Liposom PEGylated Memuat Bufalin: Efisiensi Antitumor yang Ditingkatkan, Toksisitas yang Dikurangi, dan Pengiriman Otak yang Dioptimalkan

Abstrak

Bufalin, glikosida jantung yang diekstrak dari Venenum Bufonis, menunjukkan aktivitas antitumor yang kuat tetapi dibatasi oleh bioavailabilitas buruk dan toksisitas sistemik yang signifikan ketika diwakili sebagai obat bebas. Dalam studi ini kami mengevaluasi liposom PEGylated memuat bufalin (BF/PEG-LP) dari karakteristik fisikokimia, keamanan, sitotoksisitas in vitro, aktivitas antitumor in vivo, toksisitas akut, dan distribusi jaringan. Uji hemolis sel darah merah menunjukkan bahwa BF/PEG-LP menyebabkan hemolis yang jauh lebih rendah dibandingkan bufalin bebas. Liposom kosong tidak beracun pada sel HepG2 dan HCT116. BF/PEG-LP menginduksi apoptosis bergantung pada dosis dalam sel HepG2, HCT116, A549, dan U251 dengan nilai IC₅₀ masing-masing 21,40 ± 2,39, 21,00 ± 3,34, 43,39 ± 6,43, dan 31,14 ± 2,58 ng/mL. Dalam xenograft U251, BF/PEG-LP secara signifikan menekan pertumbuhan tumor, mencapai tingkat inhibisi 38,7 % pada 2 mg/kg versus 27,6 % untuk bufalin bebas. Evaluasi farmakologis mengungkapkan perubahan perilaku sementara pada dosis tertinggi, sementara konsentrasi letal median (LD₅₀) meningkat dari 0,156 mg/kg (bufalin bebas) menjadi 3,03 mg/kg (BF/PEG-LP). Studi distribusi jaringan menunjukkan konsentrasi otak 20 % lebih tinggi dan konsentrasi jantung 30 % lebih rendah untuk BF/PEG-LP dibandingkan bufalin bebas. Temuan ini mengonfirmasi bahwa PEGylation meningkatkan farmakokinetika bufalin, mengurangi toksisitas sistemik, dan meningkatkan paparan otak, mendukung pengembangan lebih lanjut sebagai terapi glioma.

Pendahuluan

Bufalin (BF) adalah lakton triterpenoid yang menunjukkan efek anti-inflamasi, inotropik jantung, antiviral, dan antitumor. Praktikum praliklinis telah menunjukkan efektivitas BF terhadap karsinoma sel hepa, melanoma, karsinoma kolorektal, glioma, dan karsinoma ovar, terutama melalui inhibi proliferasi sel dan indusi apoptosis. Namun, terjemahan klinis telah terhambat oleh keberahan air yang rendah, bioavailabilitas oral yang terbatas, dan toksisitas bergantung pada dosis pada jaringan normal. Enkapsulasi liposom menawarkan strategi yang terbukti untuk meningkatkan keberahan obat, melindungi agen aktif dari degradasi prematur, dan memfasilitasi pengiriman target melalui barak darah-otak (BBB). PEGylation permukaan liposom lebih lanjut memperpanjang waktu sirkulasi dan mengurangi penyerapan oleh sistem fagosit mononuklear. Dalam pekerjaan sebelumnya kami menyiapkan BF/PEG-LP dan mengkarakterisasi ukuran, potensial zeta, dan efisiensi penangkapan mereka. Studi saat ini memperluas pekerjaan tersebut dengan mengkaji profil keamanan, potensi antitumor, toksisitas akut, dan biodistribusi BF/PEG-LP dalam model praliklinis.

Bahan dan Metode

Reagen

BF dan sinobufagin (CBG) dibeli dari BaoJi Chenguang Technology Development Co., Ltd. (keutuhan 98 %). Doxorubicin (DOX) berfungsi sebagai kontrol positif. BF/PEG-LP disiapkan in-house, menghasilkan diameter rata-rata 155 ± 8 nm, potensial zeta –18,5 ± 4,5 mV, dan efisiensi penangkapan 76,3 ± 4,2 %. Semua kimia lainnya adalah grade analitik.

Hewan

Tikus Sprague-Dawley jantan, tikus Kunming, dan tikus nude Balb/c berusia 6 minggu digunakan. Hewan disesuaikan, diamkan malam hari, dan semua protokol disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional (Persetujuan 2017-0603-R).

Uji Hemolisis

Sel darah merah tikus diinkubasi dengan BF atau BF/PEG-LP, dan hemolisis diukur spektrofotometrik pada 398 nm. Tingkat hemolisis dihitung relatif terhadap kontrol positif (air) dan negatif (saline).

Sitotoksisitas Liposom Kosong

Liposom kosong diuji pada sel HepG2 dan HCT116 menggunakan uji CCK-8. Kehidupan sel tetap >95 % pada konsentrasi hingga 200 µg/mL, mengonfirmasi sifat non-toksis mereka.

Aktivitas Antitumor In Vitro

Sel HepG2, HCT116, A549, dan U251 diekspose ke dalam pengenceran berurutan BF/PEG-LP selama 24 jam. Kehidupan sel diukur dengan CCK-8, dan nilai IC₅₀ diperoleh dari kurva respons-dosis.

Model Xenograft U251

Sel U251 (1 × 10⁷) diinjeksikan subkutan ke dalam tikus nude. Setelah tumor mencapai ~50 mm³, tikus menerima suntikan i.p. BF atau BF/PEG-LP pada 0,5, 1,0, atau 2,0 mg/kg harian selama 21 hari. Volume tumor, berat badan, dan pengamatan perilaku dicatat. Tumor diambil, ditimbang, dan diperiksa histologis dengan pewarnaan H&E.

Toksisitas Akut

Tikus Kunming menerima satu dosis i.v. BF atau BF/PEG-LP (1,0, 0,37, 0,14, 0,05, atau 0,02 mg/kg untuk BF; 4,0, 2,83, 2,0, 1,41, atau 1,0 mg/kg untuk BF/PEG-LP). Kelangsungan hidup dipantau selama 14 hari, dan LD₅₀ dihitung menggunakan metode Reed–Muench.

Distribusi Jaringan (HPLC)

Tikus Sprague-Dawley menerima i.p. 0,5 mg/kg BF atau BF/PEG-LP. Jaringan jantung, hati, limpa, paru-paru, ginjal, dan otak dikumpulkan pada 5, 15, 45, dan 90 menit. Sampel dihomogenisasi, diekstrak dengan asetat etil, dan dianalisis dengan HPLC (Waters 2995/2996) menggunakan fase seluler asetonitril:0,1 % asam formiat/air (65:35, v/v). Kurva kalibrasi (20–2000 ng/mL) menunjukkan R² > 0,9977.

Hasil dan Pembahasan

Properti Fisikokimia dan Keamanan

Citra TEM mengonfirmasi morfologi bola seragam. Spektrum FT-IR menampilkan puncak khas BF, mengonfirmasi enkapsulasi yang berhasil. Tingkat hemolisis BF/PEG-LP <0,5 % pada konsentrasi hingga 200 µg/mL, penurunan 95 % dibandingkan BF bebas (p < 0,01). Liposom kosong tidak menunjukkan sitotoksisitas pada sel HepG2 dan HCT116.

Stabilitas Seluruh pH

BF/PEG-LP mempertahankan integritas dalam PBS pada pH 7,4, sedangkan buffer pH 5,0 menyebabkan peningkatan signifikan dalam absorbansi, yang mengindikasikan stabilitas yang berkurang dalam kondisi asam.

Sitotoksisitas In Vitro

BF/PEG-LP menghambat kehidupan sel secara bergantung pada dosis di semua garis yang diuji. Nilai IC₅₀ adalah 21,4 ± 2,4, 21,0 ± 3,3, 43,4 ± 6,4, dan 31,1 ± 2,6 ng/mL untuk HepG2, HCT116, A549, dan U251, masing-masing. Aktivitasnya melebihi DOX (50 µg/mL) pada konsentrasi >40 ng/mL. Peringkat sensitivitas: HCT116 > HepG2 > U251 > A549.

Efisiensi Antitumor In Vivo

BF/PEG-LP secara signifikan mengurangi volume dan berat tumor dibandingkan BF bebas dan kendaraan. Pada 2 mg/kg, BF/PEG-LP mencapai tingkat inhibisi 38,7 % versus 27,6 % untuk BF bebas. Pewarnaan H&E mengungkapkan nekrosis ekstensif dalam tumor yang diobati BF/PEG-LP, proporsional dengan dosis.

Efek Perilaku dan Farmakologis

BF/PEG-LP dosis tinggi menginduksi gemetar ringan dan pelairan; aktivitas lokomotor sedikit berkurang relatif terhadap kontrol (p < 0,05). Uji penanjakan tongkat menunjukkan koordinasi yang ditingkatkan setelah satu minggu perawatan (p < 0,01).

Toksisitas Akut

Nilai LD₅₀ meningkat dari 0,156 mg/kg (BF bebas) menjadi 3,03 mg/kg (BF/PEG-LP), yang mencerminkan pengurangan ~19 kali lipat toksisitas akut. Histopatologi mengungkapkan gangguan miokar dan nekrosis hati dalam tikus yang diobati BF bebas tetapi perubahan minimal dalam grup BF/PEG-LP.

Distribusi Jaringan

BF/PEG-LP menghasilkan konsentrasi otak yang lebih tinggi (333 ± 92,5 ng/g pada 5 menit) dan konsentrasi jantung yang lebih rendah (95,0 ± 18,5 ng/g pada 5 menit) dibandingkan BF bebas. Akumulasi hati sedikit meningkat (187 ± 31,0 ng/g versus 163 ± 35,0 ng/g). Tingkat otak tetap terdeteksi hingga 90 menit, yang mengindikasikan tinggal yang lebih lama.

Kesimpulan

Enkapsulasi liposom PEGylated bufalin secara signifikan meningkatkan profil farmakokinetika, mengurangi toksisitas sistemik dan jantung, dan meningkatkan pengiriman otak. BF/PEG-LP menunjukkan aktivitas antitumor yang kuat in vitro dan in vivo, terutama terhadap glioma, dan menawarkan platform yang menjanjikan untuk terjemahan klinis. Studi mendatang sebaiknya mengkaji fenomena pembersihan darah yang dipercepat dan mengoptimalkan jadwal dosis untuk manfaat terapeutik maksimal.

Ketersediaan Data dan Bahan

Semua data yang dihasilkan atau dianalisis selama penelitian ini disertakan dalam artikel dan berkas informasi pendukungnya.