Nanoalginat melalui Inverse-Micelle Synthesis:Doxorubicin-Encapsulation dan Sitotoksisitas Kanker Payudara

Metode

Materi

Natrium alginat, kalsium klorida dihidrat, sikloheksana (99,9%), dan dodesilamin (98%) dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Doksorubisin hidroklorida dibeli dari MedChem Express (Monmouth Junction, NJ). Reagen ini digunakan apa adanya, dengan pelarutan natrium alginat dan terapi dalam air seperti yang ditunjukkan. Semua air adalah 18 MΩ air yang disaring yang disediakan dari sumber Milli-Q.

Persiapan Nanoalginat

Natrium alginat dilarutkan dalam botol kaca pada 15 mg/mL dalam air dan dibiarkan bercampur melalui batang pengaduk selama minimal 30 menit sebelum digunakan. DOX dilarutkan dalam fase berair ini jika akan dimasukkan ke dalam nanocarrier. Solusi alginat diperiksa untuk pembubaran lengkap bubuk alginat sebelum digunakan dalam sintesis. Tanpa pengenalan kation multivalen, fase alginat berair tetap homogen selama berminggu-minggu. Delapan mililiter sikloheksana dipipet ke dalam vial. Dodecylamine, padatan pada suhu kamar, dipanaskan di bawah air hangat selama beberapa menit, sampai beberapa padatan telah diubah menjadi bentuk cair. Kemudian, 80 L dodesilamina dipipet ke dalam sikloheksana. Batang pengaduk ditambahkan ke dalam botol kaca, dan campuran tersebut kemudian diaduk pada kecepatan 125 rpm. Setelah 5 menit pencampuran, fase organik dianggap tercampur dengan baik dan siap untuk penambahan fase air. Dua puluh mikroliter fase alginat berair ditambahkan ke fase organik sikloheksana/dodesilamin. Kecepatan pengadukan ditingkatkan menjadi 1200 rpm. Pencampuran terjadi di bawah pengadukan konstan selama 20 menit. Tiga puluh mikroliter larutan kalsium klorida 50 mM kemudian ditambahkan ke dalam campuran. Setelah 25 menit pencampuran/gelasi partikel, 2 mL air ditambahkan ke dalam campuran, menciptakan lapisan air di bawah lapisan organik. Nanopartikel dipisahkan menjadi fase air, dan pipet 1 mL digunakan untuk menghilangkan lapisan air.

Pemurnian NALG

Lapisan berair diputar dalam unit filter sentrifugal 100 kDa (Pall) selama 10 menit pada 3200×g dalam centrifuge untuk menghilangkan agregat besar, dan permeat dipindahkan ke unit 10 kDa (Millipore). Larutan kemudian dipintal selama 5 menit dengan kecepatan yang sama untuk menyaring kotoran-kotoran kecil. Air ditambahkan dan dipintal selama 5 menit untuk mencuci retentate. Volume akhir 1 mL dikumpulkan, dan karakterisasi dilakukan pada produk ini.

Karakterisasi NALG

Solusi nanopartikel yang disaring dipindahkan ke kuvet (Instrumen Malvern, sel zeta DTS 1070) untuk pengukuran hamburan cahaya dinamis. Distribusi ukuran ditentukan menggunakan Malvern Zetasizer ZSP (Malvern Instruments, UK). Pengukuran ukuran dilakukan menggunakan laser dengan panjang gelombang 633 nm pada 25 °C dengan metode deteksi sudut hamburan balik 173°. Pengukuran potensial zeta untuk nanopartikel alginat dilakukan dalam kuvet yang sama segera setelah pengukuran ukuran. Pengukuran untuk ukuran dan potensi zeta dilakukan dalam rangkap tiga, dan hasil yang disajikan menunjukkan mean ± standar deviasi dari tiga percobaan. Mikroskop elektron transmisi (TEM) digunakan untuk mengkonfirmasi ukuran nanopartikel dan menyelidiki morfologinya. Gambar TEM diperoleh menggunakan mikroskop elektron transmisi F-20 Technai yang beroperasi pada 4200 eV. Persiapan kisi TEM melibatkan pengendapan tetes demi tetes 10 L larutan nanopartikel pasca-filter ke permukaan tembaga kisi TEM yang didukung formavar/karbon (Ted Pella). Kisi-kisi TEM basah ditempatkan dalam desikator semalaman sebelum pencitraan untuk memastikan pengeringan yang tepat.

Doksorubisin memiliki fluoresensi intrinsik, yang dapat digunakan untuk membandingkan fluoresensi nanopartikel doksorubisin alginat (NALG-DOX) dengan kurva standar DOX untuk memperkirakan konsentrasinya. Kami menggunakan panjang gelombang eksitasi/emisi 470/550 nm. Pelepasan doksorubisin dari larutan NALG-DOX ditentukan dengan mendialisis larutan nanopartikel tersaring akhir menjadi phosphate-buffered saline (PBS) pada pH 7,4 atau buffer sitrat pada pH 5,5. Dua set lima batch NALG-DOX disiapkan seperti yang dijelaskan sebelumnya, dengan konsentrasi DOX awal 1,25 mg/mL dalam fase alginat berair. Delapan belas perangkat Slide-A-Lyzer MINI Dialisis (ThermoFisher) dengan volume dalam 100 μL dan potongan berat molekul 2 kDa disiapkan dengan menambahkan 100 μL NALG-DOX ke setiap perangkat. Setiap perangkat ditempatkan dalam botol kilau yang berisi 20 mL buffer. Batang pengaduk ditambahkan ke setiap vial yang mengandung buffer, dan semua vial ditempatkan di atas pelat pengaduk untuk pengadukan lembut selama percobaan. Botol ditutup untuk mengurangi hilangnya buffer karena penguapan, dan untuk melindungi dari cahaya. Pada setiap titik waktu (1, 2, 4, 24, 48, 72 jam), tiga perangkat dikeluarkan, 100 μL sampel dikeluarkan dari setiap perangkat dan ditempatkan di sumur terpisah, dan pengukuran fluoresensi dilakukan pada Tecan Pembaca pelat mikro M200 Pro tak terbatas (Tecan Trading AG) pada 470/550 nm. Pengukuran fluoresensi dibandingkan dengan pengukuran dari kurva standar dan alikuot awal yang diambil sebelum percobaan untuk menentukan konsentrasi dan jumlah kehilangan DOX ke buffer.

Kultur dan Dosis Sel

Sel kanker payudara murine, Bioware Ultra Green Cell Line 4T1 luciferase/protein fluoresen hijau (4T1-luc2-GFP, adenokarsinoma tikus) dan tidak ada sel reporter 4T1 yang diperoleh dari PerkinElmer (Waltham, MA). Sel-sel ini dipelihara dengan media RPMI 1640 yang dilengkapi dengan 10% serum janin sapi (FBS) dan 1% penisilin/streptomisin dalam 5% CO₂ inkubator yang beroperasi pada suhu 37 °C. Sel-sel 4T1 diunggulkan pada 4000 sel/sumur dalam pelat bawah bening berdinding hitam 96-sumur. Dua puluh empat jam setelah penyemaian di dalam sumur, media awal diaspirasi, dan formulasi obat/media diperkenalkan.

Pencitraan Fluoresensi

Pada 48 jam, media diaspirasi, sel dicuci tiga kali dengan PBS, dan formalin ditambahkan ke dalam sumur. Setelah 30 menit inkubasi suhu kamar, sel-sel dicuci kembali tiga kali dengan PBS, dan dua tetes reagen ReadyProbes sel tetap NucBlue (ThermoFisher) per mililiter media ditambahkan ke sumur. Setelah 1 jam inkubasi suhu kamar, sel-sel dicuci lagi tiga kali dengan PBS. Kemudian, 100 L PBS ditambahkan ke sel tetap, dan pelat dipindahkan ke Sistem Pencitraan Sel Otomatis EVOS FL (ThermoFisher). Objektif × 20 digunakan untuk mencitrakan bagian dari sumur tertentu di setiap pelat. Gambar dari setiap saluran fluoresensi direkam secara terpisah; gambar biru untuk 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), gambar merah untuk DOX (menggunakan saluran RFP untuk menangkap fluoresensi intrinsik), dan gambar hijau untuk GFP. Sel 4T1-luc2-GFP mengekspresikan protein fluoresen hijau, jadi tidak diperlukan pewarnaan tambahan agar sel terlihat di saluran hijau. Perlakuan DOX “menodai” sel, dan tidak diperlukan reagen lebih lanjut untuk memvisualisasikannya di saluran merah. Gambar telah disesuaikan kecerahan/kontrasnya di ImageJ.

Uji Viabilitas Sel Hidup/Mati

Penilaian kualitatif viabilitas sel 4T1 setelah koinkubasi dengan NALG, DOX, dan NALG-DOX dievaluasi menggunakan uji viabilitas sel LIVE/DEAD (ThermoFisher). Pada 72 jam setelah pengenalan media sarat obat, media diaspirasi, dan sel dicuci tiga kali dengan PBS. Uji LIVE/DEAD dilakukan dengan menambahkan dua tetes dari setiap penetes NucBlue Live Reagent dan NucGreen Dead Reagent (ThermoFisher) per mililiter media. Tiga pencucian lagi dengan PBS dilakukan setelah 30 menit inkubasi, dan formalin ditambahkan ke sumur untuk memperbaiki sel. Tiga pencucian lagi dengan PBS mengikuti formalin, dan jumlah akhir 100 μL PBS ditambahkan ke setiap sumur. Pencitraan serupa dilakukan seperti yang dinyatakan, tetapi saluran hijau sekarang menunjukkan adanya sel-sel mati, karena membran sel yang terganggu memungkinkan reagen hijau masuk ke dalam sel.

Uji Viabilitas Sel Hidup/Mati

Penilaian kuantitatif viabilitas sel 4T1 setelah koinkubasi dengan NALG, DOX, dan NALG-DOX dievaluasi menggunakan uji viabilitas sel Alamar Blue (ThermoFisher). Pada 72 jam setelah pengenalan media sarat obat, media diaspirasi. Uji Alamar Blue dilakukan dengan menambahkan 10 L reagen Alamar Blue ke setiap sumur dengan 100 L media baru dan diinkubasi selama 1 jam pada 37 °C. Setelah 1 jam, viabilitas sel ditentukan untuk setiap sumur menggunakan pembaca pelat mikro Tecan Infinite M200 Pro (Tecan Trading AG). Panjang gelombang eksitasi/emisi diatur ke 560/590, pengaturan penguatan optimal ditentukan untuk pelat oleh perangkat lunak, dan protokol baca bawah digunakan untuk membaca intensitas fluoresensi untuk setiap sumur di pelat. % viabilitas sel dapat ditentukan dari pembacaan intensitas fluoresensi melalui persamaan:

Hasil dan Diskusi

Proses Emulsi Misel Terbalik

Dalam karya ini, pembawa obat nanoalginat, NALG, disiapkan melalui proses emulsi misel terbalik, seperti yang diilustrasikan pada Gambar. 1. Alginat berair ditambahkan ke fase minyak sikloheksana/dodesilamin, yang membentuk misel terbalik. Alginat kemudian diikat silang dengan penambahan kalsium klorida (CaCl₂ ) solusi. Setelah waktu berlalu untuk memungkinkan pengikatan silang alginat dalam misel terbalik, NALG diekstraksi dengan penambahan air. Akhirnya, filter sentrifugal menghilangkan kontaminan laten dan membantu mempersempit distribusi ukuran nanopartikel. Produk akhirnya adalah larutan koloid berair transparan.

Proses formulasi untuk pembentukan NALG dan NALG-DOX. a Representasi skema dari proses sintesis misel terbalik. Rantai alginat berair diikat silang dalam rendaman organik (atas), diekstraksi ke fase berair (kiri bawah), kemudian disaring untuk pemurnian (kanan bawah). b Interaksi molekuler Ca ²⁺ ikatan silang, yang mengarah ke NALG yang terbentuk. c Foto sintesis di berbagai titik, dari kiri ke kanan, emulsi sebelum CaCl₂ penambahan, emulsi setelah CaCl₂ penambahan, dan pemisahan pada penambahan air

Komponen sistem emulsi misel terbalik ditentukan berdasarkan data eksperimen dan literatur sebelumnya. Untuk mempersempit derajat kebebasan dalam sistem, kami memilih sikloheksana untuk fase organik. Dalam optimasi proses ini, kami menguji serangkaian surfaktan untuk kemampuannya membentuk partikel alginat skala nano yang ditunjukkan oleh peningkatan kekeruhan campuran organik pada pengenalan sejumlah kecil fase air sambil diaduk. Dodecylamine adalah kandidat yang cocok dan dipilih sebagai surfaktan untuk digunakan bergerak maju. Air dipilih sebagai fase berair dalam eksperimen yang disajikan di sini.

Karakterisasi NALG

Pada Gambar. 2a, b, distribusi ukuran hidrodinamik nanopartikel untuk NALG dan NALG-DOX ditampilkan. Nanopartikel, apakah kosong atau dimuat secara terapeutik, menunjukkan puncak serupa yang berpusat di sekitar 90 nm. Diameter partikel untuk NALG dan NALG-DOX, masing-masing, adalah 92.2 ± 4.2 nm dan 82.8 ± 3.6 nm. Indeks polidispersitas (PDI) untuk partikel adalah 0,320 ± 0,063 dan 0,204 ± 0,044, dan potensial adalah 15,0 ± 0,8 mV dan 7,2 ± 4,6 mV.

Distribusi hamburan cahaya dinamis a NALG dan b NALG-DOX menunjukkan distribusi monodispersi nanopartikel alginat. Gambar mikroskop elektron transmisi c NALG dan d NALG-DOX menunjukkan morfologi bulatan partikel. Bilah skala menunjukkan 50 nm dalam gambar yang lebih besar, dan 20 nm di sisipan

Ukuran partikel konsisten pada penggabungan DOX ke dalam matriks alginat. Potensi negatif untuk NALG kosong, yang konsisten dengan nanopartikel alginat lain yang dihubungkan oleh kalsium [39]. Partikel bermuatan doksorubisin memiliki potensi positif. Hal ini dapat disebabkan sebagian kelebihan ion kalsium bermuatan positif pada permukaan partikel, yang dapat membantu memberikan muatan positif pada nanopartikel. Selain itu, amina primer yang ada pada molekul DOX dapat berinteraksi secara elektrostatik dengan gugus asam karboksilat bebas pada alginat, mengurangi muatan negatif yang tersedia pada permukaan partikel.

Gambar 2c, d menunjukkan gambar mikroskop elektron transmisi NALG dan NALG-DOX yang berikatan silang kalsium. Kedua jenis nanopartikel menampilkan morfologi sferis. Distribusi umum nanopartikel tampak serupa ukurannya dengan distribusi DLS. Konsentrasi larutan NALG-DOX akhir dievaluasi menggunakan fluoresensi intrinsik dari molekul doksorubisin. Volume produk NALG-DOX yang disaring dibagi menjadi tiga set perangkat dialisis yang ditempatkan ke dalam botol kilau berisi PBS dan DOX dibiarkan beberapa kali untuk dilepaskan dari NALG-DOX. Awalnya, konsentrasi DOX dalam larutan NALG-DOX adalah ~  4 μg/mL, menunjukkan bahwa efisiensi enkapsulasi, atau rasio DOX dalam NALG-DOX terhadap DOX awal yang ditambahkan ke formulasi, untuk NALG-DOX adalah ~ 7%. Sementara efisiensi enkapsulasi ini dianggap rendah dibandingkan dengan partikel serupa [57], hal ini mungkin karena kehadiran DOX awal dalam fase air. Kami tidak mengulangi formulasi dengan menurunkan jumlah DOX yang ada dalam fase air awal dan berhipotesis bahwa efisiensi dapat ditingkatkan dengan menurunkan jumlah DOX dalam formulasi awal. DOX yang tidak dienkapsulasi kemungkinan melewati pencucian filter 3 kDa di akhir sintesis. Dengan ketersediaan dan biaya doksorubisin yang relatif rendah, kami memilih untuk "menjenuhkan" formulasi dengan DOX, mengetahui bahwa sejumlah besar sisa DOX kemungkinan akan melewati tanpa kapsul. Meningkatkan efisiensi enkapsulasi dapat meningkatkan platform partikel ini di pekerjaan mendatang.

Kurva pelepasan untuk NALG-DOX pada pH 5,5 dan 7,4 dapat ditemukan pada Gambar. 3. NALG-DOX mempertahankan sekitar 70% muatan DOX selama 4 jam pertama, dengan 90% meninggalkan partikel pada 24 jam , pada pH 7,4. Pola pelepasan ini umum untuk bahan polimer [57, 58], dan menunjukkan pelepasan terkontrol selama 24 jam pertama saat terpapar ke reservoir PBS. Pada pH yang lebih rendah dari 5,5, lebih mirip dengan pH nanopartikel akan melihat selama penyerapan sel dalam endosom akhir [59], DOX dilepaskan pada tingkat yang lebih cepat. Ini adalah perilaku yang diinginkan, karena pelepasan yang lebih lambat diperlukan ketika dalam sirkulasi umum dalam darah, tetapi ketika dalam lingkungan mikro tumor yang asam, pelepasan yang lebih cepat lebih disukai.

Pelepasan doksorubisin dari larutan nanopartikel menunjukkan pelepasan terkontrol selama 24 jam pertama di PBS, pH 7,4. Pelepasan doksorubisin lebih cepat terjadi pada pH 5,5. Setiap titik mewakili mean ± standar deviasi n = 3 pengukuran

Serapan DOX Seluler

Penyerapan NALG-DOX oleh sel kanker payudara tikus 4T1 pada 48 jam ditunjukkan pada Gambar 4a, b. Setiap baris menunjukkan saluran warna yang terpisah, dan baris bawah menunjukkan gambar gabungan dari semua saluran warna. Di kolom kiri, konsentrasi tinggi DOX atau NALG-DOX digunakan, yang cukup untuk menghilangkan sebagian besar sel. Kolom tengah menunjukkan konsentrasi 0,31 μg/mL untuk DOX, dan 0,28 μg/mL untuk DOX dalam NALG-DOX, yang menunjukkan beberapa potensi pembunuhan sel, dan kolom kanan menunjukkan sel yang tidak diobati. Sel di gambar tengah menunjukkan doxorubicin (merah) di sekitar dan tumpang tindih dengan nukleus (biru) sel. Ada pengurangan jumlah sel di dua kolom pertama di kedua panel a dan b karena adanya DOX, yang menghambat proliferasi sel dibandingkan dengan sumur yang tidak diobati. Doksorubisin berfungsi melalui interkalasi ke dalam DNA inti [12], dan kolokalisasi doksorubisin dan nukleus dapat menunjukkan bahwa ia berfungsi melalui mekanisme ini pada saat penyerapan. Pada Gambar. 4b, doksorubisin yang dienkapsulasi berbeda di pinggiran area nuklir. Kolom kanan menunjukkan sel yang tidak diobati tanpa sinyal signifikan yang terdeteksi di saluran merah. DOX gratis, meskipun kuat, akan menimbulkan toksisitas target dan telah mengurangi waktu sirkulasi in vivo. Enkapsulasi memungkinkan pelepasan yang lebih stabil selama peningkatan waktu sirkulasi, membuat NALG-DOX berpotensi lebih baik secara in vivo, dan dapat dieksplorasi dalam pekerjaan di masa mendatang.

Mikroskop fluoresensi gambar sel kanker payudara 4T1-luc2-GFP tetap yang diobati dengan doxorubicin (DOX) (a ) dan NALG-DOX (b ) setelah paparan 48 jam. Bilah skala menunjukkan 100 μm. Noda nuklir biru:DAPI; hijau (garis sel yang ditransfeksi):GFP; merah (fluoresensi molekuler intrinsik):DOX

Sitotoksisitas NALG-DOX

Sebagai tes dasar untuk potensi pembunuhan sel, sel 4T1 yang tidak diobati dan sel yang diobati dengan NALG-DOX diwarnai dengan uji sel LIVE/DEAD (ThermoFisher) dan diperbaiki setelah 72 jam paparan. Contoh gambar dari sumur yang tidak dirawat, yang dirawat dengan baik dengan NALG, yang dirawat dengan baik dengan 0,078 μg/mL DOX, dan yang dirawat dengan baik dengan 0,20 μg/mL NALG-DOX, masing-masing ditunjukkan pada Gambar. 5a–d. Tumpang tindih hijau yang ditunjukkan pada Gambar. 5c, d menunjukkan bahwa perlakuan DOX dan NALG-DOX di sumur tersebut menyebabkan kematian banyak sel di sumur itu. Sel-sel tidak dapat berkembang biak dengan cara yang sama seperti pada sumur yang diolah dengan nanopartikel yang tidak diobati dan kosong yang ditunjukkan pada Gambar 5a, b karena adanya terapi. Pengenceran nanopartikel yang digunakan untuk dosis dalam NALG dan NALG-DOX adalah identik.

Uji fluoresensi LIVE/DEAD menunjukkan sedikit atau tidak ada kematian sel pada sel 4T1 yang tidak diobati (a ) dan dalam sel yang diobati dengan NALG (b ). Intensitas sinyal saluran hijau (pewarnaan sel mati) kuat pada sejumlah besar sel yang diobati dengan 0,078 μg/mL DOX (c ) dan 0,20 μg/mL NALG-DOX (d ), menunjukkan kematian sel. Bilah skala menunjukkan 100 μm. Konsentrasi menunjukkan jumlah DOX, baik bebas atau dalam partikel. Dosis NALG dalam (b ) pada kerapatan partikel yang sama seperti pada NALG-DOX

Penilaian kuantitatif viabilitas sel dari sel 4T1-luc2-GFP setelah 72 jam paparan NALG, DOX bebas, dan NALG-DOX melalui uji Alamar Blue (ThermoFisher) ditunjukkan pada Gambar. 6. Pada Gambar. 6a, doksorubisin bebas -sel yang diobati menunjukkan sel yang kurang layak di seluruh rentang konsentrasi daripada sel yang diobati dengan NALG-DOX (untuk konsentrasi DOX yang setara). Ini selanjutnya ditampilkan oleh IC₅₀ nilai, atau konsentrasi yang diperlukan untuk menunjukkan efek penghambatan 50%, yaitu 0,093 μg/mL dan 0,45 μg/mL, masing-masing untuk DOX gratis dan NALG-DOX. Nilai DOX gratis serupa dengan yang ditemukan pada 72 jam terhadap sel 4T1 oleh Du et al. [60]. IC₅₀ nilai serupa dengan yang ditemukan oleh Eliaz et al. dengan DOX dan DOX yang dienkapsulasi liposom pada 72 jam melawan sel melanoma B16F10 [61].

Viabilitas sel sel 4T1-luc2-GFP setelah 72 jam terpapar NALG-DOX dan DOX (a ) dan NALG (b ) pada berbagai konsentrasi. Titik data dan bilah kesalahan menunjukkan mean ± standar deviasi dari n = 3 sumur. Konsentrasi menunjukkan jumlah DOX, baik bebas atau dalam partikel, dalam (a ). Dalam b , sumur NALG diberi dosis mulai pada konsentrasi partikel yang sama dengan NALG-DOX, menunjukkan sedikit atau tidak ada kematian sel dari pembawa obat saja

Konsentrasi doksorubisin yang lebih tinggi diperlukan agar NALG-DOX menunjukkan efek yang serupa dengan obat bebas. Ini harus diharapkan, karena terapi yang dienkapsulasi lebih terhambat dalam pengangkutannya ke tempat efeknya. Doksorubisin yang dienkapsulasi masih menunjukkan efek penghambatan sel, artinya obat tersebut masih aktif secara terapeutik atau nanopartikel itu sendiri beracun bagi sel. Untuk menguji ini, viabilitas NALG dievaluasi dengan cara yang mirip dengan NALG-DOX. NALG menunjukkan toksisitas minimal di semua konsentrasi, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6b, menunjukkan bahwa obat tersebut manjur.