Toksititas Komparatif Nanopartikel dan Nanobola Kobalt Ferrit Dilapisi PEG

Abstrak

Kami menyajikan studi komparatif tentang toksititas nanopartikel dan nanobola kobalt ferrit yang dilapisi polietilena glikol (PEG). Nanopartikel disiapkan dengan metode hidrotermal sementara nanobola disiapkan dengan teknik solvothermal. Permukaan nanomaterial berhasil dimodifikasi dengan polietilena glikol. Untuk meneliti morfologi sampel yang disiapkan, digunakan difraksi sinar X (XRD), spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR), spektroskopi Raman, analisis termogravimetri (TGA), dan teknik mikroskop elektron. Analisis struktural mengonfirmasi pembentukan nanopartikel kobalt ferrit polikristal dengan diameter dalam rentang 20–25 nm dan nanobola dalam rentang 80–100 nm, masing-masing. Tikus Kunming SPF (perempuan, usia 6–8 minggu) digunakan untuk menyelidiki toksititas yang diinduksi oleh nanopartikel dan nanobola kobalt ferrit pada berbagai organ tikus. Studi distribusi bio, indeks biokimia, penilaian histopatologis, faktor inflamasi, tingkat oksidasi dan antioksidasi, dan uji sitotoksitas dilakukan untuk menilai toksititas yang diinduksi oleh nanopartikel dan nanobola kobalt ferrit pada tikus. Ditemukan bahwa nanobola kobalt ferrit lebih toksik daripada nanopartikel dan kumin terbukti menjadi agen penyembuh yang baik untuk toksititas yang diinduksi oleh nanomaterial kobalt ferrit dilapisi PEG pada tikus.

Pendahuluan

Dalam beberapa tahun terakhir, material magnetik nano telah menerima minat besar baik dalam penelitian dasar maupun aplikasi teknologi. Aplikasi ini termasuk, tetapi tidak terbatas pada, kendaraan pengiriman obat [1,2,3], citrasi resonansi magnetik (MRI) [4,5,6], hipertermia [7,8,9], biosensor [10], pemisahan sel [11], pemisahan protein [11, 12], magnetofeksi gen [13,14,15], dan pencemaran serta rehabilitasi lingkungan [16, 17]. Kobalt ferrit, sebagai material magnetik keras, digunakan sebagai agen kontras untuk MRI, pengiriman obat yang ditargetkan, dan mediator pemanas dalam hipertermia [18,19,20,21,22,23]. Meskipun kobalt ferrit digunakan dalam aplikasi biomedis, namun memiliki keterbatasan tertentu seperti toksititas tinggi karena jumlah kobalt yang signifikan yang melepas ke dalam larutan, aglomerasi dalam larutan, dan aksesibilitas permukaan yang buruk ketika surfaktan digunakan. Oleh karena itu, masalah ini diatasi dengan penggunaan modifikasi permukaan dengan bahan yang biokompatibel, non-toksik, stabil dalam air, dan dispersi [24,25,26,27,28]. Selain itu, pembuatan kobalt ferrit mudah dan hemat biaya dengan komposisi, bentuk, dan ukuran yang dapat disesuaikan untuk aplikasi tertentu. Ada berbagai teknik yang diadopsi untuk sintesis kobalt ferrit berukuran nano, termasuk mekanokimia [29], sonokimia [30], presipitasi bersama [31, 32], mikro-emulsi [33], dan lainnya [34,35,36,37,38]. Secara serupa, teknik lain termasuk metode ramah lingkungan satu tahapan diadopsi untuk pembuatan klaster tembaga fluorescein yang dapat disesuaikan menggunakan kumin sebagai templat [39]. Kekurangan besar sebagian besar teknik ini adalah kristalinitas rendah dari bahan yang disiapkan, yang pada gilirannya mengarah pada deteriorasi signifikan dari karakteristik magnetik. Dalam hal ini, teknik hidrotermal [40] dan solvothermal [41] adalah teknik paling efektif dan efisien untuk sintetisasi kobalt ferrit dengan morfologi dan kristalinitas yang terkontrol.

Dalam literatur, berbagai nanomaterial seperti nanopartikel perak (Ag NPs) telah dilaporkan digunakan untuk perawatan antimikroba dan penyakit menular yang terkait serta digunakan sebagai nanokendaraan untuk pengiriman obat dan perawatan berbagai penyakit [42]. Dalam artikel ulasan lain, ferrat telah dilaporkan digunakan untuk eliminasi berbagai spesies kimia dan biologi dari air limbah [43]. Dalam aplikasi biomedis nanomaterial kobalt ferrit, masalah utama adalah akumulasi kobalt ferrit dalam organ, yang mengakibatkan toksititas dalam tubuh yang memerlukan penghapusan segera dari nanomaterial yang terkumpul dari organ dan membutuhkan penyembuhan dari kerusakan yang diinduksi oleh kobalt ferrit. Beberapa peneliti telah mempelajari obat anti-inflamasi dan menemukan bahwa obat-obatan ini dapat mengurangi toksititas yang diinduksi oleh nanomaterial [44, 45]. Kumin dengan karakteristik antioksidan, antimutasi, anti-tumor, dan karsinogenik dapat digunakan sebagai agen penyembuh untuk toksititas yang diinduksi oleh nanomaterial kobalt ferrit [46,47,48]. Ia memiliki kemampuan untuk digunakan sebagai pemblokir TNF dari in vitro dan in vivo dengan membuat ikatan langsung dengan TNF [49].

Tujuan dari karya ini adalah untuk memfabriksikan nanopartikel dan nanobola kobalt ferrit dilapisi polietilena glikol (PEG) di laboratorium dengan morfologi yang terkontrol. Berbagai dosis nanomaterial disuntik secara intravenus ke dalam tikus dan analisis darah, distribusi bio, pewarnaan HE, dan studi kelangsungan sel dilakukan untuk menilai toksititas dari nanomaterial ini. Perbandingan toksititas nanopartikel dan nanobola kobalt ferrit dilakukan dan kumin digunakan sebagai agen penyembuh untuk toksititas yang diinduksi oleh nanobola kobalt ferrit pada tikus. Diberikan bahwa nanobola kobalt ferrit lebih toksik daripada nanopartikel karena luas permukaan yang diperluas, yang membuatnya lebih toksik dan lebih reaktif daripada nanopartikel. Sejauh kami tahu, ini adalah studi detail pertama dari jenis ini yang belum dilakukan sebelumnya.

Bahan dan Metode

Persiapan Nanomaterial

Untuk persiapan nanopartikel kobalt ferrit dilapisi PEG, kami mengadopsi teknik hidrotermal [40, 47]. Untuk tujuan ini, larutan klorida kobalt (0,2 M) dan nitrat besi (0,4 M) disiapkan secara terpisah dalam 25 mL air deionisasi (DI) masing-masing dan kemudian larutan ini dicampur dengan larutan air polietilena glikol (2,5 mM) dan natrium hidroksida (3 M), masing-masing. Campuran kemudian diaduk selama 20 min dan dituangkan ke dalam autoclave stainless steel (SS), yang dipanaskan pada 180 °C selama 6 jam. Setelah proses selesai, campuran didinginkan ke suhu ruang dan kemudian larutan dicuci 2–3 kali menggunakan air DI dan etanol untuk menghilangkan semua pengotor yang tidak diinginkan dari campuran. Campuran dikeringkan pada sekitar 80 °C selama semalaman dalam oven dan kemudian digiling menjadi bubuk halus untuk mendapatkan nanopartikel kobalt ferrit yang diinginkan.

Untuk persiapan nanobola kobalt ferrit dilapisi PEG, teknik solvothermal digunakan. Untuk tujuan ini, klorida kobalt heksahidrat dilarutkan dalam 40 mL etilena glikol (2,5 mM) yang diikuti dengan penambahan 1,35 g klorida besi heksahidrat dan 1 g polietilena glikol (PEG). Campuran kemudian diaduk selama sekitar 30 min dan kemudian diam dalam autoclave SS dilapis Teflon. Autoclave kemudian dipanaskan pada 200 °C selama 8 jam dan setelah reaksi selesai, didinginkan ke suhu ruang. Campuran dicuci dengan air deionisasi dan etanol dan kemudian dikeringkan pada 80 °C selama semalaman dalam oven. Akhirnya, campuran digiling menjadi bubuk halus untuk mendapatkan nanobola kobalt ferrit dilapisi PEG dengan diameter dalam rentang 80–100 nm. Morfologi nanomaterial yang disiapkan diteliti dengan difraksi sinar X (XRD) mengikuti metode yang digunakan dalam Ref. [50], mikroskop elektron pemindai dan transmisi (SEM dan TEM) seperti yang digunakan dalam Ref. [50, 51], spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR) suhu ruang untuk penentuan grup fungsional dalam kobalt ferrit serupa dengan Ref. [51], spektroskopi Raman, dan analisis termogravimetri (TGA) seperti yang digunakan dalam Ref. [52].

Pembelahan Radioaktif Nanomaterial

Pembelahan radioaktif nanopartikel dan nanobola kobalt ferrit dilapisi PEG dilakukan dengan ⁹⁹ᵐTc menggunakan klorida stannous sebagai agen pengurang [53,54,55]. Untuk tujuan ini, eluat generator ⁹⁹ᵐTcO₄ segar (50 µL dengan aktivitas ~ 4 mCi) disiapkan dengan menambahkannya ke dalam 30 µL suspensi SnCl₂ (1 mg/mL dalam 0,5 N HCl). Dengan bantuan larutan NaHCO₃ (1 M), pH suspensi disesuaikan dalam rentang 8–10. Larutan nanopartikel dan nanobola (40 µL masing-masing) yang mengandung ~ 0,4%wt kobalt ferrit dicampur dengan suspensi klorida stannous (50 µg), asam askorbat (10 mg/mL), dan ⁹⁹ᵐTcO₄. Campuran kemudian diaduk pada 10.000 rpm selama 25 menit pada 80 °C. Untuk pengukuran yang akurat, hitungan radioaktif dicatat dalam 24 jam karena umur paruh ⁹⁹ᵐTc yang pendek (~ 6 jam). Supernatan kemudian dicanting setelah sentrifugasi dan sisa bahan diidentifikasi sebagai nanopartikel dan nanobola kobalt ferrit dilapisi PEG-⁹⁹ᵐTc. Kromatografi kertas digunakan untuk mengukur hasil radioaktif senyawa yang diberi label, yang lebih dari 65% yang mencerminkan distribusi bio sebenarnya dari nanomaterial pada tikus in vivo.

Distribusi Bio Nanomaterial

Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1, tikus Kunming SPF (perempuan, usia 6–8 minggu, berat 18–20 g) diperoleh dari Pusat Laboratorium Ilmu Kedokteran, Universitas Lanzhou, China. Semua tikus dijaga dalam kandang di bawah sistem kontrol suhu yang dipertahankan pada 21–22 °C dan lampu dinyalakan dari 08:00 hingga 20:00. Akses bebas ke makanan dan air ledengan diberikan kepada tikus dan mereka ditangani sesuai dengan protokol Formulir Perawatan Hewan Laboratorium yang diformulasikan oleh Masyarakat Nasional Penelitian Medis dan pedoman Institusi Kesehatan Nasional AS. Tikus secara acak dibagi menjadi beberapa kelompok dengan setiap kelompok berisi 5 tikus dan kemudian disuntik secara intravenus dengan larutan nanopartikel dan nanobola kobalt ferrit dilapisi PEG-⁹⁹ᵐTc dan dibunuh setelah 1 jam, 6 jam, 16 jam, dan 24 jam, masing-masing. Jantung, paru-paru, hati, limpa, dan ginjal segera diseksi, dibungkus dalam foil, ditimbang dan kemudian radioaktivitas ⁹⁹ᵐTc dalam setiap jaringan diukur menggunakan detektor hitung gamma. Distribusi bio nanomaterial pada berbagai organ tikus disajikan dalam persen dosis suntikan per gram jaringan basah (yaitu, % ID/g).

Diagram skematis model eksperimental

Pewarnaan Hematoxylin dan Eosin

Untuk pewarnaan hematoxylin dan eosin (HE), lilin parafin diiris ke dalam xilena untuk delem dan proses diulang dua kali selama sekitar 10 menit masing-masing. Hidrasi sampel dilakukan dengan memindahkan slide melalui berbagai larutan etanol dengan konsentrasi 100% etanol, 95% etanol, dan 70% etanol masing-masing selama 2 menit. Bilas slide dalam air ledengan berjalan pada suhu ruang selama sekitar 2 menit dan ketika proses selesai, inti sel diwarnai dengan larutan pewarna hematoxylin pada 60 °C selama 10 detik dan kemudian pada suhu ruang selama 1 menit dan slide kemudian diletakkan di bawah air ledengan berjalan pada suhu ruang selama sekitar 5 menit. Warnai sampel dalam larutan eosin Y kerja selama 2 menit dan kemudian dehidrasi sampel terlebih dahulu dengan merendam dalam 95% etanol dan kemudian dalam 100% etanol masing-masing selama 2 menit. Sitoplasma diwarnai selama 7 detik dengan merendam dalam larutan pewarna eosin selama 15 detik. Setelah dikeluarkan, sitoplasma dicuci dan didehidrasi dengan etanol murni dua kali selama 1 menit masing-masing. Jaringan kemudian dibuat transparan dengan xilena selama 15 detik dan sitoplasma diperiksa dan kemudian difoto dengan segel gumpal netral. Pemeriksaan mikroskopik jaringan dilakukan menggunakan mikroskop Olympus Microphot-CX41 yang dilengkapi kamera digital.

Indeks Biokimia dan Faktor Inflamasi

Dua ratus lima puluh mikrogram nanopartikel dan nanobola kobalt ferrit dilapisi PEG disuntik secara intravenus ke dalam tikus kelompok paparan sementara kelompok kontrol diperlakukan dengan larutan garam normal 0,9% dan semua tikus kemudian dibunuh setelah 24 jam. Darah dikumpulkan dari tikus dan difugasi selama sekitar 10 menit untuk mendapatkan serum darah. Konten serum TB, ALT, AST, BUN, CREA, dan Cys-C diukur dengan imunoasay enzim terikat (ELISA) dan western blot. Enzim yang terkait dengan hati, IL-6, IL-8, dan TNF-α, memainkan peran kunci dalam respons inflamasi yang diinduksi oleh nekrosis. Biasanya, tingkat tinggi ekspresi ini terjadi ketika organ merespons inflamasi.

Uji Kelangsungan Sel MTT

Potensi sitotoksik nanopartikel dan nanobola kobalt ferrit dilapisi PEG ditentukan oleh MTT, uji warna untuk mengevaluasi aktivitas metabolik sel. Sel epitel manusia L-132 dan sel monosit manusia THP-1 yang dibeli dari Shanghai, China, diekspos pada berbagai konsentrasi nanopartikel dalam rentang 30–125 μg/mL dan nanobola dalam rentang 50–250 μg/mL dan densitas optik diukur pada 590 nm untuk berbagai uji menggunakan sistem spektrofotometer mikroplate (UNICO WFZ UV-2000, Shanghai, China). Sel L-132 dipilih karena inhalasi adalah jalur utama paparan nanomaterial dan sel THP-1 digunakan karena peran mereka dalam membersihkan materi asing. Dalam setiap uji, sel yang tidak diobati dievaluasi sebagai kontrol negatif. Hemmian aktivitas enzim diamati dalam sel, yang dibandingkan dengan sel yang tidak diobati (kontrol negatif) dan nilai diturunkan dalam bentuk rasio kontrol negatif dan dipetakan terhadap konsentrasi nanopartikel dan nanobola.

Analisis Statistik

Setiap titik data dilaporkan sebagai nilai mean (±sem) dari eksperimen yang dilakukan tiga kali. Signifikansi perbedaan dievaluasi menggunakan analisis variansi dan diagram statistik digambar dengan bantuan perangkat lunak Origin dan Microsoft Excel.

Hasil dan Pembahasan

Analisis Struktural

Analisis struktural (XRD, FTIR, Raman, dan TGA) dari nanomaterial yang disiapkan ditunjukkan pada Gambar 2. Hasil XRD pada Gambar 2a mewakili kobalt ferrit yang dilapisi dan tidak dilapisi pada skala nano, yang mengonfirmasi bahwa kobalt ferrit berhasil difabriksikan. Posisi dan intensitas relatif semua puncak yang diamati dalam data XRD mengonfirmasi sifat kristal kobalt ferrit. Tidak ada puncak tambahan yang diamati, yang menunjukkan kemurnian kobalt ferrit yang disiapkan. Ukuran kristal rata-rata kobalt ferrit ditentukan dengan menggunakan persamaan Scherrer [56], yang ditemukan ~ 24 nm. Spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR) dilakukan untuk menyelidiki distribusi kation (nikel, kobalt, dan besi) dalam kobalt ferrit. Gambar 2b menunjukkan data FTIR yang dikumpulkan pada suhu ruang. Secara teoretis, kobalt ferrit memiliki dua pita penyerapan kuat (ʋ₁ dan ʋ₂) bersama dengan beberapa lainnya yang muncul dalam rentang 400–600 cm⁻¹. Semua puncak ini jelas diindikasikan dalam data kami yang ditunjukkan pada Gambar 2b. Dalam data FTIR, ʋ₁ sesuai dengan gerangan intrinsik logam pada lokasi tetrahedral, sedangkan ʋ₂ sesuai dengan gerangan ion logam pada lokasi oktahedral [57,58,59]. Puncak yang muncul dalam FTIR pada 3421 cm⁻¹ sesuai dengan polietilena glikol (PEG) yang menunjukkan ikatan berhasil pada permukaan kobalt ferrit. Analisis Raman kobalt ferrit yang dikumpulkan pada suhu ruang ditunjukkan pada Gambar 2c, yang menunjukkan 5 puncak berbeda yang dapat dilihat dalam data. Puncak yang muncul di bawah 700 cm⁻¹ adalah puncak karakteristik utama (mode A₁g) kobalt ferrit yang sesuai dengan gerangan ion oksigen sepanjang ikatan Fe–O pada lokasi tetrahedral [60], sedangkan puncak lainnya yang muncul dalam data juga termasuk kobalt ferrit. Hal ini mengonfirmasi pembuatan berhasil PEG-kobalt ferrit dalam eksperimen kami. Gambar 2d menunjukkan hasil TGA dari sampel yang dikumpulkan dalam rentang suhu 50–380 °C yang mengindikasikan bahwa kobalt ferrit kehilangan berat pada berbagai suhu. Juga terlihat dalam analisis TGA bahwa stabilitas termal PEG relatif rendah sedangkan stabilitas PEG-kobalt ferrit tinggi.

a Hasil XRD dari kobalt ferrit. b Spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR) yang digunakan dalam rentang 500–4000 cm⁻¹. c Spektrum Raman suhu ruang dari sampel yang dikumpulkan dalam rentang frekuensi 190–1000 cm⁻¹. d Analisis termogravimetri (TGA) dari CoFe₂O₄ dilapisi PEG yang dikumpulkan dalam rentang suhu 50–400 °C

Analisis mikroskop elektron dari sampel ditunjukkan pada Gambar 3. Gambar 3(a) dan (b) menunjukkan gambar SEM dari nanopartikel dan nanobola kobalt ferrit dilapisi PEG, masing-masing, sedangkan Gambar 3(c) dan (d) menunjukkan analisis TEM dari nanobola dan nanopartikel, masing-masing. Hasil ini menunjukkan bahwa ukuran rata-rata nanopartikel sekitar 25 nm dan ukuran nanobola 80–100 nm. Dari gambar TEM nanobola, terlihat jelas bahwa nanobola terdiri dari sejumlah besar nanopartikel yang lebih kecil dengan luas permukaan besar, sehingga membuatnya mesoporous yang sangat diinginkan untuk aplikasi medis nanomaterial sebagai kendaraan pengiriman obat. Semua analisis struktural ini mengonfirmasi pembentukan berhasil nanopartikel dan nanobola kobalt ferrit murni dilapisi PEG.

SEM nanopartikel kobalt ferrit (a) dan nanobola (b). Gambar TEM nanopartikel kobalt ferrit dilapisi PEG (c) dan nanobola (d), dikumpulkan pada resolusi yang berbeda

Studi Distribusi Bio

Secara kuantitatif, distribusi bio nanopartikel dan nanobola kobalt ferrit dilapisi PEG dalam darah, jantung, hati, limpa, paru-paru, dan ginjal setelah berbagai interval waktu (1, 6, 16, dan 24 jam) ditunjukkan pada Gambar 4. Kehadiran kobalt ferrit dalam darah dan organ lain dievaluasi dalam 24 jam setelah suntikan intravenus larutan kobalt ferrit dilapisi PEG-⁹⁹ᵐTc (nanopartikel dan nanobola). Dalam kasus nanobola yang ditunjukkan pada Gambar 4(a), retensi darah kobalt ferrit ditemukan sebesar 6,5 ± 0,33% ID/g setelah 1 jam paparan dan kemudian menurun secara bertahap dalam interval waktu berikutnya (yaitu, 6, 16, dan 24 jam). Terlihat bahwa nanobola terutama didistribusikan dalam jantung, hati, limpa, paru-paru, dan ginjal; namun, sebagian besar terutama terakumulasi dalam limpa. Selain itu, distribusi bio nanobola dalam berbagai organ ditemukan paling tinggi setelah jam pertama dan kemudian menurun secara bertahap dan tetap di bawah 30% setelah 6 jam. Dalam kasus nanopartikel kobalt ferrit, retensi darah nanopartikel sekitar 2,8 ± 0,14% ID/g setelah 1 jam paparan, yang mengindikasikan pembersihan relatif cepat materi radioaktif dari aliran darah tubuh dan kemudian menurun dengan berjalannya waktu seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4(b). Nanopartikel didistribusikan dalam jantung, hati, limpa, paru-paru, dan ginjal dengan konsentrasi maksimum dalam limpa dan hati. Terjelas dari gambar bahwa distribusi bio nanopartikel dalam darah dan organ lain paling tinggi setelah jam pertama dan kemudian menurun secara bertahap setelah 6 jam dan akhirnya mencapai nilai terendah setelah 24 jam. Jika kita membandingkan hasil distribusi bio nanobola dan nanopartikel, terlihat bahwa akumulasi/kehadiran nanobola kobalt ferrit dilapisi PEG dalam darah dan organ lain tikus lebih banyak dibandingkan dengan nanopartikel. Hal ini mungkin terkait dengan luas permukaan besar dan porositas tinggi nanobola dibandingkan nanopartikel, yang merupakan salah satu faktor kritis untuk menentukan reaktivitas interaksi nanomaterial dengan sistem biologis. Dalam kasus nanopartikel, sifat non-mesoporotiknya dengan luas permukaan spesifik rendah membuatnya lebih reaktif daripada nanobola dalam kondisi yang sama. Fitur-fitur ini mungkin telah mengurangi daya tahan yang berkepanjangan nanopartikel kobalt ferrit dilapisi PEG dalam darah dan organ lain tikus. Selain itu, nanobola menyebabkan pembentukan kompleks dengan biomolekul dan mengakibatkan peningkatan tingkat spesies radikal, meningkatkan tingkat stres oksidatif, merusak DNA sel, dan mengakibatkan stres oksidatif oleh peroksidasi lipid.

Distribusi bio PEG-CoFe₂O₄ dalam darah, jantung, hati, limpa, paru-paru, dan ginjal setelah berbagai interval (1, 6, 16, 24 jam) yang diekspos pada nanobola (a) dan nanopartikel (b)

Indeks Biokimia

Untuk mempelajari efek toksisitas nanopartikel dan nanobola kobalt ferrit dilapisi PEG pada tikus, indeks biokimia diukur dan hasilnya disajikan pada Gambar 5. Berbagai parameter termasuk ALT, AST, BUN, CREA, TB, dan Cys-C diukur untuk tikus kelompok kontrol dan paparan. Perangkat lunak SPSS digunakan untuk ekstraksi data dengan *P < 0,05 yang mewakili perubahan yang signifikan selama pengukuran. Dalam kedua nanobola dan nanopartikel, terlihat bahwa semua indeks biokimia menunjukkan perubahan yang signifikan dibandingkan dengan tikus kelompok kontrol (*P < 0,05). Dalam kasus kelompok paparan nanobola kobalt ferrit, tingkat ALT, AST, dan BUN menunjukkan perbedaan yang signifikan (*P < 0,05) dibandingkan dengan tikus kelompok kontrol, sedangkan dalam kasus kelompok paparan nanopartikel, hanya Cys-C yang menunjukkan perbedaan yang signifikan dibandingkan dengan tikus kelompok kontrol (*P < 0,05). Terlihat bahwa TB dan Cys-C yang terutama bertanggung jawab sebagai biomarker fungsi ginjal menurun secara signifikan dalam kasus nanobola. Ini menunjukkan bahwa ginjal lebih terpapar oleh paparan nanobola kobalt ferrit dilapisi PEG dibandingkan nanopartikel. AST, sebagai biomarker hati, lebih terpapar oleh paparan baik nanopartikel maupun nanobola. Ini menunjukkan bahwa paparan kobalt ferrit dapat berdampak buruk pada fungsi hati. Dari semua hasil ini, jelas bahwa nanobola kobalt ferrit dilapisi PEG menyebabkan lebih banyak kerusakan pada tikus in vivo dibandingkan nanopartikel kobalt ferrit.

Indeks biokimia dalam serum darah tikus kelompok kontrol, nanopartikel, dan nanobola. Data mewakili mean ± S.D dari dua eksperimen independen yang dilakukan tiga kali. *P < 0,01

Studi Histopatologis

Kami telah menyajikan analisis histopatologi tikus kelompok kontrol, nanopartikel, nanobola, dan pengobatan seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6. Jika kita membandingkan hasil kelompok paparan nanobola dan nanopartikel dengan tikus kelompok kontrol, terlihat bahwa nanobola kobalt ferrit dilapisi PEG menyebabkan lebih banyak kerusakan pada berbagai organ (hati, limpa, ginjal, dan paru-paru) tikus dibandingkan kelompok paparan nanopartikel. Dalam ginjal, kongestsi glomerulus terjadi bersama dengan edema ringan dan sel inflamasi interstisial terlihat dalam kasus asupan nanobola dibandingkan tikus kelompok paparan nanopartikel dan kontrol. Juga terlihat bahwa nanopartikel menunjukkan inflamasi yang lebih rendah daripada nanobola. Dalam kasus paparan nanopartikel, ditemukan bahwa paru-paru relatif kurang terpapar sedangkan dalam kasus nanobola, dinding alveolus ditemukan tebal dan fibrosis ringan terlihat. Selain itu, untuk kelompok paparan nanobola, hepatosit menunjukkan pembengkakan dan edema terjadi, sedangkan inflamasi yang relatif lebih rendah ditemukan dalam tikus kelompok paparan nanopartikel.

Bagian histologi jaringan dari berbagai kelompok (kontrol, nanopartikel, nanobola, dan pengobatan)

Faktor Inflamasi dan Tingkat Oksidasi/Antioksidasi

Tingkat ekspresi IL-6, IL-8, TNF-α, MDA, dan T-AOC diukur dan hasilnya ditunjukkan pada Gambar 7. Gambar 7a mewakili pita western blot IL-6, IL-8, dan β-actin untuk kelompok kontrol, nanopartikel, dan paparan nanobola. Tingkat protein relatif IL-6 dan IL-8 untuk kelompok kontrol, nanopartikel, dan paparan nanobola ditunjukkan pada Gambar 7b, sedangkan konten TNF-α, MDA, dan T-AOC ditunjukkan pada Gambar 7c–e dengan *P < 0,05 untuk kelompok paparan versus kelompok kontrol ± sem. Hasil mengungkapkan bahwa tingkat IL-6, IL-8, TNF-α, dan MDA untuk tikus kelompok paparan nanobola kobalt ferrit lebih tinggi daripada kelompok nanopartikel dan kedua tingkat ini lebih tinggi daripada tikus kelompok kontrol. Dalam kasus T-AOC, tingkat nanobola lebih rendah daripada paparan nanopartikel dan tikus kelompok kontrol. Semua hasil ini mengindikasikan bahwa nanopartikel dan nanobola menyebabkan inflamasi pada tikus, terutama dalam hati. Namun, nanobola mempengaruhi organ lebih banyak daripada nanopartikel. Dipahami dengan baik bahwa nanomaterial dalam tubuh menghasilkan radikal bebas oksigen (ROS), yang menyebabkan serangkaian penurunan kualitatif antioksidan, yang mengakibatkan kerusakan oksidasi jaringan biologis yang berdampak buruk pada organisme seluler [61, 62]. Selain itu, ketika tingkat IL-6, IL-8, TNF-α, MDA, dan T-AOC untuk tikus yang diekspos pada nanopartikel dibandingkan dengan yang diekspos pada nanobola, ditemukan bahwa nanobola kobalt ferrit menghasilkan lebih banyak inflamasi dibandingkan tikus kelompok paparan nanopartikel.

Ekspresi IL-6, IL-8, TNF-α, MDA, dan T-AOC. a Pita western blot IL-6, IL-8, dan β-actin dalam kelompok kontrol, nanopartikel, dan paparan nanobola. b Tingkat ekspresi relatif IL-6 dan IL-8. c Konten TNF-α. d Tingkat MDA. e Diagram statistik konten T-AOC untuk kelompok kontrol dan paparan (nanopartikel dan nanobola). (*P < 0,05 untuk kelompok paparan versus kelompok kontrol ± sem)

Penilaian Sitotoksitas

Studi sitotoksitas untuk berbagai konsentrasi nanopartikel dan nanobola kobalt ferrit dilapisi PEG dilakukan dan hasilnya disajikan pada Gambar 8. Persentase kelangsungan sel L-132 ditunjukkan pada Gambar 8(a), sedangkan Gambar 8(b) mewakili persentase kelangsungan sel THP-1. Terlihat bahwa untuk konsentrasi di atas 100 μg/mL, terdapat perubahan yang signifikan dalam kelangsungan sel yang diamati untuk kedua sel, dan terlihat bahwa hasilnya lebih terpacu dalam kasus nanobola PEG. Ini mengonfirmasi bahwa nanobola kobalt ferrit menyebabkan lebih banyak kerusakan dibandingkan nanopartikel. Selain itu, kelangsungan sel menurun seiring peningkatan konsentrasi baik nanopartikel maupun nanobola, yang mengindikasikan bahwa kobalt ferrit dilapisi PEG dalam kedua bentuk menghasilkan lebih banyak toksisitas pada tikus seiring peningkatan konsentrasi. Karena dua target seluler yang berbeda (L-132 dan THP-1), seseorang dapat mengharapkan respons seluler tidak identik, tergantung pada mekanisme kematian sel [63]. Alasan yang mungkin untuk menjelaskan spesifisitas target seluler bahkan untuk ukuran partikel yang sama dapat dikaitkan dengan fungsi fagositosis, yang mengkarakterisasi monosit (sel THP-1), tetapi tidak sel epitel paru-paru [64]. Dipahami dengan baik bahwa satu nanobola terdiri dari sejumlah besar nanopartikel kecil. Jadi, ia memiliki luas permukaan yang lebih besar dibandingkan nanopartikel dan oleh karena itu, memiliki reaktivitas yang lebih tinggi dan lebih banyak kesempatan untuk berinteraksi dengan sistem biologis (jaringan) dibandingkan nanopartikel. Selain itu, karena ukuran nanobola yang lebih besar, mereka tidak dapat dikeluarkan dengan mudah melalui sirkulasi darah atau urine setelah memasuki organ. Oleh karena itu, mereka tetap dalam tubuh (organ) untuk waktu yang relatif lebih lama dibandingkan nanopartikel, yang pada gilirannya mempengaruhi jaringan secara buruk. Selain itu, nanobola menyebabkan penurunan fungsi makrofag, penurunan fagositosis nanobola itu sendiri, dan penurunan mobilitas makrofag serta disfungsi sitoskeleton.

Sitotoksitas nanopartikel dan nanobola kobalt ferrit dilapisi PEG dalam sel L-132 (a) dan THP-1 (b). *P < 0,01 dan **P < 0,05 untuk kedua sel dibandingkan kontrol tidak diobati. Data mewakili mean ± S.D dari dua eksperimen independen yang dilakukan tiga kali

Efek Kumin terhadap Toksisitas

Indeks biokimia dalam serum darah ditinjau untuk kelompok paparan nanobola dan kelompok yang dirawat kumin dan hasilnya dibandingkan dengan tikus kelompok kontrol, yang ditunjukkan pada Gambar 9. Ditemukan bahwa semua indeks ini dalam tikus kelompok pengobatan menunjukkan perbaikan yang signifikan setelah pemberian kumin ketika nilai mereka dibandingkan dengan tikus kelompok paparan nanobola dan kontrol. Dalam gambar, terlihat bahwa tingkat ekspresi ALT, AST, BUN, CREA, CYS-C, dan TB mendekati nilai normal setelah pemberian kumin. Hal ini dapat dikaitkan dengan fakta bahwa kumin memiliki karakteristik antioksidan yang kuat yang mengurangi stres oksidatif yang dihasilkan sebagai akibat dari toksisitas yang diinduksi oleh kobalt ferrit [47]. Juga telah dilaporkan bahwa TNF-α dan IL-1 memainkan peran penting dalam induksi nekrosis hati dan kumin mengurangi efek toksisitas dengan menghambat sekresi TNF-α dan IL-1 oleh makrofag [48], mirip dengan karya yang dilaporkan sebelumnya dalam Ref. [65].

Indeks biokimia dalam serum darah tikus kelompok kontrol, paparan nanobola, dan pengobatan (*P < 0,05 dibandingkan kontrol tidak diobati)

Kesimpulan

Dalam karya ini, kami berhasil memfabriksikan nanopartikel dan nanobola kobalt ferrit dilapisi PEG melalui metode hidrotermal dan solvothermal, masing-masing. Dari analisis struktural, ditemukan bahwa nanomaterial yang disiapkan sangat murni, kristal, dan biokompatibel dalam sifatnya yang berasal dari ikatan PEG yang berhasil. Ditemukan bahwa baik nanobola maupun nanopartikel kobalt ferrit beracun terhadap sistem biologis. Selain itu, telah ditunjukkan bahwa nanobola kobalt ferrit lebih toksik daripada nanopartikel karena luas permukaan yang besar dan reaktivitas yang lebih besar dengan jaringan biologis. Perubahan positif dipantau dalam indeks biokimia setelah pemberian kumin yang merupakan kimia alami yang tidak memiliki efek samping, sehingga mengonfirmasi bahwa ia dapat digunakan sebagai agen penyembuh untuk toksisitas yang diinduksi oleh nanobola kobalt ferrit.