Tindakan Sinergi Antioksidan dan Anti-Amilod Asam Klorogenat-Nanopartikel Sele nium in Vitro

Abstrak

Akuumulasi plak amiloid-β (Aβ) dan spesies reaktif oksigen (ROS) menjadi dasar patologi penyakit Alzheimer (AD). Di sini kami melaporkan komplek nanobar baru—nanopartikel sele nium dilapisi asam klorogenat (CGA@SeNPs)—yang menggabungkan kemampuan binding Aβ dari SeNPs dengan potensi antioksidan asam klorogenat (CGA). Uji in vitro menunjukkan bahwa sementara CGA bebas menyeka ROS yang diinduksi Aβ, ia gagal memblokir agregasi Aβ atau melindungi membran neuron. Sebaliknya, CGA@SeNPs secara signifikan menghambat fibrilogenesis Aβ40, mengurangi generasi ROS, dan mempertahankan viabilitas serta integritas membran sel PC12, yang melebihi CGA sendirian. Temuan ini menyoroti CGA@SeNPs sebagai kandidat terapeutik target ganda yang menjanjikan untuk AD.

Latar Belakang

Penyakit Alzheimer (AD) adalah gangguan neurodegeneratif yang progresif tanpa henti yang ditandai dengan penurunan kognitif dan kerusakan neuron. Ciri khas AD adalah penampilan ekstrakelular plak amiloid-β (Aβ) yang terlipat salah, yang tidak hanya mengganggu fungsi sinaps tetapi juga memicu produksi ROS, yang mengakibatkan kerusakan oksidatif pada DNA, lipid, dan protein. Oligomer dan protofibril Aβ yang neurotoksik semakin diakui sebagai pelaku utama dalam patogenesis AD.

Nanopartikel (NP) menawarkan atribut fisikokimia unik—ukuran kecil, luas permukaan besar, dan reaktivitas yang dapat disesuaikan—yang memungkinkan mereka untuk berinteraksi dengan Aβ, memodulasi agregasinya, dan menyampaikan agen terapeutik. Nanopartikel sele nium (SeNPs) sangat menarik karena kompatibilitas biologis, toksisitas rendah, dan peran esensial dalam homeostase redoks seluler. Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa modifikasi permukaan SeNPs dengan peptid anti-amilod dapat meningkatkan sekuestrasi Aβ mereka. Namun, dampak konjugasi antioksidan alami ke SeNPs pada inhibisi agregasi dan penyeka ROS belum telah dijelajahi.

Asam klorogenat (CGA) adalah polifenol yang melimpah di kopi dan berbagai buah. Ia menunjukkan efek antioksidan, antiinflamasi, dan neuroprotektif yang kuat, namun kegunaan klinisnya terbatas oleh ketersediaan biologis yang buruk. Dengan menggrafting CGA ke SeNPs, kami bertujuan untuk mengatasi keterbatasan ini dan mengevaluasi potensi terapeutik komplek ini terhadap toksisitas yang diinduksi Aβ.

Metode dan Desain Eksperimen

Bahan dan Garis Sel

Peptida Aβ40, dioksida sele nium, borohidrat natrium, MTT, Thioflavine T, DCFH-DA, dan reagen lainnya diperoleh dari Sigma. CGA diperoleh dari Aladdin. Sel PC12 dikultur dalam DMEM yang dilengkapi dengan 5 % FBS dan 10 % serum kuda pada 37 °C, 5 % CO₂.

Persiapan CGA@SeNPs

SeNPs disintesis dengan mengurangi campuran CGA–selenit natrium dengan NaBH₄. Rasio CGA:SeO₂ optimal adalah 1:6, menghasilkan partikel bola ~100 nm yang dikonfirmasi oleh TEM.

Karakterisasi

• Mikroskopi transmisi elektron (TEM) untuk morfologi.
• Spektroskopi energi-dispersif X-ray (EDX) untuk komposisi elemen.
• UV-vis dan spektroskopi fluoresensi untuk properti optik.
• Pencaran cahaya dinamis (DLS) untuk stabilitas ukuran dalam PBS.

Uji Antioksidan dan ROS

Aktivitas penyeka hidroksil, ABTS⁺, dan anion superoksida diukur menggunakan komersial kit. Produksi H₂O₂ yang diinduksi Aβ diukur dengan fluoresensi DCFH-DA.

Pengawasan Agregasi Aβ

Fluoresensi Thioflavine T melacak pembentukan fibril selama 5 hari. TEM memvisualisasikan morfologi fibril. Pencaran cahaya resonansi (RLS) menilai affinitas binding antara CGA@SeNPs dan monomer Aβ.

Evaluasi Sitorositas dan Apoptosis

MTT dan uji pelepasan LDH mengukur viabilitas sel dan integritas membran, masing-masing. ROS intrakelular dideteksi oleh DCFH-DA, sementara pewarnaan TUNEL-DAPI mengidentifikasi inti apoptosis pada sel PC12 yang diekspose pada agregat Aβ ± CGA atau CGA@SeNPs.

Hasil dan Pembahasan

Karakterisasi CGA@SeNPs

Gambar TEM menunjukkan bola yang seragam, ~100 nm. EDX mengonfirmasi Se (30 %) dan sinyal khas CGA (C 52,6 %, O 1,5 %). Serapan UV-vis bergeser dari 334 nm (CGA bebas) menjadi 337 nm setelah konjugasi, sementara emisi fluoresensi bergeser merah dari 443 nm menjadi 438 nm, mengonfirmasi penempelan permukaan. Data DLS menunjukkan ukuran partikel yang stabil dalam PBS selama 7 hari.

Aktivitas Antioksidan yang Ditingkatkan

CGA@SeNPs menunjukkan penyeakan yang bergantung pada dosis terhadap radikal hidroksil, ABTS⁺, dan anion superoksida, mencapai inhibisi 70 %–95 % pada 60 µg/mL—superior terhadap CGA atau vitamin C. Dalam uji H₂O₂ yang diinduksi Aβ40, CGA@SeNPs mengurangi generasi ROS secara lebih efektif daripada CGA bebas, menekankan kapasitas antioksidan sinergis.

Inhibisi Agregasi Aβ

Fluoresensi Thioflavine T menunjukkan bahwa CGA@SeNPs secara bergantung pada dosis menekan pembentukan fibril Aβ40, mengurangi puncak fluoresensi sekitar 50 % pada 60 µg/mL. TEM mengkonfirmasi temuan ini: tidak ada fibril yang diamati dalam kehadiran CGA@SeNPs, sementara CGA sendirian tidak mengubah morfologi fibril. Data RLS menunjukkan binding yang kuat dari CGA@SeNPs ke monomer Aβ, yang kemungkinan secara sterilis menghambat nukleasi.

Efek Neuroprotektif

Pada sel PC12, Aβ40 mengurangi viabilitas menjadi 53 %. CGA@SeNPs memulihkan viabilitas menjadi ~95 %, sedangkan CGA hanya meningkatkannya menjadi 66 %. Pelepasan LDH mencerminkan tren ini, dengan CGA@SeNPs menormalisasi integritas membran. Uji ROS intrakelular dan apoptosis (DCFH-DA, TUNEL) menunjukkan bahwa CGA@SeNPs menekan stres oksidatif dan fragmentasi DNA yang diinduksi Aβ, sementara CGA menawarkan perlindungan sebagian.

Kesimpulan

Asam klorogenat yang dikonjugasi ke nanopartikel sele nium memberikan komplek ini fungsi ganda anti-amilod dan antioksidan. CGA@SeNPs binding Aβ, mencegah pembentukan fibril, menyeka ROS, dan melindungi sel neuron dari kerusakan membran dan apoptosis. Dibandingkan dengan CGA bebas, komplek nano ini menawarkan efikasi dan stabilitas yang ditingkatkan, memosisikannya sebagai strategi terapeutik yang menjanjikan untuk mengurangi patologi AD.

Singkatan

ABTS⁺

2,29-Azinobis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfat asam)

AD

Penyakit Alzheimer

Aβ

Amlod-β

CGA

Asam klorogenat

DCFH-DA

2′,7′-Diklorodihidrofluoresesin diasetat

LDH

Laktat dehidrogenase

MTT

Tetrazolium bromida thiazolyl biru

ROS

Spesies reaktif oksigen

SeNPs

Nanopartikel sele nium

TEM

Mikroskopi transmisi elektron

ThT

Thioflavine T

TUNEL

Terminal transferase dUTP nick end labeling