Pengembangan Sensor pH Lisosom Akurat menggunakan Nanopartikel SiO2 yang Terdekomposisi Sendiri
Abstrak
pH asam lisosom berkaitan erat dengan otofagi; oleh karena itu, pengetahuan yang baik tentang perubahan pH lisosom yang tepat akan memberikan lebih banyak informasi tentang proses dan status otofagi. Namun, sejauh ini, hanya perubahan pH dalam rentang yang cukup luas yang dapat diindikasikan, deteksi pH lisosom yang tepat belum pernah tercapai. Dalam studi kami, kami mengembangkan indikator pH endo/lisosom berdasarkan sistem nanopartikel SiO2 yang terdekomposisi sendiri dengan parameter sintesis tertentu. Metilen biru (MB) yang terkonsentrasi di tengah dalam nanopartikel struktural terpusat-hollow merilis secara sensitif sebagai fungsi dari nilai pH dari pH 4,0–4,8, yang tepat adalah rentang pH lisosom. Korelasi linear antara nilai densitas optik (OD) dan nilai pH telah dibangun, yang telah digunakan untuk deteksi pH lisosom di 6 baris sel yang berbeda. Selain itu, dengan sistem ini, kami berhasil mendeteksi perubahan pH rata-rata lisosom sebelum dan setelah endositosis nanopartikel silikon mesopor hitam (BPSi), menjelaskan mekanisme penghentian otofagi setelah endositosis BPSi. Jadi, indikator pH lumen berbasis nanopartikel yang terdekomposisi sendiri dapat memberikan metodologi dan strategi baru untuk mengetahui lebih baik pH lisosom, kemudian menunjukkan lebih banyak detail tentang proses otofagi atau sinyal penting lainnya tentang metabolisme.
Pendahuluan
Lisosom berfungsi sebagai tujuan akhir untuk makromolekul, di mana makromolekul ini diuraikan oleh enzim hidrolitik yang diaktifkan oleh pH rendah [1]. pH asam lisosom yang dipertahankan oleh v-ATPase tipe vacuolar [2] yang memompa proton dari sitoplasma ke dalam lumen lisosom untuk menjaga aktivitas sekitar 60 jenis enzim hidrolitik [3]. Selain itu, laporan literatur terbaru mengungkapkan bahwa pH asam lisosom berkaitan erat dengan otofagi [4], sehingga pengetahuan yang baik tentang perubahan pH lisosom yang tepat akan memberikan lebih banyak informasi tentang proses dan status otofagi. Berdasarkan studi kami dan tinjauan literatur, endositosis nanopartikel positif amina kemungkinan akan meningkatkan perubahan pH dalam endo/lisosom, seperti nanopartikel PEG-dekorasi amina primer dan sekunder atau beberapa dekorasi hidrofilik pada permukaan partikel [5, 6].
Peningkatan pH yang diinduksi oleh endositosis nanopartikel amina akan secara dramatis meningkatkan lokalisasi nukleus faktor transkripsi EB (TFEB) [7], yang menghasilkan tidak hanya penyesuaian transkripsi jalur, tetapi juga menyebabkan disfungsi lisosom, yang pada akhirnya mengakibatkan blokir aliran otofagi [7,8,9]. Karena TFEB mengatur otofagi, dan akibatnya, ekspresi berlebihnya mengakibatkan peningkatan signifikan produksi autofagosom dalam sel yang dibudayakan.
Oleh karena itu, untuk memprediksi proses otofagi dan detail otofagi, pengukuran pH lisosom yang tepat dan perubahannya sangat krusial. Hingga saat ini, dari tinjauan literatur tentang nilai pH endo/lisosom [10] dan produk komersial untuk mendeteksi nilai pH endo/lisosom, hanya perubahan pH dalam rentang yang cukup luas yang dapat diindikasikan, dan deteksi pH lisosom yang tepat belum pernah tercapai. Oleh karena itu, untuk mengetahui detail dalam otofagi, pendirian metode deteksi perubahan pH lumen yang tepat adalah pendekatan yang penting.
Berdasarkan pengalaman kami sebelumnya tentang nanopartikel SiO2 yang terdekomposisi sendiri, dalam studi ini, kami mendirikan indikator pH yang tepat yang dapat merealisasikan deteksi perubahan pH lumen. Nanopartikel SiO2 memiliki keuntungan yang baik dalam ukuran yang dapat disesuaikan dan biokompatibilitas [11]. Dengan menetapkan parameter sintesis tertentu, indikator pH SiO2 yang terdekomposisi sendiri yang diriset dapat merilis beban metilen biru (MB) dengan sensitif pada pH 4,0–4,8, yang tepat adalah rentang pH lisosom. Selain itu, pembalikan MB menunjukkan korelasi linear dengan perubahan nilai pH (skema 1). Kemudian, kami menguji kelayakan indikator pH pada tingkat sel dengan memperkenalkan 6 baris sel yang berbeda, berhasil menentukan perubahan pH rata-rata lisosom sebelum dan setelah endositosis nanopartikel silikon mesopor hitam (BPSi), menjelaskan mekanisme penghentian otofagi setelah endositosis BPSi. Jadi, indikator pH lumen berbasis nanopartikel yang terdekomposisi sendiri dapat memberikan metodologi dan strategi baru untuk mengetahui lebih baik pH lisosom, kemudian menunjukkan lebih banyak detail tentang proses otofagi atau sinyal penting lainnya tentang metabolisme.
Ilustrasi skematis pengukuran pH lisosom dalam sel hidup dengan MB@SiO2
Bahan dan Metode
Bagian Bahan
Natrium silisida (NaSi) dan wafer Si (diameter 20 cm, p + (100), 0,01–0,02 Ω cm) disediakan oleh SiGNa Chemistry Inc. dan Ocmetic Inc., masing-masing. Bromida ammonium (NH4Br, 99%), bromida natrium (NaBr, 99%), toluene (tanpa air, 99,8%), asam klorida (HCl, 37%), MB, dan ortosilikat tetraetil (TEOS) dibeli dari Sigma-Aldrich. 0,5 kDa metoksi-PEG-silana dan 2 kDa metoksi-PEG-silana dibeli dari Fluorochem Ltd. dan Laysan Bio Inc. secara terpisah. Medium RPMI 1640 disediakan oleh Life Technologies. Serum sapiJanin (FBS) dibeli dari TianHang biological technology. Bikarbonat natrium, sulfat streptomisin, penicilin G, HEPES, larutan lisozim, CellLight Early-endosomes-GFP, LysoTracker™ Red DND-99, Pierce® BCA Protein Assay Kit, kemiluminesensia yang ditingkatkan, konjugat transferin pHrodo™ Red, larutan imaging sel hidup, dan reagen Trizol dibeli dari Thermo Fisher Scientific. Etanol dan ammonia–air disediakan oleh Sinopharm. Kit sintesis rantai pertama cDNA BioRT Master HiSensi dibeli dari Hangzhou Bioer Technology Co., Ltd. Lisat RIPA dibeli dari Heart Biological Technology Co., Ltd. Antibodi P62, TFEB, dan β-actin dibeli dari Proteintech Group, Inc. Antibodi LC 3B disediakan oleh Abcam. 2-(4-Piridil)-5-((4-(2-dimetilaminoetil-aminokarbonil) metoksi) fenil) oksazol (PDMPO) disediakan oleh Yeasen Biotech Co., Ltd.
Tujuan, Desain, dan Pengaturan Studi
Tujuan studi ini adalah untuk (1) mengeksplorasi pengaruh nanopartikel BPSi pada otofagi dalam sel HepG2, (2) menemukan mekanisme di balik perubahan nilai pH lisosom yang mempengaruhi otofagi, (3) mendirikan indikator pH lisosom yang tepat yang dapat mengukur pH lisosom dengan tepat, dan akhirnya, (4) menunjukkan pengaruh fluktuasi pH pada otofagi. Untuk merealisasikan tujuan studi di atas, kami menggunakan eksperimen sequensi transkriptom untuk mengeksplorasi perubahan gen transkriptom dalam sel HepG2 setelah memberi nanopartikel BPSi dan memverifikasinya dengan eksperimen RT-qPCR dan Western. Warna floresien seperti PDMPO digunakan untuk mengukur perubahan pH lisosom dalam sel HepG2 setelah memberi BPSi. Untuk mengukur pH lisosom dengan tepat, kami mengembangkan nanopartikel MB@SiO2 dengan 10 parameter dan menguji karakterisasi dari 10 jenis nanopartikel ini melalui eksperimen seperti DLS dan HR-TEM. Studi efisiensi pemuatan MB dan kinetika rilis dari 10 sistem nanopartikel yang terdekomposisi sendiri dilakukan dalam larutan pH yang berbeda dan sel HepG2. Untuk memverifikasi lokasi seluler nanopartikel setelah masuk ke dalam sel, kami melakukan eksperimen TEM sel dan mikroskopi konfokal sel hidup. Terakhir, kami mengukur perubahan pH lisosom di 6 jenis sel setelah memberi BPSi untuk memverifikasi universalitas nanopartikel MB@SiO2 untuk mengukur perubahan pH lisosom.
Sintesis Nanopartikel BPSi
Nanopartikel BPSi disiapkan dengan metode kami sebelumnya [12] dan disediakan oleh mitra kami (Wujun Xu, Departemen Fisika Terapan, Universitas Timur Finlandia). Persiapan BPSi, NaSi, garam ammonium, dan NaBr (NaSi: NH4Br: NaBr sebanding 1:4:4, w/w/w) digiling dalam kotak tangan dengan atmosfer Ar. Mereka dibiarkan bereaksi dalam tabung oven dalam atmosfer N2 pada 240 °C selama 5 jam (Eq. 1). Setelah didinginkan ke suhu ruang, mikro-partikel yang diperoleh dipurifikasi dengan mencuci dengan larutan 0,5 M HCl dan 1,0 M HF secara terpisah. Mikro-partikel digiling bola dalam etanol pada 1000 rpm selama 15 menit, dan nanopartikel BPSi dengan diameter yang diinginkan dikumpulkan dengan menyesuaikan kecepatan sentrifugal.
Melalui eksperimen Penyebaran Cahaya Dinamis (DLS), distribusi diameter dan muatan permukaan nanopartikel dikaji. Semua NP didispersikan dalam medium setelah sterilisasi dengan ultrasonikasi ringan (5 detik untuk membuatnya terdistribusi merata dalam larutan, Pemutul Ultrasonik SB-5200DT, Ningbo Scientz Biotechnology Co., Ltd.) tepat sebelum diperkenalkan ke dalam sel.
Pendirian Sistem Nanopartikel yang Terdekomposisi Sendiri 10 Seri
10 seri nanopartikel yang terdekomposisi sendiri disintesis oleh metodologi yang kami laporkan sebelumnya [13,14,15,16], dengan parameter yang dimodifikasi. Dalam prosedur tipis, sejumlah MB pertama kali ditambahkan ke campuran etanol (75 mL) dengan larutan ammonia–air (25%, 3,4 mL), setelah itu sejumlah TEOS ditambahkan. Seri nanopartikel MB@SiO2 yang terdekomposisi sendiri diperoleh setelah diaduk selama 24 jam dan dicuci 3 kali sebelum dikeringkan. Jumlah MB dan TEOS yang ditambahkan dalam protokol adalah seperti yang dijelaskan dalam Tabel 1. Arti 1,0/100 dalam NPs1.0/100 mewakili inventori MB dan TEOS saat kami menyintesis nanopartikel, dengan 1,0 mg MB dan 100 μL TEOS. Dan arti 1,5/100 dalam NPs1.5/100 dan lainnya konsisten dengan 1,0/100.
Budaya Sel
Untuk menguji efisiensi dan universalitas indikator pH berdasarkan nanopartikel yang terdekomposisi sendiri, kami mencoba mengujinya pada baris sel kanker spesifik yang berasal dari tumor. Jadi, kami memilih baris sel kanker hati, kanker paru-paru, kanker usus besar, dan melanositoma sebagai objek penelitian. Baris sel kanker usus besar manusia HCT116, HCT8, dan HCT15; sel kanker hati manusia HepG-2; sel kanker paru-paru manusia A549; dan sel melanoma tikus B16 dipertahankan dalam medium RPMI 1640 (Life Technologies) yang dilengkapi dengan 10% FBS yang diinaktivasi panas, 2,0 g/L bikarbonat natrium, 0,1 g/L sulfat streptomisin, 0,06 g/L penicilin G, dan 5,958 g/L HEPES. Sel dipertahankan dalam inkubator budaya sel standar pada 37 °C dalam atmosfer lembap dengan 5% CO2.
Karakterisasi Sistem Nanopartikel yang Terdekomposisi Sendiri 10 Seri
Morfologi semua seri nanopartikel dikarakterisasi dengan HR-TEM dengan mode STEM, dan pemetaan Si dikaji dengan pemetaan elemen EDS. Analisis distribusi ukuran nanopartikel dilakukan oleh perangkat lunak ImageJ dengan menghitung diameter nanopartikel pada citra STEM yang dipilih secara acak. Potensi zeta nanopartikel dan indeks polidispersi (PDI) telah diukur oleh studi Penyebaran Cahaya Dinamis (DLS), dalam seri buffer dengan nilai pH tertentu. Data dianalisis dengan SPSS15.0 dan hasil statistik disajikan sebagai rata-rata ± S.D.
Studi Efisiensi Pemuatan MB dan Kinetika Rilis Sistem Nanopartikel yang Terdekomposisi Sendiri 10 Seri
Untuk mempelajari efisiensi pemuatan MB dan kinetika rilis, kurva standar MB dalam konsentrasi seri pertama kali dibangun. Penyerapan MB dilakukan dengan spektroskopi UV–Vis dengan penyerapan pada 660 nm, yang merupakan λmax dari monomerk MB. Efisiensi pemuatan MB dihitung dengan persamaan berikut, Efisiensi pemuatan MB (%) = jumlah MB yang dikapsulasi/(jumlah total MB yang dimasukkan).
Rilis MB dari 10 seri nanopartikel dikaji dalam air tawar dan buffer pH dengan nilai pH yang berbeda (pH 4,0, pH 6,86, dan pH 9,18) dan Larutan Lisozim (Thermo Scientific™ #90082). Selain itu, kinetika rilis MB setelah durasi tertentu dalam buffer pH yang berbeda juga diteliti. Nilai OD pada 660 nm dan persentase rilis MB sebagai fungsi waktu kemudian diteliti.
Dalam lebih detail, studi rilis MB dilakukan dengan protokol di bawah ini; larutkan 10 seri nanopartikel dalam 15 mL buffer standar pH 4,0, 6,86, dan 9,18 dengan larutan lisosom, masing-masing; dan lakukan rilis MB dalam pemutar Hula pada 37 °C. Selama 15 hari berikutnya, 1 mL dari setiap sampel dikumpulkan, kemudian dikonsentrifugasi pada 12000 rpm selama 10 menit. Soporan dan endapan diukur untuk spektrum penyerapannya pada 200–800 nm.
Selain itu, rilis MB dalam buffer pH yang tepat dengan larutan lisozim dalam rentang pH 4,1 hingga 5,5 juga diteliti dengan protokol yang sama di atas. Durasi waktu tertentu (6 jam, 12 jam, dan 24 jam) ditempatkan sebagai titik pengamatan. Penyerapan pada 660 nm dicatat pada setiap sampel. Hubungan linear antara penyerapan setiap larutan pH dan jumlah kuadrat sisa dihitung pada setiap titik waktu, masing-masing.
Untuk mendeteksi profil rilis MB dalam sel, sel HepG-2 dibudayakan dalam kolam budaya 75 cm2 dan diberi makan NP (300 μg/mL) ketika sel telah berkembang hingga 70% dari kolam budaya. Setiap 30 menit kemudian, sel dikumpulkan. Sel secara berulang dibekukan dan dilelehkan untuk merilis MB dalam sel secara sepenuhnya. Lisat sel dikonsentrifugasi pada 12000 r/min selama 10 menit. Soporan diperoleh dan diukur penyerapannya pada 660 nm untuk menghitung jumlah total MB yang dirilis. Dalam studi ini, sel HepG2 dipilih sebagai objek penelitian, karena proliferasi sel yang cepat yang dapat meminimalkan variansi di antara semua 10 grup yang diuji.
Kolokalisasi Seluler 10 Seri Nanopartikel dan Performa Rilis di 6 Baris Sel yang Berbeda
TEM sel digunakan untuk mempelajari kolokalisasi nanopartikel dalam endo/lisosom mengikuti protokol TEM sel standar. Sel ditanam dengan intensitas 1 × 106 sel/kolam dan diinkubasi selama 24 jam, untuk memungkinkan pelekatkan sel. Sepuluh seri nanopartikel dalam medium dengan konsentrasi yang sama (100 μg/mL) diinkubasi dengan sel untuk 12 dan 24 jam, masing-masing. Sel kemudian dicuci dengan PBS selama 3 kali untuk menghilangkan nanopartikel berlebih, kemudian diperbaiki dalam larutan gluteraldehida 2,5% selama lebih dari 1 hari. Sel yang diperbaiki kemudian dicuci dan diwarnai dengan tetroksida osmium, 1% dalam air deionir selama 1 jam, diikuti dengan pencuci dengan PBS selama 3 kali dan air DI selama 2 kali. Protokol TEM sel klasik [17, 18] dilakukan selanjutnya, dan iris dengan ketebalan 90 nm dikumpulkan untuk observasi TEM. Rilis MB sebagai fungsi dari nilai pH dikaji di 6 baris sel dengan baik NPs6/100 dan NPs7.5/80. Juga, nilai OD dari rilis MB dan persentase rilis MB dicatat untuk analisis data.
Mikroskopi konfokal sel hidup digunakan untuk menilai pengambilan seluler dan nasib seluler nanopartikel MB@SiO2. Sel endos awal HepG-2 diwarnai (CellLight Early-endosomes-GFP, BacMam 2.0 ThermoFisher Scientific C10586, dengan eksitasi/emisi ~ 488/510 nm) selama 16 jam. Dan kemudian sel diinkubasi dengan NPs6/100 (eksitasi/emisi MB: 640/650–700 nm) pada konsentrasi nanopartikel 100 μg/mL pada interval waktu tertentu (2 jam, 2,5 jam, 3 jam, 5 jam, dan 6 jam). Sebelum citra diambil, lysotracker diwarnai dengan LysoTracker™ Red DND-99 (Thermo Fisher Scientific L7528, eksitasi/emisi: 577/590 nm) selama 40 menit. Setelah itu, larutan warna dikeluarkan dan sel dicuci 2–3 kali dalam PBS. Citra diambil menggunakan Mikroskop Konfokal Nikon A1R.
Sequensi Transkriptom untuk Mengevaluasi Perubahan Ekspresi Gen setelah Pemberian BPSi
Ekstraksi RNA total dari grup kontrol dan grup yang dirawat BPSi dilakukan menggunakan reagen Trizol mengikuti prosedur operasional standar. Kualitas contoh RNA total awal untuk eksperimen sequensi terdeteksi menggunakan spektrofotometer NanoDrop ND-2000. RNA total yang lulus kontrol kualitas digunakan dalam eksperimen sequensi berikutnya. Perbandingan ekspresi gen dilakukan oleh sequensi generasi berikutnya. Semua program sequensi dilakukan oleh BGI-Shenzhen Corporation (Shenzhen, China) menggunakan platform BGISEQ-500. Data mentah yang diperoleh dari sequensi dilakukan kontrol kualitas untuk menentukan apakah data sequensi cocok untuk analisis berikutnya. Jika lulus, lakukan analisis kuantitatif gen berdasarkan tingkat ekspresi gen dan lakukan analisis enrichment yang signifikan dari fungsi ontologi gen (GO) pada gen yang diekspresikan secara berbeda antara sampel yang dipilih.
Uji RT-qPCR untuk Konfirmasi Aktivasi Jaringan Gen TFEB-CLEAR
RNA total diekstrak dari sel HepG-2 yang dibudayakan dari grup kontrol dan grup yang dirawat BPSi menggunakan reagen Trizol dan ditranskripsikan balik menjadi cDNA menggunakan Kit Sintesis Rantai Pertama cDNA BioRT Master HiSensi (Hangzhou Bioer Technology Co., Ltd.) dengan primer acak. cDNA digunakan untuk memperkuat jaringan gen TFEB-CLEAR dengan PCR kuantitatif menggunakan sistem PCR real-time Applied Biosystems™ 7500 (Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, CA) dengan actin sebagai kontrol referensi. Primer yang digunakan untuk RT-PCR kuantitatif tercantum dalam Tabel S4.
Uji Western Blot untuk Konfirmasi bahwa Otofagi Teraktivasi setelah Pemberian BPSi
Protein seluler dari grup kontrol dan grup yang dirawat BPSi dengan konsentrasi berbeda diekstrak oleh lisat RIPA (Heart Biological Technology Co., Ltd.). Inhibitor protease ditambahkan ke lisat RIPA dan di pendinginkan di atas es. Cuci sel 3 kali dengan PBS yang sudah di pendinginkan. Buang cairan sepenuhnya dan tempatkan piring di atas es selama 2 menit. Empat ratus mikroliter lisat RIPA ditambahkan ke permukaan seluruh piring, di pipetkan beberapa kali dengan pipet, dan diinkubasi di atas es selama 30 min, selama itu piring digetus beberapa kali untuk melisir sel sepenuhnya. Cairan sel yang telah dilisir dipindahkan ke tabung Eppendorf 1 ml dan dikonsentrifugasi pada 13.000 rpm selama 10 menit, 4 °C. Soporan yang diperoleh direbus dalam air selama 10 min dan ditempatkan pada – 20 °C untuk penggunaan nanti. Konsentrasi protein diukur menggunakan Pierce® BCA Protein Assay Kit (Thermo scientific).
Ekstrak sel yang mengandung 25 μg total protein langsung diarahkan pada SDS-PAGE dan dipindahkan. Membran diblokir dengan susu skim 5% dan diwarnai dengan antibodi primer yang mengenali P62 (Proteintech #18420–1-AP), TFEB (Proteintech # 13372–1-AP), LC 3B (Abcam # ab192890), dan β-actin (Proteintech #20536–1-AP). Antibodi sekunder dipilih berdasarkan spesies asal antibodi primer dan dideteksi oleh kemiluminesensia yang ditingkatkan (Pierce) atau dengan menggunakan Sistem Imaging Gel Bio-Rad ChemiDoc XRS + (Bio-Rad, USA). Intensitas pita yang dinormalisasi dari P62, TFEB, dan LC 3B relatif terhadap β-actin diukur oleh densitometri menggunakan perangkat lunak ImageJ dalam grup BPSi, dan data adalah rata-rata ± S.D. dari tiga eksperimen independen.
Pengukuran pH Sel oleh PDMPO dan pHrodo™ Red Transferrin Conjugate oleh Mikroskopi Konfokal
Studi PDMPO
1 × 105 sel HepG-2 dibudayakan pada papan konfokal steril selama semalaman dan nanopartikel BPSi diberi makan dengan konsentrasi 100 μg/mL. Besok hari, sebelum penstainan imunofluoresensi, slaj dicuci tiga kali dengan 0,01 M PBS, pH 7,4, kemudian ditambahkan 1 μM warna PDMPO (Ex/Em = 329/440). Setelah dicuci dengan PBS selama tiga kali, sel diinkubasi dengan medium budaya RPMI-1640 segar dan diamati di bawah mikroskop fluoresens (Nikon A1R, Jepang) dengan kamera CCD dan mengambil gambar dalam 5 menit, dan rasio intensitas fluoresensi biru dan hijau dalam lisosom kemudian dihitung sesuai dengan prosedur Chen et al. [19].
Studi pHrodo™ Red Transferrin Conjugate
Sel HepG-2 ditempatkan pada papan konfokal dengan cara yang sama untuk pelekatkan sel selama 24 jam, kemudian papan ditempatkan di atas es selama 10 menit. Cuci sel dengan larutan Imaging Sel Dingin yang mengandung 20 mM glukosa dan 1% BSA. Tambahkan pHrodo™ Red Transferrin conjugate (Ex/Em = 560/585 nm) pada 25 μg/mL dalam larutan Imaging Sel dan diinkubasi pada 37 °C selama 20 menit, kemudian cuci sel dalam larutan Imaging Sel. Observasi juga dilakukan oleh mikroskopi konfokal. Analisis kuantitatif intensitas citra mikroskopi dilakukan oleh perangkat lunak ImageJ.
Deteksi pH Lisosom Sel
Sel A549, HepG-2, HCT8, HCT15, HCT116, dan B16 dibudayakan dalam kolam budaya 75 cm2 dan diberi makan NP ketika sel telah berkembang hingga 70% dari kolam budaya, dan 6 jam kemudian, sel dikumpulkan. Sel secara berulang dibekukan dan dilelehkan untuk merilis MB dalam sel secara sepenuhnya. Lisat sel dikonsentrifugasi pada 12000 r/min selama 10 menit. Soporan diperoleh dan diukur penyerapannya pada 660 nm untuk menghitung jumlah total MB yang dirilis. Penyerapan NPs6.0/100 pada pH standar dibandingkan untuk mendapatkan nilai pH dari setiap sel.
Analisis Statistik
Analisis statistik dilakukan dengan perangkat lunak SPSS15.0 dengan menggunakan analisis variansi dua arah (ANOVA) untuk grup independen dan menggunakan metode Tukey HSD untuk uji perbandingan berganda. Signifikansi statistik didasarkan pada nilai P < 0,05.
Hasil dan Pembahasan
Kami pertama kali mendeteksi ekspresi gen yang berbeda ketika sel diberi makan nanopartikel silica pori hitam dual fungsional PEG (BPSi NPs) (disediakan oleh laboratorium mitra kami [12]). Perubahan potensi zeta dari − 18,5 ke + 2,8 mV juga menunjukkan bahwa dual-PEGylation pada permukaan berhasil (Gambar S1a). Diameter rata-rata nanopartikel BPSi adalah 156 nm (Gambar S1b). Berdasarkan peta cluster ekspresi gen yang berbeda (Gambar S2), kami memilih lebih dari 2 kali ekspresi gen yang berbeda untuk penyelidikan lebih lanjut. Go dan KEGG diperkenalkan untuk menganalisis gen yang berbeda. Dari peta gelembung enrich Go (Gambar 1a), gen metabolik dan terkait lisosom termasuk pengumpulan fagolisosom, fagositosis, dan proses metabolisme xsenobiotik dipilih untuk analisis lebih lanjut. Secara menarik, ekspresi gen terkait TFEB-CLEAR [17] secara signifikan meningkat. Hasil RT-PCR (Gambar 1b) juga memverifikasi hasil sequensi gen, gen pada jalur ekspresi lysosom terkoordinasi dan regulasi (CLEAR) TFEB secara signifikan meningkat, seperti CTSD, CTSF, TFEB, MFN1, LAMP2, dan TPP1. Gen-gen ini telah ditandai pada jalur lisosom, seperti yang ditunjukkan pada Gambar S3. Ekspresinya lebih tinggi dari grup kontrol dan memiliki signifikansi statistik (PBPSi VS Control < 0,05). Dan TFEB secara positif mengatur ekspresi gen lisosom, mengontrol populasi lisosom, dan mendorong degradasi seluler substrat lisosom.
Otofagi teraktivasi dalam sel HepG-2 setelah pemberian BPSi. a Peta gelembung enrich GO dari gen yang berbeda yang ditemukan oleh sequensi transkriptom. b Verifikasi perubahan gen dalam jaringan gen TFEB-CLEAR setelah BPSi dirawat oleh eksperimen RT-qPCT. c Ekspresi protein P62, TFEB, LC3B II/I setelah BPSi dirawat. d Intensitas abu-abu pita yang dinormalisasi dari protein P62, TFEB, LC3B II/I dalam grup BPSi dirawat menurut grup kontrol. Data disajikan sebagai rata-rata ± S.D.
Selain itu, TFEB mengatur otofagi, dan ekspresi berlebihnya mengakibatkan peningkatan signifikan produksi autofagosom dalam sel yang dibudayakan karena fungsi utama gen TFEB adalah untuk menginduksi biosintesis lisosom dan mendorong terjadinya otofagi [20]. Analisis Western blot juga digunakan untuk menguji apakah otofagi terjadi ketika sel diberi makan BPSi NPs. Tujuan uji Western adalah untuk mengonfirmasi lebih lanjut bahwa ekspresi TFEB meningkat dan terjadinya otofagi seluler setelah pemberian BPSi. Protein LC3B dan P62 keduanya adalah penanda otofagi. Ketika otofagi terjadi, ekspresi rantai ringan 1A/1B-protein mikroskup asosiatif 3B (LC3B) II/I meningkat. p62 adalah reseptor untuk vesikel yang akan diuraikan oleh otofagi dan juga adalah reseptor untuk agregat protein ubiquitasi yang akan dibersihkan, dan ekspresinya menurun ketika otofagi terjadi. Jadi kami mengukur ekspresi protein ini dalam eksperimen Western.
Dari hasil Western blot yang ditunjukkan pada Gambar 1c, d, protein TFEB (P80 μg/ml VS control = 0,000008), LC3B II/I (P80 μg/ml VS control = 0,000297), dan p62 (P80 μg/ml VS control = 0,000016) semuanya secara signifikan meningkat. Karena peningkatan protein TFEB dan LC3B II/I menunjukkan aktivasi otofagi [18], kami menyangka bahwa endositosis BPSi mendorong terjadinya otofagi. Namun, protein p62 seharusnya downregulated selama proses otofagi, karena sifat protein pembawa yang membawa endosom ke lisosom dan akhirnya diuraikan. Dalam studi kami, peningkatan yang signifikan dari p62 menunjukkan penghentian degradasi selama proses fusasi endo-lisosom [21], yang mungkin disebabkan oleh peningkatan pH dalam vesikel endo-lisosom. Jadi, endositosis BPSi mungkin pertama kali menginduksi terjadinya otofagi, kemudian menghambat proses otofagi dengan meningkatkan nilai pH endo/lisosom, karena sifat amida yang basa.
Untuk menguji karakteristik peningkatan pH dalam endo/lisosom oleh endositosis BPSi, dua sond pH fluoresens komersial digunakan dalam studi kami, pHrodo™ Red Transferrin Conjugate (Thermo Fisher #P35376), dan RatioWorks™ PDMPO.
pHrodo™ Red sebagai indikator pH seluler komersial biasanya menunjukkan fluoresensi lemah pada pH netral tetapi meningkat seiring dengan penurunan pH. Ia diduga untuk mengukur pH sitosol sel dalam rentang 9–4 dengan pKa sekitar 6,5 dengan eksitasi/emisi 560/585 nm. Kami dapat mendapatkan kesimpulan analisis kualitatif dari penentuan 6 baris sel bahwa endositosis NP BPSi memiliki kemampuan untuk meningkatkan nilai pH dalam endo/lisosom, karena penurunan sinyal fluoresensi merah (Gambar S4 dan S5). Namun, setelah mengulang eksperimen beberapa kali mengikuti protokol operasi produk, kami hampir tidak dapat menganalisis secara kuantitatif nilai pH yang tepat yang menurun di antara baris sel yang berbeda sebelum atau setelah pemberian BPSi NPs karena tidak ada korelasi antara intensitas dan nilai pH yang terbentuk.
PDMPO kemudian digunakan sebagai solusi yang lebih baik untuk menunjukkan perubahan nilai pH setelah endositosis BPSi, yang memperkenalkan teknik citra rasio dalam pengukuran pH kuantitatif. PDMPO [2-(4-piridil)-5-((4-(2-dimetilaminoetil-aminokarbonil) metoksi) fenil) oksazol] dikarakterisir sebagai sonde pH asidotropik eksitasi dual dan emisi dual. Ia memancarkan fluoresensi hijau yang intens pada pH lebih rendah dan memberikan fluoresensi biru yang intens pada pH yang lebih tinggi. Fluoresensi yang bergantung pada pH yang unik ini membuat PDMPO menjadi sonde pH ideal untuk organul asam dengan pKa = 4,47. PDMPO secara selektif melabeli organul asam (seperti lisosom) pada sel hidup dan dua puncak emisi yang berbeda dapat digunakan untuk memantau fluktuasi pH sel hidup dalam pengukuran rasio. Namun, kami masih gagal mengukur nilai pH di 6 baris sel sebelum dan setelah pemberian BPSi. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar S6, tidak ada perbedaan signifikan yang diamati di semua 6 baris sel sebelum dan setelah pemberian BPSi. Meski korelasi telah terbentuk antara Rasio Biru/Hijau dan nilai pH (Gambar S7), korelasi non-linear dari pH 4–5 membuat metode PDMPO gagal dalam analisis kuantitatif endo/lisosom sebelum dan setelah pemberian BPSi.
Dari data dua indikator pH komersial di atas, kami pertama kali mendemonstrasikan dugaan kami bahwa nanopartikel yang dihiasi PEG dengan amida pada rantai PEG dapat membuat pH endo/lisosom meningkat karena sifat basa amida. Namun, tanpa analisis kuantitatif perubahan pH yang tepat (rentang 0,1 pH), kami masih tidak dapat mendirikan korelasi antara status otofagi dan nilai pH endo/lisosom, sehingga gagal dalam prediksi otofagi.
Berdasarkan studi kami sebelumnya tentang nanopartikel yang terdekomposisi sendiri [13, 14] [15, 22], kami mempertahankan konsentrasi hidroksida ammonium yang sama dalam etanol 75%, tetapi menyesuaikan konsentrasi MB dan TEOS. Dua seri jumlah TEOS telah ditetapkan sebagai 100 μL dan 80 μL, untuk mendapatkan ketebalan cangkung dan ukuran pori yang berbeda. Sepuluh seri jumlah MB telah ditetapkan untuk mendapatkan ukuran struktur terpusat-hollow dan efisiensi pemuatan MB yang berbeda.
Jumlah MB dan TEOS yang ditambahkan dalam protokol adalah seperti yang dijelaskan dalam Tabel 1 di bawah ini.
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2a, b, ukuran nanopartikel meningkat seiring dengan peningkatan jumlah MB, pada kedua konsentrasi TEOS (100 μL dan 80 μL). Pada konsentrasi MB yang sama, ukuran partikel meningkat seiring dengan peningkatan jumlah TEOS. Selain itu, dengan peningkatan jumlah TEOS, ketebalan cangkung tumbuh, yang telah terbukti oleh pemetaan elemen (ditunjukkan sebagai Gambar 2c). Indeks polidispersi (PDI) dan muatan permukaan nanopartikel ditunjukkan pada Gambar S8 dan Tabel S1. Studi morfologi memprediksi bahwa dengan peningkatan jumlah MB, efisiensi pemuatan akan tumbuh, yang mengarah pada profil rilis yang lebih cepat, sementara dengan peningkatan jumlah TEOS, rilis akan melambat. Dan kami perlu menemukan konsentrasi MB dan TEOS yang tepat, dengan yang kami dapatkan sistem nanopartikel yang dioptimalkan, yang mungkin dapat membuat profil rilis MB berkorelasi linear dengan perubahan pH.
Karakterisasi morfologi dari 10 nanopartikel yang terdekomposisi diri yang berbeda dengan jumlah MB atau TEOS tertentu. a Gambar STEM. b Analisis distribusi ukuran nanopartikel. c Pemetaan Si dari 10 nanopartikel yang terdekomposisi diri. Skala bar pada semua gambar adalah 100 nm. Analisis distribusi ukuran dilakukan dengan memilih secara acak 100 nanopartikel dari gambar STEM dan diukur oleh perangkat lunak ImageJ. Data disajikan sebagai rata-rata ± S.D.
Efisiensi pemuatan MB ditentukan oleh spektrum UV-Vis. Kurva standar (Gambar S9) MB pertama kali ditarik menggunakan serangkaian konsentrasi larutan MB (dari 6,25 hingga 46,88 μg/mL), dengan persamaan y = 67,63x + 0,10919, R2 = 0,9987. Seperti yang dihitung dengan persamaan di atas, kami memperoleh efisiensi pemuatan MB dari 10 nanopartikel yang terdekomposisi diri dengan parameter tertentu, data terperinci ditunjukkan pada Gambar S10.
Sebelum studi profil rilis MB dalam larutan pH yang berbeda, profil rilis dalam air tawar telah diteliti. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar S11 dan Gambar S12, semua nanopartikel dengan jumlah TEOS 80 μL menunjukkan peningkatan rilis MB seiring dengan peningkatan durasi, yang dipantulkan oleh penyerapan UV–Vis. Selain itu, dengan peningkatan jumlah MB yang dikapsulasi, tren pertumbuhan rilis MB menjadi lebih signifikan. Juga, kecepatan rilis menjadi lebih cepat. Namun, seiring dengan peningkatan jumlah TEOS menjadi 100 μL, permukaan partikel menjadi lebih padat dan rilis menjadi lebih lambat ketika jumlah MB di bawah 3,0 mg; hampir tidak ada tren peningkatan yang dapat diamati dalam rilis MB dalam air selama 14 hari rilis. Segera setelah jumlah MB meningkat ke atas 4,0 mg, tren peningkatan yang jelas dalam rilis MB dapat diamati. Hal yang perlu diperhatikan adalah bahwa parameter nanopartikel baik NPs7.5/80 maupun NPs6.0/100 menunjukkan pertumbuhan padat seiring dengan waktu bertambah, hampir menunjukkan tren peningkatan linear selama 7 hari pertama, dan kemudian mencapai plat.
Kemudian, kami berfokus pada perilaku rilis MB dalam buffer pH yang berbeda untuk mengetahui apakah nanopartikel yang terdekomposisi diri dengan parameter tertentu dapat memiliki rilis MB yang bergantung secara linear pada pH.
Pertama, kami melakukan eksperimen rilis MB pada larutan buffer pH 4,0. Dari Gambar S13, kami dapat dengan mudah mencapai kesimpulan bahwa dengan jumlah TEOS yang sama yaitu 100 μL, kecepatan rilis MB menunjukkan tren yang serupa yang diamati dalam 5 sistem nanopartikel TEOS pada 80 μL (Gambar S14), korelasi positif dengan jumlah MB yang dikapsulasi.
MB yang terkonsentrasi menyebar ke dalam larutan sekitarnya melalui difusi karena perbedaan konsentrasi. Gradien konsentrasi yang lebih besar membuat rilis MB lebih cepat. Dibandingkan dengan rilis MB dalam air tawar, kami menemukan bahwa lingkungan asam mempercepat rilis MB (Gambar S13 dan S14 dibandingkan dengan Gambar S11 dan S12), yang menunjukkan bahwa rilis MB tidak hanya didorong oleh difusi; namun, dalam larutan asam, tolakan elektrostatis juga merupakan gaya dorong yang penting karena sifat positif muatan MB. Kami kemudian menghitung persentase rilis dari setiap parameter nanopartikel berdasarkan efisiensi pemuatan MB, kurva standar MB, dan rasio pengenceran pada pengukuran. Persentase rilis mencerminkan kecepatan rilis MB dalam larutan asam pH 4,0, dan hasilnya (Gambar 3) menunjukkan bahwa hanya persentase rilis NPs7.5/80 yang menunjukkan rilis linear dalam larutan pH 4,0. Sistem nanopartikel lain dengan parameter MB dan TEOS tertentu menunjukkan tren rilis yang serupa, dan persentase rilis tidak menunjukkan pertumbuhan linear. Satu pengecualian adalah NPs6/100, dan rilis MB mencapai plat dalam waktu hanya 72 jam; sehingga, sulit untuk mengetahui apakah rilis MB dapat tumbuh linear sebelum durasi ini pada tahap ini.
Persentase rilis MB dari 10 seri nanopartikel yang terdekomposisi diri setelah durasi tertentu dalam larutan buffer pH 4,0. Semua eksperimen diulang tiga kali, dan data disajikan sebagai rata-rata ± S.D.
Sementara itu, kami menguji profil rilis MB dalam buffer dekat-netral dan basa (pH 6,86 dan pH 9,18). Hasil di Gambar S15, S16, Gambar S17, dan S18 menunjukkan bahwa rilis MB melambat seiring dengan peningkatan pH larutan menjadi 6,86; lebih jauh, dengan peningkatan konsentrasi MB terpusat, persentase rilis MB menurun. Pada pH 9,18, semua nanopartikel dengan 10 parameter tertentu menunjukkan rilis MB yang sangat lambat (Gambar S19 dan S20); tidak dalam penyerapan UV–Vis atau persentase rilis, trennya serupa dengan yang ada dalam larutan buffer pH 6,86, tetapi dengan persentase rilis yang lebih rendah. Jadi, jelas bahwa nanopartikel yang terdekomposisi diri hanya menunjukkan pertumbuhan rilis MB yang linear dalam larutan asam. Kami mengingat kembali pH endo/lisosom, dari 4 hingga 5, yang tepat adalah rentang pH pertumbuhan linear MB sebagai fungsi waktu pada parameter MB/TEOS tertentu. Jadi, kami semakin yakin bahwa sistem nanopartikel yang terdekomposisi diri dapat menjadi alat ukur yang akurat untuk menentukan secara kuantitatif pH rata-rata endo/lisosom, kemudian memberikan bukti mengenai nilai pH yang tepat dari status otofagi.
Persyaratan untuk menggunakan nanopartikel yang terdekomposisi diri tertentu sebagai indikator pH endo/lisosom adalah bahwa nanopartikel tetap stabil dalam endo/lisosom selama seluruh proses pengukuran. Kedua, rilis MB dalam endo/lisosom harus terjadi dengan lancar saat pengukuran dilakukan.
Kolokalisasi nanopartikel dalam endo/lisosom melalui studi TEM sel dan rilis MB di 6 baris sel yang berbeda diteliti. Dari hasil TEM sel, semua 10 seri nanopartikel tetap berada dalam endo/lisosom tanpa melolos, setelah 24 jam inkubasi dengan sel HepG-2 (Gambar 4). Karena diameter sel HepG2 yang digunakan pada Gambar 4 sekitar 10–20 μm dan diameter nanopartikel MB@SiO2 antara 75 dan 200 nm, akan sangat sulit untuk menjelaskan morfologi nanopartikel menggunakan citra dengan pengendaran rendah (seperti yang ditunjukkan pada Gambar S21). Kami juga menyelidiki lokasi seluler nanopartikel di 5 baris sel lainnya, dan 4 nanopartikel dipilih secara acak untuk menunjukkan bahwa nanopartikel terperangkap dalam endo/lisosom (Gambar S22). Nanopartikel dengan semua parameter menunjukkan struktur terpusat-hollow di semua 5 baris sel lainnya setelah 24 jam inkubasi, yang menunjukkan rilis MB. Selain itu, dengan observasi yang lebih presisi, kami memperhatikan bahwa rilis MB mungkin berbeda karena ukuran terpusat yang berbeda, yang mengarah pada fakta bahwa (1) pH endo/lisosom di sel yang berbeda berbeda dan (2) rilis MB dari nanopartikel sangat sensitif terhadap pH endo/lisosom, terutama untuk NPs6/100 dan NPs7.5/80. Dari Gambar S23, kami dapat menemukan bahwa nanopartikel telah merealisasikan endositosis dan tinggal dalam vesikel 2 jam setelah pemberian nanopartikel, kemudian nanopartikel secara bertahap menumpuk di lisosom.
Kolokalisasi nanopartikel dalam endo/lisosom melalui studi TEM sel setelah 12 dan 24 jam inkubasi dengan 10 seri nanopartikel. Skala bar pada citra TEM adalah 200 nm
Kemudian kami mengevaluasi korelasi antara nilai pH dan nilai OD pada pH 4,0–4,8. Dari hasil pada Gambar 5 dan Gambar S24, untuk sistem nanopartikel NPs6/100 dan NPs7.5/80, rilis MB menunjukkan penurunan linear sebagai fungsi pH dalam rentang pH 4,0 hingga 4,8.
Rilis MB sebagai fungsi nilai pH dalam NPs6/100 dan NPs7.5/80 setelah durasi inkubasi tertentu, 6 jam, 12 jam, dan 24 jam. Persamaan korelasi linear juga dihitung untuk 6 jam dan 12 jam untuk rilis MB dari baik NPs6/100 dan NPs 7.5/80 sebagai fungsi nilai pH. Semua eksperimen dilakukan tiga kali, dan data disajikan sebagai rata-rata ± S.D.
Kemudian kami mengonversi nilai OD menjadi persentase rilis MB berdasarkan efisiensi pemuatan MB dan jumlah pemberian. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar S25, dalam 6 jam pertama, persentase rilis MB dalam sistem nanopartikel NPs6/100 dan NPs7.5/80 juga menunjukkan sebagai fungsi dari nilai pH. Kemudian kami menghitung jumlah kuadrat sisa dan koefisien korelasi Pearson pada durasi rilis 6 jam dan 12 jam, masing-masing, karena jumlah kuadrat sisa menunjukkan korelasi negatif dengan kekekalan pemasangan linear, sementara semakin dekat nilai mutlak koefisien korelasi Pearson ke 1, semakin linear itu. Seperti yang ditunjukkan pada Tabel S2 dan S3, tingkat linearitas tertinggi adalah pemasangan dari sistem nanopartikel NPs6.0/100, diikuti oleh pemasangan dari NPs7.5/80 pada rilis 6 jam.
Sampai saat ini, kami sangat bersemangat dengan hasilnya bahwa metode untuk memantau nilai pH secara akurat telah diriset, terutama dengan akurasi kurang dari atau sama dengan interval nilai pH 0,1. Artinya, kami memiliki kemungkinan besar untuk menemukan korelasi antara nilai pH endo/lisosom dan status otofagi, yang sangat penting untuk studi mekanisme otofagi yang lebih baik dan prediksi proses otofagi. Seperti yang dapat dilihat pada Gambar S26, rilis MB dalam sel HepG-2 telah mencapai plat setelah inkubasi selama 4 jam. Jadi, kami memilih 6 jam sebagai titik pengamatan.
Kemudian kami dengan hati-hati menyelidiki rilis MB dari NPs6.0/100 di 6 baris sel pada durasi interaksi sel nanopartikel 6 jam, termasuk baris sel kanker hati HepG-2, baris sel kanker usus besar HCT8, HCT 15, dan HCT 116, baris sel kanker paru-paru A549, dan baris sel melanoma mio Melanosit B16.
Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2, kami dengan jelas membedakan endo/lisosom di 6 baris sel kanker, dengan akurasi pada nilai pH 0,01, yang tidak dapat dilakukan dengan kit indikator pH intraokular komersial.
Selain itu, kami mengevaluasi ulang nilai pH dalam endo/lisosom sel HepG2 sebelum dan setelah dibudayakan dengan nanopartikel BPSi. Kami mencapai kesimpulan bahwa penyerapan BPSi secara signifikan meningkatkan nilai pH endo/lisosom, dari 4,70 ± 0,09 ke 5,59 ± 0,05, yang menggambarkan dengan sempurna alasan mengapa penyerapan BPSi memicu otofagi pada awalnya lalu menghentikan aliran otofagi. Pengambilan seluler BPSi membuat jumlah endo/lisosom meningkat, yang konsisten dengan hasil sequensi gen, yaitu gen terkait otofagi (TFEB-CLEAR) diaktifkan. Sementara itu, penghentian otofagi oleh peningkatan nilai pH dalam endo/lisosom juga sesuai dengan hasil peningkatan protein p62 dalam studi Western blot.
Diskusi
Nanopartikel umumnya dapat menyebabkan otofagi dalam sel [23], dan studi telah menunjukkan bahwa respons otofagi terhadap nanopartikel yang memiliki permukaan netral atau anionik melibatkan peningkatan pengangkatan muatan otofagi. Di sisi lain, paparan sel terhadap nanopartikel yang memiliki permukaan kationik menghasilkan penyesuaian transkripsi jalur TFEB, tetapi juga menyebabkan disfungsi lisosom, yang pada akhirnya mengakibatkan blokir aliran otofagi [7]. Dan hasil kami sesuai dengan kesimpulan sebelumnya ini. Dalam studi kami, kami menemukan bahwa ekspresi gen dan protein terkait otofagi dalam sel HepG2 telah meningkat setelah pemberian nanopartikel BPSi melalui sequensi transkriptom, RT-qPCR, dan eksperimen Western. Namun, tingkat ekspresi protein P62 terkait otofagi tidak menurun meskipun otofagi diaktifkan. Kami menyangka bahwa PEG-amina pada permukaan nanopartikel BPSi meningkatkan nilai pH lisosom, yang mengakibatkan inhibisi degradasi P62. Indikator pH lisosom yang ada tidak dapat memverifikasi dugaan kami. Untuk mengukur pH lisosom sel hidup dengan akurat, kami mendirikan metode baru untuk penentuan kualitatif pH endo/lisosom berdasarkan sistem nanopartikel yang terdekomposisi sendiri. Sepuluh sistem nanopartikel dengan parameter MB/TEOS tertentu digunakan untuk mendapatkan metode pengukuran yang sensitif terhadap pH yang dioptimalkan. Gradien konsentrasi MB radial dari dalam ke luar berfungsi sebagai gaya dorong utama untuk rilis MB. Rilis obat berlangsung bersamaan dengan dekomposisi pembawa, yang didorong oleh mekanisme yang dikendalikan difusi. Selain itu, seiring dengan penurunan nilai pH, konsentrasi ion hidrogen meningkat, dan interaksi elektrostatis yang ditingkatkan mempromosikan rilis MB dari dalam lebih cepat daripada dalam larutan netral [24]. Sistem nanopartikel terpusat-hollow yang dioptimalkan dapat merilis MB yang terkonsentrasi di tengah sebagai fungsi linear dari nilai pH yang tepat dalam rentang pH 4,0–4,8, yang tepat adalah pH lisosom. Akhirnya, dengan indikator pH kualitatif ini berdasarkan nanopartikel yang terdekomposisi diri, kami berhasil mendeteksi nilai pH rata-rata lisosom di 6 baris sel. Selain itu, dengan sistem ini, kami dapat secara kualitatif membedakan perubahan pH lisosom sebelum dan setelah endositosis nanopartikel BPSi oleh sel HepG-2, menjelaskan mekanisme terjadinya otofagi dan kemudian penghentiannya setelah endositosis BPSi. Sistem nanopartikel yang terdekomposisi diri membuka jalan baru yang luar biasa untuk mempelajari nilai pH lumen, menyediakan alat baru untuk mengetahui lebih baik sinyal dan metabolisme sel, dan kemudian menyediakan cara dan metode baru untuk pengobatan kanker [25, 26].
Kesimpulan
Dalam studi ini, kami menemukan bahwa BPSi dapat mempromosikan otofagi sel melalui sequensi transkriptom, tetapi grup amino pada permukaan nanopartikel dapat meningkatkan pH lisosom dan menghambat degradasi aliran otofagi. Jadi, pH lisosom sangat mempengaruhi tahapan otofagi. Dan memperoleh informasi pH lisosom yang tepat akan mempromosikan pemahaman otofagi. Namun, indikator pH lisosom fluoresens yang ada hanya dapat menentukan rentang pH lisosom yang luas; oleh karena itu, kami mendirikan indikator pH lisosom yang tepat berdasarkan sistem terdekomposisi sendiri. Dengan menyesuaikan parameter sintesis MB@SiO2, rilis MB yang dimuat pada nanopartikel berkorelasi linear dan negatif dengan pH. Dan nanopartikel terutama tinggal dalam lisosom setelah masuk ke dalam sel. Dengan mengukur jumlah MB yang dirilis dalam sel, nilai pH lisosom dapat dihitung dengan tepat sesuai dengan fungsi linear. Indikator pH yang tepat yang diriset menyediakan alat dan metodologi baru yang luar biasa untuk mempelajari nilai pH lisosom secara akurat dan kemudian memperoleh lebih banyak informasi tentang otofagi.
Ketersediaan Data dan Bahan
Semua data yang dihasilkan atau dianalisis selama studi ini termasuk dalam artikel ini dan file informasi pelengkapnya.
