Titik Kuantum Kadmium Tellurida Modifikasi PEG Mengantarkan Doksorubicin untuk Pengobatan Targeted Multiple Myeloma Ekstrameduler

Pendahuluan

Multiple myeloma (MM) adalah malignitas hematologik kedua yang paling umum, yang ditandai oleh proliferasi klonal sel plasma di tulang sumsum. Meskipun kemajuan dalam kemoterapi dan agen target telah memperpanjang kelangsungan hidup keseluruhan, subset pasien dengan penyakit ekstrameduler (EMM) terus memiliki prognosa yang parah, dengan kelangsungan hidup median kurang dari enam tahun setelah rezidiv. Opsi terapeutik saat ini, termasuk talidomida dan bortezomib, memberikan manfaat yang terbatas untuk EMM, sedangkan kemoterapi dosis tinggi dapat meningkatkan hasil namun seringkali tidak dapat ditoleransi karena kardiotoksisitas dan presi tulang sumsum.

Doksorubicin tetap menjadi sumbang dalam terapi MM; namun, penggunaan klinisnya dibatasi oleh efek samping yang bergantung pada dosis, terutama pada populasi lanjut usia yang mencakup mayoritas pasien MM. Sistem pengiriman obat berbasis nanopartikel menawarkan solusi yang menjanjikan dengan memperpanjang sirkulasi sistemik, memungkinkan pelepasan yang terkontrol, dan mengkonsentrasi agen terapeutik pada situs tumor sambil menyelamatkan jaringan sehat.

Titik kuantum kadmium tellurida (CdTe QDs) menunjukkan properti optik unik dan dapat difungsikan dengan polietilenglikol (PEG) untuk mencapai “penghindaran imun,” mengurangi opsonisasi dan memperpanjang waktu tinggal darah. CdTe QDs yang difungsikan PEG telah ditunjukkan internalisasi yang efisien melalui endosistolis fase cair dan melepaskan muatan sebagai respons terhadap mikroenvironment asam yang khas pada tumor. Dalam karya ini, kami memproduksi nanokonjugat PEG-CdTe-DOX dan mengevaluasi karakteristik fisikokimia, pelepasan obat yang responsif pH, penyerapan seluler, sitotoksisitas, dan induksi apoptoisis pada baris sel EMM manusia.

Bahan dan Metode

Bahan

Titik kuantum PEG-CdTe, kit assay protein bicinchoninic acid (BCA) Pierce™, dan doksorubicin (DOX) dibeli dari Sigma-Aldrich, Dalian Meilun Biology Technology Co., dan pemasok lain seperti yang tertera dalam naskah asli. PRMI-1640, FBS, Annexin V-FITC, CCK-8, dan reagen terkait diperoleh dari sumber komersial standar. Antibodi terhadap Bax, Caspase-3, Bcl-2, dan β-aktin diperoleh dari Cell Signaling Technology. Instrumentasi analitik mencakup TEM (Japan Electron Optics Laboratory), Zetasizer NanoZs (Malvern), HPLC (Jasco), mikroskop konfokal Nikon C-2, sel aliran BD Accuri C6, dan sistem deteksi ECL Tanon 5200.

Persiapan PEG-CdTe-DOX

DOX diadsorpsi pada titik kuantum PEG-CdTe melalui interaksi elektrostatis dengan mencampur volume yang sama (100 µl) dari 1 mg/ml PEG-CdTe dan 1 mg/ml DOX dalam 800 µl air deion, diaduk pada 100 rpm selama 24 jam pada 37 °C dalam gelap. Campuran dikomfugasi (30 menit, 4 °C, 30.000 rpm) untuk mengumpulkan PEG-CdTe-DOX, yang dicuci dua kali untuk menghilangkan DOX yang tidak terikat. Efisiensi enkapsulasi (EE) dan muatan obat (DL) dihitung sebagai berikut:

$$\text{DL}=\frac{\text{Berat obat dalam NP}}{\text{Berat NP}}\times 100\%$$

$$\text{EE}=\frac{\text{Berat obat dalam NP}}{\text{Berat awal obat}}\times 100\%$$

Karakterisasi

Morfologi PEG-CdTe dan PEG-CdTe-DOX diperiksa oleh TEM. Diameter hidrodinamik dan distribusi ukuran diukur dengan pencaharan cahaya dinamis (DLS) dalam PBS. Untuk menilai pelepasan obat yang responsif pH, PEG-CdTe-DOX (1 mg/ml DOX) difusikan (MWCO 3,5 kDa) terhadap PBS pada pH 5,0, 6,0, 7,4, dan 8,0, dengan sampel dikumpulkan setiap 2 jam selama 24 jam. Konsentrasi DOX diukur dengan spektrofotometri pada 450 nm.

Mikroskopi Konfokal Fluoresensi

Sel PRMI8226 diinkubasi dengan PEG-CdTe, DOX bebas, atau PEG-CdTe-DOX selama 4 jam, di-fix dengan DAPI, dan dicitrakan dengan mikroskop konfokal Nikon C-2. Panjang gelombang emisi: DAPI 450 nm; DOX 585 nm.

Budidaya Sel

Baris sel PRMI8226 dan 293T dipertahankan dalam RPMI-1640 dan DMEM masing-masing, yang disuplai 10 % FBS, 100 U/ml penicilin, dan 100 µg/ml streptomycin pada 37 °C, 5 % CO₂.

Assay Viabilitas Sel

CCK-8 digunakan untuk mengevaluasi viabilitas sel PRMI8226 dan 293T setelah pengobatan dengan PBS, PEG-CdTe, DOX bebas, atau PEG-CdTe-DOX pada berbagai konsentrasi dan titik waktu. Viabilitas sel diekspresikan sebagai (1 – ODₜ/OD_c) × 100 %.

Penyerapan Seluler

Sel aliran mengukur intensitas fluoresensi DOX intrakelular dalam sel PRMI8226 setelah inkubasi 24 jam dengan formulasi yang berbeda. Intensitas fluoresensi relatif (FI) dihitung sebagai FI_terlakukan / FI_PEG-CdTe.

Assay Apoptoisis

Sel PRMI8226 diwarnai dengan Annexin V-FITC dan PI, kemudian dianalisis dengan sel aliran untuk menentukan apoptoisis awal dan akhir.

Western Blotting

Ekstrak protein dari sel PRMI8226 yang diobati dipisahkan oleh SDS-PAGE 10 %, ditransfer ke membran PVDF, dan diprobe untuk Bax, Bcl-2, Caspase-3, dan β-aktin. Band divisualisasikan dengan ECL dan dikuantifikasi menggunakan Image J.

Analisis Statistik

Data disajikan sebagai mean ± SD. Signifikansi statistik dievaluasi dengan uji t Student, dengan *p* < 0,05 dianggap signifikan. Eksperimen dilakukan dalam triplicate.

Hasil

Karakterisasi PEG-CdTe-DOX

Gambar TEM mengonfirmasi inti kristalin dan dispersi seragam dari PEG-CdTe dan PEG-CdTe-DOX (Gambar 2a,b). Analisis DLS menunjukkan diameter hidrodinamik 8,20 nm untuk PEG-CdTe dan 78,31 nm untuk PEG-CdTe-DOX (Gambar 2c). EE dan DL adalah 77,20 % ± 1,12 % dan 42,12 % ± 0,98 %, masing-masing (Gambar 2e). Potensial zeta adalah –20,12 ± 2,45 mV (PEG-CdTe) dan –10,50 ± 1,26 mV (PEG-CdTe-DOX).

Studi pelepasan obat menunjukkan profil yang dipicu pH: ~92,5 % DOX dilepaskan pada pH 5,0 dan 88 % pada pH 6,0 dalam 24 jam, sedangkan pelepasan jauh lebih lambat pada pH fisiologis 7,4 dan 8,0 (Gambar 2d). Perilaku ini memastikan pelepasan DOX yang lebih disukai dalam mikroenvironment tumor asam.

Karakteristik PEG-CdTe dan PEG-CdTe-DOX. Catatan: a, b Gambar TEM; c DLS; e EE dan DL; d Pelepasan bergantung pH; f Viabilitas sel 293T setelah paparan PEG-CdTe.

Citra konfokal mengonfirmasi pengiriman DOX intrakelular yang kuat oleh PEG-CdTe-DOX, dengan fluoresensi merah yang jauh lebih tinggi dalam sel PRMI8226 dibandingkan DOX bebas (Gambar 3).

Penyerapan Seluler dan Sitotoksisitas PEG-CdTe-DOX In Vitro

Sel aliran mengungkapkan peningkatan signifikan dalam intensitas fluoresensi DOX intrakelular dalam sel yang diobati PEG-CdTe-DOX dibandingkan DOX bebas (*p* < 0,01; Gambar 4a). Assay CCK-8 menunjukkan inhibi viabilitas PRMI8226 yang bergantung pada waktu: 58 %, 70 %, dan 85 % pada 24, 48, dan 72 jam, masing-masing, yang melebihi efek DOX bebas (*p* < 0,05). Penting, PEG-CdTe sendirian tidak mempengaruhi viabilitas sel, menekankan kompatibilitas biologisnya. Sel 293T tidak terpengaruh pada konsentrasi PEG-CdTe yang setara, mengonfirmasi sitotoksisitas selektif terhadap sel myeloma (Gambar 4b).

Gambar mikroskopi fluoresensi sel PRMI8226 setelah paparan PEG-CdTe, DOX bebas, atau PEG-CdTe-DOX. Fluoresensi merah menunjukkan pengiriman DOX (skala bar: 50 µm).

Intensitas fluoresensi rata-rata (a) dan inhibi pertumbuhan CCK-8 (b) sel PRMI8226 yang diobati dengan PBS, PEG-CdTe, DOX bebas, dan PEG-CdTe-DOX.

Apoptoisis Sel PRMI8226

Pewarnaan Annexin V/PI menunjukkan peningkatan yang jelas dalam sel apoptotik dalam grup PEG-CdTe-DOX (66,5 %) dibandingkan DOX bebas (34,1 %) dan kontrol (≤ 7 %) (Gambar 5). Perbedaan yang signifikan ini (*p* < 0,01) menunjukkan bahwa PEG-CdTe-DOX meningkatkan apoptoisis melalui mekanisme yang ditermediasi pengiriman.

Tingkat apoptoisis sel PRMI8226 di bawah berbagai pengobatan.

Western Blotting

Analisis Western blot menunjukkan peningkatan pro-apoptotik Bax dan Caspase-3, dan penurunan anti-apoptotik Bcl-2 dalam sel yang diobati PEG-CdTe-DOX dibandingkan DOX bebas (Gambar 6). Pergeseran yang jelas dalam rasio Bax/Bcl-2 mengonfirmasi aktivasi jalur apoptoisis mitokondria.

Ekspresi protein terkait apoptoisis dalam sel PRMI8226.

Pembahasan

Ketidaktahan yang buruk terhadap kemoterapi dosis tinggi adalah hambatan utama untuk pengobatan EMM yang efektif. Nanocarrier PEG-CdTe-DOX kami mengatasi keterbatasan ini dengan mengirimkan DOX secara selektif ke sel myeloma, mencapai konsentrasi intrakelular yang lebih tinggi sambil menyelamatkan jaringan normal. EE tinggi (≈77 %) dan DL (≈42 %) memungkinkan pemuatan obat yang efisien. PEGylasi memberikan properti stealth, mengurangi opsonisasi dan memperpanjang sirkulasi sistemik, sementara ukuran nano (~78 nm) memungkinkan permeabilitas dan retensi yang ditingkatkan (EPR) dalam jaringan tumor.

Mikroenvironment tumor asam (pH 5–6) memicu pelepasan DOX yang cepat dari PEG-CdTe-DOX, seperti yang ditunjukkan oleh kinetika pelepasan. Pelepasan lokal ini memaksimalkan sitotoksisitas di tempat yang dibutuhkan dan membatasi paparan sistemik, sehingga mengurangi kardiotoksisitas dan presi tulang sumsum—keterbatasan umum dari terapi DOX konvensional. In vitro, PEG-CdTe-DOX menghasilkan inhibi pertumbuhan dan apoptoisis yang superior dalam sel PRMI8226, diiringi oleh pergeseran dalam rasio Bax/Bcl-2 dan aktivasi Caspase-3, mengonfirmasi keterlibatan jalur mitokondria.

Temuan ini selaras dengan laporan sebelumnya bahwa titik kuantum yang difungsikan PEG meningkatkan targeting tumor dan mengurangi efek off-target. Penting, PEG-CdTe sendirian menunjukkan sitotoksisitas yang tidak signifikan, menekankan kesesuaiannya sebagai carrier obat. Studi in vivo masa depan diperlukan untuk memastikan farmakokinetika, distribusi biodaya, dan manfaat terapeutik dalam model hewan EMM.

Kesimpulan

Kami telah berhasil merancang sistem titik kuantum kadmium tellurida modifikasi PEG yang memuat dan mengantarkan doksorubicin ke sel multiple myeloma ekstrameduler secara efisien. Nanokonjugat ini mencapai pelepasan obat yang poten dan responsif pH, meningkatkan apoptoisis melalui jalur mitokondria, dan mempertahankan viabilitas sel normal, menawarkan platform yang menjanjikan untuk terapi EMM yang lebih aman dan lebih efektif.

Singkatan

DAPI

4′,6-Diamidino-2-fenilindol

DL

Muatan obat

DOX

Doksorubicin

EE

Efisiensi enkapsulasi

EMM

Multiple myeloma ekstrameduler

FCM

Sel aliran

HPLC

Kromatografi cairan tinggi performa

MM

Multiple myeloma

PBS

Layar pelindung fosfat

PEG-CdTe-DOX

Titik kuantum kadmium tellurida modifikasi polietilenglikol yang dimuat doksorubicin

SDS/PAGE

Elektroforesis gel akrilamida polimer natrium dodeksil sulfat

TEM

Mikroskopi elektron transmisi