Preparasi In Situ yang Mudah dan Aktivitas Antibakteri In Vitro Misel Kopolimer Berbasis Perak Berbasis PDMAEMA
Abstrak
Misel polimer yang terdefinisi dengan baik dengan struktur cangkang inti adalah platform pengiriman yang baik untuk menstabilkan nanopartikel perak (AgNPs) di bidang antimikroba yang menargetkan penyakit. Konstruksi rasional dari struktur polimer, pendekatan preparasi yang efisien, mudah, dan hijau, dan eksplorasi komprehensif dari AgNP turunan diperlukan, seperti ukuran, stabilitas partikel, aktivitas antibakteri, dan sifat lainnya. Di sini, kami merancang dan menilai aktivitas antimikroba in vitro dari misel kopolimer yang didekorasi dengan AgNPs dengan topologi kopolimer yang berbeda. Pertama, diperoleh kopolimer triblok bintang linier atau empat lengan dengan berat molekul dan derajat polimerisasi yang sama, yang terdiri dari DMAEMA untuk reduksi in situ ion perak untuk membentuk AgNP tanpa zat pereduksi eksternal. HEMA dan PEGMA dalam cangkang misel memberikan peningkatan stabilitas AgNP selama sirkulasi darah. Kombinasi pemodelan komputasi dan hasil eksperimen menunjukkan bahwa kedua jenis misel dapat membuat AgNPs dengan morfologi monodisperse dan spherical. Misel bintang yang distabilkan AgNPs memiliki ukuran rata-rata yang lebih kecil, stabilitas yang lebih baik, dan aktivitas antibakteri yang lebih tinggi daripada yang memiliki struktur linier, yang mungkin disebabkan oleh stabilitas misel dari kopolimer bintang yang lebih tinggi. Selanjutnya, uji evaluasi sitotoksisitas menunjukkan bahwa AgNPs stabil AgNPs kopolimer linier atau kopolimer bintang yang dicapai memiliki biokompatibilitas yang baik. Karya ini memberikan pendekatan yang mudah dan universal dalam desain rasional AgNP yang distabilkan misel dengan topologi yang sesuai untuk melawan berbagai infeksi bakteri.
Pengantar
Dalam beberapa dekade terakhir, sejumlah agen antimikroba tradisional telah banyak digunakan untuk mengobati penyakit menular. Menurut Organisasi Kesehatan Dunia, kemunculan mikroorganisme yang resistan terhadap banyak obat secara cepat telah menjadi masalah global yang semakin serius, yang menempati peringkat tiga besar dalam daftar ancaman utama bagi kesehatan manusia [1,2,3,4,5]. Oleh karena itu, perlu dikembangkan agen antimikroba baru dengan keamanan yang baik, kemampuan antibakteri yang efektif tanpa menghasilkan resistensi bakteri. Nanopartikel perak (AgNPs) sebagai salah satu agen antimikroba terbaik sejak zaman kuno, banyak digunakan dalam barang-barang konsumen karena kinerjanya yang unggul terhadap berbagai patogen bakteri dan jamur, toksisitas yang relatif rendah terhadap sel mamalia, dan resistensi bakteri yang terbatas [6,7, 8,9,10]. AgNPs mampu meningkatkan permeabilitas membran bakteri, meresap ke dalam sitoplasma, mendenaturalisasi protein bakteri, dan mengganggu replikasi bakteri, yang mengakibatkan kematian bakteri [11,12,13]. Sejumlah besar formulasi perak telah digunakan untuk menjelaskan aktivitas antibakteri AgNP [14,15,16,17], misalnya, pembalut luka melalui hidrogel polikarboksibetain zwitterionik bersama dengan AgNP antibakteri sebagai komponen inti yang diusulkan oleh Zhang et al. [18], permukaan multifungsi yang diperoleh melalui pelapisan multikomponen untuk AgNPs co-imobilisasi yang diusulkan oleh Moreno-Couranjou et al., dll. [19].
Namun, luas permukaan spesifik yang besar dan energi permukaan yang tinggi menyebabkan agregasi AgNP, yang telah menjadi hambatan besar untuk aplikasinya. Dengan demikian, matriks polimer atau stabilizer eksternal diperlukan untuk menstabilkan AgNPs. Seperti diketahui, matriks polimer adalah metode yang paling umum untuk menyelesaikan masalah agregasi. Saat ini, beberapa metode telah digunakan untuk menstabilkan AgNPs dengan matriks polimer, seperti metode reduksi kimia, metode elektrokimia, metode fotokimia, dan metode gelombang mikro. Di antara mereka, reduksi kimia adalah metode yang umum dan efektif. Perak nitrat direduksi menjadi AgNPs dengan menambahkan reduktor seperti hidrazin hidrat (N2 H4 ), natrium borohidrida (NaBH4 ), natrium sitrat, dan asam askorbat dalam larutan [20,21,22,23]. Misalnya, Hoda et al. polystyrene-block-polyacrylicacid buatan (PS-b -PAA) misel terbalik yang diisi dengan AgNP 20 nm di bawah pengaruh zat pereduksi N2 H4 , dan blok PS memainkan lapisan luar dalam toluena [24]. Kelompok Liu melaporkan bahwa nanotemplate misel rakitan sendiri dibuat dari poli(ε-kaprolakton)-blok-poli (asam aspartat) (PCL-b -PAsp). AgNP yang terdispersi dengan baik disiapkan dengan AgNO3 sebagai prekursor dan NaBH4 sebagai peredam [25]. Namun, metode di atas tidak ramah lingkungan, dan penambahan reduktor berlebihan menghasilkan produk sampingan, sehingga sulit untuk memurnikan AgNP dan membatasi penerapan antimikroba yang menargetkan penyakit menular.
Sementara itu, telah dilaporkan bahwa polimer yang mengandung gugus amina dapat digunakan sebagai reduktor dan penstabil untuk menyiapkan AgNPs in situ. Misalnya, Lang et al. mensintesis polimer bintang enam lengan yang terdiri dari PCL, 2-(dimethylamino) ethyl methacrylate (DMAEMA), dan poly (ethylene glycol) methyl ether methacrylate (PEGMA). Sistem ini secara langsung mereduksi perak nitrat menjadi AgNPs tanpa menambahkan reduktor lain dalam fase air [26]. Meskipun AgNP yang disebutkan di atas menghadirkan modifikasi permukaan yang lancar tanpa peredam tambahan, relatif terhadap nanopartikel emas [27, 28], efek topologi polimer pada reduksi dan stabilitas nanopartikel perak bersama dengan aplikasinya dalam aktivitas antibakteri berbasis misel kurang dipelajari.
Dalam karya ini, pendekatan ringan, mudah, dan hijau telah dirancang untuk melawan infeksi bakteri, memanfaatkan misel polimer yang dirakit sendiri dari kopolimer triblok bintang linier atau empat lengan dengan berat molekul dan derajat polimerisasi yang sama seperti platform nano. untuk menghias AgNPs (Skema 1). Dalam pendekatan ini, kopolimer triblok, yang terdiri dari DMAEMA, 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA), dan PEGMA, dapat menghasilkan misel rakitan sendiri dalam kondisi berair, yang merupakan templat yang baik untuk preparasi dan stabilisasi AgNPs. Blok PDMAEMA dengan gugus amina tersier dapat dengan mudah menyerap Ag
+
ion melalui interaksi koordinasi dan kemudian in situ menghasilkan AgNPs tanpa agen pereduksi. Blok HEMA dan PEGMA dengan hidrofilisitas tinggi dapat digunakan sebagai stabilisator fase air untuk lebih meningkatkan stabilitas AgNPs. Oleh karena itu, perak nitrat dapat secara spontan berkoordinasi dan terdeoksidasi ke dalam inti misel kopolimer yang dirakit sendiri untuk membentuk AgNPs. Mereka tertanam dalam inti misel dan dapat mengakibatkan penghancuran membran bakteri. Di sini, bagaimana topologi kopolimer bintang linier atau empat lengan mempengaruhi panjang gelombang serapan maksimum, morfologi, ukuran partikel, potensi zeta, stabilitas, serta efisiensi antibakteri AgNP sedang diselidiki sepenuhnya. Oleh karena itu, studi tentang hubungan antara struktur dan sifat dapat menemukan penjelasan mendalam tentang nanopartikel hibrida perak untuk pengobatan infeksi bakteri. Selain itu, akan memberikan ide desain dan dasar teknis untuk preparasi AgNPs dengan struktur yang lebih stabil dan ukuran partikel yang dapat dikontrol.
Ilustrasi skema pembentukan kopolimer linier/bintang misel AgNP yang distabilkan untuk aktivitas antibakteri yang sangat baik
Materi dan Metode
Materi
Pentaerythritol (J&K Scientific Ltd.) dikeringkan melalui pengurangan tekanan selama 24 jam sebelum digunakan. 2-(Dimetilamino) etil metakrilat (DMAEMA,> 98%), 2-hidroksietil metakrilat (HEMA, 99%), dan poli (etilena glikol) metil eter metakrilat (PEGMA, Mn =300 Da, 99%), semuanya dari Aldrich, dimurnikan dengan melewati kolom netral yang mengandung alumina untuk menghilangkan inhibitor. Dengan pemanfaatan kalsium hidrida (CaH2 ), tetrahidrofuran (THF) dan toluena dari Aldrich dikeringkan dan kemudian disuling di bawah tekanan tereduksi sebelum digunakan. Etil 2-bromoisobutirat (EBiB, 98%, Alfa Aesar), 2-bromoisobutiril bromida (BIBB, 98%, Alfa Aesar), 1,1,4,7,10,10-hexamethyltriethylenetetramine (HMTETA, 99%), perak nitrat (AgNO3 , 99,9%), tembaga bromida (CuBr2 ), metanol, trietilamina (TEA), diklorometana (DCM), aseton, n -heksana, dimetil sulfoksida (DMSO), stannous oktoat (Sn(Okt)2 ), natrium karbonat (Na2 CO3 ), natrium bikarbonat (NaHCO3 ), natrium klorida (NaCl), natrium sulfat (Na2 JADI4 ), dan semua reagen lainnya yang diperoleh dari J&K Perusahaan Kimia digunakan saat diterima.
Karakterisasi dan Instrumentasi Umum
Resonansi magnetik nuklir proton (
1
Spektrum H NMR) dari kopolimer triblok linier atau empat lengan terdeteksi di CDCl3 , dan D2 O pada 25 °C melalui spektrometer Bruker ADVANCE 400 MHz (Madison, WI, USA). Pengukuran spektrum spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR) dari kopolimer linier, kopolimer bintang, dan AgNP yang distabilkan miselnya dilakukan menggunakan spektrofotometer IR FT (Nicolet Nexus untuk Euro, AS) yang dilengkapi dengan mode transmisi pada 25 °C. Sampel granular disiapkan setelah digiling dengan kalium bromida (KBr) dan kemudian dikompres. Untuk mendapatkan spektrum, kondisi spektral ditetapkan sebelumnya dengan panjang gelombang dari 4000 sampai 400 cm
−1
(32 pemindaian) dan resolusi 8 cm
−1
. Potensi zeta dari misel kopolimer linier dan bintang menstabilkan AgNP pada rasio molar yang berbeda diukur menggunakan pengukuran elektroforesis dengan instrumen Malvern Zetasizer Nano S (Malvern, WR, UK) di mana setiap sampel diuji tiga kali pada 25 °C. Mikroskop elektron transmisi (TEM, FEI Tecnai-G20) yang beroperasi pada 200 kV dilakukan untuk mengamati morfologi misel kopolimer linier dan bintang menstabilkan AgNP pada rasio molar yang berbeda. Proses persiapan produk untuk TEM adalah sebagai berikut:10 L larutan sampel pertama-tama diteteskan ke dalam kotak tembaga yang dilapisi dengan karbon dan kemudian dikeringkan di udara. Spektrum UV-Vis dari misel kopolimer linier dan bintang yang distabilkan AgNPs pada rasio molar yang berbeda ditentukan menggunakan spektrofotometer UV-Vis (UV-2450, Shimadzu, Kyoto, Jepang). Analisis termogravimetri (TGA) dilakukan pada peralatan NETZSCH (STA409PC, Jerman). Semua sampel bubuk kering (kopolimer linier, kopolimer bintang, dan AgNP yang distabilkan miselnya) dipanaskan dari 25 hingga 600 °C pada laju 10 °C / menit dalam kondisi nitrogen.
Sintesis PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA
Aktivator kontinu yang diregenerasi oleh polimerisasi radikal transfer atom transfer elektron (AGERT ATRP) dari DMAEMA, HEMA, dan PEGMA dilakukan mengikuti prosedur yang dimodifikasi dari Zhang et al. [29, 30]. Singkatnya, setelah penambahan CuBr2 (10 mg, 0,045 mmol), 100 mL labu leher tiga kering dievakuasi dan dibilas dengan argon tiga kali. Dengan bantuan jarum suntik degas, toluena anhidrat (25 mL), EBiB (88 L, 0,24 mmol), DMAEMA (5,15 mL, 30,5 mmol), dan ligan HMTETA (62 L, 0,24 mmol) disuntikkan secara teratur ke dalam wadah, berikut agitasi 10 menit. Setelah menyuntikkan Sn(Okt)2 (78 L, 0,24 mmol) dengan toluena (2 mL) sebagai larutan, reaksi berlangsung pada 70 °C dalam penangas minyak selama 8 jam. Blok berturut-turut HEMA (2,32 mL, 18,4 mmol) disuntikkan untuk reaksi 8 jam berikutnya setelah larutan menjadi lebih kental. Akhirnya, dengan partisipasi PEGMA monomer ketiga (8,89 g, 55,6 mmol), kami menyaksikan reaksi terus menerus selama 72 jam sebelum mendinginkan labu hingga hampir suhu kamar. THF (30 mL) disuntikkan ke dalam wadah dan campuran reaksi kemudian dilewatkan melalui kolom alumina netral untuk menghilangkan katalis. Produk PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA diendapkan menjadi sepuluh kali lipat kelebihan dingin n -heksana, disaring, dan akhirnya dikeringkan di bawah vakum selama 48 jam pada 35 °C.
Sintesis (PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA)4
Inisiator yang diakhiri bromo tipe bintang (Br)4 disintesis dengan esterifikasi gugus hidroksil terminal yang ada pada pentaeritritol dengan 2-bromoisobutiril bromida menggunakan THF sebagai pelarut dan TEA sebagai zat pengikat asam. Biasanya, setelah diisi dengan pentaeritritol (2,72 g, 2 mmol), labu leher-tiga 100 mL dievakuasi dan dibilas dengan argon tiga kali, mengikuti injeksi THF anhidrat (120 mL) dan TEA (12,51 mL, 90 mmol) secara berurutan secara berurutan . Di bawah keadaan es/air, 2-bromoisobutiril bromida (11,12 mL, 90 mmol) disuntikkan tetes demi tetes ke larutan yang diaduk dengan kuat, mengikuti reaksi 4 jam pada 0 °C dan kemudian 20 jam pada 25 °C. Untuk memurnikan produk, campuran pertama-tama dilewatkan melalui kolom alumina netral. Produk mentah dicuci berturut-turut dengan air, 10% Na2 CO3 , NaHCO3 jenuh3 , dan NaCl jenuh, kemudian berturut-turut dikeringkan dengan Na2 JADI4 semalaman, disaring, dan dipekatkan sebelum dituangkan ke dalam sepuluh kali lipat kelebihan dingin n -heksana untuk mengendapkan produk, dan akhirnya dikeringkan di bawah vakum selama 24 jam untuk menerima produk.
Rute sintetis dan jumlah makan (PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA)4 dilakukan menggunakan prosedur yang sama seperti PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA.
Persiapan AgNP Menggunakan Misel Kopolimer Linear atau Berbentuk Bintang
PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA atau (PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA)4 larutan berair (pH 7,0) diperoleh terlebih dahulu, dimana AgNO3 larutan ditambahkan sambil memicu reaksi reduksi DMAEMA dengan Ag
+
untuk membentuk AgNPs in situ di inti misel. Mengambil rasio mol DMAEMA dan AgNO3 sama dengan 9 sebagai contoh, pertama, PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA atau (PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA)4 dengan jumlah [DMAEMA] yang sama =4,8 mM diaduk dalam aseton (5 mL) selama 4 jam diikuti dengan penambahan air suling (20 mL) sambil diaduk semalaman untuk membentuk misel yang stabil. Kemudian AgNO3 larutan (220 L, 48 mM) disuntikkan tetes demi tetes ke dalam larutan di atas dan diaduk pada suhu 25 ° C dalam kegelapan selama 48 jam. Akhirnya, AgNP yang distabilkan misel polimer linier atau bintang disiapkan dengan mengumpulkan dan mengeringkan beku sebelum disimpan pada -20 °C untuk eksperimen berikut.
Pengujian Antibakteri
Investigasi antibakteri pada AgNP yang distabilkan misel polimer dilakukan terhadap Escherichia coli DH5alpha (E . koli Strain DH5α) menggunakan media Luria-Bertani (LB) sebagai pembawa untuk menyiapkan konsentrasi yang berbeda dari larutan AgNP yang distabilkan misel polimer dengan ultrasonik. E mono monoklonal . koli DH5α dibudidayakan semalaman dalam media LB (5 mL) pada 37 °C pada Shaker pada 200 rpm sebelum suspensi bakteri diencerkan menjadi 1 × 10
5
CFU/mL dengan media LB. Setelah mencampur volume yang sama dari bakteri yang diencerkan dengan konsentrasi misel kopolimer yang berbeda atau AgNP yang distabilkan misel dan inkubasi pada 37 °C selama 16 jam, perubahan kerapatan optik pada panjang gelombang 600 nm dicirikan oleh pembaca lempeng mikro (Multiskan Spectrum, Thermo Scientific, Vantaa, Finlandia). Setiap pengujian diulang enam kali.
Evaluasi Viabilitas Sel
Untuk mengevaluasi viabilitas sel, pengujian 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) dengan sel karsinoma hepatoseluler hati (HepG2) dilakukan. Sebelum penyemaian sel, sel HepG2 pertama kali diinkubasi dalam atmosfer yang dilembabkan dengan 5% CO2 pada suhu 37 °C dalam medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco (DMEM) yang dilengkapi dengan 10% serum janin sapi (FBS), penisilin (100 L/mL), dan streptomisin (0,1 mg/mL). Kemudian, sel HepG2 diunggulkan dalam media DMEM segar pada pelat 96-sumur dengan kepadatan 1 × 10
4
per sumur dan dikultur selama 1 hari. Setelah mengganti media DMEM dalam misel kopolimer yang telah disiapkan sebelumnya atau larutan AgNP yang distabilkan misel (100 L) pada berbagai konsentrasi, sel-sel terus dikultur selama 24 jam berikutnya. Setelah dicuci dengan buffer PBS tiga kali, 20 L reagen MTT (5 mg/mL) dan 180 L DMEM segar kemudian ditambahkan dan diinkubasi selama 4 jam. Terakhir, larutan diubah menjadi 200 L DMSO dan plate dikocok perlahan selama 10 menit. Absorbansi pada 570 nm diukur dengan pembaca pelat mikro yang disebutkan di atas. Data dari enam eksperimen paralel dirata-ratakan.
Simulasi Dinamika Partikel Disipatif
Untuk menganalisis proses pertumbuhan AgNPs, simulasi dinamika partikel disipatif (DPD), yang didasarkan pada model butiran kasar, dilakukan dengan menggunakan modul mesocite Material Studio 8.0 (Accelrys Inc., San Diego, CA, AMERIKA SERIKAT). Seperti yang ditunjukkan pada File tambahan 1:Gambar S1, enam jenis manik-manik merupakan kopolimer PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA atau (PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA)4 :jingga untuk bagian tengah, hijau muda untuk MAA1 (metakrilat di samping rantai samping etilamin), hijau untuk DMA (rantai samping amino etil), merah muda untuk HEMA, biru muda untuk MAA2 (metakrilat di samping rantai samping PEG), dan biru untuk PASAK. Sebuah cluster kecil dengan kristal sel satuan (panjang kisi:3,87 ) terdiri dari empat atom perak, ditandai sebagai manik-manik perak (warna emas). Pada saat yang sama, setiap butiran air (W) berwarna hitam mengandung lima molekul air. Menurut pekerjaan kami sebelumnya, File tambahan 1:Tabel S1 menunjukkan hasil parameter interaksi komputasi [31, 32]. Sebuah 30 × 30 × 30 rc
3
kotak simulasi kubik dengan kondisi batas periodik digunakan ke segala arah dengan 100.000 langkah simulasi total dan langkah waktu integrasi 0,05 ns.
Analisis Statistik
Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan dua sampel Siswa t uji dengan varian yang tidak sama. p <0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Hasil dan Diskusi
Sintesis dan Karakterisasi Kopolimer Linier/Bintang
Kopolimer linier PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA dan kopolimer bintang (PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA)4 disintesis dengan polimerisasi ARGET ATRP DMAEMA, HEMA, dan PEGMA dengan CuBr2 /HMTETA sebagai katalis, Sn(Okt)2 sebagai reduktor, dan EBiB atau pentaerythritol yang sebelumnya diasilasi dengan BIBB sebagai inisiator dalam toluena (Skema 2). Struktur dan komposisi polimer target diverifikasi oleh
1
HNMR. Misel polimer dirakit sendiri dari PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA atau (PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA)4 dengan DMAEMA sebagai blok fungsional, di mana Ag
+
ion tertarik dan direduksi menjadi AgNPs tanpa partisipasi agen pereduksi ekstra. Efek struktur topologi kopolimer pada AgNP dibahas dan dievaluasi dari sifat fisikokimia, antibakteri, dan aktivitas antikanker.
Rute sintetis a PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA dan b (PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA)4
Struktur kimia kopolimer linier/bintang dikonfirmasi oleh
1
HNMR. Pertama, gugus hidroksil akhir pentaeritritol dipindahkan seluruhnya ke gugus terminal bromin (Br)4 , seperti yang ditunjukkan dalam
1
Spektrum H NMR (File tambahan 1:Gambar S2). Puncak pada 4,33 ppm dikaitkan dengan -CH2 O- di pentaerythritol, sedangkan yang baru -(CH3 )2 - sinyal pada 1,94 ppm muncul. Dan nilai rasio integrasi puncak pada 1,94 ppm hingga 4,33 ppm adalah sekitar 3. Seperti yang ditunjukkan pada file tambahan 1:Gambar S3 dan S4, puncak -C(CH3 )2 - muncul pada 1,94 ppm. Sinyal pada 1,83 ppm, 1,00 ppm ditetapkan ke -CH2 - dan -CCH3 - dalam rantai utama metil metakrilat, masing-masing. Puncak pada 2,58 ppm dan 4,08 ppm milik resonansi karakteristik dari dua proton metilen yang berdekatan -CH2 KH2 - di blok DMAEMA, dan puncak pada 2,29 ppm ditetapkan ke metil proton -CH3 -, yang terikat pada gugus amina tersier. Kehadiran -CH2 KH2 - proton metilen yang terhubung ke gugus hidroksil terminal di unit HEMA muncul masing-masing pada 4,08 ppm dan 3,57 ppm. Puncak PEG karakteristik -OCH2 KH2 - dan terminal -CH3 proton muncul pada 3,67 dan 3,39 ppm, masing-masing. Puncak ikatan rangkap pada 5,5–6,1 ppm menghilang di
1
spektrum HNMR. Dihitung dari nilai rasio integrasi sinyal (f) hingga (a) (If /Akua ), sinyal (g) ke (a) (Ig /Akua ), dan sinyal (h) ke (a) (Ih /Akua ), masing-masing, PDMAEMA19.3 -b -PHEMA12,5 -b -PPEGMA24.6 dan (PDMAEMA5.0 -b -PHEMA5.6 -b -PPEGMA5.0 )4 diperoleh.
Persiapan dan Karakterisasi Linear/Star Copolymer Micelles Stabilized AgNPs
Proses pembentukan AgNPs ditunjukkan pada Skema 1. Sepasang elektron bebas pada atom N yang termasuk dalam gugus amina tersier dalam rantai molekul PDMAEMA, memiliki kemampuan koordinasi dan reduksi, sehingga dapat digunakan baik sebagai agen penjebak dan agen pereduksi. Pertama, ion perak terperangkap oleh PDMAEMA karena kompleksasi antara Ag
+
dan atom N, membentuk (Ag
+
)-PDMAEMA kompleks. Selanjutnya, Ag
+
direduksi in situ untuk membentuk atom perak pada tahap nukleasi. Setelah itu, nukleasi Ag dilanjutkan dengan pertumbuhan kristal Ag, sehingga terbentuk AgNPs [26]. Blok hidrofilik PPEGMA bertindak sebagai cangkang misel, yang memberikan lapisan pelindung yang stabil dan selanjutnya meningkatkan stabilitas AgNP. Efek stabilisasi sterik dari misel rakitan sendiri dalam sistem ditentukan oleh kesetimbangan termodinamika misel pada stabilisasi AgNP dan aglomerasi antara AgNP. Dalam kasus AgNP dalam jumlah kecil, stabilisasi sterik kopolimer dapat mencegah agregasi AgNP lebih lanjut. Dengan bertambahnya jumlah Ag maka stabilitas misel terhadap AgNPs akan melemah dan kemudian kemungkinan terjadinya tumbukan antar partikel akan meningkat sehingga mengakibatkan pertumbuhan ukuran AgNPs. Dengan memanfaatkan stabilisasi spasial misel, AgNP yang kami siapkan memiliki ukuran partikel yang terkontrol, yang berpotensi besar untuk aplikasi antibakteri.
Simulasi DPD dilakukan untuk menyelidiki proses pertumbuhan dan distribusi AgNPs, dengan konsentrasi yang sama dari eksperimen sebenarnya (PDMAEMA/AgNO3 rasio molar =1/1, fraksi volume kopolimer linier, Ag dan manik-manik air masing-masing 10%, 0,23%, dan 89,77%). Gambar 1 mengungkapkan bahwa manik-manik PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA dan AgNPs awalnya menunjukkan keadaan terdistribusi tidak teratur dalam larutan berair. Seiring berjalannya waktu, delapan misel kopolimer rakitan akhirnya terbentuk dan tersebar merata, sementara semua manik-manik Ag dimuat ke dalam misel. Dapat dilihat bahwa AgNPs dalam kesetimbangan dapat distabilkan dalam misel kopolimer tanpa agregasi lebih lanjut, menunjukkan bahwa misel rakitan sendiri mampu mencegah agregasi AgNP lebih lanjut dan kemudian mencapai tujuan untuk mengontrol ukuran partikel dan distribusinya.
Simulasi DPD proses pertumbuhan dan distribusi AgNPs dengan PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA di PDMAEMA/AgNO3 rasio molar =1/1 dalam waktu simulasi yang berbeda. a Molekul air disembunyikan untuk kejelasan. b Hanya AgNP yang ditampilkan
Karakterisasi FT IR dari kopolimer linier/bintang dan AgNP yang distabilkan miselnya ditunjukkan pada File tambahan 1:Gambar S5. Jelas, dibandingkan dengan kopolimer linier/bintang sederhana, getaran regangan -COOR pada 1730 cm
−1
dan vibrasi lentur ikatan C-N pada PDMAEMA pada 1457 cm
−1
menurun setelah pembentukan AgNP, menunjukkan bahwa AgNP telah berhasil dimuat ke misel kopolimer. Sifat kristalin kopolimer linier/bintang misel AgNP yang distabilkan dikonfirmasi oleh spektrum difraksi sinar-X (File tambahan 1:Gambar S6). Nilai puncak difraksi 38.5°, 44.8°, 64.2°, dan 78.0° berhubungan dengan (111), (200), (220), dan (311) muka kristal dari struktur kristal kubus berpusat muka (fcc) nanopartikel yang mengandung Ag [33, 34]. Potensi zeta dari kopolimer linier / bintang misel AgNP yang distabilkan diukur. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2, potensi zeta dari misel kopolimer ini menstabilkan AgNP adalah sekitar 15,0–23,2 mV. Apalagi dengan meningkatnya jumlah AgNO3 , potensi zeta dari AgNP yang menstabilkan misel sangat meningkat karena dekorasi lebih banyak AgNP. Untuk menyelidiki lebih lanjut dispersi AgNP dan efek stabilisasi misel pada AgNP, simulasi DPD misel kopolimer linier/bintang menstabilkan AgNP pada PDMAEMA/AgNO yang berbeda3 rasio molar dilakukan. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2, hasilnya juga menunjukkan bahwa ukuran AgNP sebanding dengan rasio di mana jumlah AgNP kecil yang dikumpulkan meningkat dan jarak di antara mereka menurun, yang mengarah pada peningkatan kemungkinan tumbukan dan aglomerasi.
Potensi zeta dan tampilan penampang a linier dan b kopolimer bintang misel menstabilkan AgNP. Data dikumpulkan dengan PDMAEMA/AgNO berbeda3 rasio molar (a) 1/1, (b) 3/1, (c) 6/1, (d) 9/1
Spektrum untuk empat kopolimer linier misel AgNP yang distabilkan memiliki perbedaan kecil pada puncak serapan maksimum yang terletak sekitar 437 nm, yang merupakan puncak serapan resonansi plasmon permukaan (SPR) karakteristik dari AgNP spherical/near-spherical, terkait dengan eksitasi resonansi dan transisi interband dari mereka (Gbr. 3a). Hasilnya membuktikan bahwa gugus amina tersier dalam kopolimer linier dapat bereaksi dengan perak nitrat dan pembentukan AgNP hampir tidak bergantung pada hambatan sterik dari misel kopolimer linier. Selanjutnya, kopolimer bintang dengan blok yang sama dan derajat polimerisasi di bawah kondisi yang sama, ukuran partikel AgNP menurun ketika PDMAEMA/AgNO3 rasio molar meningkat. Hal ini tercermin melalui pergeseran hipsokromik dalam spektrum UV-Vis di mana puncak serapan maksimum masing-masing berada pada 429 nm, 426 nm, 421 nm, dan 414 nm, karena perbedaan kuantitas AgNP yang dibentuk oleh reduksi koordinasi pada amina tersier. misel kopolimer bintang (Gbr. 3b). Dengan kata lain, stabilisasi sterik dari kopolimer bintang dapat menstabilkan AgNP lebih baik dan mencegah agregasi lebih lanjut pada sejumlah kecil AgNP. Sebaliknya, peningkatan jumlah AgNP melemahkan efek stabilisasi, yang memberikan lebih banyak peluang untuk tumbukan AgNP, dan akhirnya menghasilkan AgNP yang lebih besar. Membandingkan Gambar 3a dengan Gambar 3b, puncak penyerapan pada 437 nm AgNP dalam misel kopolimer linier memiliki distribusi panjang gelombang yang lebih luas, sedangkan AgNP dalam misel kopolimer bintang berada di sekitar 422 nm. Di sini, tidak ada pergeseran biru yang ditunjukkan dalam spektrum kopolimer linier, yang dapat dijelaskan oleh fakta bahwa blok misel kopolimer linier memiliki efek yang lebih lemah pada hambatan sterik untuk AgNP, yang mengakibatkan peningkatan kemungkinan aglomerasi tumbukan antara AgNP.
Spektrum UV-Vis a linier dan b kopolimer bintang misel menstabilkan AgNP pada PDMAEMA/AgNO berbeda3 rasio molar (a) 1/1, (b) 3/1, (c) 6/1, (d) 9/1
Pengukuran TEM kemudian dilakukan untuk mengetahui ukuran, distribusi ukuran, dan morfologi AgNPs. Gambar TEM dari AgNP bergantung pada AgNO3 rasio makan ditunjukkan pada Gambar. 4. Ketika PDMAEMA/AgNO3 rasio molar adalah 6 dan 1, dihitung menggunakan perangkat lunak ImageJ, ukuran partikel AgNPs kopolimer linier terstabilisasi misel adalah 11,1 nm dan 25,7 nm, sedangkan diameter kopolimer bintang misel distabilkan AgNP masing-masing adalah 3,7 nm dan 6,4 nm. Peningkatan AgNO3 konten menyebabkan lebih banyak atom perak dalam misel, energi permukaan yang lebih tinggi, dan jumlah AgNP agregat meningkat sesuai dengan ukuran AgNP yang lebih besar. Jelas bahwa AgNP yang distabilkan misel bersifat monodispersi dan bulat dengan AgNP yang distabilkan misel kopolimer linier. Ukuran AgNP yang distabilkan misel selanjutnya melengkapi hasil UV-Vis.
Gambar TEM dari a , b kopolimer linier dan c , d star copolymers micelles stabilized AgNPs at different PDMAEMA/AgNO3 molar ratios:a , c 6/1, b , d 1/1
Stability of the Linear/Star Copolymers Micelles Stabilized AgNPs
The stability of the linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs is of great influence for the development of biomedical field. Obviously, the SPR peak in UV-Vis spectra (Fig. 5) of star copolymer micelles stabilized AgNPs did not display any significant changes for at least 1 month even after further diluted by one time, three times, and six times, indicating that the prepared AgNPs appeared well long-term colloidal stability within the experimental concentration range. However, the results of linear copolymer micelles stabilized AgNPs showed that the UV absorption wavelength decreased slightly as the increase of dilution ratios. And the micelles concentration of linear copolymer decreased after 1 month of placement may lead to insufficient provision of steric hindrances to stabilize AgNPs.
UV-Vis spectra of a linear copolymers and b star copolymers micelles stabilized AgNPs solution at PDMAEMA/AgNO3 molar ratio =6/1 after 1 month at the diluted times of 1 (a), 3 (b), and 6 (c), respectively
From the thermogravimetric analysis curves in Fig. 6, it was shown that the initial decomposition temperature (Tonset ) of linear copolymers micelles was 217 °C, which shifted to 172 °C after silver loading, suggesting that the linear copolymer micelles stabilized AgNPs showed lower thermal stability than the pure linear copolymers micelles. It may be due to the fact that the chemical structure of PDMAEMA in the molecular chain changes and the catalytic effect of AgNPs in the thermal degradation process cannot be ignored [35]. As for star copolymers and their stabilized AgNPs, Tonset were around 213 °C. The two Tonset of star copolymers micelles and their micelles stabilized AgNPs showed very few gaps, which could be speculated that the more stable star-shaped copolymers have better effect on stabilizing AgNPs than the linear copolymers. Combined the results of UV-Vis, TEM, and TGA measurements, it could be inferred that compared to the linear copolymers, the star copolymers have superior advantages in topology for stabilizing AgNPs, such as better stability, more uniform dispersion, slower nucleation rate during reduction, and the better product with a smaller and more uniform size of AgNPs.
TGA curves of a linear copolymers and b star copolymers micelles and their micelles stabilized AgNPs at PDMAEMA/AgNO3 molar ratio =6/1
Antibacterial Activity and Cell Viability
To evaluate the antibacterial activities of the linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs by optical density (OD600 ) measurements, E . coli DH5α was selected as the Gram-negative bacterial model. The absorbance at 600 nm after incubation was tested by incubating the bacteria with the eight different concentrations of micelles and micelles stabilized AgNPs at 37 °C. Results shown in Fig. 7a illustrated that the bacterial growth curves were highly correlated with the AgNPs concentration in the LB medium. The inhibition of linear/star copolymers micelles on the growth of bacteria was weak, which was not fatal to bacteria. However, as the concentration of linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs increased, the survival rate of E . coli DH5α was significantly inhibited, indicating a strong antibacterial efficacy of AgNPs against E . coli DH5α. The concentrations of linear copolymers micelles stabilized AgNPs preventing the bacterial growth in the experiments were relatively higher than those of star copolymers micelles stabilized AgNPs, which might due to the fact that bigger size of AgNPs could lead to a lower antibacterial performance because of the inefficient exposure of bacteria to AgNPs and relatively slow release behavior of AgNPs.
a Antibacterial activity and b cell viability of linear copolymers and star copolymers micelles stabilized AgNPs at PDMAEMA/AgNO3 molar ratio =6/1. *p <0.05, two-tailed Student t tes
Cancer is an uncontrollable disease of cell growth that can occur in any part of the body. The most common cancers are liver cancer, breast cancer, colorectal cancer, and lung cancer. Among them, the liver cancer has the much higher prevalence in both developed and developing countries. Therefore, the toxicity experiments of the linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs on HepG2 cells were carried out, in which HepG2 cells were incubated with linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs at different concentrations (10, 50, 100, 200, 400 mg/L, respectively) for 48 h and the cell viability with MTT assay was the most intuitive data to evaluate the biocompatibility of the composite material. As shown in Fig. 7b, the percentage of viable cells for the linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs exhibited negligible cytotoxicity, and was about 90% viability even at the highest concentration applied (400 μg/mL) after 48-h incubation, indicating the advantageous cytocompatibility of the micelles stabilized AgNPs within a relatively wide range of concentration.
Conclusion
In conclusion, PDMAEMA-based linear and star copolymer micelles as effective delivery carriers for silver-bearing antimicrobials were developed, and their in vitro antimicrobial efficacy and cell viability were investigated. Being a reducing agent and a stabilizer simultaneously, the micellar PDMAEMA core acted as loading platform for AgNPs in situ translated from the precursor silver nitrate. In silico simulation and experimental results indicated that both types of the copolymer micelles could generate monodisperse and spherical AgNPs. Compared with linear copolymers sliver-bearing micelles, the fabricated star copolymers micelles stabilized AgNPs exhibited smaller average size, better stability against dilution and pyrogenic decomposition, and enhanced antibacterial activities against E . coli DH5α due to the serious damage of bacterial membrane caused by loaded AgNPs. Moreover, both types of copolymer micelles stabilized AgNPs possessed great cytocompatibility toward HepG2 cells. Therefore, these studies may provide some guidance for the construction of more effective AgNPs weapon with well-defined and feasible polymer topology for combating the multiple bacteria-induced infections.
Ketersediaan Data dan Materi
Kumpulan data yang digunakan dan/atau dianalisis selama studi saat ini tersedia dari penulis terkait atas permintaan yang wajar.
