Nanopartikel Berbasis Laminarin untuk Pengiriman Protoporfirin IX dalam Terapi Fotodinamis Tingkatkan: Penyerapan Sel, Generasi ROS, dan Efektivitas In Vivo

Abstrak

Miksel amfifilik derived dari konjugat laminarin (HLDM) dirancang untuk mengenkapsulasi fotosensitiser hidrofobik protoporfirin IX (Pp IX) untuk terapi fotodinamis (PDT) kanker payudara. Miksel yang dihasilkan, berukuran sekitar 149 nm, menunjukkan rilis responsif dual pH dan redoks, yang meningkatkan keberlanjutan dalam air dan biokompatibilitas. Studi in vitro dengan sel MCF-7 mengungkapkan penyerapan seluler yang efisien, generasi spesies reaktif oksigen (ROS) yang diinduksi cahaya, dan apoposis yang ditandai dengan kerusakan inti. Dalam model xenograft tikus nude, miksel HLDM yang dimuat Pp IX combined dengan radiasi 630 nm menghasilkan inhibisi pertumbuhan tumor yang signifikan tanpa toksis sistemik yang teramati. Temuan ini menunjukkan bahwa platform nanosederajat berbasis laminarin dapat secara signifikan meningkatkan pengiriman Pp IX dan efektivitas PDT in vitro dan in vivo.

Pendahuluan

Terapi fotodinamis (PDT) memanfaatkan fotosensitiser, cahaya, dan oksigen molekular untuk menghasilkan ROS yang secara selektif membunuh sel tumor sambil menyelamatkan jaringan normal. PDT telah muncul sebagai opsi minimal invasif untuk berbagai malignansi—termasuk kanker payudara, hati, paru-paru, melanoma, dan kulit—namun adopsi klinisnya telah terbatas oleh akumulasi tumor yang terbatas dari fotosensitiser konvensional.

Protoporfirin IX (Pp IX) adalah fotosensitiser yang potente namun hidrofobik yang sering mengagregasi dalam media air, mengurangi jendela terapeutiknya. Polisakarida laut laminarin, yang dikenal karena biokompatibilitas dan aktivitas antitumor intrinsik, menawarkan cangkir hidrofilik yang dapat menyetabilkan obat hidrofobik dan memberikan properti target tumor melalui responsivitas pH dan redoks.

Kami melaporkan sintesis sistem miksel HLDM (hematin-laminarin-dithiodipropionic acid-MGK) yang responsif dual pH/redoks yang mengenkapsulasi Pp IX, bertujuan untuk meningkatkan keterlarutan, meningkatkan akumulasi tumor, dan memaksimalkan sitotoksisitas yang dikomandasikan ROS.

Metode

Bahan

Laminarin (Sigma-Aldrich), DMSO, L-glutation, Hoechst 33342, DMEM, FBS, kit uji ROS (Beyotime), reagen H&E, Pp IX (Aladdin), dan semua reagen lainnya adalah grade analitis. Sel kanker payudara manusia MCF-7 diperoleh dari Universitas Yantai, dan tikus nude betina (14–18 g) diperoleh dari Beijing Vital River.

Sintesis dan Karakterisasi HLDM

HLDM disintesis melalui asilasi berurutan asam dithiodipropionik dengan MGK, diikuti oleh esterifikasi yang diperantai EDC/DMAP dengan laminarin. Produk diverifikasi oleh spektroskopi ¹H-NMR, IR, dan UV-vis.

Persiapan Miksel HLDM yang Dimuat Pp IX

HLDM dan Pp IX dilarutkan bersama dalam pelarut organik, kemudian dialisis terhadap air deionisasi (MWCO 2000 Da) di bawah pengadukan (600 rpm). Miksel dikoleksi pada suhu kamar.

Karakterisasi

Ukuran partikel dan potensial zeta diukur dengan analyzer Beckman Coulter; morfologi diperiksa oleh TEM (Hitachi H-600). Efisiensi enkapsulasi (EE) dan muatan obat (DL) dihitung dari absorbansi UV-vis pada 630 nm.

Budidaya Sel dan Studi Penyerapan

Sel MCF-7 dibudidayakan dalam DMEM/FBS. Untuk penyerapan, sel diinkubasi dengan Pp IX bebas, miksel LH, atau miksel HLDM (20 µg mL⁻¹) selama 1–4 jam. Fluoresensi diamati oleh mikroskopi terbalik (Nikon Eclipse E400).

Lokasi Subseluler

Setelah inkubasi 4 jam, sel diperbaiki, diwarnai dengan Hoechst 33342, dan diimajing untuk menentukan distribusi Pp IX.

Deteksi ROS

Sel MCF-7 diobati dengan formulasi (20 µg mL⁻¹) selama 2 jam, diirradiasi pada 630 nm selama 30 menit, kemudian diinkubasi dengan DCFH-DA (10 µmol L⁻¹). Fluoresensi (ex 488 nm, em 525 nm) menunjukkan produksi ROS.

Fototoksisitas dan Uji Kehidupan Sel

Sel ditanam pada plate 96-lubang, diekspos terhadap konsentrasi yang bervariasi (1–10 µg mL⁻¹) dari setiap formulasi, diirradiasi (630 nm, 30 menit), dan diinkubasi selama 24 jam. MTT (5 mg mL⁻¹) ditambahkan, dan absorbansi pada 490 nm diukur untuk menghitung keberadaan sel.

Morfologi Inti

Setelah pengobatan 4 jam, sel diperbaiki, diwarnai dengan warna inti, dan diimajing untuk menilai kondensasi kromatin.

Efektivitas dan Keselamatan In Vivo

Sel MCF-7 (1,5 × 10⁶) disuntik subkutan ke dalam tikus nude. Setelah tumor mencapai 70–100 mm³, tikus menerima salah satu dari lima perawatan: salin, Pp IX bebas (5 mg kg⁻¹), miksel HLDM (5 mg kg⁻¹ ekuivalen Pp IX), Pp IX bebas + cahaya 630 nm, atau miksel HLDM + cahaya 630 nm. Volume tumor dan berat badan dipantau setiap hari selang; tikus diutanasikan pada hari 20 untuk histologi (H&E).

Analisis Statistik

Data dinyatakan sebagai mean ± SD (n = 3). Perbedaan dinilai dengan one-way ANOVA, dengan *P < 0,05 dianggap signifikan.

Hasil dan Pembahasan

Karakterisasi HLDM

¹H-NMR mengonfirmasi konjugasi yang berhasil MGK, asam dithiodipropionik, hematin, dan laminarin, dengan puncak karakteristik pada δ 0,8, 2,8, 6,5, dan 3–4 ppm. Spektra IR menampilkan band karbonil ester yang diharapkan, dan UV-vis menunjukkan penyerapan yang berbeda pada 580 nm yang sesuai dengan hematin dalam HLDM.

Properti Miksel

Pencaharan cahaya dinamis mengungkapkan diameter rata-rata 149,3 ± 35 nm dan potensial zeta hampir netral. Gambar TEM mengonfirmasi morfologi bola dengan agregasi sesekali pada konsentrasi lebih tinggi. EE dan DL masing-masing 68 persen dan 12 persen, yang menunjukkan muatan yang efisien.

Penyerapan Seluler

Imajing fluoresensi menunjukkan akumulasi Pp IX yang bergantung pada waktu dan dosis dalam sel MCF-7, dengan miksel HLDM menunjukkan penyerapan yang jauh lebih tinggi daripada Pp IX bebas atau miksel LH. Penyerapan yang ditingkatkan dikaitkan dengan mekanisme rilis yang sensitif terhadap pH/redoks.

Distribusi Subseluler

Studi kolokalisasi mengungkap akumulasi Predominan sitoplasma dan mitokondria dari Pp IX yang diantar oleh miksel HLDM, sesuai dengan target organel yang dikenal dari Pp IX.

Generasi ROS

Fluoresensi DCFH-DA signifikan lebih tinggi pada sel yang diobati dengan miksel HLDM plus cahaya dibandingkan Pp IX bebas, mengonfirmasi produksi ROS yang kuat hanya di bawah iluminasi.

Fototoksisitas

Di bawah radiasi cahaya, miksel HLDM mencapai pembunuhan sel >80 persen pada 5 µg mL⁻¹, sedangkan Pp IX butuh >10 µg mL⁻¹ untuk efek yang setara. Dalam kegelapan, semua formulasi menunjukkan sitotoksisitas minimal.

Morfologi Inti

Miksel HLDM yang dimuat Pp IX menginduksi kondensasi kromatin dan fragmentasi inti yang bergantung pada dosis, yang mengindikasikan apoposis.

Efektivitas In Vivo

Hanya grup miksel HLDM yang menerima cahaya 630 nm yang menunjukkan inhibisi pertumbuhan tumor yang signifikan (≈ 70 persen penurunan pada hari 20). Pp IX bebas dengan cahaya menghasilkan presersi modest, sementara salin dan grup tidak diirradiasi terus tumbuh. Berat badan tetap stabil di semua grup, dan pewarnaan H&E mengungkap nekrosis yang luas dalam kohort HLDM + cahaya.

Kesimpulan

Kami telah merancang miksel berbasis laminarin yang responsif dual pH/redoks yang efisien mengenkapsulasi Pp IX, meningkatkan keterlarutannya, dan memfasilitasi rilis spesifik tumor. Sistem ini menghasilkan fototoksisitas yang dikomandasikan ROS yang kuat in vitro dan mencapai aktivitas antitumor yang signifikan in vivo tanpa toksis sistemik. Hasil ini memosisikan miksel HLDM sebagai platform yang menjanjikan untuk PDT payudara dan tumor padat lainnya di masa depan.

Ketersediaan Data dan Bahan

Dataset yang mendukung kesimpulan artikel ini disertakan dalam artikel.

Singkatan

HLDM

Hematin-Laminarin-Dithiodipropionic acid-MGK

LH

Laminarin-Hematin

Pp IX

Protoporfirin IX

PDT

Terapi fotodinamis

ROS

Spesies reaktif oksigen