Mesopori Silica Nanoparticle-Based Kombinasi Inhibitor NQO1 dan 5-Fluorouracil untuk Efek Antitumor Ampuh Terhadap Karsinoma Sel Skuamosa Kepala dan Leher (HNSCC)

Bahan dan Metode

Persiapan 5-FU/ß-lap-Loaded Lipid Bilayer-Mesopori Silica Nanoparticles

MSN yang mengandung obat dibuat dengan melarutkan cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) (210 mg) dalam 180 ml air dan direbus hingga 80 °C, diikuti oleh 5-FU dan -lap ditambahkan 20% b/b dari total nanopartikel dan kemudian amonium fluorida (NH4F) (30 mg) ditambahkan dan diaduk dengan baik selama 60 min. Selanjutnya, 1,6 ml tetraetil ortosilikat (TEOS) ditambahkan secara tetes demi tetes selama 30 menit dan terus diaduk selama 3 jam. Koloid putih semi-transparan terbentuk yang dikumpulkan setelah sentrifugasi (15 min) pada 10.000 rpm pada 24 ± 1 °C. MSN disuspensikan kembali dalam air ultra murni, dan siklus sentrifugasi diulang 2 kali. Secara terpisah, membran film tipis dibuat menggunakan DSPE-PEG2000 (2% dari total berat MSN) dan dihidrasi dengan air yang tersuspensi dengan MSN yang mengandung obat. Campuran segera diperiksa disonikasi selama 5 menit pada 50 W pada suhu kamar (25 ° C). Lapisan ganda lipid PEGylated yang mendukung MSN akhirnya dicuci dua kali dan disuspensikan kembali dalam air ultra murni.

Ukuran Partikel, Analisis Potensi Zeta, dan Analisis Morfologi

Diameter partikel, indeks polidispersitas (PDI), dan potensi zeta dievaluasi menggunakan Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK). Partikel dianalisis menggunakan mekanisme hamburan cahaya dinamis (DLS) dan dispersi partikel diencerkan dengan baik sebelum percobaan. Semua percobaan dilakukan dalam rangkap tiga pada suhu kamar. Morfologi nanopartikel ditentukan dengan mikroskop elektron transmisi (TEM) menggunakan CM 200 UT, Philips, MA, USA) yang dioperasikan pada 100 kV. Secara singkat, dispersi partikel diencerkan, setetes ditempatkan dalam kisi TEM 300-mesh dan dibiarkan mengendap selama 10 menit. Partikel-partikel tersebut diwarnai dengan asam fosfotungstat (PTA) 2% sebagai pewarnaan negatif, dikeringkan dengan udara, dan diamati di bawah mikroskop TEM.

Pemuatan Obat

Analisis pemuatan obat dua cara dilakukan dengan menghitung obat yang tidak terbebani atau yang tidak terikat dalam supernatan dan obat yang dimuat dalam nanopartikel. Efisiensi drug loading dilakukan dengan metode HPLC. HPLC dilengkapi dengan pompa Shimadzu LC-20 AD PLC dan detektor PDA SPD-M20A dan perangkat lunak analisis Shimadzu LC yang berisi kolom C18 fase terbalik (Fenomena C18, 150 4,6 mm, 5 μm). Fase gerak untuk 5-FU terdiri dari campuran asetonitril dan air (10:90, v/v) dan dipompa dengan kecepatan 1 ml/menit. Panjang gelombang deteksi diatur pada 265 nm untuk 5-FU. Fase gerak untuk -lap terdiri dari asetonitril/air (31:69, v/v) dan panjang gelombang deteksi ditetapkan pada 254 nm pada 35 °C. Kapasitas pembebanan (LC) dan efisiensi pembebanan (LE) dari 5-FU/ -lap dihitung menggunakan rumus masing-masing.

Studi Pelepasan Obat

Pelepasan 5-FU dan -lap dievaluasi dalam PBS (pH 7.4) dan ABS (pH 5.0) pada 37 °C menggunakan metode dialisis. Secara singkat, 1 mg ekuivalen dari masing-masing nanopartikel berisi obat dimuat dalam membran dialisis dalam 1 ml buffer masing-masing dan ujungnya disegel. Membran dialisis yang disegel ditempatkan dalam 25 ml buffer ABS dan PBS masing-masing dan ditempatkan dalam penangas air yang bergetar pada suhu 37 °C. Sampel dikumpulkan pada interval waktu yang telah ditentukan dan diganti dengan buffer segar dengan volume yang sama. Jumlah obat yang dilepaskan dalam buffer masing-masing dievaluasi dengan metode HPLC seperti yang dijelaskan di bagian sebelumnya.

Kultur Sel dan Uji Aktivitas NAD(P)H:Quinone Oxidoreductase 1 (NQO1)

Sel Cal33 HNSCC dikultur dalam medium Eagle yang dimodifikasi (DMEM) Dulbecco yang dilengkapi dengan 10% FBS dan 1% campuran antibiotik. Sel-sel dipertahankan dalam kondisi ambien dalam inkubator. Untuk uji aktivitas NQO1, sel Cal33 diunggulkan dalam pelat 96-sumur dengan kepadatan penyemaian 8 × 10 ³ sel per sumur dan diinkubasi semalaman. Sel-sel diperlakukan dengan konsentrasi -lap yang berbeda dan diinkubasi selama 24 jam. 0,8% digitonin (50 μl 2 nM EDTA) digunakan untuk melisiskan sel dan pengujian dilakukan menggunakan menadiol dan MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) sebagai reaksi dan aktivitas penggabungan substrat diukur pada 620 nm. Pengujian dilakukan dalam rangkap tiga.

Uji Viabilitas Sel In Vitro

Uji viabilitas sel -lap dalam peningkatan konsentrasi dan uji viabilitas sel dari rejimen individu dan kombinasi diuji dengan 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-car boxymethoxyphenyl)-2-(4 uji -sulfofenil)-2H-tetrazolium (MTS). Secara singkat, sel Cal33 diunggulkan dalam pelat 96-sumur dengan kepadatan penyemaian 1 × 10 ⁴ sel per sumur dan diinkubasi semalaman. Hari berikutnya, sel diperlakukan dengan peningkatan konsentrasi -lap, secara terpisah; sel diperlakukan dengan rejimen individu dan kombinasi 5-FU dan -lap pada konsentrasi dasar 5, 10, dan 20 μg/ml dan diinkubasi selama 24 h. Sel-sel dicuci dua kali dan diperlakukan dengan larutan MTS sesuai dengan pedoman pabrik. Viabilitas sel dihitung dengan memperhatikan sel yang tidak diberi perlakuan, dan pembaca lempeng mikro digunakan untuk absorbansi pada 460 nm.

Analisis Western Blot

Sel-sel yang diunggulkan dalam pelat 6-sumur diperlakukan dengan peningkatan konsentrasi -lap, secara terpisah; sel diperlakukan dengan individu (5-FU atau -lap) dan rejimen kombinasi 5-FU dan -lap (FNQ-MSN) dan diinkubasi selama 24 jam. Sel-sel dipanen, dilisis (M-per buffer), dan disentrifugasi, dan protein yang mengandung supernatan dikumpulkan. Konsentrasi protein dalam lisat sel dievaluasi menggunakan metode asam bicinchoninic (BCA). Gel poliakrilamida Bis-Tris 10% digunakan untuk memisahkan protein dan segera dipindahkan ke membran polivinilidena fluorida (PVDF). Membran diblokir menggunakan susu skim 5% yang disiapkan dalam n buffer tris-buffered saline (TBS) yang mengandung Tween 20 (TBST, pH 7.2). Antibodi primer kelinci poliklonal NQO1 (1:1000), tikus monoklonal Bcl-2 (1:1000), dan tikus monoklonal GAPDH (1:1000) diinkubasi pada membran semalam pada 4 °C. Membran dicuci dengan TBST dan kemudian diinkubasi dengan antibodi sekunder (antimouse atau antirabbit IgG) pada pengenceran 1:10000 pengenceran. Membran dicuci lagi dengan TBST dan noda terkena larutan substrat ECL dan kepadatan pita protein dievaluasi menggunakan photodeveloper.

Pengujian Apoptosis dan Hoechst

Sel Cal33 diunggulkan di piring 6 lubang dengan kepadatan penyemaian 2 × 10 ⁵ sel per sumur dan diinkubasi semalaman. Sel-sel kemudian dirawat dengan individu (5-FU atau -lap) dan rejimen kombinasi 5-FU dan -lap (FNQ-MSN) dan diinkubasi selama 24 jam. Sel-sel dipanen, dicuci, disentrifugasi, dan dibuat pelet. Sel-sel diperlakukan dengan 2,5 μl annexin V dan 2,5 μl PI dan diinkubasi selama 15 min dalam kondisi gelap. Sel-sel kemudian dibuat hingga 1 ml dan dievaluasi menggunakan penyortiran sel yang diaktifkan fluoresensi (FACS, BD, FACSverse). Sebanyak 10.000 sel dianalisis. Prosedur serupa untuk penyemaian sel dan perawatan obat diikuti dan kemudian diwarnai dengan pewarna Hoechst 33342 (10 μg/ml) dan diinkubasi selama 10 min. Sel-sel dicuci dan difiksasi dengan paraformaldehyde (PFA) 4% dan dicuci lagi. Morfologi sel diamati di bawah mikroskop fluoresensi (Nikon A1, Jepang).

Efikasi Antitumor FNQ-MSN DALAM Model Tumor Xenograft HNSCC

Delapan belas hingga dua puluh dua gram tikus BALB/c jantan rata-rata berusia 4-5 minggu diperoleh dari Pusat Fasilitas Hewan In-House di Universitas Industri Ringan Zhengzhou, Henan. Hewan-hewan itu dipelihara di ruangan ber-AC dengan siklus gelap-terang 12 h dan diberi akses gratis ke makanan dan air. Semua protokol hewan telah disetujui oleh Komite Etika Universitas Industri Ringan Zhengzhou, Henan. Untuk membuat model xenograft, 1 × 10 ⁷ Sel Cal33 dalam 150 μl media kultur diinokulasi di pinggul kanan tikus secara subkutan. Ketika ukuran rata-rata tumor mencapai 80–100 mm3, tikus secara acak dibagi menjadi 5 kelompok untuk kontrol, 5-FU, -lap, 5-FU+ß-lap, dan FNQ-MSN, masing-masing dengan 8 tikus di setiap kelompok. . 5-FU diberikan dengan dosis tetap 5 mg/kg dan -lap dengan dosis tetap 25 mg/kg dan diberikan 3 kali dengan jeda 3 hari untuk setiap injeksi vena ekor. Berat tikus dan volume tumor dipantau secara teratur selama 18 hari. Volume tumor dihitung menggunakan rumus

Penelitian ini tidak mengamati kematian tikus karena pemuatan sel tumor dan semua hewan di-eutanasia dengan CO₂ dan kemudian dikorbankan dengan dislokasi serviks menjelang akhir penelitian.

Analisis Statistik

Beberapa kelompok dibandingkan dengan menggunakan analisis varians dua arah (ANOVA). Tingkat signifikansi p <0,05 dianggap signifikan dan semua data disajikan sebagai rata-rata ± standar deviasi kecuali dan jika tidak disebutkan secara khusus dalam percobaan masing-masing.

Hasil dan Diskusi

Persiapan 5-FU/ß-lap-Loaded Lipid Bilayer yang Didukung Nanopartikel Silika Mesopori

Dalam penelitian ini, kami telah menyesuaikan nanopartikel silika mesopori yang distabilkan oleh lapisan ganda lipid PEGylated. MSN 5-FU/ß-lap-loaded dibuat dengan metode emulsisonikasi, dan kemudian MSN berisi obat dimasukkan ke dalam labu yang mengandung film tipis lipid yang terdiri dari DSPE-PEG2000. Campuran disonikasi dan diperoleh MSN berlapis lipid yang mengandung 5-FU/ß-lap (FNQ-MSN) (Gbr. 1a). Efisiensi pemuatan (LE) dari 5-FU dan -lap masing-masing adalah 91,5 ± 1,65% dan 92,9 ± 1,24%. FNQ-MSN menunjukkan 8,1 ± 1,12 wt% 5-FU dan 7,6 ± 0,95 wt% -lap yang menunjukkan kapasitas pemuatan tinggi (LC) pembawa MSN. Kehadiran lipid bilayer akan mencegah pelepasan yang tidak diinginkan dalam sirkulasi sistemik dan dengan demikian mencegah toksisitas. Ukuran partikel rata-rata dari drug-loaded MSN adalah 92,1 ± 0,85 nm (PDI ~ 0,089) sementara perakitan lipid bilayer pada permukaan MSN (FNQ-MSN) meningkatkan ukuran partikel rata-rata menjadi 128,4 ± 1,24 nm (PDI ~ 0,115) menunjukkan a kehadiran padat bahan lipid pada permukaan MSN (Gbr. 1b). Potensi zeta berubah dari 18,2 ± 1,22 menjadi 26,4 ± mV. Ukuran partikel kecil FNQ-MSN akan memungkinkan akumulasi preferensial pembawa obat dalam jaringan tumor bocor berdasarkan efek EPR. Selain itu, PEGylated permukaan akan memberikan stabilitas yang sangat baik dan waktu sirkulasi darah yang lama yang selanjutnya akan meningkatkan kemungkinan FNQ-MSN dalam jaringan tumor. Gambar TEM menunjukkan kemiripan morfologi dengan liposom dan disajikan berbentuk bulat sempurna tersebar merata di grid. Gambar TEM dengan jelas menunjukkan bagian luar keabu-abuan kemudian dan inti yang lebih gelap menunjukkan adanya perakitan lipid pada permukaan MSN (Gbr. 1c). Ukuran yang diamati dari TEM menguatkan dengan ukuran partikel DLS dari zetasizer. MSN memiliki saluran yang tertata dengan baik untuk distribusi molekul obat yang homogen. Sifat permukaan pori-pori adalah salah satu faktor penting dalam pemuatan stabil molekul-molekul kecil. Berbagai gaya fisik yang terlibat dalam interaksi tuan rumah-tamu terutama mencakup gaya hidrofobik dan gaya interaksi van der Waals. Kapasitas pemuatan obat yang lebih tinggi akan memberikan, konsentrasi intraseluler yang lebih tinggi dan efisiensi pembunuhan yang lebih tinggi di lokasi tumor. FNQ-MSN menunjukkan stabilitas yang sangat baik dalam media PBS dan ukuran partikel tetap tidak berubah selama masa studi sampai 30 hari. Peningkatan stabilitas sistem pembawa dan kapasitas pemuatan yang tinggi dari sistem pembawa akan meningkatkan biodistribusi dan efisiensi dalam pengobatan tumor.

a Presentasi skematis konstruksi 5-FU dan -lap-loaded lipid bilayer-dilapisi nanopartikel silika mesopori. Dua obat dimuat dalam pori-pori MSN yang selanjutnya distabilkan oleh perakitan lipid bilayer PEGylated pada permukaan luar MSN. b Distribusi ukuran partikel FNQ-MSN. c Gambar TEM FNQ-MSN dengan sisipan perbesaran yang lebih tinggi

Pelepasan Obat In Vitro

Pelepasan obat in vitro 5-FU dan -lap dari FNQ-MSN dipelajari di PBS dan ABS (Gbr. 2). Seperti yang ditunjukkan, dua tren pelepasan yang berbeda diamati pada pH 7.4 dan pH 5.0. Misalnya, 25% 5-FU dilepaskan dalam 24 jam pada pH 7,4 dibandingkan dengan ~ 40% pelepasan obat pada pH 5,0 dalam 24 jam. Demikian pula, 20% dan 30% dari -lap dirilis di pH 7.4 dan pH 5.0, masing-masing. Kinetika pelepasan identik selama periode penelitian dengan 50% 5-FU dilepaskan dalam buffer basa dan 80% pelepasan obat pada pH 5,0 setelah 72 jam masa studi. Pelepasan obat yang responsif terhadap pH dalam kondisi asam menguntungkan untuk pengobatan kanker. Tidak ada fenomena pelepasan meledak yang diamati pada kedua kondisi pH yang terutama dikaitkan dengan adanya lapisan DSPE-PEG yang mengontrol pelepasan obat dari FNQ-MSN selama periode penelitian. Perbedaan yang signifikan dalam pelepasan obat diamati antara kondisi pH 7.4 dan pH 5.0. Pada kondisi pH 7.4, PEG-b -DSPE menunjukkan properti lapisan siluman yang tinggi sehingga mencegah pelepasan senyawa yang dienkapsulasi. Hasil ini menunjukkan bahwa pelepasan obat dipercepat pada pH 5.0, menunjukkan pembongkaran cangkang pelindung di sekitar permukaan MSN. Laju pelepasan obat yang sensitif terhadap pH, yang memastikan pelepasan obat maksimum di dalam sel kanker, dapat meningkatkan kemanjuran antitumor dan mengurangi toksisitas yang tidak diinginkan pada jaringan normal. Ada kemungkinan bahwa dengan adanya elemen yang responsif terhadap pH, FNQ-MSN dapat mengakibatkan pelepasan lapisan ganda lipid pada MSN yang mengakibatkan pelepasan yang lebih baik dalam kondisi pH yang lebih rendah.

Pelepasan in vitro 5-FU dan -lap dari FNQ-MSN dalam kondisi buffer pH 7.4 dan pH 5.0. Studi pelepasan dilanjutkan sampai 72 jam, dan pelepasan obat diukur menggunakan metode HPLC. **p <0,01

Sensitivitas NQO1 terhadap -lap

Karena peningkatan regulasi NQO1 di banyak sel kanker termasuk HNSCC terkait dengan prognosis yang buruk dan hasil terapi yang buruk, obat yang menargetkan NQO1 bisa menjadi strategi potensial untuk pengobatan kanker [24]. NQO1 diekspresikan secara berlebihan dalam tingkat mulai dari 100 hingga 200 kali lipat pada karsinoma sel skuamosa dibandingkan dengan yang terkait dengan jaringan normal. Oleh karena itu, pengaruh putaran- pada aktivitas enzim NQO1 dipelajari dalam sel Cal33. Seperti yang ditunjukkan, -lap menunjukkan penghambatan yang bergantung pada konsentrasi dari aktivitas enzim NQO1 dalam sel Cal33 (Gbr. 3a). Khususnya, efek penghambatan yang signifikan diamati pada dosis 20-50 μg/ml -lap. Selanjutnya, potensi penghambatan -lap pada protein NQO1 dipelajari lebih lanjut dengan analisis western blot (Gbr. 3b). Hasil dengan jelas mengungkapkan penurunan signifikan protein NQO1 dalam sel kanker dengan peningkatan konsentrasi -lap. Kira-kira, 80% penghambatan NQO1 diamati pada 100 μg/ml -lap. Obat bioaktif NQO1 seperti -lap dimetabolisme oleh NQO1 dan membentuk senyawa hidrokuinon tidak stabil yang segera mengubah kembali ke komponen aslinya meninggalkan 2 oksidasi satu elektron dan mengkonsumsi 2 O ²⁻ . Ini akan menciptakan siklus redoks yang sia-sia di mana 1 molekul -lap akan menghasilkan 130 mol superoksida dengan biaya mengonsumsi 60–70 mol NAD(P)H6. Radikal superoksida (O2.−) yang terbentuk akan diubah menjadi hidrogen peroksida (H2O2−) dan akan menyebabkan apoptosis sel dan kematian sel [25].

a Pengaruh aktivitas -lap yang bergantung pada konsentrasi pada aktivitas NQO1 sel kanker Cal33 dengan metode enzimatik. b Pengaruh aktivitas -lap yang bergantung pada konsentrasi pada tingkat protein NQO1 dengan analisis western blot menggunakan GAPDH sebagai protein rumah tangga

Efek Antikanker In Vitro FNQ-MSN di Sel HNSCC

Efek antikanker in vitro dari -lap dalam sel Cal33 dipelajari dengan uji MTT. Hasil mengungkapkan bahwa -lap menunjukkan penurunan yang bergantung pada konsentrasi pada viabilitas sel (Gbr. 4a). Khususnya, penurunan yang signifikan dalam viabilitas sel diamati pada konsentrasi 50 μg/ml. Untuk percobaan lebih lanjut, 20 μg/ml dipilih (di bawah nilai IC50 dari -lap). Selanjutnya, efek potensiasi -lap pada 5-FU dipelajari pada 3 konsentrasi yang berbeda (5, 10, dan 20 μg/ml). Seperti yang ditunjukkan, kombinasi 5-FU+ß-lap menghasilkan viabilitas sel yang lebih rendah; terutama, FNQ-MSN menunjukkan viabilitas sel yang secara signifikan lebih rendah dibandingkan dengan obat individu atau kombinasi fisik mana pun (Gbr. 4b). Misalnya, 5-FU dan -lap menunjukkan viabilitas sel sebesar 35,7% dan 70,2% sedangkan 5-FU+-lap masing-masing menunjukkan 26,5% dan FNQ-MSN menunjukkan 13,1%. Hasil dengan jelas menunjukkan bahwa efek sitotoksik 5-FU meningkat secara signifikan bila dikombinasikan dengan -lap. Perlu dicatat bahwa FNQ-MSN lebih efektif dibandingkan dengan 5-FU+ß-lap yang dikaitkan dengan internalisasi yang lebih baik dan pelepasan terkontrol dari terapi yang dimuat dari sistem pembawa. Hasil dengan jelas mengungkapkan efek penghambatan -lap pada aktivitas enzim NQO1 dan tingkat protein dan mempotensiasi efek antikanker 5-FU dan menghasilkan peningkatan hasil terapeutik dalam pengobatan HNSCC.

a Pengaruh aktivitas -lap yang bergantung pada konsentrasi pada viabilitas sel sel Cal33. b Efek sitotoksik individu dan kombinasi dengan agen kemoterapi kedua, 5-FU pada 3 konsentrasi berbeda masing-masing 5-20 μg/ml. Viabilitas sel dievaluasi dengan uji MTT setelah 24 jam inkubasi. c Analisis Western blot ekspresi protein NQO1 dan Bcl-2 setelah pengobatan dengan individu dan kombinasi 5-FU dan -lap

Peran FNQ-MSN dalam Jalur Sinyal:Analisis Western Blot

Mekanisme efek sitotoksik yang dimediasi -lap lebih lanjut dieksplorasi dengan analisis western blot. Seperti yang ditunjukkan, -lap menghasilkan penurunan pita protein NQO1 dibandingkan dengan kontrol; namun, penurunan paling menonjol pada tingkat NQO1 diamati pada kelompok sel yang diberi perlakuan FNQ-MSN (Gbr. 4c). Peningkatan chemosensitivity Cal33 yang diinduksi -lap dengan meningkatkan apoptosis sel dievaluasi melalui tingkat protein Bcl-2. Keluarga Bcl-2 memainkan peran penting dalam mengatur homeostasis sel dan mengontrol proliferasi dan kematian sel kanker. Proses penurunan Bcl-2 dan peningkatan Bax mengakibatkan pelepasan sitokrom C di sitosol yang akan menginisiasi seluruh kaskade kaspase yang mengakibatkan kematian sel. Hasil dengan jelas menyoroti bahwa kombinasi 5-FU dan -lap (FNQ-MSN) secara signifikan menurunkan regulasi Bcl-2 yang menunjukkan peningkatan efek antikanker pada sel kanker Cal33.

Analisis Apoptosis HNSCC

Setelah analisis viabilitas sel, efek apoptosis obat individu dan kombinasi pada sel Cal33 dievaluasi dengan flow cytometer setelah pewarnaan annexin V/PI (Gbr. 5). Efek apoptosis individu 5-FU (10 μg/ml) atau -lap (30 μg/ml) tidak menghasilkan apoptosis sel kanker yang berarti; namun, 5-FU+ß-lap menghasilkan peningkatan dramatis dalam proporsi apoptosis sel kanker. Yang penting, FNQ-MSN menghasilkan lebih dari 60% apoptosis sel (apoptosis awal dan akhir) yang menandakan efek terapeutik superior dari rejimen kombinasi berbasis pembawa. Efek apoptosis selanjutnya dikonfirmasi dengan pewarnaan Hoechst 33342. Seperti yang ditunjukkan, sel yang diobati dengan FNQ-MSN menghasilkan jumlah sel yang lebih tinggi yang mengalami apoptosis, kondensasi nuklir, dan fitur fragmentasi dibandingkan dengan 5-FU atau -lap saja (Gbr. 6). Selama proses apoptosis, sel-sel menyusut tanpa mengalami kerusakan pada membran sel luar dan mengakibatkan kondensasi kromatin dengan peningkatan pembentukan tubuh apoptosis.

Analisis flow cytometer sel Cal33 menggunakan pewarnaan ganda annexin V dan PI setelah perlakuan dengan individu dan kombinasi 5-FU dan -lap. 10.000 peristiwa dicatat dalam flow cytometer

Analisis morfologi inti sel Cal33 setelah pewarnaan dengan Hoechst 33342; sel diperlakukan dengan individu dan kombinasi 5-FU dan -lap. 10.000 peristiwa dicatat dalam flow cytometer

Pengujian Langsung/Mati

Efek antikanker dari obat individu dan kombinasi dievaluasi lebih lanjut dengan uji Live/Dead. The treated cells were subjected to Calcein AM and ethidium bromide staining as a respective marker of live and dead cells (Fig. 7). As shown, untreated cells are stained with 100% of green fluorescence. The individual drugs, 5-FU (10 μg/ml) or ß-lap (30 μg/ml) though showed slight red fluorescence stained cells; however, predominant cells exhibited green fluorescence indicating limited cell death. Remarkable cell death was observed in FNQ-MSN-treated cancer cells as shown by predominant red fluorescence and fewer green fluorescence stained cells. The higher anticancer effect of FNQ-MSN was attributed to the synergistic activity of 5-FU and ß-lap in the cancer cells and the ability of ß-lap to increase the chemosensitivity of 5-FU.

Live/dead analysis of Cal33 cells using double staining of Calcein AM and ethidium bromide after treatment with individual and combination of 5-FU and ß-lap

In Vivo Antitumor Efficacy of FNQ-MSN Against HNSCC Xenograft Model

To further evaluate the efficacy of combinational regimen in an animal model, HNSCC xenograft was prepared and administered with 5 mg/kg of 5-FU and 10 mg/kg of ß-lap, respectively. The pharmaceutical grade of ß-lap is ARQ761 which is presently in phase I clinical trial for the treatment of metastatic malignancies. ß-lap has set the limit for the maximum tolerable dose in humans as per the preclinical studies [27]. Keeping this in mind, we have optimally selected a dose of 10 mg/kg of ß-lap for the in vivo studies. As shown, no significant decrease in tumor volume was observed with individually administered 5-FU and ß-lap compared with that of non-treated control (Fig. 8a). Notable decrease in tumor volume was observed with a physical mixture of 5-FU+ß-lap; however, combined treatment of carrier-based 5-FU and ß-lap (FNQ-MSN) significantly delayed the tumor growth and prolonged the survival of tumor-bearing xenograft mice. The tumor volume graph of FNQ-MSN could be divided into two parts; insignificant growth in tumor volume was observed until day 9 while tumor significantly increased after day 9 until day 18, nevertheless, overall tumor volume was manifold smaller compared with that of control or other groups. The toxicity concern of the individual and combinational regimen was evaluated in terms of body weight (Fig. 8b). As shown, physical mixture of 5-FU+ß-lap resulted in severe toxicity as represented by more than 10% loss in body weight while 5-FU resulted in 5% of body weight. As expected, FNQ-MSN did not result in any loss of body weight indicating the unique advantage of the lipid-MSN-based carrier system. The enhanced antitumor effect of FNQ-MSN was attributed to the inhibitory effect of ß-lap towards the NQO1 enzyme and protein which in turn increased the chemosensitivity of 5-FU and resulted in synergistic anticancer effect in the Cal33 human tumors, second, lipid bilayer–coated MSN protected the drug during the systemic circulation and might release in a controlled manner in the tumor tissue, third, PEGylation of nanocarrier might prolonged the blood circulation time allowing for the preferential accumulation in the tumor tissues owing to EPR effect [28, 29]. PEGylated MSN were mainly trapped in RES of the liver, spleen, and lung, accounting for over 80% of the administered dose. PEG modification of MSN obviously decreased the clearance rate of MSN in organs, demonstrating that the PEGylated NPs were more difficult to be removed from the RES organs regardless of the particle shape [30, 31]. Overall, in vivo study on HNSCC model offer a “proof of concept” that effective combination of 5-FU+ß-lap in stable nanocarrier might enhance the therapeutic efficacy in tumor while alleviating the associated toxic effect.

a In vivo antitumor efficacy of FNQ-MSN in HNSCC xenograft model. The mice bearing HNSCC tumors were treated with 5-FU, ß-lap, 5-FU+ß-lap and FNQ-MSN at a fixed dose of 5 mg/kg of 5-FU and 10 mg/kg of ß-lap intravenously for 3 times. Tumor volume was noted as a part of efficacy analysis and compared with non-treated control. b Body weight analysis corresponding to tumor volume data. *p <0.05 and ***p <0.001

Ketersediaan Data dan Materi

All data generated or analyzed during this study are included in this published article and its supplementary information files.

Singkatan

5-FU:

5-Fluorouracil

EPR:

Enhanced permeation and retention effect

FNQ-MSN:

5-FU/ß-lap-loaded mesoporous silica nanoparticles

HNSCC:

Head and neck squamous cell carcinomas

MSN:

Mesoporous silica nanoparticle

NQO1:

NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1

ß-lap:

ß-lapachone

Dichroism Melingkar Raksasa Merdu dari Array Nanocrescent Logam Kiral Ekstrinsik Area Besar RETRACTED ARTICLE:Studi Perbandingan Toksisitas Polyethylene Glycol–Coated Cobalt Ferrite Nanospheres and Nanoparticles