Administrasi Oral Nanopartikel Lipid Padat yang Diisi Resveratrol Meningkatkan Resistensi Insulin Melalui Ekspresi Penargetan Protein SNARE di Jaringan Adiposa dan Otot pada Tikus dengan Diabetes Tipe 2
Abstrak
Dalam studi saat ini, kami mengembangkan resveratrol (RES)-loaded solid lipid nanoparticle (SLN-RES) untuk meningkatkan resistensi insulin melalui upregulasi kompleks protein SNARE pada tikus dengan diabetes tipe 2. Karakteristik SLN-RES meliputi:ukuran rata-rata 248 nm, potensi zeta 16,5 mV, dan efisiensi penjeratan RES 79,9%. Profil pelepasan SLN-RES menunjukkan ledakan awal diikuti pelepasan berkelanjutan dalam kondisi alami. Hasil spektroskopi inframerah mengungkapkan penggabungan yang baik dari RES ke dalam SLN inti. Nanopartikel bulat dengan agregasi lebih sedikit diamati di bawah pemeriksaan mikroskopis elektronik. Pemberian SLN-RES secara oral mencegah penurunan berat badan dan menunjukkan efek hipoglikemik yang lebih baik daripada RES. Status stres oksidatif serum dikembalikan ke tingkat normal oleh SLN-RES. Lebih lanjut, ekspresi synaptosomal-associated protein 23 (Snap23), syntaxin-4 (Stx4), dan vesicle-associated membrane protein 2 (Vamp2) sebagai elemen utama kompleks protein SNARE direduksi oleh SLN-RES lebih signifikan daripada perlakuan RES pada jaringan otot. Namun, SLN-RES memiliki efek yang mirip dengan pengobatan RES di jaringan adiposa. Secara keseluruhan, hasil kami mengungkapkan SLN-RES bisa menjadi pendekatan terapi modern dan menarik untuk peningkatan resistensi insulin melalui penargetan ekspresi Snap23, Stx4, dan Vamp2 di jaringan adiposa dan otot.
Penyajian Hipotesis
Enkapsulasi resveratrol (RES) ke dalam nanopartikel inti lipid meningkatkan manfaatnya melalui peningkatan stabilitas dan penyerapan usus oral ketika dikonsumsi secara oral. SLN-RES meningkatkan resistensi insulin lebih dari RES. Efek antioksidan RES meningkat saat dimasukkan ke dalam SLN.
Menguji Hipotesis
Analisis spektroskopi SLN-RES dilakukan untuk menentukan efikasi enkapsulasi. Hipotesis kedua adalah untuk mengevaluasi efek pengobatan SLN-RES pada parameter stres oksidatif dan efek hipoglikemiknya terhadap diabetes tipe 2 pada model hewan.
Implikasi Hipotesis
Peningkatan stabilitas dan penyerapan usus menyebabkan bioavailabilitas RES ketika diberikan secara oral. Peningkatan bioavailabilitas RES ketika dimasukkan ke dalam SLN menyebabkan peningkatan konsentrasi RES di jaringan yang ditargetkan. Peningkatan konsentrasi RES dalam jaringan yang ditargetkan menyebabkan efek hipoglikemik RES yang lebih banyak ketika dimasukkan ke dalam SLN daripada RES.
Latar Belakang
Diabetes melitus tipe 2 merupakan gangguan metabolisme yang ditandai dengan resistensi insulin. Resistensi insulin terutama berkembang melalui gangguan sistem transpor glukosa (GLUT 2 dan 4) di otot dan jaringan adiposa [1]. Protein SNARE melumpuhkan sistem GLUT 4 ke membran sel dan memainkan peran penting dalam perdagangan membran, docking, dan fusi vesikel. Synaptosomal-associated protein 23 (SNAP-23), syntaxin-4 (STX4), dan vesicle-associated membrane protein 2 (VAMP-2) dikenal sebagai komponen utama kompleks protein SNARE [2]. Laporan sebelumnya mengidentifikasi bahwa downregulation protein SNARE mempercepat resistensi insulin [3]. Selama beberapa tahun terakhir, sejumlah besar data menunjukkan komponen herbal memiliki banyak efek menguntungkan yang dapat memperbaiki banyak gangguan metabolisme [4,5,6]. Upaya penelitian oleh Cté et al. menunjukkan infus intraduodenal akut RES kompensasi resistensi insulin melalui penurunan protein SIRT1 duodenum dan mengurangi produksi glukosa hati pada model tikus [4]. Hal ini juga, Gencoglu et al. melaporkan pemberian RES intraperitoneal mengurangi resistensi insulin pada tikus diabetes melalui normalisasi ekspresi visfatin dan peningkatan regulasi ekspresi SIRT1 pada otot rangka. Pemberian RES menyebabkan peningkatan ekspresi GLUT4 dan GLUT2 pada diabetes yang diinduksi streptozotocin pada tikus. Secara keseluruhan, temuan ini memberikan wawasan baru tentang efek menguntungkan dari suplementasi RES terhadap resistensi insulin. Meskipun aplikasi terapeutiknya menjanjikan, penyerapan usus yang rendah dan degradasi gastrointestinal terutama menyebabkan rendahnya bioavailabilitas RES bila diberikan secara oral [7].
Selama beberapa tahun terakhir, nanomedicine menyediakan pendekatan cerdas untuk pengiriman obat dari banyak obat untuk mengatasi bioavailabilitas yang rendah, stabilitas yang buruk, dan peningkatan strategi penargetan [8]. Dengan demikian, misel, liposom, nanopartikel polimer, dan nanopartikel lipid padat (SLN) adalah sistem penghantaran obat yang paling terkenal [9, 10]. Studi terbaru menunjukkan menggabungkan RES ke dalam sistem pengiriman skala nano adalah metode yang mudah untuk menghindari keterbatasan dan bisa lebih efektif daripada suspensi obat murni dalam upaya klinis [11]. Bukti terbaru menunjukkan penggabungan obat dalam nanopartikel lipid padat (SLNs) dapat meningkatkan bioavailabilitas RES ketika diberikan secara oral [11, 12]. Froza dkk. menunjukkan nanoenkapsulasi RES meningkatkan efek neuroprotektifnya terhadap penyakit Alzheimer melalui peningkatan konsentrasi obat di jaringan otak [13]. Menurut laporan sebelumnya yang disebutkan di atas, telah diusulkan bahwa enkapsulasi RES ke dalam nanopartikel inti lipid dapat meningkatkan resistensi insulin lebih baik daripada RES melalui peningkatan bioavailabilitas oralnya.
Pekerjaan ini berfokus pada pengembangan, pengoptimalan, dan karakterisasi RES-loaded SLN (SLN-RES) dengan tujuan untuk meningkatkan bioavailabilitas oralnya. Oleh karena itu, dalam penelitian ini, kami menyiapkan SLN-RES dan mencoba menentukan sifat-sifatnya. Kemudian, efek pengobatan oral SLN-RES pada gula darah puasa (FBS), insulin, dan parameter stres oksidatif dievaluasi pada tikus dengan diabetes tipe 2. Selanjutnya, kami menyelidiki efek pemberian oral SLN-RES pada ekspresi gen Snap23, Stx4, dan Vamp2 di jaringan adiposa dan otot.
Bahan dan Metode
Materi
Trans-resveratrol (> 99%) disediakan dari Mega Resveratrol (USA), streptozotocin (STZ) dan nicotinamide (NA) dibeli dari Sigma-Aldrich (Jerman), dan lesitin kedelai terhidrogenasi (S100) diberikan sebagai hadiah oleh Lipoid KG (Ludwigshafen, Jerman). Minyak sawit terhidrogenasi (S154) diberikan sebagai hadiah oleh Condea (Witten, Jerman), dan reagen TRIzol dan kit sintesis cDNA dipasok dari Invitrogen (AS). Kit ELISA Tikus Insulin dibeli dari Bio-Equip (China). Produk dan pelarut lain digunakan di kelas analitis.
Persiapan SLN-RES
SLN-RES diproduksi sesuai dengan penelitian sebelumnya dengan sedikit modifikasi [14]. Secara singkat, 40 mg S100 dan 1 g sorbitol ditambahkan ke dalam 15 ml air suling dan dipanaskan pada 70 °C sebagai fase air. Fasa organik yang meliputi 100 mg S154, 70 mg S100, dan RES dilebur pada suhu 70 °C, kemudian ditambahkan 5 ml kloroform sebagai pelarut organik. Selanjutnya, fase organik dengan cepat dicampur dengan fase air yang telah dipanaskan sebelumnya dengan pengadukan pada 1000 rpm/menit sampai pelarut organik dihilangkan. Suspensi yang dihasilkan disonikasi selama 2 menit dan kemudian disuntikkan dalam air dingin (2 ° C) di bawah pengadukan terus menerus pada 1000 rpm / menit selama 2 jam untuk memantapkan matriks lipid dengan cepat. Kemudian, sampel dipertahankan pada kondisi gelap sampai kering. Sampel yang dihasilkan dicuci dua kali dengan air suling dengan sentrifugasi untuk menghilangkan supernatan yang mengandung obat bebas. Supernatan menjadi sasaran pengukuran efisiensi jebakan ( EE). Serangkaian SLN disiapkan dengan menambahkan jumlah RES murni (30, 50, dan 70 mg) yang berbeda ke dalam fase lipid cair untuk mencapai EE tinggi. Pengaruh pemuatan RES pada ukuran partikel rata-rata, indeks polidispersitas (PDI), muatan permukaan (potensial zeta), dan EE SLN telah dievaluasi (Tabel 1).
Karakterisasi SLN-RES
Diameter rata-rata nanopartikel, potensi zeta, dan PDI SLN-RES diukur dengan difraksi laser (Zetasizer Nano-ZS; Malvern Instrument, UK). Karakterisasi dilakukan setelah pengenceran SLN-RES dalam aquades (1/30).
Efisiensi Jebakan
Nilai EE didefinisikan sebagai persentase RES yang terperangkap ke dalam SLN relatif terhadap total RES menggunakan persamaan berikut. Jumlah RES yang terperangkap ditentukan dengan memisahkan RES bebas dari RES yang dienkapsulasi. RES gratis diukur menggunakan spektrofotometer UV pada 310 nm.
Pola pelepasan obat in vitro dari RES dianalisis sebagai berikut. SLN-RES yang telah disiapkan dilarutkan dalam medium plasma sambil diaduk pada pH 7.4 dan 1.2. Pada titik waktu yang ditentukan (0,5, 1, 2, 4, 6, dan 8 h), jumlah media yang ditentukan ditarik dan kemudian disaring dengan filter jarum suntik 0,24 m untuk kuantifikasi bentuk bebas RES. RES yang difilter mewakili jumlah RES yang dilepaskan ke media.
Mikroskop Transmisi Elektron
Karakterisasi morfologi dievaluasi dengan mikroskop elektron transmisi (TEM). Secara singkat, SLN-RES disebarkan ke kisi tembaga berlapis karbon dan dilihat di bawah TEM ZEISS. Morfologi permukaan, agregasi, dan ketidakteraturan SLN-RES dikarakterisasi.
Spektroskopi Inframerah Transformasi Empat
S100, RES, dan sampel kering SLN dan SLN-RES dianalisis untuk mengkonfirmasi interaksi antarmolekul dan karakterisasi kimia permukaan nanopartikel dengan spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR), menggunakan spektrometer inframerah (FTIR PerkinElmer, USA). Spektrum diperoleh dalam kisaran 400 dan 4000 cm
−1
. Sampel kering disiapkan menggunakan KBr untuk membentuk pelet.
Desain Studi Hewan
Dua puluh tikus Wistar jantan (200-250 g) disediakan dari Animal House of Razi Institute (Iran). Hewan-hewan itu ditangani sesuai dengan protokol yang disetujui oleh Komite Etik Universitas Ilmu Kedokteran Hamadan. Tikus diberi makan dengan air tawar dan makanan standar dan dipelihara dalam kondisi yang terkendali (25 ± 2 °C dan pencahayaan siklus terang/gelap 12 jam). Diabetes tipe 2 diinduksi dengan injeksi intraperitoneal STZ 65 mg/kg (0,1 M dalam natrium sitrat; pH, 4,5) dan nikotinamida 110 mg/kg pada dosis tunggal [15]. Tingkat FBS diukur setelah 3 hari. Tikus dengan kadar glukosa di atas 150 dianggap sebagai model diabetes. Setelah seminggu, RES dan bubuk SLN-RES dilarutkan dalam air suling dan diberikan secara oral dengan gavage setiap hari selama 1 bulan. Hewan secara acak dibagi menjadi empat kelompok dari 5 tikus di setiap kelompok:HC, kontrol yang sehat; DC, kontrol diabetes; RES, tikus diabetes yang diberi resveratrol 10 mg/kg secara oral; dan SLN-RES, tikus diabetes yang diobati dengan nanopartikel lipid padat resveratrol secara oral (sampel SLN-RES bubuk yang mengandung 10 mg/kg RES). Pada akhir penelitian, hewan ditimbang dan kemudian dibius dengan ketamin dan xylazine secara intraperitoneal (masing-masing 100 mg/kg dan 10 mg/kg). Setelah itu, darah dikumpulkan dari tusukan jantung dan serum dipisahkan dan disimpan pada suhu -20°C. Selanjutnya, otot rangka dan jaringan adiposa viseral diambil dan segera dibekukan dan disimpan pada suhu -80 °C untuk analisis lebih lanjut.
Pengukuran Gula Darah Puasa
FBS diukur dengan kit uji kolorimetri (Pars Azmun, Iran).
Pengukuran Serum Insulin
Tingkat serum insulin diukur dengan kit ELISA komersial (Bio-Equip, China) sesuai dengan instruksi pabrik. Resistensi insulin dihitung menggunakan rumus homeostasis model assessment (HOMA).
Total Kapasitas Antioksidan
Kemampuan sampel untuk mereduksi besi (Fe
+3
) menjadi besi (Fe
+2
) ditentukan sebagai kapasitas antioksidan total (TAC). Reaksi antara Fe
2+
dan 2,4,6-Tri(2-pyridyl)-s-triazine (TPTZ) menghasilkan kompleks berwarna biru [16].
Total Grup Thiol
Total gugus tiol (-SH) diukur dengan menggunakan reagen 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB). Reagen ini bereaksi dengan gugus tiol untuk menghasilkan kompleks berwarna kuning [17].
Uji Peroksidasi Lipid
Malondialdehid (MDA) sebagai produk akhir dari proses peroksidasi lipid diukur dengan menggunakan metode kolorimetri. Lipid teroksidasi bereaksi dengan asam tiobarbiturat (TBA) dan menghasilkan kompleks berwarna merah muda. 1,1,3,3-Tetraethoxypropane digunakan sebagai standar [18].
Status Oksidator Total
Potensi oksidasi sampel diukur dengan metode status oksidan total (TOS). Secara singkat, Fe
+3
dan jingga xylenol menghasilkan kompleks berwarna, dalam kondisi asam. Pengujian dikalibrasi dengan H2 O2 , dan hasilnya dinyatakan dalam M H2 O2 setara/L [19].
Reaksi rantai polimerase transkripsi terbalik kuantitatif (qRT-PCR) dilakukan untuk menentukan ekspresi gen Snap23, Stx4, dan Vamp2. Total mRNA diekstraksi dari jaringan adiposa dan otot yang dibekukan cepat menggunakan reagen TRIzol. Kuantitas dan kualitas mRNA ditentukan menggunakan spektrofotometer UV NanoDrop (BioTek Laboratories, Inc., USA). MRNA ditranskripsikan secara terbalik ke cDNA menggunakan Kit Sintesis cDNA Untai Pertama RevertAid. Amplifikasi kuantitatif dilakukan dengan sekuens primer spesifik menggunakan sistem deteksi PCR real-time CFX96. Primer maju dan mundur masing-masing digunakan untuk amplifikasi gen:5′-dTTCCGTTTCTGTGTCCAATAG dan 5′-dTTGTGCTTTCCAGAGACTCAT untuk Snap23, 5′-dTCAGCAGACTATGTGGAAC dan 5′-dCCAAGATGAGAACAGTGACAGA untuk Stx4 , dan 5′-dCTAGACTTGGTCCTAATAG GAATTAG2 dan 5AGTCTAATAG. Perubahan relatif ekspresi gen dihitung menurut 2
-ΔΔCt
rumus. 18s rRNA sebagai gen rumah tangga digunakan. Semua eksperimen dilakukan dalam rangkap tiga.
Analisis Statistik
Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan software SPSS 16 dan GraphPad Prism 6.00, LaJolla, CA (USA). Data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi (SD). Analisis varians satu arah (ANOVA) digunakan untuk membandingkan perbedaan antar kelompok. p < 0,05 dianggap sebagai tingkat signifikan.
Hasil dan Diskusi
Karakterisasi Fisikokimia SLN-RES
Seperti dapat dilihat pada Tabel 1, saat rasio obat terhadap lipid meningkat, ukuran partikel dan nilai PDI hampir konstan yang mungkin disebabkan oleh pembentukan beberapa lapisan fosfolipid di SLN [11]. Kisaran ukuran nanopartikel saat ini adalah sekitar 250 nm yang cocok untuk penyerapan usus dan bypass sistem filtrasi hati dan limpa [20]. Juga, kisaran ukuran ini dapat mengarah pada peningkatan bioavailabilitas RES melalui peningkatan waktu sirkulasi SLN-RES dan pelepasan obat yang berkepanjangan. Pengembangan nanopartikel dengan ukuran dan nilai PDI yang lebih kecil dapat mempermudah penyerapannya di usus. Sebagai saran, modifikasi SLN dengan polietilen glikol (PEG) dapat meningkatkan formulasi kami untuk meningkatkan permeabilitas dan waktu sirkulasi sistemiknya [21].
Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1, nilai PDI 0,4 dianggap memiliki distribusi heterogen, yang menyatakan adanya aglomerat. Pada SLN-RES-30, peningkatan kandungan RES membantu meningkatkan kemungkinan tertampung dalam SLN, meskipun persentase EE jelas berkurang diikuti dengan peningkatan kandungan obat dalam formulasi SLN-RES-70. Disimpulkan bahwa peningkatan kadar lipid pada SLN-RES-70 tidak cukup untuk menampung semua jumlah RES ke dalam matriks SLN [22]. Jadi SLN-50 dipilih sebagai formulasi yang dioptimalkan untuk penyelidikan lebih lanjut.
Hasil potensial Zeta menunjukkan muatan permukaan negatif (− 16.5 ± 17.7 mV) untuk formulasi saat ini. Mengenai pengamatan morfologi, muatan permukaan SLN-RES dianggap cukup untuk mencegah fenomena agregasi partikel dan stabilitas SLN halus [21]. Potensi zeta semua formulasi dengan atau tanpa obat hampir mirip satu sama lain artinya enkapsulasi obat ke dalam SLN tidak berpengaruh signifikan terhadap muatan permukaan pembawa. Akibatnya, obat ditempatkan di bagian dalam SLN karena sifat lipofilik RES [23].
Pengujian Rilis In Vitro
Saat hasilnya disajikan pada Gambar. 1, perilaku pelepasan yang berbeda terdeteksi pada pH = 7.4 dan pH = 1.2. Setelah 6 h dan 1 h, sekitar 70% RES dilepaskan dari nanopartikel pada kondisi pH netral dan asam, masing-masing. Pelepasan burst awal terjadi karena pelepasan obat yang teradsorpsi pada permukaan nanopartikel pada fase awal [24]. Setelah itu, cara pelepasan berkelanjutan dapat dikaitkan dengan interaksi obat-lipid, gradien konsentrasi, dan penggabungan obat ke dalam inti pembawa berminyak. Profil pelepasan berkelanjutan mengarah pada peningkatan konsentrasi serum obat dan akibatnya membantu meningkatkan bioavailabilitas dan pengiriman RES yang terarah. Sebagai saran, pemberian RES secara intravena dapat melewati kondisi asam lambung [22].
Profil pelepasan RES secara in vitro dari SLN-RES dalam kondisi asam dan alami
Evaluasi Morfologi
Seperti yang dapat dilihat pada Gambar. 2, analisis TEM memberikan hasil yang baik di mana sebagian besar partikel mencapai bentuk dan ukuran bola yang teratur dalam kisaran 20-30 nm. Juga, nanopartikel berbentuk batang dan amorf diamati disertai dengan agregasi yang lebih sedikit. Ukuran partikel SLN diperkirakan antara 20 dan 30 nm yang tidak sesuai dengan temuan DLS (Tabel 1). Perbedaan ini mungkin akibat dari hidrasi nanopartikel melalui pengenceran sampel dalam analisis DLS. Juga, ada nanopartikel berbentuk batang yang mungkin disebabkan oleh injeksi konstan emulsi ke dalam air dingin dengan jarum suntik. Kami tidak mengamati agregasi SLN dalam pengamatan TEM yang mewakili muatan permukaan dan stabilitas yang cukup untuk formulasi kami [23].
Mikrograf elektron transmisi SLN-RES. Batang=100 nm
Memvalidasi Efisiensi Pemuatan RES dengan Spektroskopi Inframerah
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3, hasil FTIR dari spektrum lesitin menunjukkan puncak yang lebar pada 3370–3390 cm
−1
yang mengacu pada regangan simetris N-H dari gugus fungsi kolin. Puncaknya pada 1735 cm
−1
mewakili C=O peregangan dari senyawa ester dalam lesitin. Juga, puncak karakteristik pada 2922, 2853, dan 3010 cm
−1
disebabkan oleh peregangan gugus C-H. Spektrum SLN menunjukkan beberapa puncak karakteristik yang mirip dengan spektrum lesitin tanpa pergeseran, tetapi intensitas puncak milik lesitin sangat menurun ketika ditempatkan ke dalam SLN. Ini mungkin karena lingkungan hidrofilik dan efek pelindung dari surfaktan. Dalam penelitian ini, spektrum RES menunjukkan gugus fungsi termasuk pita serapan pada 3290 cm
−1
karena peregangan O-H milik kelompok alkohol, 965 cm
−1
untuk ikatan trans C=C, 1154 cm
−1
untuk peregangan C-O, 1445 cm
−1
dan 1587 cm
−1
untuk regangan C=C pada cincin aromatik (AR), dan 1606 cm
−1
untuk regangan C-C gugus alkena. Juga, RES menunjukkan puncak karakteristik dengan intensitas kuat dari tekukan C-H monosubstitusi pada 770 cm
−1
dan peregangan Ar-C-H pada 3020 cm
−1
. Ada puncak dengan intensitas pada 1175-1263 yang mewakili kelompok ArO-H dari RES. Hasil kami memvalidasi penggabungan RES ke SLN sedangkan sidik jari RES diulang dalam SLN-RES, tetapi spektrum SLN tidak terkait dengan sidik jari ini. Juga, puncaknya sekitar 1735–1740 cm
−1
dikaitkan dengan C=O peregangan (R-C(O)-O-R) yang mengacu pada ester dalam lesitin fosfolipid di semua spektrum mengharapkan RES.
Spektrum FTIR dari SLN (solid lipid nanoparticle), SLN-RES (resveratrol-loaded solid lipid nanoparticle), S100 (lecithin), dan RES (pure resveratrol powder)
Data FTIR memvalidasi keberadaan obat dalam pembawa. Terjadi puncak lebar pada 3040–3670 cm
−1
dalam lesitin, SLN, dan SLN-RES yang disebabkan oleh peregangan O-H yang berkontribusi pada sifat hidrofobik yang kuat dari sampel. Pergeseran puncak yang luas antara SLN dan SLN-RES dapat dirujuk ke pembentukan ikatan hidrogen ketika RES ditempatkan ke dalam SLN. Kami menyimpulkan permukaan partikel ditutupi oleh lesitin karena peningkatan peregangan C-H di SLN-RES. Di sisi lain, penurunan intensitas sidik jari RES dalam spektrum SLN-RES mengacu pada penutup lipid RES dalam struktur SLN. Perbedaan antara puncak karakteristik dari RES dan SLN-RES memvalidasi bahwa ada potensi interaksi kimia antara RES dan komponen formulasi lainnya. Puncak baru yang terlihat pada 1000 cm
−1
di SLN-RES dikaitkan dengan Ar-O-R yang mengacu pada interaksi antara RES dan lesitin. Sebaliknya, pada spektrum RES, pita serapan pada 1106 cm
−1
terkait dengan gugus Ar-O-H yang menghilang di SLN-RES. Perubahan ini memberikan bukti lain untuk berinteraksi antara RES dan SLN. Selain itu, peningkatan intensitas menjadi jelas pada 2850–2900 cm
−1
dalam SLN-RES daripada di SLN menunjukkan peningkatan peregangan C-H yang mungkin disebabkan oleh peningkatan lokalisasi permukaan surfaktan dan penempatan RES dalam nanopartikel inti. Secara keseluruhan, hasil kami memvalidasi penggabungan RES dalam SLN inti lipid yang diukir oleh lesitin [11, 22].
Pengaruh Perlakuan RES dan SLN-RES Terhadap Kenaikan Berat Badan, Gula Darah Puasa, Insulin, dan Indeks HOMA
Hasil pada Tabel 2 menunjukkan bahwa pada kelompok DC, injeksi STZ menurunkan berat badan secara signifikan dibandingkan pada kelompok HC. Pemberian RES mencegah penurunan berat badan dibandingkan dengan kelompok DC. SLN-RES melayani berat badan normal lebih signifikan daripada pengobatan RES sedangkan terpaksa kelompok HC. Berdasarkan laporan sebelumnya, pemberian SLN-RES secara oral memiliki efek yang sama dengan RES gratis ketika diberikan secara intraperitoneal. Gencoglu dkk. melaporkan bahwa pengobatan intraperitoneal RES melayani berat badan setelah induksi diabetes sedangkan berat badan akhir model diabetes yang menerima RES adalah 10% lebih rendah daripada tikus yang sehat [25].
Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2, FBS meningkat secara signifikan pada kelompok DC dibandingkan dengan kelompok HC. Pada akhir penelitian, FBS serum menurun baik dengan pengobatan RES dan RES-SLN dibandingkan dengan kelompok DC. Induksi diabetes menurunkan kadar insulin serum dibandingkan dengan kelompok HC. Menariknya, tingkat serum insulin pada tikus diabetes dikompensasi oleh pengobatan RES-SLN. Pemberian RES dan SLN-RES sangat meningkatkan HOMA daripada kelompok DC. Pada kelompok SLN-RES, HOMA lebih baik dibandingkan perlakuan RES yang mendekati kelompok HC.
Efek hipoglikemik yang diperoleh dengan SLN-RES lebih baik daripada RES secara signifikan yang mungkin disebabkan oleh peningkatan penyerapan usus dan peningkatan waktu sirkulasi RES nanoenkapsulasi dalam darah. Konsisten dengan proposal kami, Sadi et al. menunjukkan pengobatan intraperitoneal RES bertepatan dengan efek hipoglikemik yang mendalam dan peningkatan resistensi insulin pada diabetes yang diinduksi STZ [26].
Pengaruh Perlakuan RES dan SLN-RES terhadap Parameter Stres Oksidatif Tingkat Serum
Seperti disebutkan dalam Tabel 3, dalam penelitian ini, induksi diabetes menyebabkan penurunan indikator antioksidan dan peningkatan indikator oksidan secara signifikan dibandingkan dengan kelompok HC. Pengobatan RES mencegah penipisan tingkat serum TAC dan menghambat peningkatan MDA. Anehnya, pengobatan SLN-RES dapat mengembalikan tingkat serum TAC dan MDA sepenuhnya. Mungkin, peningkatan waktu sirkulasi RES menyebabkan efek modulasi yang lebih baik dari RES-SLN [27]. Sesuai dengan hasil ini, Gokce et al. melaporkan bahwa SLN dan pembawa lipid berstruktur nano (NLC) yang mengandung RES mengurangi ROS intraseluler dalam kultur sel fibroblas [28]. Juga, Coradini dan rekan penulis melaporkan bahwa ko-enkapsulasi RES dan kurkumin dalam pembawa lipid menurunkan radikal hidroksil secara luar biasa in vitro [29]. Selain itu, pemberian RES-SLN menyebabkan penurunan nilai TOS dan peningkatan kadar -SH dibandingkan dengan kelompok DC secara signifikan. Namun, pengobatan RES tidak meningkatkan kadar TOS dan -SH yang menunjukkan efek antioksidan lemah dari RES yang mungkin dikaitkan dengan rendahnya bioavailabilitas RES bila diberikan secara oral.
Pengaruh Perawatan RES dan SLN-RES pada Ekspresi Gen Snap23, Stx4, dan Vamp2 di Jaringan Adiposa
Upaya sebelumnya menunjukkan bahwa peningkatan ekspresi gen Snap23, Stx4, dan Vamp2 menyebabkan peningkatan resistensi insulin. Oh dkk. melaporkan bahwa overekspresi Stx4 dalam sel pankreas model transgenik meningkatkan resistensi insulin [30]. Di sini, perlakuan RES secara jelas menginduksi ekspresi gen Snap23, Stx4, dan Vamp2 dalam adiposa (Gbr. 4a-c). Farimani dkk. menunjukkan bahwa pengobatan RES menurunkan regulasi ekspresi gen Stx4 dan Vamp2 secara signifikan dalam jaringan adiposa model tikus diabetes [31]. Setiap perubahan signifikan tidak diamati antara pengobatan RES dan SLN-RES di jaringan adiposa di mana mungkin waktu paruh eliminasi serum RES tidak cukup untuk paparan obat jaringan adiposa. Ekspresi gen Snap23 tidak mempengaruhi RES dan SLN-RES yang mungkin merupakan akibat dari kelebihan produksi protein SNAP23 dalam adiposit yang dapat menyebabkan represi transkripsi melalui mekanisme umpan balik. Untuk menjawab pertanyaan ini, pengukuran tingkat protein SNAP23 dapat menjelaskan data yang ada secara lebih rinci. Selain itu, pengukuran ekspresi Snap23 hepatik menggunakan metode time course akan menjelaskan pengamatan kami dengan jelas.
Pengaruh pengobatan RES dan SLN-RES pada tingkat mRNA Snap23, Stx4, dan Vamp2 di adiposa (a –c ) dan jaringan otot (d –f ). α , dibandingkan dengan kelompok DC; δ , ada perbedaan yang signifikan antara kelompok RES dan SLN-RES (p < 0,05); π , dikembalikan ke kelompok HC (tidak ada perbedaan yang signifikan dibandingkan dengan kelompok HC (p> 0,05)). Data dinyatakan sebagai mean ± SD.*p < 0,05,
+p < 0.01,
#p < 0.001
Pengaruh Perawatan RES dan SLN-RES pada Ekspresi Gen Snap23, Stx4, dan Vamp2 di Jaringan Otot
Seperti yang diilustrasikan pada Gambar. 4d-f, injeksi STZ pada kelompok DC dikaitkan dengan penurunan regulasi Snap23, Stx4, dan Vamp2 dalam jaringan otot dibandingkan dengan kelompok HC. SLN-RES menginduksi ekspresi Snap23 dan Stx4 di jaringan otot lebih baik daripada bentuk bebas RES. Kami mengamati hasil terbaik tentang ekspresi gen Vamp2. Pemberian oral SLN-RES mengkompensasi penurunan regulasi Vamp2 mendekati level normal. Mirip dengan hasil kami, Mullainadhan et al. menunjukkan bahwa pemberian bisphenol-A pada tikus albino jantan dewasa meningkatkan ekspresi protein Snap23, Stx4, dan Vamp2 pada otot gastrocnemius [32]. Kemungkinan peningkatan penyerapan RES melalui pemberian RES-SLN dapat meningkatkan kemungkinan RES-SLN untuk mencapai jaringan otot yang menyebabkan efek pengaturan yang lebih baik pada ekspresi gen Snap23, Stx4, dan Vamp2. Based on the previous evidence, the potential penetrating ability and cell uptake capacity of SLN-RES affect the tissue accumulation of RES that may be responsible for the different effects of SLN-RES on the gene expression of SNARE proteins in adipose and muscle tissue. In other words, our results supported differently in vivo biodistribution pattern of RES in intact form within the SLN.
Conclusion
We prepared suitable nanocarrier in terms of physicochemical and morphological properties for oral delivery of RES. In light of our result, we concluded that SLNs could serve as a promising delivery system to enhance the therapeutic effect of oral treatment of RES against insulin resistance through improving the hypoglycemic effect and elevating the expression of Snap23, Stx4, and Vamp2 in adipose and muscle tissue. However, subsequent studies will be necessary to identify the in vivo biodistribution and pharmacokinetic properties of SLN-RES.
Ketersediaan Data dan Materi
Semua data yang dihasilkan atau dianalisis selama penelitian ini disertakan dalam artikel yang dipublikasikan ini.
