Protoporphyrin IX-loaded laminarin nanopartikel untuk pengobatan antikanker, perilaku selulernya, deteksi ROS, dan penelitian pada hewan
Abstrak
Partikel berskala nano berbasis konjugat laminarin dalam penelitian ini diusulkan sebagai sistem pengiriman protoporfirin IX (Pp IX) dalam terapi fotodinamik (PDT) sel kanker payudara manusia (MCF-7). Hematin-Laminarin-Dithiodipropionic Acid-MGK, disebut sebagai HLDM, adalah bahan pembawa amfifilik dengan pH ganda/sensitif redoks yang dapat digunakan untuk memuat obat hidrofobik untuk meningkatkan kelarutan dan meningkatkan biokompatibilitas. Oleh karena itu, kami menggabungkan fotosensitizer (Pp IX) dengan HLDM untuk membuat nano-misel baru, yang di sini disebut misel HLDM bermuatan Pp IX. Misel HLDM bermuatan Pp IX berukuran 149,3 ± 35 nm dalam air netral. Fototoksisitas, efek PDT in vitro, dan kepekaan ganda terhadap pH dan lingkungan mikro redoks dari misel HLDM bermuatan Pp IX diperiksa pada konsentrasi yang berbeda dengan menggunakan sel kanker payudara manusia MCF-7. Percobaan pada fototoksisitas dan produksi spesies oksigen reaktif (ROS) membuktikan bahwa misel dapat menghasilkan PDT untuk membunuh sel kanker dengan panjang gelombang cahaya tertentu. Percobaan apoptosis menunjukkan bahwa misel dapat menyebabkan kerusakan nuklir. Efek PDT in vivo dari misel dipelajari dengan membangun model tikus telanjang pembawa tumor dari sel MCF-7. Studi in vivo menunjukkan bahwa misel HLDM yang mengandung Pp IX dapat menginduksi efek anti-tumor yang luar biasa. Platform pengobatan nano berbasis laminarin yang menjanjikan bertindak sebagai sistem penghantaran obat baru untuk meningkatkan penyerapan, akumulasi, dan kemanjuran PDT Pp IX in vitro dan in vivo.
Pengantar
Terapi fotodinamik (PDT) [1,2,3] adalah jenis terapi mapan yang dipengaruhi oleh sumber cahaya, fotosensitizer, dan oksigen molekuler [4], yang dapat menghasilkan spesies oksigen reaktif (ROS) yang dimediasi secara langsung [5, 6] mematikan secara langsung efek pada sel kanker di dalam area yang diterangi di bawah kondisi sifat invasif minimal [6] dan toksisitas rendah. Ini dapat menimbulkan kerusakan DNA [7], mengaktifkan jalur pensinyalan untuk memfasilitasi reaksi vaskulotoksik yang menghalangi suplai darah ke area tumor [8], dan memicu pengenalan dan penghancuran sel tumor oleh sistem kekebalan tubuh [9]. Efek utamanya adalah mengatasi resistensi obat [10, 11] dan memunculkan efek antitumor selektif, yang mengakibatkan kematian sel kanker.
Saat ini, pengobatan tradisional untuk tumor [12], seperti radioterapi, kemoterapi, dan pembedahan, banyak digunakan di klinik, tetapi metode ini memiliki toksik dan efek samping yang besar, trauma yang besar, risiko yang besar, keterbatasan tertentu, dan kekambuhan yang mudah. PDT digunakan dalam pengobatan kanker yang luas, termasuk kanker payudara [13,14,15], hepatosit [14], paru-paru [16], melanoma [17], dan kulit [18], menjadi fokus peneliti dalam dan luar negeri. . Pengalaman telah membuktikan bahwa PDT adalah pilihan yang lebih baik untuk menggantikan metode konvensional seperti kemoterapi [19] dan pembedahan dalam terapi berbagai penyakit dan tumor [20], karena memiliki keunggulan seperti menghambat metastasis kanker [21] dan bersifat selektif dan mudah beradaptasi. Namun, aplikasi sebagian besar fotosensitizer terbatas dalam terapi kanker karena akumulasinya yang terbatas di lokasi tumor [22].
Protoporfirin IX (Pp IX) adalah fotosensitizer hidrofobik [23, 24] yang memiliki potensi besar untuk digunakan dalam diagnosis dan PDT. Pp IX adalah turunan hematoporfirin yang juga dapat memicu apoptosis tanpa stimulus eksternal (seperti sinar laser [25]), yang menunjukkan kemungkinan memiliki fungsi baru untuk menyembuhkan kanker [26].
Akumulasi Pp IX topikal pada lesi prakanker dan ganas merupakan strategi yang menarik untuk dilakukan [27], karena fluoresensinya memberikan metode yang nyaman untuk orientasi tumor [28].
Namun, Pp IX memiliki beberapa kelemahan yang perlu dipecahkan [29], seperti memiliki kelarutan yang buruk dan mudah beragregasi dalam larutan berair, sehingga mengurangi efikasinya. Oleh karena itu, laminarin [30] adalah biomaterial pembawa nanomedicine laut yang digunakan sebagai pembawa gugus hidrofilik untuk meningkatkan fitur fotosensitizer yang tidak menguntungkan. Telah terbukti bahwa laminarin memiliki aktivitas biologis yang efektif, termasuk antitumor, antivirus, dan sebagainya. Mengumpulkan bukti menunjukkan [31] bahwa ia memiliki efisiensi terapeutik yang baik pada berbagai jenis sel kanker in vitro dan in vivo (seperti sel kanker payudara dan usus besar [32]).
Nanopartikel polimer yang responsif terhadap rangsangan, seperti liposom dan misel, dapat lebih memastikan pengiriman obat dan mengurangi efek samping. Liposom [33] dapat digunakan sebagai alat diagnostik dan terapeutik, dan amfoterisin B dapat dimasukkan ke dalam liposom untuk mengobati infeksi jamur [34]. Nanopartikel misel polimer [35] adalah penghantaran obat yang cerdas [36]. Misel Hematin-Laminarin-Dithiodipropionic acid-MGK (HLDM) bermuatan Pp IX dengan sensitifitas ganda pH/redoks dan respons foto mengandung inti hidrofobik untuk memuat Pp IX serta cangkang hidrofilik laminarin. Mereka telah menjadi salah satu penghantaran obat nanoscopic yang paling signifikan untuk meningkatkan fitur fotosensitizer yang tidak menguntungkan [37], seperti biodistribusi obat, efek samping, dan pelepasan obat [38, 39].
Mengenai hal ini, oleh karena itu kami merancang nanoplatform penghantaran obat multifungsi [40] berdasarkan laminarin sebagai respons terhadap pH [41] dan sifat redoks [42], yang dapat mempertahankan kelarutan dalam air dan memadamkan Pp IX dalam sirkulasi darah tubuh manusia sementara dequenching Pp IX di situs yang ditargetkan [43]. Jenis pengiriman obat yang responsif terhadap rangsangan internal dan eksternal telah mendapat perhatian yang luas, seperti suhu [44], ultrasound [45], pH, dan redoks. Sistem termoresponsif telah dipelajari untuk mengontrol penghantaran obat, menunjukkan potensi penghantaran obat yang lebih baik [46]. Sistem penghantaran obat yang responsif terhadap rangsangan telah mendorong pelepasan obat sesuai permintaan yang berkelanjutan [47] secara permanen dan terdistribusi dengan cepat.
Dalam penelitian ini, misel HLDM bermuatan Pp IX disiapkan untuk mengatasi beberapa kelemahan Pp IX [48], seperti ketidakstabilan dan agregasi dalam larutan berair. Kami berhipotesis bahwa misel HLDM bermuatan Pp IX, yang dirakit sendiri dari nanocarrier HLDM [49], harus diakumulasikan dan dilepaskan Pp IX di lingkungan mikro tumor [50]. Pp IX dirangsang oleh untuk memfasilitasi pembentukan ROS setelah akumulasi Pp IX dalam sel tumor, yang dapat menyebabkan kematian sel kanker (seperti pada Gambar 1). Sintesis dan karakterisasi bahan HLDM telah dibuktikan dengan 1H-NMR seperti yang dilaporkan sebelumnya [51]. Jadi, dalam penelitian ini, serapan seluler, fototoksisitas, pembentukan ROS, pengamatan morfologi nuklir, dan efek PDT in vivo dari misel HLDM bermuatan Pp IX telah dipelajari.
Ilustrasi skema obat nano berbasis laminarin (HLDM) yang digunakan untuk memberikan fotosensitizer untuk terapi tumor
Metode
Materi
Laminarin dibeli dari Sigma-Aldrich (Shanghai, PR China). Dimetil sulfoksida (DMSO) dipasok oleh Tianjin Bodi Co. Ltd. l-glutathione (GSH), Hoechst 33342 disediakan oleh Sigma-Aldrich (Shanghai, PR China). Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) dan fetal bovine serum (FBS) diperoleh dari Science Biotechnology Co. Ltd. (Shangdong, Yantai, China). Kit uji spesies oksigen reaktif (ROS) disediakan oleh Beyotime Biotechnology (Shanghai, Cina). H& E dibeli dari Bioworld Technology Co. Ltd. (Nanjing, China). Pp IX dipasok oleh Aladdin Reagent Net (Shanghai, China). Semua reagen dan pelarut lainnya memiliki tingkat kimia.
Sel kanker payudara manusia (MCF-7) dipasok oleh Laboratorium Farmakologi Molekuler, di Sekolah Farmasi Universitas Yantai (Shandong, Cina).
Tikus telanjang betina dengan berat 14–18 g (3–4 minggu) dibeli dari Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd.
Sintesis dan Karakterisasi Bahan HLDM
Bahan HLDM disintesis dan disediakan dengan menggunakan metode seperti yang disajikan dalam laporan sebelumnya [51]. Pertama, oksaloil klorida digunakan untuk mengaktifkan asam ditiopropionat menjadi asil klorida, yang diasilasi dengan MGK untuk mendapatkan HOOC-S-S-MGK. Setelah itu digunakan 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimida hidroklorida (EDCI) dan 4-dimetilaminopiridin (DMAP) untuk mengaktifkan HOOC-S-S-MGK, kemudian dilakukan reaksi esterifikasi dengan laminarin pada suhu 40°C. Akhirnya, kami mensintesis bahan HLDM dengan esterifikasi menggunakan EDC/DMAP sebagai katalis. DMSO-D6 dan D2 O dipilih sebagai pelarut untuk menganalisis komposisi senyawa. Dan
1
Spektrum H-NMR (Advance Bruker 400M; Swiss Bruker Company, Madison, WI, USA), spektrum IR, dan spektrum serapan UV-tampak (200–700 nm) untuk bahan HLDM diuji dan ditentukan pada suhu kamar.
Misel HLDM bermuatan Pp IX dieksploitasi melalui metode dialisis. Singkatnya, inti hidrofobik terdiri dari MGK, asam ditiodipropionat, dan hematin serta cangkang hidrofilik laminarin dapat berkumpul sendiri dalam air untuk membentuk polimisel. Pp IX dimuat dalam inti hidrofobik selama agitasi untuk mendapatkan misel HLDM yang dimuat Pp IX. HLDM dan Pp IX didialisis dalam air deionisasi (MWCO 2000 Da) pada pengaduk 90-1 pada 600 rpm setelah diaduk selama waktu yang wajar dalam reagen organik untuk larut, diikuti dengan pemrosesan selanjutnya, untuk mendapatkan misel HLDM bermuatan Pp IX. Seluruh prosedur berlangsung pada suhu kamar.
Karakterisasi Misel
Ukuran partikel dan potensi zeta untuk misel HLDM bermuatan Pp IX ditentukan dengan menggunakan Beckman Coulter Particle Analyzer (nomor bagian:A35878) pada suhu kamar. Morfologi misel HLDM bermuatan Pp IX divisualisasikan dengan mikroskop elektron transmisi H-600 (H-600 TEM; Hitachi, Tokyo, Jepang). Untuk menentukan kemampuan pemuatan, misel HLDM bermuatan Pp IX dipecah oleh peralatan ultrasonik dalam reagen organik. Konsentrasi Pp IX bebas dalam misel diukur dengan spektrum serapan UV-tampak pada 630 nm. Efisiensi jebakan (EE) dan kandungan pemuatan obat (DL) dihitung sesuai dengan rumus.
EE (%) =(bobot Pp IX dalam misel HLDM bermuatan Pp IX/bobot keseluruhan Pp IX) ×100%
DL (%) =(berat Pp IX dalam misel HLDM bermuatan Pp IX/berat misel) ×100%
Budaya Sel
Garis sel kanker payudara manusia (MCF-7), garis sel kanker usus besar (CT-26) (Gbr. 5), dan garis sel kanker paru-paru (A549) (Gbr. 5) digunakan untuk menentukan misel HLDM bermuatan Pp IX dengan mikroskop fluoresensi terbalik (AxioVert.A1). Telah terbukti secara luas sebelumnya bahwa bahan-bahan ini memiliki efek anti-tumor. Tetapi percobaan menunjukkan bahwa MCF-7 dapat memiliki lebih banyak penyerapan daripada dua garis sel kanker lainnya. Oleh karena itu, MCF-7, yang dikultur dalam DMEM (Hyclone) dengan 10% serum janin sapi, dipilih untuk memantau efek kuratif pada 37 °C dalam suasana lembab yang mengandung 5% CO2 .
Serapan Sel
Media segar yang mengandung misel Pp IX, Pp IX-loaded laminarin-hematin (LH) gratis, atau misel HLDM yang diisi Pp IX ditambahkan untuk menggantikan media asli setelah 24 jam, masing-masing. Sel MCF-7 kemudian dikultur selama 1 jam, 2 jam, dan 4 jam (konsentrasi Pp IX:20 g/mL) atau selama 4 jam dengan mengikuti konsentrasi Pp IX yang berbeda :10 g/mL, 20 g/mL, dan 50 g/mL di atas atmosfer. Konsekuensi dari serapan seluler diamati dengan mikroskop fluoresensi terbalik (Eclipse E400; Nikon Corporation, Tokyo, Jepang) untuk mendapatkan analisis kualitatif [52].
Studi Lokasi Sel
Dalam penelitian ini, Pp IX tidak hanya obat antikanker untuk menimbulkan kematian sel kanker tetapi juga probe fluoresensi merah untuk menemukan serapan. Sel MCF-7 dalam media segar yang mengandung misel LH bebas Pp IX, Pp IX, atau misel HLDM bermuatan Pp IX dikultur selama 4 jam pada konsentrasi 20 g/mL di atas atmosfer. Setelah difiksasi dengan paraformaldehyde 4%, fiksatif diganti dengan Hoechst 33342 (10 g/mL) untuk mewarnai nukleus selama 15 menit. Hasil lokasi divisualisasikan dengan mikroskop fluoresensi terbalik.
Pengukuran Generasi Spesies Oksigen Reaktif
Kemampuan generasi untuk spesies oksigen reaktif (ROS) diukur secara intraseluler menggunakan mikroskop fluoresensi, yang menggunakan probe ROS 2′,7′-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA). MCF-7 diunggulkan ke dalam piring enam sumur dan diinkubasi. Setelah 24 jam, media dipindahkan dan diganti dengan media segar yang mengandung misel HLDM bebas Pp IX atau Pp IX (20 g/mL) selama 2 jam. Sel-sel dicuci dengan media DMEM, diikuti dengan penyinaran selama setengah jam (630 nm). Setelah dicuci dua kali, sel MCF-7 diinkubasi dengan DCFH-DA (10 mol/L) di atas atmosfer selama 30 menit, yang kemudian dicitrakan dengan mikroskop fluoresensi (panjang gelombang eksitasi:488 nm, panjang gelombang emisi:525 nm) setelah dicuci kembali dengan media DMEM.
Uji Fototoksisitas dan Viabilitas
MCF-7 diinokulasi untuk tanaman 96-sumur untuk mendeteksi sitotoksisitas berbagai bentuk sediaan untuk uji viabilitas. Kemudian DMEM segar termasuk konsentrasi yang berbeda dari misel LH bebas Pp IX, Pp IX-loaded, atau misel HLDM Pp IX-loaded (1, 2, 5, dan 10 g/mL) ditambahkan di setiap sumur. Untuk kelompok fototoksisitas, sel diinkubasi selama 4 jam untuk menyerap, dan selanjutnya diiradiasi selama 30 menit, diikuti dengan inkubasi selama 24 jam di atas atmosfer. Di sisi lain, sumur dibuat untuk menganalisis sitotoksisitas dan viabilitas dalam kondisi gelap sebagai kelompok kontrol. Mereka selanjutnya diinokulasi selama 24 jam di atas atmosfer.
Dua puluh mikroliter larutan 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) (5 mg/mL) dan 180 L PBS (pH 7,4) kemudian ditambahkan ke dalam 96-sumur. piring dan selanjutnya diinkubasi selama 3 jam. Selanjutnya, 150 L DMSO digunakan untuk melarutkan produk formazan dan absorbansi (OD) diukur menggunakan instrumen berlabel enzim (SpectraMax M 5) pada 490 nm. Viabilitas MCF-7 dinyatakan dengan menggunakan rumus berikut:
Nilai sampel OD diberikan oleh sel yang diberi obat, sedangkan nilai kontrol OD diberikan oleh sel tanpa obat, dan nilai OD hitam diperoleh dari sumur tanpa obat dan sel.
Observasi Morfologi Nuklir
Garis sel MCF-7 diinkubasi selama 24 jam, dan kemudian distimulasi dengan misel HLDM bermuatan Pp IX selama 4 jam. Setelah pembilasan dan fiksasi, sel diwarnai dengan probe fluoresensi nuklir selama 20 menit pada suhu 37 ° C, diikuti dengan penghilangan pewarna dari lingkungan menggunakan PBS. Gambar fluoresensi yang sesuai divisualisasikan menggunakan mikroskop fluoresensi.
Evaluasi Keamanan dan Kemanjuran Di Vivo
Tikus telanjang betina kemudian digunakan untuk menyelidiki kelayakan antikanker dari misel HLDM bermuatan Pp IX in vivo. Sel MCF-7 (1,5 × 10
6
sel/0,1 mL) disuntikkan pada sapi mencit telanjang betina sebagai model hewan, dan kemudian estrogen diberikan melalui gavage intragastrik untuk mendorong pertumbuhan tumor. Tikus telah dibagi secara acak menjadi lima kelompok setelah volume tumor mencapai sekitar 70–100 mm
3
, yang dilambangkan sebagai salin normal, Pp IX bebas (5 mg/kg), misel HLDM bermuatan Pp IX (5 mg/kg setara Pp IX bebas), Pp IX bebas (5 mg/kg) ditambah penyinaran cahaya, dan Misel HLDM bermuatan Pp IX (5 mg/kg setara Pp IX gratis) ditambah penyinaran cahaya. Kelompok yang dirawat dengan cahaya diekspos dalam laser 630 nm dengan 30 menit pada 24 jam pasca injeksi. Kemanjuran terapeutik dievaluasi dengan memantau volume tumor dalam lima kelompok yang diobati setiap hari dan menganalisis slide histopatologis setelah 20 hari. Dan berat badan diukur untuk menilai keamanan obat dalam lima kelompok perlakuan setiap 2 hari [53].
Analisis Statistik
Semua data dalam penelitian ini dicatat sebagai Means ± standar deviasi (n =3). Selain itu, perbedaan yang signifikan antara kelompok yang berbeda dianalisis menggunakan analisis variasi satu arah (ANOVA). Perbedaan dianggap signifikan secara statistik pada tingkat probabilitas *P 0,05 (signifikan), **P 0,01 (sangat signifikan).
Hasil dan Diskusi
Karakterisasi materi HLDM
1
Spektrum H-NMR untuk bahan HLDM ditunjukkan dalam laporan sebelumnya [51]. Puncak metil untuk MGK diamati pada sekitar :0,8 (Gbr. 2h).
1
Spektrum H-NMR mengungkapkan puncak penyerapan sekitar :2,8 (Gbr. 2g), yaitu CH2 dalam asam 3,3-dithiodipropionic. Munculnya puncak sinyal pada :6,5 (Gbr. 2j) membuktikan adanya hematin. Puncak karakteristik laminarin dalam bahan polimer amfifilik ditemukan pada daerah antara 3 dan 4 ppm, menunjukkan bahwa produk baru HLDM telah berhasil disintesis.
1
Spektrum H-NMR HLDM
Spektrum IR untuk HLDM
Spektrum IR bahan HLDM ditunjukkan dalam laporan sebelumnya [51]. Puncak ganda pada gambar membuktikan koneksi MCK. Selain itu, puncak yang dikarakterisasi dari gugus karbonil ester diamati pada spektrum IR.
Spektrum Penyerapan UV-Visible HLDM
Pada Gambar 3a, hematin memiliki panjang gelombang serapan ultraviolet (sekitar 580 nm) dan pada Gambar 3b, Laminarin-Dithiodipropionic acid-MGK tidak memiliki penyerapan pada posisi yang sama. Spektrum serapan UV-terlihat dicapai untuk memverifikasi hubungan hematin berdasarkan ini. Hasilnya menunjukkan bahwa panjang gelombang serapan yang dikarakterisasi dalam 580 nm diamati pada bahan HLDM (Gbr. 3c). Hematin telah berhasil dihubungkan ke bahan HLDM.
Spektrum serapan UV-terlihat dari hematin (a ), Laminarin-S-S-MGK (b ), dan HLDM (c )
Karakterisasi Misel yang Diisi Pp IX
Ukuran dan potensi zeta misel HLDM bermuatan Pp IX ditunjukkan pada Gambar 4a, b. Ditunjukkan bahwa misel telah diserap lebih baik oleh sel kanker, untuk meningkatkan efisiensi dan mengurangi efek samping (peningkatan permeabilitas dan efek retensi, EPR). Misel dilihat dengan mata telanjang setelah filter membran Millipore pada Gambar. 4c. Atas dasar ini, gambar misel HLDM bermuatan Pp IX dipindai dengan mikroskop elektron transmisi (TEM) seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4d. Morfologinya adalah partikel yang tidak seragam, karena waktu untuk ultrasound kurang. Di sisi lain, aglomerasi partikel diamati pada gambar, mungkin karena konsentrasi yang lebih tinggi (Gbr. 5).
a , b Ukuran dan potensi zeta misel HLDM bermuatan Pp IX. c Misel HLDM bermuatan Pp IX dalam air. d Gambar TEM misel HLDM yang dimuat Pp IX
Serapan misel HLDM bebas Pp IX, LH bermuatan Pp IX, dan HLDM bermuatan Pp IX di CT-26 (kiri) dan A549 (kanan)
Efisiensi jebakan (EE) dan konten pemuatan obat (DL) dihitung dengan rumus (Tabel 1). Ditemukan setelah banyak percobaan bahwa fluktuasi EE dan DL tidak stabil, karena kami telah berspekulasi bahwa misel HLDM bermuatan Pp IX mungkin beragregasi dalam larutan berair.
Serapan Seluler
Dalam penelitian ini, fluoresensi Pp IX dideteksi untuk menyelidiki ketergantungan waktu dan konsentrasi. Seperti yang terlihat dari diagram, misel HLDM bermuatan Pp IX diserap dalam sel MCF-7 dan intensitas fluoresensinya meningkat seiring waktu dan konsentrasi. Dengan membandingkan tiga misel pada Gambar. 6a, sel kanker yang diberi misel HLDM bermuatan Pp IX memiliki lebih banyak fluoresensi. Ini karena bagian pH/redoks telah dikaitkan dengan bahan untuk menanggapi lingkungan mikro tumor. Sel kanker yang diberi Pp IX gratis memiliki fluoresensi yang lebih lemah karena agregasi dalam DMEM.
a Serapan misel HLDM bebas Pp IX, LH bermuatan Pp IX, dan HLDM bermuatan Pp IX. b Lokasi sel misel HLDM bermuatan Pp IX
Dari apa yang telah dibahas di atas, kita dapat dengan aman menarik kesimpulan bahwa bahan HLDM, termasuk bagian sensitivitas pH dan reduksi, dapat meningkatkan aglomerasi Pp IX dan meningkatkan penyerapan dan pelepasannya dalam sel tumor.
Studi Lokasi Sel
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6b, nukleus diwarnai dengan pewarna fluoresen, dan kemudian kita bisa melihat fenomena fluoresensi merah yang disajikan di luar fluoresensi biru. Kami telah berspekulasi bahwa serapan sel mungkin terkait dengan sitoplasma, jadi hipotesis ini diverifikasi oleh penelitian sebelumnya bahwa Pp IX telah terakumulasi dan terlokalisasi di mitokondria dan sitoplasma sel tumor [54].
Pengukuran Generasi Spesies Oksigen Reaktif
Seperti ditunjukkan pada Gambar. 7, spesies oksigen reaktif (ROS) dalam sel MCF-7 dipantau dengan menggunakan DCFH-DA sebagai indikator, yang telah diamati memiliki fluoresensi hijau dalam mikroskop fluoresensi. Misel HLDM bermuatan Pp IX memiliki intensitas fluoresensi hijau yang lebih kuat di bawah cahaya sedangkan Pp IX bebas hampir tidak memiliki fluoresensi. Kami telah berspekulasi bahwa Pp IX bebas mungkin menggumpal menyebabkan efek pendinginan sendiri di DMEM. Fluoresensi hijau dari tiga kelompok dapat diabaikan tanpa cahaya (seperti kelompok kontrol). Hasil ini menegaskan bahwa Pp IX dapat merangsang oksigen untuk menghasilkan ROS sebagai fotosensitizer dalam kondisi cahaya.
Generasi spesies oksigen reaktif (ROS) dalam kondisi cahaya
Pengujian Fototoksisitas dan Viabilitas
Uji sitotoksisitas dan viabilitas sel dilakukan dengan sel kanker MCF-7 payudara manusia di bawah dua lingkungan eksternal yang berbeda, menggunakan uji MTT. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 8a, perbedaan kerusakan sel yang signifikan dapat diabaikan di semua sampel di bawah kegelapan. Ketika konsentrasi Pp IX ditingkatkan menjadi 50 g/mL, viabilitas sel MCF-7 yang kami deteksi tetap pada level tinggi. Fenomena tersebut menunjukkan bahwa sitotoksisitas terhadap sel atau organ tidak meningkat secara signifikan dengan peningkatan konsentrasi Pp IX.
a Viabilitas sel MCF-7 dari misel LH bermuatan Pp IX, Pp IX, atau misel HLDM bermuatan Pp IX dalam kondisi cahaya. b Toksisitas cahaya relatif dari misel LH bermuatan Pp IX, Pp IX, atau misel HLDM bermuatan Pp IX pada penyinaran. n =3; * menunjukkan P 0,05
Seperti yang digambarkan pada Gambar. 8b, 5 g/mL Pp IX memiliki perbedaan bermakna pada kelompok obat bebas dan misel. Sitotoksisitas terhadap sel atau organ meningkat secara signifikan pada kelompok misel, karena konsentrasi Pp IX meningkat di bawah cahaya, sedangkan kelompok Pp IX bebas menunjukkan sedikit perubahan hingga konsentrasi 10 g/mL. Data ini menunjukkan bahwa efisiensi fototoksik misel bermuatan Pp IX jelas lebih tinggi dibandingkan dengan Pp IX bebas. Sekali lagi, percobaan menunjukkan bahwa fotosensitizer bebas dapat terakumulasi untuk menyebabkan efek pendinginan sendiri. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa misel HLDM bermuatan Pp IX memiliki potensi besar untuk membunuh sel kanker dengan penyinaran cahaya.
Pengamatan Morfologi Nuklir
Dalam studi lokasi sel, kami menemukan tanpa disadari bahwa nukleus yang diwarnai menunjukkan bintik-bintik putih, dan konsentrasi Pp IX yang lebih tinggi lebih jelas dengan fenomena ini. Mungkin ini karena kerusakan DNA pada nukleus. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 8, misel HLDM bermuatan 20 g/mL Pp IX dapat menyebabkan kerusakan DNA dibandingkan dengan kontrol yang sesuai di MCF-7. Ketika konsentrasinya mencapai 50 g/mL, kerusakan akan serius pada sel kanker. Studi observasi morfologi nuklir menunjukkan bahwa kerusakan DNA merupakan penanda awal kematian sel MCF-7 yang diinduksi oleh Pp IX [26] (Gbr. 9).
Kerusakan DNA sel MCF-7 setelah pengobatan Pp IX
Evaluasi Keamanan dan Kemanjuran Di Vivo
Seperti ditunjukkan pada Gambar. 10a, b, pertumbuhan tumor dari lima kelompok diukur untuk mengevaluasi kemanjuran in vivo. Kelompok yang diobati dengan saline menunjukkan pertumbuhan yang berkelanjutan pada tingkat yang relatif tinggi. Tidak ada perbedaan bermakna antara kelompok yang diberi misel HLDM bebas Pp IX dan Pp IX dengan kelompok salin. Data ini menunjukkan bahwa volume tumor kurang terpengaruh oleh Pp IX tanpa iradiasi. Sementara itu, kelompok yang diberi Pp IX bebas plus cahaya menghasilkan sedikit perubahan volume tumor. Apa yang menyebabkan fenomena ini adalah bahwa obat bebas tidak stabil secara in vivo dan dengan demikian mudah terkumpul dalam darah. Oleh karena itu, mungkin telah dihilangkan sebelum sampai ke jaringan tumor. Sebaliknya, pertumbuhan tumor yang diobati dengan misel HLDM bermuatan Pp IX secara signifikan dihambat pada Gambar 10a. Fenomena ini membuktikan bahwa misel menunjukkan efek antitumor yang signifikan setelah memberikan panjang gelombang cahaya tertentu untuk dirangsang. Singkatnya, percobaan ini menunjukkan bahwa efek antitumor dari misel HLDM bermuatan Pp IX telah meningkat dengan jelas di bawah kondisi cahaya.
Evaluasi aktivitas dan keamanan antitumor in vivo. a Volume tumor berubah seiring waktu perawatan. b Volume tumor dari lima kelompok:(a ) garam normal, (b ) gratis Pp IX (5 mg/kg), (c ) Misel HLDM bermuatan Pp IX (5 mg/kg setara Pp IX gratis), (d ) gratis Pp IX (5 mg/kg) ditambah penyinaran ringan, dan (e ) Misel HLDM bermuatan Pp IX (5 mg/kg setara Pp IX gratis) ditambah penyinaran cahaya. c Perubahan tubuh tikus telanjang pembawa tumor
Di sisi lain, berat badan relatif diukur untuk mengevaluasi keamanan misel HLDM bermuatan Pp IX (Gbr. 10c). Tidak ada penurunan berat badan yang nyata dan perubahan yang dapat diabaikan pada semua kelompok, menunjukkan keamanan hayati yang baik dari perawatan ini pada tikus.
Selanjutnya, slide histopatologis menunjukkan polimorfisme nuklir yang jelas pada kelompok saline pada Gambar. 11. Perubahan patologis pada jaringan tumor yang diwarnai dengan hematoxylin dan eosin (H&E) memiliki perbedaan yang signifikan dalam lima kelompok. Hasilnya menunjukkan sedikit kondensasi nuklir pada misel HLDM bermuatan Pp IX dan gugus Pp IX bebas. Jaringan tumor dari kelompok misel HLDM (plus cahaya) yang dimuat Pp IX menunjukkan kerusakan nuklir yang jelas. Oleh karena itu, kami menyimpulkan bahwa hasil ini konsisten dengan hasil di atas untuk evaluasi efikasi dan keamanan in vivo.
Pewarnaan tumor H&E dengan formulasi berbeda. Semua data dilaporkan sebagai mean ± SD. n =3; * menunjukkan P 0,05
Sampai saat ini, berbagai bahan telah dipelajari untuk penghantaran obat [55]. Dalam penelitian sebelumnya, kami berhasil mensintesis konjugat laminarin polisakarida laut dengan pH ganda/redoks sensitif, dan dalam penelitian ini, konjugat tersebut digunakan sebagai sistem pengiriman untuk Pp IX, untuk mencapai efek anti-tumor. Eksperimen in vivo menunjukkan bahwa misel HLDM yang memuat Pp IX dapat secara efektif mengirimkan Pp IX ke dalam sel kanker dan menghasilkan efek mematikan langsung yang dimediasi ROS pada sel kanker. Eksperimen sitotoksisitas menunjukkan bahwa misel memiliki sedikit sitotoksisitas tanpa penyinaran cahaya, sedangkan larutan misel konsentrasi rendah memiliki dampak nyata pada viabilitas sel dalam pencahayaan tertentu. Pada tingkat hewan, misel HLDM bermuatan Pp IX memberikan efek fototoksik untuk menghasilkan efek anti-tumor yang relevan. Oleh karena itu, aktivitas misel HLDM bermuatan Pp IX disertifikasi secara meyakinkan secara in vitro dan in vivo.
Kesimpulan
A novel laminarin-based nanomedicine platform to address undesirable characteristics of Pp IX such as instability and astatic distribution was successfully studied in this research. The photosensitivity and phototoxicity of Pp IX-loaded HLDM micelles were detected and evaluated in vitro and in vivo. Nuclear morphological observation of Pp IX showed that the Pp IX-loaded HLDM micelles could effectively deliver and accumulate Pp IX to cancer cells and cause nuclear damage. The research on phototoxicity and ROS production manifested that Pp IX-loaded HLDM micelles exhibited a relevant PDT effect, exerting anti-tumor activity with a certain wavelength light. Likewise, the in vivo research testified that the Pp IX-loaded HLDM micelles could induce PDT effect under the light condition, which could remarkably enhance the anti-tumor effect of Pp IX. To sum up, the results for in vitro and in vivo studies indicated that Pp IX-loaded HLDM micelles could effectively produce PDT effect and can be applied in the future in tumor treatment in the next research. This promising laminarin-based nanomedicine platform will have great potential for becoming new drug delivery system [57] to deliver hydrophobic photosensitizer for cancer photodynamic therapy (PDT).
Ketersediaan data dan materi
Kumpulan data yang mendukung kesimpulan artikel ini disertakan dalam artikel.
