanpa 60 μg/mL CGA@SeNPs/CGA selama 3 hari. Setelah itu, sel diperlakukan dengan sampel ini selama 72 jam lagi. Setelah inkubasi, sel diperlakukan dengan 10 L MTT per sumur, mengikuti manual Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation assay (Promega). Pelepasan laktat dehidrogenase (LDH) diuji menggunakan kit deteksi komersial. Sel-sel PC12 diperlakukan seperti di atas. Pada akhir perawatan, pelat 96-sumur disentrifugasi pada 1500×g selama 10 mnt. Aktivitas LDH dalam supernatan diukur sesuai dengan instruksi pabrik.
Pembuatan ROS Intraseluler
Efek CGA@SeNPs/CGA pada generasi ROS intraseluler yang diinduksi Aβ40 dipantau dengan uji DCFH-DA. Sel PC12 (1 × 10
5
per sumur) diperlakukan dengan cara yang sama seperti pada uji MTT. Kemudian, sel dicuci dua kali dengan PBS dan diinkubasi dengan DCFH-DA (10 mM) pada suhu 37 °C selama 30 menit. Tingkat ROS intraseluler diperiksa di bawah mikroskop fluoresen (perbesaran ×200) dengan panjang gelombang eksitasi dan emisi masing-masing pada 488 nm dan 525 nm. Untuk mengukur tingkat ROS intraseluler, sel diperlakukan dengan cara yang sama dan dipanen dengan sentrifugasi, ditangguhkan kembali dalam PBS. Kemudian, sel-sel tersebut dianalisis dengan flow cytometry.
TUNEL-DAPI Co-staining Assay
Sel-sel PC12 diperlakukan dengan cara yang sama seperti pada uji MTT. Setelah itu, sel-sel dalam chamber slide difiksasi dengan 3,7% form-aldehida dan ditembus dengan 0,1% Triton X-100 dalam PBS. Uji pewarnaan dilakukan dengan menggunakan kit uji terminal transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) (KeyGen BioTECH, Nanjing, China) mengikuti protokol pabrikan. Gambar diambil menggunakan mikroskop fluoresen (perbesaran ×200).
Statistik
Signifikansi statistik diperkirakan menggunakan analisis varians satu arah (ANOVA) diikuti dengan uji post hoc Bonferroni. Signifikansi statistik ditetapkan pada P < 0,05.
Hasil dan Diskusi
Karakterisasi CGA@SeNP
Dalam penelitian ini, kami menggunakan metode sederhana untuk mensintesis CGA@SeNPs dengan mereduksi campuran CGA dan Na2 SeO3 dengan NaBH4 . Nanopartikel dengan ukuran mulai dari 30 hingga 150 nm lebih menguntungkan untuk serapan seluler [21]. TEM menunjukkan CGA@SeNPs memiliki struktur bola dengan diameter sekitar 100 nm (Gbr. 1a), menunjukkan bahwa ukuran CGA@SeNPs cocok untuk aplikasi biologis. Analisis komposisi unsur menunjukkan bahwa Se, C, dan O dapat dengan mudah ditemukan dalam grafik spektroskopi sinar-X (EDX) dispersi energi CGA@SeNPs (Gbr. 1b). Sinyal atom Se adalah 30,00%, bersama dengan sinyal atom C yang kuat (52,60%) dan sinyal atom O (1,50%) dari CGA, menunjukkan bahwa kami telah berhasil menyiapkan CGA@SeNPs.
Karakterisasi CGA@SeNPs. a Gambar TEM dari CGA@SeNPs. b Analisis EDX dari CGA@SeNPs. c Spektrum penyerapan UV-vis dari CGA@SeNPs. d Spektrum emisi CGA@SeNPs
Spektrum serapan UV-vis CGA menunjukkan puncak penyerapan karakteristik pada 334 nm (Gbr. 1c). Namun, sedikit pergeseran diamati pada spektrum penyerapan UV-vis CGA@SeNPs dan puncak penyerapan diubah menjadi 337 nm. Panjang gelombang emisi CGA dan CGA@SeNPs dideteksi dengan spektrofotometer fluoresensi. Panjang gelombang emisi CGA adalah 442,9 nm, yang digeser menjadi 437,5 nm di CGA@SeNPs (Gbr. 1d). Hasil ini mengkonfirmasi keberadaan CGA pada permukaan SeNP. Spektrum FT-IR dari CGA@SeNPs memberikan bukti bahwa CGA telah membentuk bagian dari nanokomposit. Frekuensi peregangan O–H terletak di 3353,99 cm
−1
dalam spektrum FT-IR CGA (File tambahan 1:Gambar S1); namun, puncak karakteristik di CGA@SeNPs ini diubah menjadi 3419.00 cm
−1
. Pergeseran tersebut menegaskan bahwa CGA terkonjugasi ke permukaan SeNP melalui gugus OH.
Stabilitas CGA@SeNPs dalam kondisi fisiologis penting untuk mengevaluasi aplikasi masa depan mereka. Dengan demikian, distribusi ukuran CGA@SeNPs di PBS (pH 7,4) dipantau pada suhu kamar selama 7 hari. Seperti yang ditunjukkan pada File tambahan 1:Gambar S2, ukuran CGA@SeNPs tetap stabil dengan ukuran rata-rata sekitar 100 nm, dan CGA@SeNPs mempertahankan dispersibilitas air yang baik di PBS dalam 7 hari. Stabilitas CGA@SeNP yang menguntungkan mendukung aplikasi potensialnya di bidang medis.
Penghambatan Generasi ROS
A yang disimpan dapat mengaktifkan mikroglia dan merangsang mikroglia untuk menghasilkan neurotoksin, seperti ROS, yang selanjutnya dapat menyebabkan kerusakan saraf yang parah di otak [22]. Selain itu, ROS seperti hidrogen peroksida (H2 O2 ) juga dapat dihasilkan oleh agregat Aβ [23]. Dengan demikian, kami menyelidiki aktivitas antioksidan CGA@SeNPs dan efek CGA@SeNPs pada H2 yang diinduksi agregat Aβ O2 pembentukan. Seperti yang ditunjukkan pada File tambahan 1:Gambar S3, CGA@SeNPs memiliki aktivitas pembersihan yang kuat terhadap radikal dengan cara yang bergantung pada konsentrasi. Ketika konsentrasi mencapai 60 μg/mL, radikal hidroksil, ABTS
+
, dan aktivitas scavenging anion superoksida masing-masing mencapai 70,3%, 95,2%, dan 95,1%. Jelas, daya reduksi CGA@SeNPs meningkat dengan meningkatnya konsentrasi. Di antara semua sampel, CGA@SeNPs menunjukkan daya reduksi yang kuat dan kapasitas pemulungan pada radikal hidroksil, ABTS
+
, dan anion superoksida daripada Vc dan CGA. Hasil ini menunjukkan bahwa CGA@SeNPs menunjukkan aktivitas antioksidan yang lebih tinggi, yang dapat membantu dalam mengais oksigen aktif pada AD. Hal yang perlu diperhatikan adalah bahwa modifikasi CGA pada SeNP memberikan efek sinergis pada aktivitas antioksidan.
Efek CGA@SeNPs pada H2 . yang dimediasi Aβ O2 generasi diselidiki oleh uji DCFH-DA [24], yang dapat menunjukkan generasi H2 O2 dari Aβ dengan ada atau tidak adanya CGA@SeNPs. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2, CGA@SeNPs dan CGA menurunkan H2 O2 dengan cara yang tergantung dosis. Lebih penting lagi, sampel Aβ yang mengandung CGA@SeNP menunjukkan lebih sedikit H2 O2 daripada yang mengandung CGA, mengungkapkan bahwa aktivitas antioksidan yang tinggi dari CGA@SeNPs menunjukkan lebih banyak efek daripada CGA dalam mengurangi H2 yang diinduksi Aβ. O2 generasi.
H2 O2 generasi dari reaksi Aβ40 dengan ada atau tidak adanya nanopartikel. Aβ =35 μM, nanopartikel/CGA =20, 40, dan 60 μg/mL
Penghambatan Agregasi Aβ oleh CGA@SeNPs
Meskipun aktivitas antioksidan CGA adalah properti yang terkenal, aktivitas agregasi anti-amiloid CGA masih belum diketahui. Untuk memverifikasi kelayakan CGA@SeNPs untuk aplikasi terapi AD, efek penghambatan CGA@SeNPs pada agregasi Aβ pertama kali diselidiki oleh uji fluorometrik berbasis ThT, yang merupakan metode mapan untuk memantau pembentukan -sheet di bawah kontinyu waktu [25]. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3a, Aβ40 beragregasi secara spontan dan fluoresensi fibril Aβ meningkat secara bertahap hingga mencapai dataran tinggi dengan 3 hari inkubasi. Kami telah mengamati bahwa CGA@SeNPs mampu secara perlahan mengagregasi protein amiloid dengan meningkatnya konsentrasi. Intensitas fluoresensi serat Aβ40 sekitar dua kali lebih banyak daripada Aβ40 yang diinkubasi dengan 60 μg/mL CGA@SeNPs tercapai. Namun, sedikit atau tidak ada perubahan dalam intensitas fluoresensi ThT yang diamati pada CGA, menunjukkan bahwa CGA hanya sedikit menghambat agregasi Aβ40.
Efek penghambatan CGA@SeNPs pada fibrilasi Aβ40. a Fluoresensi ThT dari pembentukan fibril Aβ40 dengan ada atau tidak adanya nanopartikel/CGA dari 0 hingga 5 hari. Aβ40 =35 μM, nanopartikel/CGA =20, 40, dan 60 μg/mL. b Morfologi Aβ40 diinkubasi dengan atau tanpa nanopartikel atau CGA selama 3 hari. Aβ40 =35 μM, nanopartikel/CGA =60 μg/mL
Perubahan morfologi Aβ40 yang diinkubasi dengan atau tanpa CGA atau CGA@SeNPs ditunjukkan pada Gambar. 3b. Aβ40 yang diinkubasi dalam 3 hari membentuk banyak fibril, sedangkan dengan adanya CGA@SeNPs (60 g/mL), tidak ada fibril yang terbentuk. Seperti yang diharapkan, CGA tidak secara signifikan menghambat fibrillogenesis Aβ, sedangkan sejumlah besar agregat diamati dalam larutan Aβ40 yang diberi perlakuan CGA, yang konsisten dengan uji fluorometrik ThT. Hasil ini menunjukkan bahwa setelah modifikasi CGA pada SeNP, jelas dapat menurunkan pembentukan -sheet.
Aktivitas Pengikatan CGA@SeNP ke Aβ40
Untuk mendapatkan pemahaman yang lebih baik tentang aktivitas penghambatan CGA@SeNPs pada agregasi Aβ, kami menyelidiki afinitas pengikatan CGA@SeNPs untuk Aβ40. Pertama, untuk mengevaluasi pengikatan nanopartikel pada serat Aβ40 pada tingkat ultrastruktural, serat Aβ40 diinkubasi dengan CGA@SeNPs. Kami mengamati bahwa fibril secara khusus terikat pada permukaan SeNP tanpa adanya nanopartikel tersuspensi bebas yang tidak terkait (Gbr. 4a).
Afinitas CGA@SeNPs untuk Aβ40. a Kapasitas pengikatan CGA@SeNPs pada serat Aβ40. Serat Aβ40 yang dilakukan diinkubasi dengan CGA@SeNPs dan diperiksa pada TEM. Aβ40 =35 μM, CGA@SeNPs =60 μg/mL. b Afinitas dan spesifikasi CGA@SeNPs untuk monomer Aβ40. Spektrum RLS dari monomer Aβ40 dengan adanya konsentrasi CGA@SeNPs yang berbeda. Aβ40 =600 nM, konsentrasi nanopartikel, 1–9:0, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, dan 0,4 μg/mL. c Spektrum RLS CGA@SeNPs, konsentrasi nanopartikel, 1–9:0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, dan 0,45 μg/mL
Hamburan cahaya resonansi (RLS) adalah teknik optik yang kuat berdasarkan hamburan cahaya elastis dan telah banyak diterapkan untuk mempelajari ukuran, bentuk, dan distribusi nanopartikel dalam larutan [26]. Jadi, kami selanjutnya menggunakan RLS untuk menganalisis interaksi antara monomer Aβ40 dan CGA@SeNPs. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4b, c, intensitas RLS NP jauh lebih rendah daripada NP yang diinkubasi dengan monomer 600 nM Aβ40 pada konsentrasi yang sama. Setelah CGA@SeNPs terkena molekul Aβ, Aβ diyakini mengikat pada permukaan SeNPs melalui N-donor yang mengandung rantai samping asam amino untuk membentuk ikatan Se-N [27]. Pembentukan konjugat molekul Aβ pada CGA@SeNPs menghasilkan peningkatan ukuran hamburan, yang meningkatkan intensitas RLS sistem (Gbr. 4b). Dikombinasikan dengan hasil uji ThT dan TEM, diduga bahwa interaksi antara permukaan CGA@SeNP yang besar dan monomer Aβ40 dapat menghasilkan kondisi yang tidak menguntungkan untuk nukleasi dan pertumbuhan fibril melalui pemblokiran kontak langsung antara monomer. Dengan demikian, CGA@SeNPs memberikan lebih banyak efek daripada CGA dalam menghambat agregasi Aβ40.
Penghambatan Neurotoksisitas Aβ40
Sitotoksisitas Aβ40 dengan ada atau tidak adanya CGA@SeNPs dalam sel PC12 diselidiki dengan uji MTT. Gambar 5a menunjukkan bahwa serat Aβ40 beracun bagi sel PC12, yang mengurangi viabilitas sel hingga 53%. Di hadapan CGA@SeNPs, kelangsungan hidup sel meningkat menjadi sekitar 95%. Namun, pra-perawatan sel dengan CGA hanya sedikit meningkatkan kelangsungan hidup sel menjadi 66%. Selain itu, CGA@SeNPs tidak beracun bagi sel PC12 (File tambahan 1:Gambar S4), menunjukkan bahwa CGA@SeNPs dapat menghambat neurotoksisitas Aβ40.
Neurotoksisitas Aβ40 diinkubasi dengan atau tanpa CGA@SeNPs/CGA. a Viabilitas sel sel PC12 menuju Aβ40 dengan adanya CGA@SeNPs atau CGA diuji dengan uji MTT. b Pelepasan LDH ke dalam media kultur. Aβ40 =35 μM, CGA@SeNPs/CGA =60 μg/mL
Telah dilaporkan bahwa Aβ secara istimewa bergerak pada permukaan sel dan menyebabkan kerusakan membran sel [28]. Oleh karena itu, untuk menentukan integritas membran sel setelah terpapar Aβ40 dengan ada atau tidak adanya NPs/CGA, kami mengukur kadar LDH ekstraseluler dalam media kultur sel. Dalam pengujian ini, tingkat LDH yang tinggi mencerminkan kerusakan membran sel. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5b, dibandingkan dengan kontrol, setelah terpapar Aβ40, pelepasan LDH meningkat menjadi 142%. Sesuai dengan hasil MTT, dengan adanya CGA@SeNPs, pelepasan LDH berkurang ke tingkat normal. Menariknya, kami mengamati bahwa CGA tidak mengurangi konsentrasi LDH, menunjukkan bahwa CGA tidak dapat mencegah sel PC12 dari kerusakan membran sel yang disebabkan oleh agregat Aβ.
Pencegahan Generasi ROS yang Diinduksi Aβ40 di Sel PC12
Agregat Aβ mampu menghasilkan ROS yang dapat menyebabkan stres oksidatif pada AD [29]. Karena sifat anti-oksidasi dan anti-agregasi CGA @ SeNPs, kami berhipotesis bahwa itu akan dapat mengurangi generasi ROS yang diinduksi Aβ40 dalam sel PC12. Dengan demikian, efek NP pada generasi ROS yang diinduksi agregat Aβ40 diukur dengan DCFH-DA. DCF adalah penanda fluoresen yang berasal dari reaksi DCFH-DA nonfluoresen dengan ROS, yang dapat menunjukkan pembentukan ROS yang diinduksi oleh agregat Aβ40. Seperti yang ditunjukkan pada File tambahan 1:Gambar S5, perlakuan dengan agregat Aβ40 menyebabkan peningkatan konten ROS lebih dari 1,5 kali lipat dibandingkan dengan sel yang tidak diobati. Perawatan CGA@SeNP menurunkan intensitas fluoresensi DCF dalam sel PC12, menunjukkan bahwa CGA@SeNPs menurunkan ROS yang diinduksi fibril Aβ ke tingkat normal. Menariknya, CGA juga mengurangi generasi ROS dalam sel PC12, tetapi tidak sejelas CGA@SeNPs.
Pencegahan Apoptosis Sel yang Diinduksi Aβ40 di Sel PC12
Telah dilaporkan bahwa kematian sel saraf yang disebabkan oleh fibril Aβ adalah peristiwa penting dalam patologi AD [30]. Untuk mempelajari lebih lanjut sitotoksisitas fibril Aβ40, kami melakukan pewarnaan bersama TUNEL-DAPI untuk menentukan efek NP atau CGA dalam apoptosis sel yang diinduksi Aβ40. Fragmentasi DNA merupakan ciri khas dari apoptosis sel, yang dapat dideteksi pada tahap awal apoptosis dengan menggunakan TUNEL [31]. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6, inti apoptosis diwarnai dengan warna hijau fluoresen terang oleh TUNEL. Aβ40 secara dramatis meningkatkan jumlah inti yang diwarnai TUNEL, sedangkan pengobatan CGA@SeNP menyebabkan penurunan inti positif-TUNEL, menunjukkan bahwa CGA@SeNPs dapat melindungi neuron dari apoptosis sel PC12 yang diinduksi Aβ40. Jika tidak, tingkat tinggi ROS dalam sel juga berpartisipasi dalam apoptosis [32]. Dengan demikian, hasil ini menunjukkan bahwa apoptosis yang dibangkitkan Aβ40 mungkin dikaitkan dengan generasi ROS. Perlu diperhatikan bahwa CGA juga dapat mengurangi apoptosis sel yang diinduksi Aβ40. Dari uji MTT dan LDH, CGA tidak meningkatkan kelangsungan hidup sel dan mengurangi kerusakan membran sel yang diinduksi agregat Aβ. Hasil gabungan dari uji TEM dan ThT, kami menemukan bahwa CGA memiliki sifat anti-oksidasi yang dapat membersihkan oksigen aktif dalam proses agregasi Aβ, tetapi tidak dapat sepenuhnya menghambat agregasi A. Oleh karena itu, CGA dapat menurunkan generasi ROS dalam larutan inkubasi dan sel PC12, melindungi apoptosis sel yang diinduksi ROS, tetapi tidak dapat mengurangi kerusakan membran sel yang diinduksi agregat Aβ. Kerusakan membran sel akan mengakibatkan bocornya isi intraseluler ke jaringan sekitarnya, yang dapat menyebabkan kerusakan jaringan dan inflamasi [33]. Dengan demikian, kombinasi agregasi Aβ yang dihambat dan pembentukan spesies oksigen reaktif dapat dipertimbangkan sebagai metode terapi baru.
CGA@SeNPs mencegah apoptosis sel yang diinduksi Aβ40 dalam sel PC12. Apoptosis sel dideteksi dengan uji co-staining TUNEL-DAPI. Inti sel normal diwarnai dengan warna biru, dan fragmen DNA diwarnai dengan warna hijau. Aβ40 =35 μM, CGA@SeNPs/CGA =60 μg/mL
Kesimpulan
Singkatnya, CGA memiliki sifat farmakologis anti-oksidasi, tetapi tidak memiliki efek dalam menghambat fibrilasi Aβ. Modifikasi permukaan CGA pada SeNP memberinya properti anti-agregasi baru. Aβ40 dapat mengikat pada permukaan CGA@SeNPs, yang menghasilkan kondisi yang tidak menguntungkan untuk nukleasi dan pertumbuhan fibril melalui pemblokiran kontak langsung antara monomer. Dalam hal itu, CGA@SeNPs menghambat agregasi Aβ40, membersihkan ROS, dan melindungi sel PC12 dari gangguan membran sel dan apoptosis yang dimediasi ROS yang diinduksi oleh agregat Aβ40. Namun, pada kelompok CGA, agregat Aβ tidak bergerak di permukaan sel dan menyebabkan kerusakan membran sel, yang juga mengakibatkan kematian sel. Secara keseluruhan, CGA@SeNPs lebih efisien daripada CGA dalam mengurangi racun Aβ40 dalam penggunaan jangka panjang.
