Bufalin, berasal dari Venenum Bufonis , memberikan efek antitumor tetapi memiliki bioavailabilitas rendah dan efek samping bila diberikan sebagai agen tunggal. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi sifat fisik dan kimia, efikasi antitumor, farmakologi umum, toksisitas akut, dan profil distribusi jaringan liposom PEGylated bufalin-loaded (BF/PEG-LP), yang disiapkan dalam penelitian sebelumnya. Untuk mengevaluasi keamanan sediaan, tes hemolisis sel darah merah dilakukan, yang menunjukkan bahwa tingkat hemolisis BF/PEG-LP secara signifikan lebih rendah daripada bufalin saja. Uji viabilitas sel mengungkapkan bahwa liposom kosong tidak beracun. Dalam percobaan in vitro, BF/PEG-LP yang bergantung pada dosis menginduksi apoptosis sel kanker HepG2, HCT116, A549, dan U251, dengan konsentrasi penghambatan setengah maksimal (IC50 ) nilai 21.40 ± 2,39, 21.00 ± 3.34, 43.39 ± 6.43, dan 31.14 ± 2.58 ng/mL, masing-masing, pada 24 h. Eksperimen xenograft tumor pada tikus telanjang menunjukkan bahwa BF/PEG-LP secara signifikan menghambat pertumbuhan sel U251. Evaluasi farmakologis mengungkapkan bahwa BF/PEG-LP berdampak pada perilaku umum, aktivitas mandiri, dan koordinasi tikus setelah seminggu pemberian dibandingkan dengan tikus pada kelompok kontrol. Dalam uji toksisitas akut, konsentrasi mematikan rata-rata (LD50 ) dari BF dan BF/PEG-LP pada mencit masing-masing adalah 0,156 dan 3,03 mg/kg. Profil distribusi jaringan menunjukkan bahwa konsentrasi BF di jaringan otak 20% lebih tinggi, sedangkan di jaringan jantung 30% lebih rendah ketika BF/PEG-LP diberikan pada tikus dibandingkan dengan BF. Dengan demikian, BF/PEG-LP menunjukkan hemolisis dan sitotoksisitas yang lebih rendah dan sifat farmakokinetik dan antitumor yang lebih baik dibandingkan dengan bufalin saja, yang menunjukkan potensinya untuk aplikasi farmakologi di masa depan, terutama untuk pengobatan glioma.
Bufalin (BF; 3β,14-dihydroxy-5β,20(22)-bufadienolide, 5β,20(22)-bufadienolide-3β, 14-diol), diekstraksi dari Venenum Bufonis , memiliki aktivitas anti-inflamasi, kardiotonik, antivirus, acesodyne, dan antitumor [1, 2]. Kelompok kami juga mengungkapkan bahwa BF memiliki efek terapeutik pada hepatoma, melanoma, karsinoma kolon, glioma, dan karsinoma ovarium epitel, yang dapat dikaitkan dengan penghambatan proliferasi sel dan induksi apoptosis sel [3,4,5,6,7] .
Lan dkk. [8] sebelumnya menetapkan model glioma xenograft pada tikus telanjang, yang BF diberikan setiap hari melalui intraperitoneal (i.p. ) injeksi. Pada kelompok yang diobati dengan BF, hampir tidak ada inti binuklir dan mitosis yang diamati; selain itu, nukleolus lebih kecil, dan morfologi sel lebih teratur daripada kelompok kontrol. Meskipun BF memiliki banyak potensi efek farmakologis dan hasil yang diperoleh sejauh ini menjanjikan, BF sebagai agen tunggal masih jauh dari aplikasi klinis. Selanjutnya, pengobatan BF dikaitkan dengan efek samping dan efek samping yang tidak diinginkan seperti reaksi imun, cedera jaringan normal, dan toksisitas tinggi [9].
Beberapa sistem penghantaran obat, seperti emulsi lipid, nanopartikel, dan liposom, telah digunakan untuk meningkatkan kelarutan, aktivitas farmakologis, dan bioavailabilitas BF [10, 11]. Selain itu, rakitan mandiri polimer fungsional aktif agregasi-induced emisi (AIE) telah menunjukkan potensi besar untuk berbagai aplikasi biomedis termasuk pencitraan biologis dan pengiriman obat intraseluler [12, 13]. Di antara sistem penghantaran obat ini, sediaan liposom memiliki beberapa keuntungan untuk digunakan sebagai sistem penghantaran intravena (i.v.). Sediaan liposomal tidak hanya dapat meningkatkan kelarutan dalam air dan mengurangi efek samping dari agen yang dimuat [14], tetapi juga membawa agen melintasi sawar darah-otak (BBB) sehingga dapat mengobati tumor otak lebih efektif dan efisien [15] . BBB terdiri dari sel-sel endotel kapiler otak dan persimpangan ketat di antara mereka, sel berbentuk bintang, sel glial, dan membran basal, yang memungkinkan hanya obat yang sangat larut dalam lemak untuk lewat dan menyebar di jaringan otak [16]. Meskipun demikian, persiapan liposom memiliki beberapa kekurangan. Penyerapan oleh protein plasma dan pengenalan oleh sistem fagosit mononuklear menyebabkan pembersihan cepat obat yang dimuat dari darah. Namun, modifikasi permukaan liposom dengan PEG dapat mengatasi masalah ini [17].
Dalam penelitian sebelumnya, kami menyiapkan liposom PEGylated yang sarat dengan bufalin (BF/PEG-LP) dan mengkarakterisasinya, termasuk profil sitotoksisitas dan farmakokinetiknya, dalam upaya untuk mengatasi tantangan yang disebutkan di atas, meningkatkan kemanjuran pengiriman obat, dan mengurangi toksisitas. Untuk memperluas penelitian itu, kami mengevaluasi lebih lanjut sifat fisik dan kimia, kemanjuran antitumor, toksisitas akut, dan profil distribusi jaringan BF/PEG-LP.
BF dan cinobufagin (CBG) dibeli dari BaoJi Chenguang Technology Development Co., Ltd. (BaoJi, China; kemurnian 98%, diidentifikasi oleh HPLC) dan dilarutkan dalam DMSO untuk penyimpanan pada 20 °C sebagai larutan stok. CBG digunakan sebagai standar internal (IS). Doxorubicin (DOX) dibeli dari Beijing Solarbio Science &Technology Co., Ltd. (Beijing, Cina; kemurnian 98%, diidentifikasi oleh HPLC) dan dilarutkan dalam DMSO untuk penyimpanan pada 20 °C sebagai larutan stok. BF/PEG-LP disiapkan di laboratorium kami (ukuran partikel, 155.0 ± 8.46 nm; potensi zeta, – 18.5 ± 4.49 mV; efisiensi jebakan, 76,31% ± 4,23%, terdeteksi oleh HPLC) [6]. Asam format tingkat HPLC dibeli dari Tedia Company Inc. (Fairfield, OH, USA). Kit penghitung sel-8 (CCK-8) dibeli dari Dojindo Laboratories (Kumamoto, Jepang). Etil asetat tingkat HPLC dibeli dari Pusat Pengembangan Reagen Kimia Kermel Tianjin (Tianjin, Cina). Asetonitril tingkat HPLC dibeli dari Merck (Darmstadt, Jerman). Semua reagen lainnya adalah kelas analitis.
Tikus Sprague-Dawley jantan, dengan berat sekitar 230–250 g; Tikus Kunming, dengan berat 18–22 g; dan tikus Balb/c telanjang berusia 6 minggu dipasok oleh Pusat Penelitian Hewan Eksperimental, Universitas Kedokteran Militer Keempat (Xi'an, Cina). Hewan-hewan itu disimpan secara terpisah dalam sistem kandang berventilasi individual (IVC) dan diberi makan makanan dan air laboratorium standar ad libitum selama 5 hari. Semua hewan dipuasakan (kecuali air) semalaman sebelum percobaan. Prosedur eksperimental yang melibatkan hewan ditinjau dan disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional dari Universitas Kedokteran Militer Keempat (Persetujuan 2017-0603-R).
Kurva kalibrasi dibuat dengan spiking 100 μL homogenat jaringan dengan masing-masing 20 μL larutan kerja untuk menghasilkan sampel yang mengandung 20, 50, 200, 500, dan 2000 ng/mL BF. Sampel homogenat standar berduri disiapkan terlebih dahulu dan dievaluasi dengan setiap batch analitik dari sampel yang tidak diketahui.
Delapan mililiter darah dikumpulkan dari tikus dan kemudian diheparinisasi dan diencerkan dengan 10 mL 0,9% normal saline. Sampel darah utuh kemudian dicampur dengan 100 μL larutan BF atau 1 mL suspensi BF/PEG-LP. Setelah 40 menit perendaman dalam penangas air yang dipertahankan pada 37 °C, sampel disentrifugasi pada 750g selama 5 menit untuk menghilangkan sel darah merah dan fragmennya. Supernatan diendapkan dalam 2 mL larutan etanol/asam klorida (39:1; etanol 99% (v/v ):37% asam klorida (w/v )). Supernatan disentrifugasi pada 750g selama 5 min, setelah itu absorbansi diukur pada 398 nm dengan spektrofotometer UV. Kontrol positif yang terdiri dari air suling dan kontrol negatif yang terdiri dari salin 0,9% disiapkan dan diukur dengan cara yang sama.
Tingkat hemolisis (HR%) dari suspensi nanopartikel dihitung sebagai berikut:
$$ \mathrm{HR}\%=\left({\mathrm{A}}_{\mathrm{sampel}}-{\mathrm{A}}_{\mathrm{negative}}\right)/\left ({\mathrm{A}}_{\mathrm{positive}}-{\mathrm{A}}_{\mathrm{negative}}\right)\times 100\% $$dimana A contoh adalah absorbansi sampel, A negatif adalah absorbansi dari kontrol negatif, dan A positif adalah absorbansi dari kontrol positif.
CCK-8 digunakan untuk mendeteksi sitotoksisitas liposom kosong pada sel HepG2 karsinoma hepatoseluler manusia dan sel HCT116 kanker usus besar manusia. Sel HepG2 dan sel HCT116 yang ditangguhkan (1 × 10 4 sel/sumur) diinokulasi ke dalam cawan 96-sumur dan dikultur dengan media kultur RPMI-1640 sampai fase logaritmik. Konsentrasi yang berbeda dari liposom kosong ditambahkan ke media kultur. Enam sumur ulangan disiapkan untuk setiap konsentrasi. Setelah inkubasi selama 24 jam, media dibuang, dan 100 μL larutan kerja CCK-8 (media kultur CCK-8:RPMI-1640, 10:100) ditambahkan. Setelah 2 jam inkubasi, absorbansi terdeteksi dan diukur pada 450 nm oleh pembaca lempeng mikro (Bio-Rad 680, Hercules, CA, USA).
BF/PEG-LP dibuat dengan hidrasi dengan phosphate-buffered saline (PBS) pada pH 7.4 dan pH 5.0, masing-masing. Liposom disimpan pada suhu 4 °C dalam kondisi gelap. Absorbansi sampel pada 296 nm diukur pada 0, 5, 15, 30, 60, dan 120 min.
Proliferasi sel dievaluasi dengan uji proliferasi CCK-8. Sel HepG2, HCT116, A549, dan U251 diunggulkan secara individual dengan kepadatan 1 × 10 4 sel/sumur di pelat 96-sumur pada 37 °C dengan 5% (v/v ) CO2 . Setelah 24 jam, konsentrasi BF/PEG-LP yang berbeda ditambahkan ke sumur. Setelah inkubasi 24 jam, media sel dibuang, dan 100 μL larutan kerja CCK-8 ditambahkan. Setelah 2 h inkubasi, absorbansi terdeteksi dan diukur pada 450 nm oleh pembaca lempeng mikro (Bio-Rad 680). Persentase sel yang hidup dan IC50 nilai diperkirakan dari kurva dosis-respons. Nilai setiap sampel dan kontrol ditentukan dengan rata-rata enam sumur ulangan.
Sel U251 (1 × 10 7 ) dalam 0,15 mL PBS diinokulasi secara subkutan pada tikus telanjang dan dibiarkan tumbuh selama 7 hari untuk mencapai ukuran tumor lebih dari 50 mm 3 . Kemudian, tikus secara acak dibagi menjadi dua kelompok dengan masing-masing enam ekor tikus. Pada kelompok perlakuan, 0,5, 1,0, atau 2,0 mg/kg/hari BF atau BF/PEG-LP adalah ip. disuntikkan selama 21 hari berturut-turut. PBS yang mengandung 0,1% DMSO disuntikkan pada kelompok kontrol kendaraan, sedangkan 2 mg/kg cisplatin (DPP) disuntikkan pada kelompok kontrol positif.
Penimbangan bobot badan mencit dilakukan setiap 2 hari sekali. Semua tikus yang diobati dengan BF dan BF/PEG-LP diamati dengan cermat untuk kondisi kulit dan rambut mereka, volume asupan makanan dan air, karakteristik tinja, dan perubahan perilaku. Pada akhir percobaan, tikus dikorbankan, dan xenograft tumor diangkat dan ditimbang. Tumor yang ditransplantasikan kemudian difiksasi dalam larutan paraformaldehyde 4% dan disematkan dalam parafin. Bagian setebal lima mikron disiapkan dan diwarnai dengan hematoxylin dan eosin (H&E). Pertumbuhan dan nekrosis sel tumor dan infiltrasi jaringan sekitarnya diamati di bawah mikroskop cahaya.
Lima puluh tikus Kunming secara acak dibagi menjadi lima kelompok (n = 10 per grup) yaitu i.p. diberikan berikut ini dengan dosis tunggal:salin dengan volume yang diberikan pada kelompok kontrol, 20 mg/kg natrium pentobarbital sebagai kelompok kontrol positif, dan 1,0, 1,5, dan 2,0 mg/kg sebagai dosis rendah, sedang, dan tinggi. -dosis kelompok BF/PEG-LP. Kemudian diamati perilaku umum, postur, gaya berjalan, salivasi, miofibrilasi, nistagmus, dan sekresi mencit. Setelah 1 jam pemberian, tikus ditempatkan dalam kotak lapangan terbuka. Jumlah tikus yang bergerak di dalam kotak dihitung selama 10 menit setelah tikus dibiarkan beradaptasi selama 1 menit.
Tikus secara acak dibagi menjadi lima kelompok (n = 10 per kelompok, setengah laki-laki dan setengah perempuan) yaitu i.p. diberikan sebagai berikut:salin pada volume yang diberikan pada kelompok kontrol kosong, 2,5 mg/kg klorpromazin hidroklorida sebagai kelompok kontrol positif; dan 1,0, 1,5, dan 2,0 mg/kg BF/PEG-LP masing-masing sebagai kelompok BF/PEG-LP dosis rendah, sedang, dan tinggi.
Sebuah batang logam halus (diameter 1,27 cm, panjang 80 cm) ditempatkan tegak lurus ke tanah dan dipasang di bagian bawah agar tetap tegak. Setelah 1 minggu perawatan, uji panjat dilakukan masing-masing selama 30, 60, dan 120 menit. Tikus ditempatkan di atas batang logam dan dibiarkan merangkak turun secara alami. Koordinasi tikus saat mereka menuruni batang logam diamati dan diberi skor. Kriteria penilaian adalah sebagai berikut:0 poin, penurunan selangkah demi selangkah; 1 poin, meluncur turun; 2 poin, ketidakmampuan untuk turun; dan 3 poin, tidak ada refleks yang diamati.
Konsentrasi mematikan rata-rata (LD50 ) dari BF dan BF/PEG-LP dihitung untuk mengevaluasi toksisitas akut. Sebanyak 110 tikus Kunming (setengah jantan dan setengah betina) secara acak dibagi menjadi 11 kelompok (n = 10). Lima kelompok menerima satu i.v. dosis BF pada 1,0, 0,37, 0,14, 0,05, atau 0,02 mg/kg, dan lima kelompok menerima satu i.v. dosis BF/PEG-LP pada 4.0, 2.83, 2.0, 1.41, atau 1.0 mg/kg. Volume injeksi adalah 0,2 mL. BF pertama dilarutkan dalam normal saline dengan 1% DMSO; BF dan BF/PEG-LP kemudian diencerkan dengan normal saline untuk mendapatkan konsentrasi yang diinginkan. Kelompok kontrol diberikan normal saline yang mengandung 1% DMSO. Setelah pengobatan, perilaku umum tikus diamati selama 14 hari, dan tingkat kematian dicatat. Perubahan patologis pada tikus setelah i.v. administrasi diamati dengan mikroskop optik (NIKON Eclipse ci, Tokyo, Jepang).
Tikus Sprague-Dawley secara acak dibagi menjadi dua bagian (empat kelompok di setiap bagian, n = 6 per kelompok). Kedua bagian ini adalah i.p. diberikan 0,5 mg/kg BF dan BF/PEG-LP, masing-masing. Sampel jaringan utama, termasuk jantung, hati, limpa, paru-paru, ginjal, dan otak, dikumpulkan pada 5, 15, 45, dan 90 menit setelah pemberian. Sampel jaringan dengan cepat dibilas dengan larutan garam (0,9%), menghilangkan darah dan isinya yang sesuai. Setelah dibersihkan, kertas saring digunakan untuk mengeringkan sampel. Sampel ditimbang kemudian dihomogenkan dalam larutan garam 0,9% (sampel tisu ke larutan garam, 1:2, w/w ). Homogenat yang diperoleh disimpan pada – 80 °C hingga analisis.
Senyawa target diekstraksi, dan interferensi protein endogen dihilangkan dengan metode preparasi cair-cair [18]. Kami menemukan bahwa etil asetat meningkatkan pemulihan ekstraksi dan meminimalkan interferensi endogen, menghasilkan peningkatan sensitivitas dan selektivitas deteksi BF. Akibatnya, etil asetat digunakan sebagai pelarut yang optimal untuk preparasi sampel. Dua puluh mikroliter larutan kerja IS ditambahkan ke dalam 100 L alikuot homogenat jaringan. Kemudian, sampel divortex-campuran selama 30 s dan diekstraksi dengan 2.5 mL etil asetat selama 2 min. Setelah sentrifugasi pada 3500 g selama 10 min, lapisan organik atas dipindahkan ke tabung lain dan diuapkan pada 45 °C di bawah aliran nitrogen yang lembut. Residu dilarutkan dalam 100 μL fase gerak (asetonitril:0,1% asam format/larutan air, 65:35, v/v ) melalui vortex-mixing selama 5 min dan sentrifugasi pada 12000 g selama 10 min. Kemudian, 10 L alikuot supernatan disuntikkan ke dalam sistem HPLC (Waters 2995/2996, Waters Corporation, Milford, MA, USA). Kondisi kromatografi yang dioptimalkan untuk deteksi BF dan IS telah dijelaskan sebelumnya [6].
Semua hasil dinyatakan sebagai mean ± SD (n = 3), dan perbedaan antara formulasi dibandingkan dengan analisis varians satu arah (ANOVA), menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism 5. P < 0.05 menunjukkan signifikansi dalam semua kasus.
Mikroskop elektron transmisi (TEM) mengungkapkan bahwa BF/PEG-LP memiliki bentuk bola yang seragam, seperti yang ditunjukkan pada file tambahan 1:Gambar S1A. Struktur BF/PEG-LP diidentifikasi dengan FT-IR. Seperti yang ditunjukkan pada File tambahan 1:Gambar S1B, karakteristik memuncak pada 3495 cm −1 dan 3436 cm −1 merepresentasikan vibrasi ulur N–H dari ikatan amida, sedangkan puncaknya pada 1079 cm −1 mewakili getaran peregangan C–O–C dari ikatan eter di BF/PEG-LP. Untuk mengevaluasi keamanan formulasi in vitro, laju hemolisis liposom kosong, BF, dan BF/PEG-LP ditentukan dengan uji hemolisis RBC, dan viabilitas sel sel HepG2 dan HCT116 yang diobati dengan liposom kosong diukur dengan CCK -8 pengujian. Kelompok BF menunjukkan hemolisis yang jelas; namun, tingkat hemolisis kelompok BF/PEG-LP secara signifikan lebih rendah pada konsentrasi yang sama (P < 0,01). Ketika konsentrasi BF/PEG-LP ditingkatkan menjadi 200 μg/mL, laju hemolisis jelas lebih tinggi daripada liposom kosong (P < 0.01, Gbr. 1a). Hasil uji CCK-8 menunjukkan bahwa liposom kosong tidak beracun pada sel HepG2 dan HCT116 (Gbr. 1b).
Sifat fisik dan kimia BF/PEG-LP. a Laju hemolisis sel darah merah dari liposom kosong, BF, dan BF/PEG-LP. Data disajikan sebagai \( \overline{x} \)± s (n = 3). **P < 0.01 vs. Kelompok BF/PEG-LP pada konsentrasi yang sama. b Sitotoksisitas liposom kosong dalam sel HepG2 dan HCT116. Data disajikan sebagai \( \overline{x} \) ± s (n = 6). c Stabilitas BF/PEG-LP dalam kondisi pH yang berbeda. Data disajikan sebagai \( \overline{x} \) ± s (n = 6). **P < 0.01 vs. kelompok pH 7.4 pada titik waktu yang sama. Singkatan:BF, bufalin; Liposom PEGylated BF/PEG-LP, bufalin-loaded PEGylated
Pengaruh pH lingkungan terhadap stabilitas BF/PEG-LP dievaluasi dengan spektrofotometri UV. Gambar 1c menunjukkan bahwa absorbansi sampel dari kelompok pH 5.0 meningkat seiring dengan waktu penyimpanan, yang menunjukkan bahwa BF/PEG-LP lebih stabil dalam PBS pada pH 7.4 (P < 0.01).
Apoptosis dalam sel HepG2, HCT116, A549, dan U251 yang diinduksi oleh BF/PEG-LP ditentukan dengan uji CCK-8. IC50 nilai BF/PEG-LP untuk semua sel yang diuji disajikan pada Tabel 1. BF/PEG-LP secara signifikan menurunkan viabilitas semua jenis sel dengan cara yang bergantung pada dosis (Gbr. 2). Efek penghambatan BF/PEG-LP serupa dengan DOX (kontrol positif, 50 μg/mL) pada konsentrasi melebihi 40 ng/mL. Selain itu, berdasarkan IC50 nilai, sensitivitas sel terhadap BF/PEG-LP diberi peringkat sebagai berikut:HCT116 > HepG2 > U251 > A549.
Sitotoksisitas BF/PEG-LP di HepG2 (a ), HCT116 (b ), A549 (c ), dan U251 (d ) sel. Data disajikan sebagai\( \overline{x} \) ± s (n = 6). *P < 0,05, **P < 0.01 vs. kelompok kontrol untuk setiap baris sel. Singkatan:BF/PEG-LP, liposom PEGylated yang mengandung bufalin; DOX, doksorubisin
Setelah pemberian BF/PEG-LP, perilaku umum mencit berbeda dengan kelompok kosong. Secara khusus, tikus dalam kelompok BF/PEG-LP dosis tinggi menunjukkan tremor dan air liur. Setelah pemberian, tikus tetap berada di kotak lapangan terbuka selama 10 menit, dan jumlah kisi aktif dicatat. Pada kelompok kontrol positif (pentobarbital), jumlah jaringan aktif hanya 342 ± 35, yang secara signifikan lebih rendah dibandingkan dengan kelompok kontrol (725 ± 127, P < 0,05). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3a, jumlah jaringan aktif pada kelompok BF/PEG-LP dosis sedang dan tinggi berbeda secara signifikan dari kelompok kontrol. Uji rod-climbing menunjukkan bahwa BF/PEG-LP memiliki efek promosi tertentu pada gerakan terkoordinasi tikus setelah seminggu pemberian dibandingkan dengan kelompok kontrol (P < 0.01), sedangkan klorpromazin memiliki efek promosi yang signifikan pada kelompok kontrol positif (P < 0.05), seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3b.
Efek farmakologis BF/PEG-LP pada aktivitas lokomotor (a ) dan latihan terkoordinasi (b ) pada tikus. Data disajikan sebagai \( \overline{x} \) ± s (n = 10). *P < 0,05, * * P < 0.01 vs. kelompok kontrol pada setiap titik waktu; # P < 0,05 vs kelompok BF/PEG-LP dosis rendah. Singkatan:BF/PEG-LP, liposom PEGylated yang mengandung bufalin
Dengan pemberian yang berkepanjangan, tikus dalam kelompok kontrol positif, BF, dan BF/PEG-LP menunjukkan keterbelakangan mental, asupan makanan berkurang, reaksi lambat, dan bulu kusam. Kematian tikus terjadi pada kelompok BF dan BF/PEG-LP. Tingkat antitumor dari kelompok kontrol positif adalah 36,5%; kelompok BF dosis tinggi adalah 27,6%; dan kelompok BF/PEG-LP dosis rendah, sedang, dan tinggi masing-masing adalah 11,4%, 28,9%, dan 38,7%. Kecuali untuk kelompok BF dosis rendah, ada perbedaan yang signifikan antara tingkat antitumor dari kelompok yang diobati dengan obat dan kelompok kontrol negatif (P < 0.05), seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4a. Dibandingkan dengan kelompok BF dosis rendah, tingkat penghambatan tumor kelompok BF/PEG-LP dosis tinggi secara signifikan lebih tinggi (P < 0.01), seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4b.
Efek penghambatan BF dan BF/PEG-LP pada pertumbuhan xenografts glioma pada tikus telanjang. Perbandingan berat tumor (a ) dan tingkat penghambatan tumor (b ) di masing-masing kelompok. Data disajikan sebagai \( \overline{x} \) ± s (n = 10). *P < 0,05, **P < 0.01 vs. kelompok kontrol; # P < 0.05, ## P < 0.01 vs. kelompok BF/PEG-LP dosis tinggi. c Pewarnaan H&E jaringan tumor dari tikus yang mengandung tumor. Singkatan:BF, bufalin; BF/PEG-LP, liposom PEGylated yang mengandung bufalin; DPP, cisplatin; H&E, hematoxylin dan eosin
Xenograft pada tikus yang mengandung tumor berbentuk nodular. Pewarnaan H&E menunjukkan bahwa pada kelompok kontrol, inti sel tumor besar, sitoplasma kecil, dan pertumbuhan sel kuat; pada kelompok BF/PEG-LP dosis tinggi, area jaringan tumor nekrotik yang luas diamati, dan derajat nekrosis bergantung pada dosis, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4c.
Toksisitas akut dari satu i.v. dosis formulasi pada tikus Kunming ditentukan. LD50 nilai BF dan BF/PEG-LP masing-masing adalah 0,156 dan 3,03 mg/kg. Dibandingkan dengan BF, toksisitas akut BF/PEG-LP secara signifikan lebih rendah (P < 0,01); efek ini dikaitkan dengan formulasi liposom, yang mengontrol pelepasan BF ke dalam darah.
Perubahan patologis pada tikus setelah i.v. administrasi diamati dengan mikroskop optik (Gbr. 5). Perubahan patologis diamati pada beberapa organ, seperti jantung, hati, dan ginjal. Pembubaran serat miokard jantung dan fraktur dengan perdarahan terlihat jelas. Nekrosis diamati pada hepatosit dan endoteliosit paru.
Perubahan patologis diamati pada tikus mati setelah pemberian intravena 1,0 mg/kg BF dan 4,0 mg/kg BF/PEG-LP. Bagian jaringan diwarnai dengan H&E dan diamati dengan mikroskop optik. Catatan:Mikroskop optik:NIKON Eclipse ci; Sistem pencitraan:NIKON Digital Sight DS-FI2 (Tokyo, Jepang); Pembesaran:×200. Singkatan:BF, bufalin; BF/PEG-LP, liposom PEGylated yang mengandung bufalin; H&E, hematoxylin dan eosin
Perbandingan kromatogram dari homogenat jaringan kosong dan homogenat berduri, yang menunjukkan bahwa tidak ada gangguan yang signifikan pada waktu retensi BF dan CBG (IS), digunakan untuk menguji selektivitas metode, seperti yang ditunjukkan pada File tambahan 1:Gambar S2. Kurva kalibrasi dibangun dari rasio area puncak BF ke IS (Y) versus konsentrasi homogenat jaringan mulai dari 20 hingga 2000 ng/mL, dengan koefisien korelasi R 2 > 0.9977 (Tabel 2). Eksperimen presisi, akurasi, dan pemulihan BF dalam sampel biologis ditunjukkan pada File tambahan 1:Tabel S1, sedangkan hasil eksperimen stabilitas ditunjukkan pada File tambahan 1:Tabel S2.
Data mentah dari percobaan distribusi jaringan ditunjukkan pada File tambahan 1:Tabel S3. Setelah i.v. injeksi BF/PEG-LP, distribusi jaringannya dipengaruhi oleh beberapa variabel, seperti komposisi, ukuran partikel, dan potensi zeta [19]. Konsentrasi BF di berbagai jaringan, termasuk jantung, hati, limpa, paru-paru, ginjal, dan otak, diukur pada 5, 15, 45, dan 90 menit, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6. Pada 45 menit setelah iv. pemberian, konsentrasi BF pada kedua kelompok sangat rendah di beberapa jaringan, seperti jantung, hati, limpa, paru-paru, dan ginjal, menunjukkan bahwa distribusi dan eliminasi BF terjadi dengan cepat. Konsentrasi BF di otak, meskipun bukan jaringan lain, masih dapat dideteksi pada 90 menit setelah i.v. pemberian pada kedua kelompok, menunjukkan bahwa distribusi dan eliminasi BF relatif lebih lambat di otak dibandingkan jaringan lain.
Distribusi jaringan BF pada organ tikus. A Rumus molekul bufalin (a ) dan cinobufagin (b , ADALAH). B Profil distribusi jaringan BF pada tikus setelah dosis tunggal intravena BF/PEG-LP atau BF pada 0,5 mg/kg. Data disajikan sebagai \( \overline{x} \) ± s (n = 6). Singkatan:BF, bufalin; BF/PEG-LP, liposom PEGylated yang mengandung bufalin; IS, standar internal
Sementara itu, BF 1,20 kali lipat lebih tinggi (333 ± 92,5 ng/g pada 5 min) terdeteksi di jaringan otak kelompok BF/PEG-LP dibandingkan dengan kelompok BF. Selain itu, konsentrasi BF yang lebih tinggi ditemukan di jaringan hati, limpa, dan otak pada kelompok BF/PEG-LP. Akumulasi BF yang signifikan terdeteksi di hati, dengan konsentrasi 187 ± 31.0 ng/g pada kelompok BF/PEG-LP dan 163 ± 35.0 ng/g pada kelompok BF (P < 0,01). Fenomena serupa, yang terutama disebabkan oleh peningkatan dramatis BF dalam darah sebelum metabolisme dan ekskresi, diamati pada penelitian sebelumnya [20, 21].
Menurut hasil percobaan distribusi jaringan, BF sendiri dapat melintasi BBB, kemungkinan karena kelarutannya dalam lemak yang tinggi, berat molekul yang rendah (386,52 g/mol), dan struktur kimia yang mirip dengan kolesterol. berbagi struktur inti induk yang sama. Namun, aplikasi klinis BF terbatas karena kelarutan lemaknya yang tinggi dan kelarutan air yang buruk. Bioavailabilitas BF rendah jika tidak diberikan dalam bentuk alternatif. Dalam penelitian sebelumnya [6], kami menunjukkan bahwa formulasi BF/PEG-LP dapat meningkatkan kelarutan dalam air, memperpanjang durasi sirkulasi darah, memperpanjang waktu paruh, dan memperluas cakupan aplikasi BF, termasuk untuk i.v. kemoterapi. Dalam penelitian ini, pemberian BF/PEG-LP menghasilkan peningkatan konsentrasi BF di otak, yang dipertahankan untuk durasi yang lebih lama (90 min). Selain itu, ada perbedaan yang signifikan dalam konsentrasi BF antara kelompok BF dan BF/PEG-LP pada 45 min (167,59 ± 54,52 vs 71,52 ± 48,35 ng/g, P < 0.01).
Dalam penelitian sebelumnya, BF ditunjukkan untuk memberikan efek seperti digitalis pada jantung, meningkatkan denyut jantung dan kekuatan kontraktif miokard pada tikus [22]. Oleh karena itu, kardiotoksisitas BF pada dosis besar dapat disebabkan oleh akumulasinya di jantung. Percobaan biodistribusi dalam penelitian ini menunjukkan bahwa akumulasi BF di jantung lebih rendah pada kelompok BF/PEG-LP dibandingkan pada kelompok BF (95.0 ± 18.5 vs . 134 ± 17.8 ng/g pada 5 min, P < 0.01; 15.32 ± 5.56 vs. 63.79 ± 28.21 ng/g pada 15 min, P < 0,01). Whether cardiac toxicity can be attenuated with a lower dose of BF requires further verification. Nevertheless, the antitumor effect of BF was sufficiently strong in this study (the IC50 values for glioma cells were nanomolar). For in vivo application, it is critical to decrease the toxicity (especially heart toxicity) and increase the water solubility of BF, which was our focus in this study.
In general, PEGylated liposomes are considered to have no or low immunogenicity. However, according to recent studies, when PEGylated liposomes were repeatedly injected into the same animal, an immune response was triggered [23]. In fact, a second injection of PEGylated liposomes resulted in reduced blood circulation time and increased hepatic and splenic accumulation, which is known as the accelerated blood clearance (ABC) phenomenon. Such immunogenicity of PEGylated liposomes presents major challenges in the research of liposomal formulations and their clinical application. However, liposomal formulations that do not display the ABC phenomenon have been reported, such as a long-circulating DOX-loaded liposomal formulation (Doxil, Sequus pharmaceuticals, Inc., San Francisco, CA, USA), which has been commercialized. DOX was released from the liposomes and entered the spleen, damaging spleen cells and thereby reducing the production of anti-PEG IgM, which could selectively bind with PEG on the surface of the liposomes administered at the second injection. Whether BF/PEG-LP exhibits the ABC phenomenon remains unknown and requires further study. If so, mitigating the ABC phenomenon will require in-depth investigation.
In the present study, we evaluated hemolysis induced by BF/PEG-LP and the cytotoxicity of blank liposomes to verify the safety thereof. Moreover, the effect of environmental pH on the release of BF from liposomes was investigated to assess the stability of BF/PEG-LP. BF encapsulation in a liposomal suspension might affect its antitumor activity in vitro and in vivo and general behavior, acute toxicity, and tissue distribution in vivo. Nonetheless, we believe that the development of the liposomal formulation described in this study has laid a foundation for the future clinical application of BF. Intensive investigation of the relevance of the ABC phenomenon to BF/PEG-LP is warranted in the future.
Semua data yang dihasilkan atau dianalisis selama penelitian ini disertakan dalam artikel yang diterbitkan ini dan file informasi tambahannya.
Accelerated blood clearance
The aggregation-induced emission
Blood-brain barrier
Bufalin
Bufalin-loaded PEGylated liposomes
Cinobufagin
Kit penghitung sel-8
Half-maximal inhibitory concentration
Intraperitoneally
Internal standard
Intravenously
Median lethal concentration
Garam dengan buffer fosfat
Red blood cell
bahan nano
Abstrak Asam oleanolic telah digunakan hanya sebagai agen tambahan dalam produk kosmetik. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menunjukkan pengaruh asam oleanolat sebagai bahan aktif untuk pengurangan kerutan pada manusia dan untuk mengembangkan formulasi misel polimer yang memungkinkan asam ole
Abstrak Melanoma maligna adalah kanker kulit yang sangat agresif yang bertanggung jawab atas 80% kematian, dan kelangsungan hidup rata-rata keseluruhan pada pasien dengan melanoma metastatik hanya 6-9 bulan. Pengobatan kombinasi melalui pemberian simultan obat ganda dalam nanocarrier tunggal telah
Abstrak Terapi kombinasi telah menjadi strategi standar dalam pengobatan tumor klinis. Kami telah menunjukkan bahwa kombinasi Tetradrine (Tet) dan Cisplatin (CDDP) menunjukkan aktivitas antikanker sinergis yang nyata, tetapi efek samping yang tak terhindarkan membatasi konsentrasi terapeutik mereka
Sistem distribusi tenaga listrik memerlukan perhatian dan pertimbangan yang rinci saat merencanakan dan merancang. Sistem tenaga sangat penting untuk menjaga operasi sehari-hari berfungsi dengan baik. Mari kita lihat beberapa aspek penting perencanaan dan desain sistem distribusi. Pentingnya Pere
