Nanopartikel Silika Mesoporos Pengiriman Ganda Inhibitor NQO1 dan 5-Fluorouracil, Meningkatkan Aktivitas Antitumor pada Karsinoma Sel Sekam Kepala dan Leher

Abstrak

Karsinoma sel sekam kepala dan leher (HNSCC) adalah salah satu bentuk kanker yang paling mematikan, dan 90% asalnya berasal dari sel sekam. NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 (NQO1), enzim yang überekspresi dalam karsinoma sel sekam, berperan penting dalam proliferasi dan kemotoleransi. Tujuan utama adalah untuk mempelajari efek inhibi ß-lapachone (ARQ761 dalam bentuk klinis) dalam HNSCC dan untuk mempelajari efek kombinasi 5-FU dan ß-lap dalam meningkatkan efektivitas terapeutik dalam HNSCC. Nanopartikel silika mesoporos yang dirangkap lapisan lipid dimuat 5-FU/ß-lap disiapkan dan ditinjau untuk properti fisikokimia dan biologisnya. ß-lap menunjukkan inhibi yang bergantung pada konsentrasi aktivitas enzim NQO1 dalam sel Cal33. Secara menarik, efek inhibi yang signifikan diamati pada dosis 20–50 μg/ml ß-lap. Kombinasi 5-FU+ß-lap menghasilkan keberadaan sel yang lebih rendah; yang paling menonjol, nanopartikel silika mesoporos dimuat 5-FU/ß-lap (FNQ-MSN) menunjukkan keberadaan sel yang jauh lebih rendah dibandingkan dengan obat tunggal atau kombinasi fisik. ß-lap menghasilkan penurunan dalam pita protein NQO1 dibandingkan kontrol; namun, penurunan yang paling menonjol dalam level NQO1 diamati dalam grup sel yang treated FNQ-MSN. FNQ-MSN menghasilkan lebih dari 60% apoptosi sel (apoptosi awal dan akhir) dan fragmentasi nukleus yang dominan dari sel kanker yang menunjukkan efek anti-kanker yang unggul dari regimen kombinasi berbasis pengiriman. Penurunan yang signifikan dalam volume tumor diamati dengan campuran fisik 5-FU+ß-lap; namun, pengobatan kombinasi 5-FU dan ß-lap berbasis pengiriman (FNQ-MSN) secara signifikan menunda pertumbuhan tumor dan memperpanjang hidupan tikus xenograft yang membawa tumor. Temuan ini menunjukkan potensi inhibitor NQO1 dalam meningkatkan potensi kemoterapi 5-FU dalam pengobatan HNSCC.

Pendahuluan

Karsinoma sel sekam kepala dan leher (HNSCC) adalah salah satu bentuk kanker yang paling mematikan dan 90% asalnya berasal dari sel sekam [1]. HNSCC sangat angiogenik secara alami dan vaskulernya mengekspresikan berbagai sitokin termasuk faktor pertumbuhan fibroblast (FGFs) dan faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGFs) yang terkait dengan metastasis yang lebih tinggi dan kelangsungan hidup yang buruk [2]. Insidensi HNSCC di Cina merupakan yang keenam dalam kematian terkait kanker dengan sekitar 250.000 kasus baru terdaftar pada tahun 2015 dan 77.500 kasus kematian. Tingkat kelangsungan hidup 5 tahun keseluruhan HNSCC sangat rendah karena faktor-faktor termasuk sifat agresif, resesi awal, metastasis tinggi, dan tingkat mortalitas tinggi karena prognosa buruk [3]. Opsi pengobatan utama dalam HNSCC adalah prosedur bedah diikuti dengan radioterapi atau kemoterapi. Untuk spesifiknya, kemoterapi jika digunakan secara efektif pada tahap awal atau pasca-bedah akan melawan pertumbuhan tumor [4, 5]. Penggunaan kemoterapi yang efektif akan menghilangkan sel kanker dalam jaringan tumor dan menghambat resesi tumor. Namun, kemoterapi jangka panjang berdasarkan agen tunggal sering menghasilkan resistensi obat dan mengurangi efektivitas terapeutik [6]. Oleh karena itu, perlu menerapkan strategi inovatif untuk meningkatkan kelangsungan hidup dan kualitas hidup pasien HNSCC.

Beberapa agen anti-kanker yang digunakan dalam pengobatan HNSCC termasuk sitoplatina, 5-fluorouracil (5-FU), paklitaksel, atau doksetaksel. Di antara semua, 5-fluorouracil (5-FU) digunakan sebagai terapi garis pertama dalam HNSCC dan pengobatan karsinoma sel sekam lainnya [7]. 5-FU adalah analog pirimidin yang bekerja dengan menghambat irreversibel sintes timalat dalam sel kanker dan sehingga menekan replikasi DNA yang mengakibatkan kematian sel [8]. Seperti semua obat anti-kanker, 5-FU tidak bebas dari efek samping dalam sirkulasi sistemik dan menyebabkan toksisitas pada jaringan normal, sementara dilaporkan bahwa kombinasi 5-FU dengan agen sekunder dapat mengurangi efek samping dan meningkatkan efektivitas terapeutik keseluruhan dalam pengobatan kanker [9].

NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 (NQO1) adalah protein flavin yang ditingkatkan dalam jaringan tumor dalam rentang 100-200 kali lipat dibandingkan dengan jaringan normal [10]. Oksidoriduktase dua elektron ini adalah enzim detoksifikasi fase II yang dapat diinduksi mampu mendetoksifikasi kuinon dengan membentuk hidrokuinon stabil [11]. NQO1 ditunjukkan ekspresi pada level basal rendah dalam jaringan manusia normal di mana ia melindungi sel terhadap siklus redoks dan stres oksidatif dan mengstabilkan p53 suppressor. NQO1 überekspresi konstitutif dalam beberapa kanker termasuk payudara, pankreas, dan karsinoma sel sekam [12]. Überekspresi NQO1 mempromosikan progresi beban kanker dan membuat sel kanker lebih resisten terhadap obat kemoterapi seperti 5-FU atau sitoplatina (induktor stres oksidatif) menjadikan NQO1 sebagai target onkogenik potensial untuk meningkatkan efektivitas terapeutik [13]. Telah dilaporkan bahwa penurunan NQO1 oleh siRNA meningkatkan efek sitotoksik berbagai obat seperti gemcitabine atau doxorubicin [14]. Selain itu, beberapa inhibitor NQO1 sintetis dan alami dilaporkan seperti kumarin atau kurkumin atau ES936 [15,16,17]. Dalam studi ini, kami menggunakan ß-lapachone (ß-lap, 3,4-Dihydro-2,2-dimethyl-2H-naphtho [1,2-b]pyran-5,6-dione) sebagai inhibitor NQO1 [18]. ß-lap bekerja melalui mekanisme dependen NQO1 dan menciptakan sejumlah besar spesies reaktif oksigen (ROS) yang akan menyebabkan kerusakan pada rantai DNA dan menyebabkan kematian sel kanker [19].

Penggunaan nanopartikel untuk pengiriman sistemik molekul kecil menjadi pendekatan yang promising dalam pengobatan kanker [20]. Nanopartikel yang dimuat obat memerlukan jadwal pemberian yang lebih sedikit dan ditunjukkan meningkatkan efektivitas anti-kanker dan secara relatif mengurangi efek samping. Di antara semua pengiriman, nanopartikel silika mesoporos (MSN) memiliki potensi signifikan untuk menyampaikan beban secara efektif ke jaringan tumor [21, 22]. Pori mikrometer memungkinkan pemuatan stabil obat dan mencegah rilisnya dalam sirkulasi sistemik dan mengakumulasi secara preferensial dalam jaringan kanker yang bocor menggunakan efek permeasi dan retensi yang ditingkatkan (EPR) [23].

Secara keseluruhan, tujuan utama studi ini adalah untuk menggabungkan manfaat terapeutik 5-FU dan inhibitor NQO1 untuk meningkatkan efek anti-kanker dalam HNSCC. Efek anti-kanker in vitro dianalisis menggunakan berbagai teknik seperti keberadaan sel, analis western blot, flow citometer/Hoechst-basis uji apoptosi, dan uji hidup/mati. Studi in vivo dilakukan pada model xenograft sel tumor Cal33.

Kesimpulan

Singkatnya, kami berhasil merumuskan nanopartikel silika mesoporos yang dilapisi lapisan lipid dimuat 5-FU+ß-lap. Kami telah menunjukkan bahwa (i) efek antitumor ß-lap secara bergantung pada konsentrasi dalam sel tumor HNSCC, (ii) kombinasi 5-FU+ß-lap menghasilkan inhibi yang signifikan terhadap protein NQO1 dan protein Bcl-2, (iii) FNQ-MSN berbasis kombinasi menunjukkan penurunan yang signifikan dalam beban tumor dalam xenograft HNSCC. Data ini secara pasti menunjukkan bahwa dosis sublethal inhibitor NQO1 (ß-lap) dapat meningkatkan efektivitas terapeutik 5-FU dalam tumor HNSCC dan dapat diperluas ke pengobatan klinis pada maliganitas lainnya.

Bahan dan Metode

Persiapan Nanopartikel Silika Mesoporos yang Dilapisi Lapisan Lipid Dimuat 5-FU/ß-lap

MSN yang dimuat obat disiapkan dengan melarutkan bromida cetiltrimetilamoniun (CTAB) (210 mg) dalam 180 ml air dan merebus hingga 80 °C, diikuti dengan penambahan 5-FU dan ß-lap sebesar 20% w/w dari total nanopartikel dan kemudian fluorida ammonium (NH4F) (30 mg) ditambahkan dan diaduk rata selama 60 menit. Selanjutnya, 1,6 ml ortosilikat tetraetil (TEOS) ditambahkan secara tetes selama 30 min dan diaduk terus-menerus selama 3 jam. Koloid putih semi-transparan terbentuk yang dikumpulkan setelah sentrifugasi (15 menit) pada 10000 rpm pada 24 ± 1 °C. MSN disuspendasi dalam air ultrapure, dan siklus sentrifugasi diulang 2 kali. Terpisah, lapisan tipis film disiapkan menggunakan DSPE-PEG2000 (2% dari total berat MSN) dan dihidrasi dengan air yang tersuspendasi dengan MSN yang dimuat obat. Campuran segera di-sonikasi probe selama 5 menit pada 50 W pada suhu ruangan (25 °C). MSN yang didukung lapisan lipid PEGylated akhirnya dicuci dua kali dan disuspendasi dalam air ultrapure.

Analisis Ukuran Partikel, Potensial Zeta, dan Morfologi

Diameter partikel, indeks polidispersi (PDI), dan potensial zeta dievaluasi menggunakan Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, Inggris). Partikel dianalisis menggunakan mekanisme pencaran cahaya dinamis (DLS) dan dispersi partikel diencerkan dengan baik sebelum eksperimen. Semua eksperimen dilakukan tiga kali pada suhu ruangan. Morfologi nanopartikel ditentukan oleh mikroskop transmisi elektron (TEM) menggunakan CM 200 UT, Philips, MA, Amerika Serikat) yang dioperasikan pada 100 kV. Singkatnya, dispersi partikel diencerkan, satu titik ditempatkan pada grid TEM 300-mesh dan dibiarkan mengelem selama 10 menit. Partikel diwarnai kontras dengan asam fosfotungstik 2% (PTA) sebagai warna negatif, dikeringkan di udara, dan diamati di bawah mikroskop TEM.

Pemuatan Obat

Analisis pemuatan obat dua cara dilakukan dengan menghitung obat yang tidak dimuat atau tidak terikat dalam sobrenatan dan obat yang dimuat dalam nanopartikel. Efisiensi pemuatan obat dilakukan dengan metode HPLC. HPLC dilengkapi dengan pompa PLC Shimadzu LC-20 AD dan detektor PDA SPD-M20A serta perangkat lunak analisis Shimadzu LC yang berisi kolom reverse phase C18 (Phenomenex C18, 150 4.6 mm, 5 μm). Fasa mobile untuk 5-FU terdiri dari campuran asetonitril dan air (10:90, v/v) dan dipompa pada laju 1 ml/min. Panjang gelombang deteksi disetel pada 265 nm untuk 5-FU. Fasa mobile untuk ß-lap terdiri dari asetonitril/air (31:69, v/v) dan panjang gelombang deteksi disetel pada 254 nm pada 35 °C. Kemampuan pemuatan (LC) dan efisiensi pemuatan (LE) 5-FU/ ß-lap dihitung menggunakan rumus yang sesuai.

$$ \mathrm{LE}\ \left(\%\right)=({W}_{total\ 5-\mathrm{FU}+\mathrm{\ss}-\mathrm{lap}}-{W}_{free\ 5-\mathrm{FU}+\mathrm{\ss}-\mathrm{lap}}/{W}_{total\ 5-\mathrm{FU}+\mathrm{\ss}-\mathrm{lap}})\times 100 $$ $$ \mathrm{LC}\ \left(\%\right)=({W}_{total\ 5-\mathrm{FU}+\mathrm{\ss}-\mathrm{lap}}-{W}_{free\ 5-\mathrm{FU}+\mathrm{\ss}-\mathrm{lap}}/{W}_{total\ \mathrm{NP}\ \mathrm{mass}})\times 100 $$

Studi Rilis Obat

Rilis 5-FU dan ß-lap dievaluasi dalam PBS (pH 7,4) dan ABS (pH 5,0) pada 37 °C menggunakan metode dialisis. Singkatnya, 1 mg ekuivalen setiap nanopartikel yang dimuat obat dimuat dalam membran dialisis dalam 1 ml buffer yang sesuai dan ujungnya ditutup. Membran dialisis yang ditutup ditempatkan dalam 25 ml buffer ABS dan PBS yang sesuai dan ditempatkan dalam mandi air goyang pada 37 °C. Sampel dikumpulkan pada interval waktu yang ditentukan dan diganti dengan volume yang sama dari buffer segar. Jumlah obat yang dilepaskan dalam buffer yang sesuai dievaluasi oleh metode HPLC seperti yang dijelaskan dalam bagian sebelumnya.

Budidaya Sel dan Uji Aktivitas NAD(P)H:Quinone Oxidoreductase 1 (NQO1)

Sel Cal33 HNSCC dibudidayakan dalam medium Eagle modifikasi Dulbecco (DMEM) yang disuplementasi dengan 10% FBS dan 1% campuran antibiotik. Sel dipertahankan dalam kondisi ambient dalam inkubator. Untuk uji aktivitas NQO1, sel Cal33 ditanam dalam plate 96-lubang pada kepadatan tanam 8 × 10³ sel per lubang dan diinkubasi selama semalam. Sel diperlakukan dengan berbagai konsentrasi ß-lap dan diinkubasi selama 24 jam. Digitonin 0,8% (50 μl EDTA 2 nM) digunakan untuk melisis sel dan uji dilakukan menggunakan menadion dan MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida) sebagai reaksi coupling substrat dan aktivitas diukur pada 620 nm. Uji dilakukan tiga kali.

Uji Keberadaan Sel In Vitro

Uji keberadaan sel ß-lap dengan konsentrasi yang meningkat dan uji keberadaan sel regimen individu dan kombinasi diuji dengan uji 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-karboximetoksifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolium (MTS). Singkatnya, sel Cal33 ditanam dalam plate 96-lubang pada kepadatan tanam 1 × 10⁴ sel per lubang dan diinkubasi selama semalam. Besok, sel diperlakukan dengan konsentrasi ß-lap yang meningkat, terpisah; sel diperlakukan dengan regimen individu dan kombinasi 5-FU dan ß-lap pada konsentrasi dasar 5, 10, dan 20 μg/ml dan diinkubasi selama 24 jam. Sel dicuci dua kali dan diperlakukan dengan larutan MTS sesuai panduan produsen. Keberadaan sel dihitung dengan mengacu pada sel yang tidak treated, dan pembaca mikropirat digunakan untuk absorbansi pada 460 nm.

Analis Western Blot

Sel yang ditanam dalam plate 6-lubang diperlakukan dengan konsentrasi ß-lap yang meningkat, terpisah; sel diperlakukan dengan regimen individu (5-FU atau ß-lap) dan kombinasi 5-FU dan ß-lap (FNQ-MSN) dan diinkubasi selama 24 jam. Sel dipanen, dilisis (buffer M-per), dan di sentrifugasi, dan sobrenatan yang berisi protein dikumpulkan. Konsentrasi protein dalam lisat sel dievaluasi menggunakan metode asam bisionikoinat (BCA). Gel poliakrilamida Bis-Tris 10% digunakan untuk memisahkan protein dan segera ditransfer ke membran fluorida polyvinylidenida (PVDF). Membran diblokir menggunakan susu non-lemak 5% yang disiapkan dalam buffer saline Tris (TBS) yang mengandung Tween 20 (TBST, pH 7,2). Antibodi primer polyclonal NQO1 kelinci (1:1000), monoclonal Bcl-2 tikus (1:1000), dan monoclonal GAPDH tikus (1:1000) diinkubasi pada membran selama semalam pada 4 °C. Membran dicuci dengan TBST dan kemudian diinkubasi dengan antibodi sekunder (antimouse atau antirabbit IgG) dengan pengenceran 1:10000. Membran lagi dicuci dengan TBST dan blot diekspos ke larutan substrat ECL dan densitas pita protein dievaluasi menggunakan pengembang foto.

Uji Apoptosis dan Hoechst

Sel Cal33 ditanam dalam plate 6-lubang pada kepadatan tanam 2 × 10⁵ sel per lubang dan diinkubasi selama semalam. Sel kemudian diperlakukan dengan regimen individu (5-FU atau ß-lap) dan kombinasi 5-FU dan ß-lap (FNQ-MSN) dan diinkubasi selama 24 jam. Sel dipanen, dicuci, di sentrifugasi, dan diformasi pellet. Sel diperlakukan dengan 2,5 μl annexin V dan 2,5 μl PI dan diinkubasi selama 15 menit dalam kondisi gelap. Sel kemudian dibuat hingga 1 ml dan dievaluasi menggunakan flow citometri sel sorting (FACS, BD, FACSverse). Total 10.000 sel dianalisis. Prosedur serupa untuk penanaman sel dan pemberian obat diikuti dan kemudian diwarnai dengan warna Hoechst 33342 (10 μg/ml) dan diinkubasi selama 10 menit. Sel dicuci dan di fix dengan paraformaldehid 4% (PFA) dan dicuci lagi. Morfologi sel diamati di bawah mikroskop fluoresens (Nikon A1, Jepang).

Efektivitas Antitumor FNQ-MSN pada Model Tumor Xenograft HNSCC

Tikus BALB/c jantan berusia 4–5 minggu dengan berat 18–20 gram diperoleh dari Pusat Fasilitas Hewan Dalam Rumah Universitas Industri Ringan Zhengzhou, Henan. Hewan dipertahankan dalam ruang pendingin dengan siklus gelap-terang 12 jam dan diberikan akses bebas ke pakan dan air. Semua protokol hewan disetujui oleh Komite Etika Universitas Industri Ringan Zhengzhou, Henan. Untuk membentuk model xenograft, 1 × 10⁷ sel Cal33 dalam 150 μl medium budidaya diinokulasi pada pinggul kanan tikus secara subkutan. Ketika ukuran tumor rata-rata mencapai 80–100 mm3, tikus dibagi secara acak ke dalam 5 grup untuk kontrol, 5-FU, ß-lap, 5-FU+ß-lap, dan FNQ-MSN, masing-masing dengan 8 tikus per grup. 5-FU diberikan pada dosis tetap 5 mg/kg dan ß-lap pada dosis tetap 25 mg/kg dan diberikan 3 kali dengan jeda 3 hari untuk setiap injeksi vena ekor. Berat tikus dan volume tumor secara teratur dipantau selama 18 hari. Volume tumor dihitung menggunakan rumus

$$ V\ \left({\mathrm{mm}}^3\right)={\mathrm{Lebar}}^2\ \left({\mathrm{mm}}^2\right)\times \mathrm{Panjang}\ \left(\mathrm{mm}\right)/2 $$

Studi saat ini tidak mengamati kematian tikus karena pemuatan sel tumor dan semua hewan di eutanasi dengan CO₂ kemudian diubah dengan pengocokan leher pada akhir studi.

Analisis Statistik

Beberapa grup dibandingkan menggunakan analisis variansi dua arah (ANOVA). Tingkat signifikansi p < 0,05 dianggap signifikant dan semua data disajikan sebagai rata-rata ± deviasi standar kecuali disebutkan secara khusus dalam eksperimen yang sesuai.

Hasil dan Pembahasan

Persiapan Nanopartikel Silika Mesoporos yang Didukung Lapisan Lipid Dimuat 5-FU/ß-lap

Dalam studi ini, kami telah menyesuaikan nanopartikel silika mesoporos yang stabil dengan lapisan lipid PEGylated. MSN dimuat 5-FU/ß-lap disiapkan dengan metode emulsi-sonikasi, dan kemudian MSN yang dimuat obat diperkenalkan ke dalam labu yang berisi film tipis lipid yang terdiri dari DSPE-PEG2000. Campuran di-sonikasi dan MSN yang dilapisi lipid yang mengandung 5-FU/ß-lap diperoleh (FNQ-MSN) (Gambar 1a). Efisiensi pemuatan (LE) 5-FU dan ß-lap adalah 91,5 ± 1,65% dan 92,9 ± 1,24%, masing-masing. FNQ-MSN menunjukkan 8,1 ± 1,12 wt% 5-FU dan 7,6 ± 0,95 wt% ß-lap yang menunjukkan kemampuan pemuatan (LC) yang tinggi dari pengiriman MSN. Kehadiran lapisan lipid akan mencegah rilis yang tidak diinginkan dalam sirkulasi sistemik dan sehingga mencegah toksisitas. Ukuran partikel rata-rata MSN yang dimuat obat adalah 92,1 ± 0,85 nm (PDI ~ 0,089) sementara rangkap lapisan lipid pada permukaan MSN (FNQ-MSN) meningkatkan ukuran partikel rata-rata menjadi 128,4 ± 1,24 nm (PDI ~ 0,115) yang menunjukkan kehadiran yang solid dari material lipid pada permukaan MSN (Gambar 1b). Potensial zeta berubah dari − 18,2 ± 1,22 hingga − 26,4 ± mV. Ukuran partikel kecil FNQ-MSN akan memungkinkan akumulasi yang prioritas dari pengiriman yang dimuat obat ke jaringan tumor bocor melalui efek EPR. Selain itu, permukaan PEGylated akan memberikan stabilitas yang baik dan waktu sirkulasi darah yang diperpanjang yang akan meningkatkan kesempatan FNQ-MSN di jaringan tumor. Gambar TEM menunjukkan kemiripan morfologi dengan liposom dan menyajikan bentuk bola yang sempurna yang terdistribusi seragam pada grid. Gambar TEM jelas menunjukkan lapisan luar kelabu dan inti yang lebih gelap yang menunjukkan kehadiran rangkap lipid pada permukaan MSN (Gambar 1c). Ukuran yang diamati dari TEM sesuai dengan ukuran partikel DLS dari zetasizer. MSN memiliki saluran yang teratur untuk distribusi homogen molekul obat. Properti permukaan pori adalah salah satu faktor penting dalam pemuatan stabil molekul kecil. Berbagai gaya fisik yang terlibat dalam interaksi tuan-tamu terutama mencakup gaya hidrofobik dan gaya interaksi van der Waals. Kemampuan pemuatan obat yang lebih tinggi akan memberikan konsentrasi seluler yang lebih tinggi dan efisiensi pembunuhan yang lebih tinggi di situs tumor. FNQ-MSN menunjukkan stabilitas yang baik dalam medium PBS dan ukuran partikel tetap tidak berubah selama periode studi hingga 30 hari. Stabilitas yang ditingkatkan sistem pengiriman dan kemampuan pemuatan yang tinggi dari sistem pengiriman akan meningkatkan distribusi biologis dan efisiensi dalam pengobatan tumor.

Rilis Obat In Vitro

Rilis obat in vitro 5-FU dan ß-lap dari FNQ-MSN diteliti dalam PBS dan ABS (Gambar 2). Seperti yang ditunjukkan, dua tren rilis yang berbeda diamati pada pH 7,4 dan pH 5,0. Misalnya, 25% 5-FU dilepaskan dalam 24 jam pada pH 7,4 dibandingkan dengan ~ 40% rilis obat dalam 24 jam pada pH 5,0. Secara serupa, 20% dan 30% ß-lap dilepaskan pada pH 7,4 dan pH 5,0, masing-masing. Kinetika rilis identik selama periode studi dengan 50% 5-FU dilepaskan dalam buffer alkalik dan 80% rilis obat pada pH 5,0 setelah 72 jam periode studi. Rilis obat responsif pH dalam kondisi asam menguntungkan untuk pengobatan kanker. Tidak ada fenomena rilis mendadak yang diamati dalam kedua kondisi pH terutama dipertimba kepada kehadiran lapisan DSPE-PEG yang mengontrol rilis obat dari FNQ-MSN selama periode studi. Perbedaan yang signifikan dalam rilis obat diamati antara kondisi pH 7,4 dan pH 5,0. Pada kondisi pH 7,4, PEG-b-DSPE menunjukkan properti lapisan stealth yang tinggi sehingga mencegah rilis senyawa yang dikapsulasi. Hasil saat ini menunjukkan bahwa rilis obat dipercepat pada pH 5,0, mengindikasikan penurunan lapisan pelindung di sekitar permukaan MSN. Tingkat rilis obat yang sensitif pH, yang memastikan rilis obat maksimum di dalam sel kanker, dapat meningkatkan efektivitas antitumor dan mengurangi toksisitas yang tidak diinginkan pada jaringan normal. Kemungkinan bahwa kehadiran elemen responsif pH, FNQ-MSN dapat menghasilkan pengelupasan lapisan lipid pada MSN sehingga menghasilkan rilis yang ditingkatkan dalam kondisi pH lebih rendah.

Sensitivitas NQO1 terhadap ß-lap

Karena üregulasi NQO1 dalam banyak sel kanker termasuk HNSCC terkait dengan prognosa buruk dan hasil terapeutik yang buruk, obat yang menargetkan NQO1 dapat menjadi strategi potensial menuju pengobatan kanker [24]. NQO1 überekspresi pada level yang berkisar dari 100- hingga 200 kali lipat dalam karsinoma sel sekam dibandingkan dengan yang terkait dengan jaringan normal. Oleh karena itu, pengaruh ß-lap terhadap aktivitas enzim NQO1 diteliti dalam sel Cal33. Seperti yang ditunjukkan, ß-lap menunjukkan inhibi NQO1 aktivitas enzim yang bergantung pada konsentrasi dalam sel Cal33 (Gambar 3a). Secara menarik, efek inhibi yang signifikan diamati pada dosis 20–50 μg/ml ß-lap. Selanjutnya, potensi inhibi ß-lap terhadap protein NQO1 diteliti lebih lanjut melalui analis western blot (Gambar 3b). Hasil secara jelas mengungkapkan penurunan yang signifikan dalam protein NQO1 dalam sel kanker seiring peningkatan konsentrasi ß-lap. Sekitar, 80% inhibi NQO1 diamati pada 100 μg/ml ß-lap. Obat bioaktivasi NQO1 seperti ß-lap dimetabolisme oleh NQO1 dan membentuk senyawa hidrokuinon tidak stabil yang segera berubah kembali ke komponen asli yang menghasilkan 1 oksidasi satu elektron dan mengonsumsi 2 O²⁻. Ini akan menciptakan siklus redoks sia-sia di mana 1 molekul ß-lap akan menghasilkan 130 mol superoxide dengan biaya mengonsumsi 60–70 mol NAD(P)H6. Radikal superoxide (O2.−) yang terbentuk akan diubah menjadi peroksida hidrogen (H2O2−) dan akan menyebabkan apoptosis sel dan kematian sel [25].

Efek Anti-Kanker In Vitro FNQ-MSN pada Sel HNSCC

Efek anti-kanker in vitro ß-lap pada sel Cal33 diteliti dengan uji MTT. Hasil menunjukkan bahwa ß-lap menunjukkan penurunan yang bergantung pada konsentrasi pada keberadaan sel (Gambar 4a). Secara menarik, penurunan yang signifikan dalam keberadaan sel diamati pada konsentrasi 50 μg/ml. Untuk eksperimen lebih lanjut, 20 μg/ml dipilih (di bawah nilai IC50 ß-lap). Selanjutnya, efek potensiasi ß-lap pada 5-FU diteliti pada 3 konsentrasi berbeda (5, 10, dan 20 μg/ml). Seperti yang ditunjukkan, kombinasi 5-FU+ß-lap menghasilkan keberadaan sel yang lebih rendah; yang paling menonjol, FNQ-MSN menunjukkan keberadaan sel yang jauh lebih rendah dibandingkan dengan obat tunggal atau kombinasi fisik (Gambar 4b). Misalnya, 5-FU dan ß-lap menunjukkan keberadaan sel sebesar 35,7% dan 70,2% sementara 5-FU+ß-lap menunjukkan 26,5% dan FNQ-MSN menunjukkan 13,1%, masing-masing. Hasil secara jelas menunjukkan bahwa efek sitotoksik 5-FU secara signifikan meningkat ketika digabungkan dengan ß-lap. Perlu dicatat bahwa FNQ-MSN lebih efektif dibandingkan dengan 5-FU+ß-lap dikaitkan dengan internalisasi yang lebih baik dan rilis yang terkontrol dari terapeutik yang dimuat dari sistem pengiriman. Hasil secara jelas mengungkapkan efek inhibi ß-lap terhadap aktivitas enzimatik NQO1 dan level protein dan memotensiasi efek anti-kanker 5-FU yang menghasilkan hasil terapeutik yang ditingkatkan dalam pengobatan HNSCC.

Peran FNQ-MSN dalam Jalur Sinyal: Analis Western Blot

Mekanisme efek sitotoksik yang dimediasi ß-lap diteliti lebih lanjut melalui analis western blot. Seperti yang ditunjukkan, ß-lap menghasilkan penurunan dalam pita protein NQO1 dibandingkan kontrol; namun, penurunan yang paling menonjol dalam level NQO1 diamati dalam grup sel yang treated FNQ-MSN (Gambar 4c). Peningkatan kemosensitivitas Cal33 yang diinduksi ß-lap dengan meningkatkan apoptosis sel dievaluasi melalui level protein Bcl-2. Keluarga Bcl-2 berperan penting dalam mengatur homeostasis sel dan mengontrol proliferasi serta kematian sel kanker. Proses penurunan Bcl-2 dan kenaikan Bax menghasilkan rilis sitokrom C ke sitosol yang akan memicu seluruh kaskade kaspase yang mengakibatkan kematian sel [26]. Hasil secara jelas menyoroti bahwa kombinasi 5-FU dan ß-lap (FNQ-MSN) secara signifikan menurunkan Bcl-2 yang mengindikasikan efek anti-kanker yang ditingkatkan dalam sel kanker Cal33.

Analisis Apoptosis HNSCC

Setelah analisis keberadaan sel, efek apoptosis obat individu dan kombinasi pada sel Cal33 dievaluasi dengan flow citometer setelah warna annexin V/PI (Gambar 5). Efek apoptosis obat individu 5-FU (10 μg/ml) atau ß-lap (30 μg/ml) tidak menghasilkan apoptosis sel kanker yang signifikan; namun, 5-FU+ß-lap menghasilkan peningkatan dramatis dalam proporsi apoptosis sel kanker. Pentingnya, FNQ-MSN menghasilkan lebih dari 60% apoptosis sel (apoptosi awal dan akhir) yang menunjukkan efek terapeutik yang unggul dari regimen kombinasi berbasis pengiriman. Efek apoptosis lebih dikonfirmasi melalui warna Hoechst 33342. Seperti yang ditunjukkan, sel yang treated dengan FNQ-MSN menghasilkan jumlah sel yang lebih tinggi yang mengalami apoptosis, kondensasi nukleus, dan fitur fragmentasi dibandingkan dengan 5-FU atau ß-lap sendirian (Gambar 6). Selama proses apoptosis, sel menyusut tanpa mengalami kerusakan pada membran sel luar dan menghasilkan kondensasi kromatin dengan pembentukan tubuh apoptosis yang meningkat.

Uji Hidup/Mati

Efek anti-kanker obat individu dan kombinasi diteliti lebih lanjut melalui uji Hidup/Mati. Sel yang treated dianalisis dengan warna Calcein AM dan bromida etidium sebagai penanda masing-masing sel hidup dan mati (Gambar 7). Seperti yang ditunjukkan, sel yang tidak treated diwarnai dengan 100% fluoresensi hijau. Obat individu, 5-FU (10 μg/ml) atau ß-lap (30 μg/ml) meskipun menunjukkan sel yang diwarnai fluoresensi merah sedikit; namun, mayoritas sel menunjukkan fluoresensi hijau yang menunjukkan kematian sel yang terbatas. Kematian sel yang luar biasa diamati dalam sel kanker yang treated FNQ-MSN seperti yang ditunjukkan oleh fluoresensi merah yang dominan dan lebih sedikit sel yang diwarnai fluoresensi hijau. Efek anti-kanker yang lebih tinggi FNQ-MSN dipertimba kepada aktivitas sinergis 5-FU dan ß-lap dalam sel kanker dan kemampuan ß-lap untuk meningkatkan kemosensitivitas 5-FU.

Efektivitas Antitumor In Vivo FNQ-MSN terhadap Model Xenograft HNSCC

Untuk mengevaluasi lebih lanjut efektivitas regimen kombinasi dalam model hewan, xenograft HNSCC disiapkan dan diberikan 5 mg/kg 5-FU dan 10 mg/kg ß-lap, masing-masing. Grade farmasi ß-lap adalah ARQ761 yang saat ini berada dalam uji klinis fase I untuk pengobatan maliganitas metastatic. ß-lap telah menetapkan batas untuk dosis maksimum yang dapat ditoleransi pada manusia menurut studi praliklinis [27]. Dengan mengingat ini, kami telah memilih dosis 10 mg/kg ß-lap secara optimal untuk studi in vivo. Seperti yang ditunjukkan, tidak ada penurunan yang signifikan dalam volume tumor dengan pemberian individu 5-FU dan ß-lap dibandingkan dengan kontrol yang tidak treated (Gambar 8a). Penurunan yang signifikan dalam volume tumor diamati dengan campuran fisik 5-FU+ß-lap; namun, pengobatan kombinasi 5-FU dan ß-lap berbasis pengiriman (FNQ-MSN) secara signifikan menunda pertumbuhan tumor dan memperpanjang hidupan tikus xenograft yang membawa tumor. Grafik volume tumor FNQ-MSN dapat dibagi menjadi dua bagian; pertumbuhan volume tumor yang tidak signifikan diamati hingga hari 9 sementara tumor secara signifikan meningkat setelah hari 9 hingga hari 18, meskipun, volume tumor keseluruhan jauh lebih kecil dibandingkan dengan kontrol atau grup lain. Kekhawatiran toksisitas regimen individu dan kombinasi dievaluasi dalam hal berat badan (Gambar 8b). Seperti yang ditunjukkan, campuran fisik 5-FU+ß-lap menghasilkan toksisitas parah yang diwakili oleh penurunan berat badan lebih dari 10% sementara 5-FU menghasilkan 5% berat badan. Seperti yang diharapkan, FNQ-MSN tidak menghasilkan penurunan berat badan yang mengindikasikan keunggulan unik dari sistem pengiriman berbasis lipid-MSN. Efek antitumor yang ditingkatkan FNQ-MSN dipertimba kepada efek inhibi ß-lap terhadap enzim dan protein NQO1 yang pada gilirannya meningkatkan kemosensitivitas 5-FU dan menghasilkan efek anti-kanker sinergis dalam tumor manusia Cal33, kedua, lapisan lipid yang melapisi MSN melindungi obat selama sirkulasi sistemik dan mungkin dilepaskan secara terkontrol dalam jaringan tumor, ketiga, PEGylation dari nanokarier mungkin memperpanjang waktu sirkulasi darah yang memungkinkan akumulasi yang prioritas dalam jaringan tumor melalui efek EPR [28, 29]. MSN yang di-PEGylated terutama tertangkap dalam RES hati, limpa, dan paru, mencakup lebih dari 80% dosis yang diberikan. Modifikasi PEG dari MSN secara jelas mengurangi laju klarifikasi MSN dalam organ, menunjukkan bahwa NP yang di-PEGylated lebih sulit untuk dikeluarkan dari organ RES terlepas dari bentuk partikel [30, 31]. Secara keseluruhan, studi in vivo pada model HNSCC menawarkan "bukti konsep" bahwa kombinasi yang efektif 5-FU+ß-lap dalam nanokarier stabil dapat meningkatkan efektivitas terapeutik dalam tumor sambil mengurangi efek toksis yang terkait.

Ketersediaan Data dan Bahan

Semua data yang dihasilkan atau dianalisis selama studi ini disertakan dalam artikel yang diterbitkan ini dan berkas informasi pelengkapnya.

Singkatan

5-FU:

5-Fluorouracil

EPR:

Efek permeasi dan retensi yang ditingkatkan

FNQ-MSN:

Nanopartikel silika mesoporos dimuat 5-FU/ß-lap

HNSCC:

Karsinoma sel sekam kepala dan leher

MSN:

Nanopartikel silika mesoporos

NQO1:

NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1

ß-lap:

ß-lapachone