Studi Pembentukan dan Aplikasi pada Indikator pH Lisosom yang Tepat Berdasarkan Nanopartikel yang Dapat Diurai Sendiri
Abstrak
PH asam lisosom terkait erat dengan autophagy; dengan demikian, lisosom yang diketahui dengan tepat, perubahan pH akan memberikan lebih banyak informasi tentang proses dan status autophagy. Sejauh ini, bagaimanapun, hanya perubahan pH dalam kisaran yang relatif luas yang dapat diindikasikan, deteksi pH lisosom yang tepat belum pernah tiba. Dalam penelitian kami, kami menetapkan indikator pH endo/lisosom berdasarkan SiO yang dapat terurai sendiri2 sistem nanopartikel dengan parameter sintesis tertentu. Biru metilen terkonsentrasi pusat (MB) dalam nanopartikel struktural berongga pusat menyajikan pelepasan sensitif sebagai fungsi dari nilai pH dari pH 4.0–4.8, yang merupakan kisaran pH lisosom. Korelasi linier dari nilai densitas optik (OD) dan nilai pH telah dibangun, yang telah digunakan untuk mendeteksi pH lisosom dalam 6 garis sel yang berbeda. Selain itu, dengan sistem ini, kami berhasil mendeteksi secara tepat perubahan rata-rata pH lisosom sebelum dan sesudah endositosis NP silikon mesopori hitam (BPSi), mengklarifikasi mekanisme penghentian autophagy setelah endositosis BPSi. Jadi, indikator pH luminal berbasis nanopartikel yang dapat terurai sendiri dapat memberikan metodologi dan strategi baru untuk mengetahui pH lisosom dengan lebih baik, kemudian menunjukkan detail lebih lanjut tentang proses autofagi atau sinyal penting lainnya tentang metabolisme.
Pengantar
Lisosom berfungsi sebagai tujuan akhir makromolekul, di mana makromolekul ini didegradasi oleh enzim hidrolitik yang diaktifkan oleh pH rendah [1]. PH asam lisosom yang dipertahankan oleh tipe vakuolar H + −ATPase (v-ATPase) [2] yang memompa proton dari sitoplasma ke dalam lumen lisosom adalah untuk menjaga aktivitas ~ 60 jenis enzim hidrolitik [3]. Selain itu, laporan literatur terbaru mengungkapkan bahwa pH asam lisosom terkait erat dengan autophagy [4], sehingga perubahan pH lisosom yang tepat akan memberikan informasi lebih lanjut tentang proses dan status autophagy. Berdasarkan studi dan tinjauan literatur kami, endositosis nanopartikel bermuatan positif amina mungkin akan meningkatkan perubahan pH pada endo/lisosom, seperti nanopartikel berdekorasi PEG amina primer dan sekunder atau beberapa dekorasi hidrofilik pada permukaan partikel [5, 6].
Peningkatan pH yang diinduksi oleh endositosis nanopartikel amina akan secara dramatis meningkatkan lokalisasi nukleus faktor transkripsi EB (TFEB), menghasilkan tidak hanya peningkatan regulasi transkripsi jalur, tetapi juga menyebabkan disfungsi lisosom, yang pada akhirnya mengakibatkan penyumbatan fluks autofagik. 7,8,9]. Karena TFEB mengatur autophagy, dan akibatnya, ekspresi berlebihnya mengarah pada peningkatan yang signifikan dalam produksi autophagosome dalam sel yang dikultur.
Jadi, untuk memprediksi proses autophagy dan detail autophagy, pH lisosom yang tepat dan pengukuran perubahannya sangat penting. Sampai sekarang, dari nilai pH endo/lisosom yang menunjukkan tinjauan literatur [10] dan produk komersial untuk mendeteksi nilai pH endo/lisosom, hanya perubahan pH dalam kisaran yang relatif luas yang dapat diindikasikan, dan deteksi pH lisosom yang tepat belum pernah tiba. . Jadi, untuk mengetahui detail wawasan autophagy, penetapan metode deteksi perubahan pH luminal yang tepat merupakan pendekatan yang penting.
Berdasarkan pengalaman kami sebelumnya tentang SiO yang dapat terurai sendiri2 nanopartikel, dalam penelitian ini, kami menetapkan indikator pH yang tepat yang dapat mewujudkan deteksi perubahan pH luminal. SiO2 nanopartikel memiliki keunggulan baik dalam ukuran merdu dan biokompatibilitas [11]. Dengan menetapkan parameter sintesis tertentu, SiO yang dapat terurai sendiri2 Indikator pH dapat secara sensitif melepaskan payload methylene blue (MB) pada pH 4.0–4.8, yang merupakan kisaran pH lisosom. Selain itu, pelepasan MB menunjukkan korelasi linier dengan perubahan nilai pH (skema 1). Kemudian, kami menguji kelayakan indikator pH pada tingkat sel dengan memperkenalkan 6 garis sel yang berbeda, berhasil menentukan perubahan pH rata-rata lisosom sebelum dan sesudah endositosis NP silikon mesopori hitam (BPSi), mengklarifikasi mekanisme penghentian autophagy setelah BPSi endositosis. Jadi, indikator pH luminal berbasis nanopartikel yang dapat terurai sendiri dapat memberikan metodologi dan strategi baru untuk mengetahui pH lisosom dengan lebih baik, kemudian menunjukkan detail lebih lanjut tentang proses autofagi atau sinyal penting lainnya tentang metabolisme.
Ilustrasi skema MB@SiO2 pengukuran pH lisosom dalam sel hidup
Bahan dan Metode
Bagian Materi
Natrium silisida (NaSi) dan wafer Si (diameter 20 cm, p + (100), 0,01–0,02 Ω cm) masing-masing disediakan oleh SiGNa Chemistry Inc. dan Ocmetic Inc.. Amonium bromida (NH4 Br, 99%), natrium bromida (NaBr, 99%), toluena (anhidrat, 99,8%), asam klorida (HCl, 37%), MB, dan tetraetil ortosilikat (TEOS) dibeli dari Sigma-Aldrich. 0,5 kDa metoksi-PEG-silane dan 2 kDa metoksi-PEG-silane dibeli dari Fluorochem Ltd. dan Laysan Bio Inc. secara terpisah. Media RPMI 1640 disediakan oleh Life Technologies. Fetal bovine serum (FBS) dibeli dari teknologi biologis TianHang. Sodium bicarbonate, streptomycin sulfate, penicillin G, HEPES, Lysozyme Solution, CellLight Early-endosomes-GFP, LysoTracker™ Red DND-99, Pierce® BCA Protein Assay Kit, peningkatan chemiluminescence, pHrodo™ Red Transferrin conjugate, Live Cell Imaging Solution, dan Reagen trizol dibeli dari Thermo Fisher Scientific. Etanol dan amonia-air disediakan oleh Sinopharm. BioRT Master HiSensi cDNA First-Strand Synthesis kit dibeli dari Hangzhou Bioer Technology Co., Ltd. RIPA lysate dibeli dari Heart Biological Technology Co., Ltd. P62, TFEB, dan antibodi -aktin dibeli dari Proteintech Group , Inc. Antibodi LC 3B disediakan oleh Abcam. 2-(4-Pyridyl)-5-((4-(2-dimethylaminoethy-laminocarbamoyl) methoxy) phenyl) oxazole (PDMPO) disediakan oleh Yeasen Biotech Co., Ltd.
Tujuan, Desain, dan Setting Studi
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk (1) mengeksplorasi pengaruh nanopartikel BPSi pada autophagy di sel HepG2, (2) mengetahui mekanisme di bawah perubahan nilai pH lisosom yang mempengaruhi autophagy, (3) menetapkan indikator pH lisosom yang tepat yang dapat mengukur pH lisosom dengan tepat, dan akhirnya, (4) menunjukkan pengaruh fluktuasi pH pada autophagy. Untuk mewujudkan tujuan penelitian di atas, kami menggunakan eksperimen sekuensing transkriptom untuk mengeksplorasi perubahan gen transkriptom dalam sel HepG2 setelah memberi makan nanopartikel BPSi dan memverifikasinya dengan RT-qPCR dan eksperimen Barat. Pewarna fluoresen seperti PDMPO digunakan untuk mengukur perubahan pH lisosom dalam sel HepG2 setelah memberi makan BPSi. Untuk mengukur pH lisosom dengan tepat, kami mengembangkan MB@SiO2 nanopartikel dengan 10 parameter dan menguji karakterisasi dari 10 jenis nanopartikel tersebut melalui eksperimen seperti DLS dan HR-TEM. Studi efisiensi pemuatan MB dan kinetika pelepasan dari 10 seri sistem nanopartikel yang dapat terurai sendiri diuji dalam larutan pH dan sel HepG2 yang berbeda. Untuk memverifikasi lokasi intraseluler nanopartikel setelah memasuki sel, kami melakukan percobaan TEM sel dan mikroskop confocal sel hidup. Akhirnya, kami mengukur perubahan pH lisosom dalam 6 jenis sel setelah memberi makan BPSi untuk memverifikasi universalitas MB@SiO2 nanopartikel untuk mengukur perubahan pH lisosom.
Sintesis Nanopartikel BPSi
Nanopartikel BPSi disiapkan dengan metode kami sebelumnya [12] dan dipasok oleh kolaborator kami (Wujun Xu, Departemen Fisika Terapan, Universitas Finlandia Timur). Pembuatan BPSi, NaSi, garam amonium, dan NaBr (NaSi:NH4 Br:NaBr 1:4:4, b/b/b) ditumbuk dalam kotak sarung tangan dengan atmosfer Ar. Mereka diizinkan untuk bereaksi dalam oven tabung di bawah N2 atmosfer pada 240 °C selama 5 h (Persamaan 1). Setelah didinginkan hingga suhu sekitar, mikropartikel yang diperoleh dimurnikan dengan membilasnya dengan larutan HCl 0,5 M dan HF 1,0 M secara terpisah. Mikropartikel digiling bola dalam etanol pada 1000 rpm selama 15 min, dan nanopartikel BPSi dengan diameter yang diinginkan dikumpulkan melalui penyesuaian kecepatan sentrifugasi.
Melalui percobaan Dynamic Light Scattering, distribusi diameter dan muatan permukaan nanopartikel dipelajari. Semua NP tersebar di media setelah sterilisasi dengan sedikit ultrasonikasi (5 s untuk membuatnya tersebar merata dalam larutan, Pembersih ultrasonik SB-5200DT, Ningbo Scientz Biotechnology Co., Ltd.) tepat sebelum pengenalannya ke sel.
Pembentukan Sistem Nanopartikel Self-Decomposable 10 Seri
10 seri nanopartikel self-decomposable disintesis dengan metodologi yang kami laporkan sebelumnya [13,14,15,16], dengan parameter yang dimodifikasi. Dalam prosedur yang khas, sejumlah MB pertama-tama ditambahkan ke campuran etanol (75 mL) dengan larutan amonia-air (25%, 3,4 mL), setelah itu sejumlah TEOS ditambahkan. Seri MB@SiO yang dapat diurai sendiri2 NP diperoleh setelah diaduk selama 24 jam dan dicuci 3 kali sebelum dikeringkan. Jumlah MB dan TEOS yang ditambahkan dalam protokol seperti yang dijelaskan pada Tabel 1. Arti 1.0/100 dalam NP1.0/100 mewakili inventaris MB dan TEOS ketika kami mensintesis nanopartikel, dengan 1,0 mg MB dan 100 μL TEOS. Dan arti 1.5/100 dalam NP1.5/100 dan lainnya konsisten dengan 1.0/100.
Budaya Sel
Untuk menguji efisiensi dan universalitas indikator pH berdasarkan nanopartikel yang dapat terurai sendiri, kami mencoba mengujinya pada garis sel kanker turunan tumor tertentu. Oleh karena itu, kami memilih kanker hati, kanker paru-paru, kanker usus besar, dan garis sel melanositoma sebagai objek penelitian. Garis sel sel kanker usus besar manusia HCT116, HCT8, dan HCT15; sel kanker hati manusia HepG-2; sel kanker paru-paru manusia A549; dan sel melanoma tikus B16 dipertahankan dalam media RPMI 1640 (Life Technologies) yang dilengkapi dengan 10% FBS yang tidak diaktifkan panas, 2,0 g/L natrium bikarbonat, 0,1 g/L streptomisin sulfat, 0,06 g/L penisilin G, dan 5,958 g/L HEPES. Sel-sel dipelihara dalam inkubator kultur sel standar pada 37 °C dalam atmosfer yang dilembabkan dengan 5% CO2 .
Karakterisasi 10 Seri Sistem Nanopartikel yang Dapat Diurai Sendiri
Morfologi semua nanopartikel seri dikarakterisasi dengan HR-TEM dengan mode STEM, dan pemetaan Si dipelajari dengan pemetaan elemen EDS. Analisis distribusi ukuran nanopartikel dilakukan oleh perangkat lunak ImageJ dengan menghitung diameter nanopartikel pada gambar STEM yang dipilih secara acak. Potensi zeta nanopartikel dan indeks polidispersitas (PDI) telah diukur dengan studi hamburan cahaya dinamis (DLS), dalam buffer seri dengan nilai pH tertentu. Data dianalisis dengan SPSS15.0 dan hasil statistik disajikan sebagai mean ± S.D.
Studi Efisiensi Pemuatan dan Kinetika Rilis MB dari 10 Seri Sistem Nanopartikel yang Dapat Diurai Sendiri
Untuk mempelajari efisiensi pemuatan MB dan kinetika pelepasan, kurva standar MB dalam konsentrasi seri pertama kali dibuat. Penyerapan MB dilakukan dengan spektrum UV–Vis dengan absorbansi pada 660 nm, yaitu λ maks dari monomer MB. Efisiensi pemuatan MB dihitung dengan persamaan di bawah ini, efisiensi pemuatan MB (%) = jumlah MB yang dienkapsulasi/(jumlah total input MB).
Pelepasan MB dari 10 seri nanopartikel dipelajari dalam air murni dan buffer pH dengan nilai pH yang berbeda (pH 4.0, pH 6.86, dan pH 9.18) dan Larutan Lisozim (Thermo Scientific™
#
90082). Selain itu, kinetika pelepasan MB setelah durasi tertentu dalam buffer pH yang berbeda juga diselidiki. Nilai OD pada 660 nm dan persentase pelepasan MB sebagai fungsi waktu kemudian dipelajari.
Secara lebih rinci, studi rilis MB dilakukan oleh protokol di bawah ini; melarutkan 10 nanopartikel seri dalam buffer standar 15 mL pH 4,0, 6,86, dan 9,18 masing-masing dengan larutan lisosom; dan melakukan pelepasan MB dalam mixer Hula pada 37 °C. Selama 15 hari berikutnya, 1 mL dari setiap sampel dikumpulkan, kemudian disentrifugasi pada 12000 rpm selama 10 min. Supernatan dan endapan diukur spektrum serapannya pada 200–800 nm.
Selain itu, pelepasan MB dalam buffer pH yang tepat dengan larutan lisozim dalam kisaran pH dari 4,1 hingga 5,5 juga diselidiki dengan protokol yang sama di atas. Durasi waktu tertentu (6 h, 12 h, dan 24 h) ditempatkan sebagai titik waktu pengamatan. Penyerapan pada 660 nm dicatat di setiap sampel. Hubungan linier penyerapan masing-masing larutan pH dan jumlah kuadrat residu dihitung masing-masing pada setiap titik waktu.
Untuk mendeteksi profil pelepasan MB dalam sel, sel HepG-2 dikultur dalam ukuran 75 cm
2
labu kultur dan diberi makan dengan NP (300 μg/mL) ketika sel diproliferasikan hingga 70% dari labu kultur. Setiap 30 menit kemudian, sel-sel dikumpulkan. Sel-sel dibekukan berulang kali dan dicairkan untuk melepaskan MB di dalam sel sepenuhnya. Lysates sel disentrifugasi pada 12000 r/min selama 10 min. Supernatan diperoleh dan diukur absorbansinya pada 660 nm untuk menghitung jumlah total MB yang dilepaskan. Dalam penelitian ini, sel HepG2 dipilih sebagai objek penelitian, karena proliferasi selnya yang cepat sehingga dapat meminimalkan varians di antara 10 kelompok yang diuji.
Kolokalisasi Seluler dari 10 Seri Nanopartikel dan Performa Rilis dalam 6 Garis Sel Berbeda
Sel TEM digunakan untuk mempelajari kolokalisasi nanopartikel dalam endo/lisosom mengikuti protokol TEM sel standar. Sel diunggulkan dalam intensitas 1 × 10
6
sel / labu dan diinkubasi selama 24 jam, memungkinkan perlekatan sel. Sepuluh seri nanopartikel dalam medium dengan konsentrasi yang sama (100 μg/mL) diinkubasi dengan sel masing-masing selama 12 dan 24 h. Sel kemudian dicuci dengan PBS selama 3 kali untuk menghilangkan kelebihan nanopartikel, kemudian difiksasi dalam larutan glutaraldehid 2,5% selama lebih dari 1 hari. Sel-sel tetap kemudian dicuci dan diwarnai dengan osmium tetroksida, 1% dalam air deionisasi selama 1 jam, diikuti dengan pencucian dengan PBS selama 3 kali dan air DI selama 2 kali. Protokol TEM sel klasik [17, 18] dilakukan selanjutnya, dan bagian dengan ketebalan 90 nm dikumpulkan untuk observasi TEM. Pelepasan MB sebagai fungsi dari nilai pH dipelajari dalam 6 baris sel dengan kedua NP6/100 dan NP7.5/80 . Juga, nilai OD dari rilis MB dan persentase rilis MB dicatat untuk analisis data.
Mikroskop confocal sel hidup digunakan untuk menilai serapan seluler dan nasib intraseluler MB@SiO2 nanopartikel. Endosom awal sel HepG-2 diwarnai (CellLight Early-endosomes-GFP, BacMam 2.0 ThermoFisher Scientific C10586, dengan eksitasi/emisi ~ 488/510 nm) selama 16 h. Dan kemudian sel diinkubasi dengan NP6/100 (eksitasi/emisi MB:640/650–700 nm) pada konsentrasi nanopartikel 100 μg/mL pada interval waktu tertentu (2 h, 2.5 h, 3 h, 5 h, dan 6 h). Sebelum gambar diambil, lysotracker diwarnai dengan LysoTracker™ Red DND-99 (Thermo Fisher Scientific L7528, eksitasi/emisi:577/590 nm) selama 40 mnt. Setelah itu, keluarkan larutan noda dan cuci sel 2-3 kali dalam PBS. Gambar diambil menggunakan Mikroskop Confocal Nikon A1R.
Pengurutan Transkriptome untuk Mengevaluasi Perubahan Ekspresi Gen setelah Pemberian BSi
Ekstraksi RNA total dari kelompok kontrol dan kelompok yang diobati dengan BPSi dilakukan dengan menggunakan reagen Trizol mengikuti prosedur operasi standar. Kualitas sampel RNA total awal untuk percobaan sekuensing dideteksi menggunakan spektrofotometer NanoDrop ND-2000. Total RNA yang lolos kontrol kualitas digunakan dalam eksperimen sekuensing berikutnya. Perbandingan ekspresi gen dilakukan dengan sekuensing generasi berikutnya. Semua program pengurutan dilakukan oleh BGI-Shenzhen Corporation (Shenzhen, Cina) menggunakan platform BGISEQ-500. Data mentah yang diperoleh dengan pengurutan dilakukan pengendalian kualitas untuk menentukan apakah data pengurutan tersebut sesuai untuk analisis selanjutnya. Jika lolos, lakukan analisis kuantitatif gen berdasarkan tingkat ekspresi gen dan lakukan analisis pengayaan signifikan fungsi ontologi gen (GO) pada gen yang diekspresikan secara berbeda di antara sampel yang dipilih.
Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR) Assay untuk Mengonfirmasi Aktivasi Jaringan Gen TFEB-CLEAR
Total RNA diekstraksi dari sel-sel HepG-2 yang dikultur dari kelompok kontrol dan perlakuan BPSi dengan menggunakan reagen Trizol dan ditranskripsi balik ke cDNA dengan menggunakan BioRT Master HiSensi cDNA First-Strand Synthesis Kit (Hangzhou Bioer Technology Co., Ltd .) dengan primer acak. cDNA digunakan untuk memperkuat jaringan gen TFEB-CLEAR dengan PCR kuantitatif dengan sistem PCR real-time Applied Biosystems™ 7500 (Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, CA) dengan aktin sebagai kontrol referensi. Primer yang digunakan untuk RT-PCR kuantitatif tercantum dalam Tabel S4.
Western Blot Assay untuk Mengonfirmasi bahwa Autophagy Diaktifkan setelah Pemberian BPSi
Protein seluler dari kelompok kontrol dan kelompok perlakuan BPSi konsentrasi berbeda diekstraksi dengan RIPA lisat (Heart Biological Technology Co., Ltd.). Protease inhibitor ditambahkan ke lisat RIPA dan didinginkan sebelumnya di atas es. Mencuci sel 3 kali dengan PBS yang telah didinginkan sebelumnya. Buang cairan sepenuhnya dan masukkan piring ke dalam es selama 2 menit. Empat ratus mikroliter RIPA lisat ditambahkan ke permukaan seluruh cawan, dipipet beberapa kali dengan pipet, dan diinkubasi di atas es selama 30 menit, di mana cawan dikocok beberapa kali untuk melisiskan sel sepenuhnya. Cairan sel yang dilisiskan dipindahkan ke tabung Eppendorf 1 ml dan disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 10 min, 4 °C. Supernatan yang diperoleh direbus dalam air selama 10 menit dan ditempatkan di – 20 ° C untuk digunakan nanti. Konsentrasi protein diukur menggunakan Pierce® BCA Protein Assay Kit (Ilmuan termo).
Ekstrak sel yang mengandung 25 μg protein total secara langsung menjadi sasaran SDS-PAGE dan ditransfer. Membran diblokir dengan susu skim 5% dan diperiksa dengan antibodi primer yang mengenali P62 (Proteintech
#
18420–1-AP), TFEB (Proteintech # 13372–1-AP), LC 3B (Abcam
#
ab192890), dan -aktin (Proteintech
#
20536-1-AP). Antibodi sekunder dipilih menurut spesies asal antibodi primer dan dideteksi dengan peningkatan chemiluminescence (Pierce) atau dengan menggunakan Bio-Rad ChemiDoc XRS + Gel Imaging System (Bio-Rad, USA). Intensitas pita yang dinormalisasi dari P62, TFEB, dan LC 3B relatif terhadap -aktin dikuantifikasi dengan densitometri menggunakan perangkat lunak ImageJ dalam kelompok BPSi, dan datanya adalah mean ± S.D. dari tiga eksperimen independen.
Mengukur pH Sel dengan PDMPO dan pHrodo™ Red Transferin Conjugate dengan Confocal Microscopy
Studi PDMPO
1 × 10
5
Sel HepG-2 dikultur pada pelat confocal steril semalaman dan nanopartikel BPSi diberi makan dengan konsentrasi 100 μg/mL. Keesokan harinya, sebelum pewarnaan imunofluoresensi, slide dicuci tiga kali dengan saline buffer fosfat (PBS) 0,01 M, pH 7,4, kemudian ditambahkan pewarna PDMPO 1 μM (Ex/Em = 329/440). Setelah dicuci dengan PBS selama tiga kali, sel diinkubasi dengan media kultur RPMI-1640 segar dan diamati di bawah mikroskop fluoresensi (Nikon A1R, Jepang) dengan kamera CCD dan mengambil gambar dalam waktu 5 menit, dan rasio intensitas fluoresensi biru dan hijau dalam lisosom kemudian dihitung menurut prosedur Chen et al. [19].
Studi Konjugat Transferin Merah pHrodo™
Sel-sel HepG-2 dilapisi dalam pelat confocal dengan cara yang sama untuk perlekatan sel selama 24 jam, kemudian menyimpan pelat di atas es selama 10 menit. Sel dicuci dengan Live Cell Imaging Solution dingin yang mengandung 20 mM glukosa dan 1% BSA. Ditambahkan pHrodo™ Red Transferrin conjugate (Ex/Em = 560//585 nm) pada 25 μg/mL dalam Live Cell Imaging Solution dan inkubasi pada 37 °C selama 20 min, kemudian cuci sel dalam Live Cell Imaging Solution. Pengamatan juga dilakukan dengan mikroskop confocal. Analisis kuantitatif intensitas gambar mikroskopis dilakukan oleh perangkat lunak ImageJ.
Deteksi pH Lisosom Sel
Sel A549, HepG-2, HCT8, HCT15, HCT116, dan B16 dikultur dalam 75 cm
2
labu kultur dan diberi makan dengan NP ketika sel-sel berkembang biak hingga 70% dari labu kultur, dan 6 jam kemudian, sel-sel dikumpulkan. Sel-sel dibekukan berulang kali dan dicairkan untuk melepaskan MB di dalam sel sepenuhnya. Lysates sel disentrifugasi pada 12000 r/min selama 10 min. Supernatan diperoleh dan diukur absorbansinya pada 660 nm untuk menghitung jumlah total MB yang dilepaskan. Absorbansi NP6.0/100 pada pH standar dibandingkan untuk mendapatkan nilai pH masing-masing sel.
Analisis Statistik
Analisis statistik dilakukan dengan software SPSS15.0 dengan menggunakan two-way analysis of variance (ANOVA) untuk kelompok bebas dan menggunakan metode Tukey HSD untuk uji perbandingan berganda. Signifikansi statistik didasarkan pada nilai P < 0,05.
Hasil dan Diskusi
Kami pertama kali mendeteksi ekspresi gen diferensial ketika sel-sel yang diberi makan dengan nanopartikel silika berpori hitam fungsional ganda PEG (BPSi NPs) (ditawarkan oleh lab kolaborasi kami [12]). Perubahan potensial zeta dari 18.5 menjadi + 2.8 mV juga menunjukkan bahwa permukaan dual-PEGylation berhasil (Gbr. S1a). Diameter rata-rata nanopartikel BPSi adalah 156 nm (Gbr. S1b). Berdasarkan peta panas cluster ekspresi gen diferensial (Gbr. S2), kami memilih lebih dari 2 kali lipat ekspresi gen diferensial untuk penyelidikan lebih lanjut. Go dan KEGG diperkenalkan untuk menganalisis gen diferensial. Dari peta gelembung pengayaan Go (Gbr. 1a), gen metabolik dan terkait lisosom termasuk perakitan fagolisosom, fagositosis, dan proses metabolisme xenobiotik dipilih untuk analisis lebih lanjut. Khususnya, ekspresi gen terkait TFEB-CLEAR [17] meningkat secara signifikan. Hasil RT-PCR (Gbr. 1b) juga memverifikasi hasil sekuensing gen, gen pada TFEB - jalur ekspresi lisosom terkoordinasi, dan regulasi (CLEAR) meningkat secara signifikan, seperti CTSD, CTSF, TFEB, MFN1, LAMP2, dan TPP1 . Gen-gen ini telah ditandai pada jalur lisosom, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. S3. Ekspresi mereka lebih tinggi daripada kelompok kontrol dan memiliki signifikansi statistik (PKontrol BPi VS <0,05). Dan TFEB secara positif mengatur ekspresi gen lisosom, mengontrol populasi lisosom, dan mendorong degradasi seluler substrat lisosom.
Autophagy diaktifkan dalam sel HepG-2 setelah memberi makan BPSi. a Peta gelembung pengayaan GO dari gen yang diekspresikan secara berbeda yang ditemukan oleh sekuensing transkriptom. b Verifikasi perubahan gen dalam jaringan gen TFEB-CLEAR setelah BPSi diobati dengan eksperimen RT-qPCT. c Ekspresi protein P62, TFEB, LC3B II/I setelah perlakuan BPSi. d Intensitas abu-abu pita yang dinormalisasi dari protein P62, TFEB, LC3B II/I pada kelompok yang diobati dengan BPSi menurut kelompok kontrol. Data disajikan sebagai rata-rata ± S.D.
Selain itu, TFEB mengatur autophagy, dan ekspresi berlebihnya menyebabkan peningkatan yang signifikan dalam produksi autophagosome dalam sel yang dikultur karena fakta bahwa fungsi utama gen TFEB adalah untuk menginduksi biosintesis lisosom dan mempromosikan terjadinya autophagy [20]. Analisis Western blot juga digunakan untuk memberi kesaksian apakah autophagy terjadi ketika sel diberi makan dengan NP BPSi. Tujuan dari tes Barat adalah untuk mengkonfirmasi lebih lanjut bahwa ekspresi TFEB meningkat dan terjadinya autophagy sel setelah makan BPSi. Protein LC3B dan P62 keduanya merupakan penanda autophagy. Ketika autophagy terjadi, ekspresi protein terkait mikrotubulus 1A/1B-light chain 3B (LC3B) II/I meningkat. p62 adalah reseptor untuk vesikel yang akan didegradasi oleh autophagy dan juga merupakan reseptor untuk agregat protein ubiquitinated untuk dibersihkan, dan ekspresinya menurun ketika autophagy terjadi. Jadi kami mengukur ekspresi protein ini dalam eksperimen Barat.
Dari hasil Western blot ditunjukkan pada Gambar 1c, d, TFEB (P80 g/ml Kontrol VS = 0,000008), LC3B II/I (P80 g/ml Kontrol VS = 0.000297), dan hal.62 (P80 g/ml Kontrol VS = 0,000016) protein semuanya diregulasi secara signifikan. Karena peningkatan regulasi protein TFEB dan LC3B II/I yang mengindikasikan aktivasi autophagy [18], kami menduga bahwa endositosis BPSi mendorong terjadinya autophagy. Namun, protein p62 seharusnya diturunkan regulasinya selama proses autophagy, karena sifat protein pembawa yang membawa endosom ke lisosom dan akhirnya terdegradasi. Dalam penelitian kami, peningkatan regulasi p62 yang signifikan mengindikasikan penghentian degradasi selama proses fusi endo-lisosom [21], yang mungkin disebabkan oleh peningkatan pH dalam vesikel endo-lisosom. Dengan demikian, endositosis BPSi pertama-tama dapat menginduksi terjadinya autophagy, kemudian menghambat proses autophagy dengan meningkatkan nilai pH endo/lisosom, karena alkalinitas amidanya.
Untuk membuktikan karakteristik peningkatan pH dalam endo/lisosom oleh endositosis BPSi, dua probe fluoresen pH komersial digunakan dalam penelitian kami, pHrodo™ Red Transferrin Conjugate (Thermo Fisher
#
P35376), dan RatioWorks™ PDMPO.
pHrodo™ Red sebagai indikator pH intraseluler komersial biasanya berpendar lemah pada pH netral tetapi meningkat berpendar saat pH turun. Itu seharusnya mengukur pH sitosol seluler dalam kisaran 9–4 dengan pKa ~ 6,5 dengan eksitasi/emisi 560/585 nm. Kami dapat memperoleh kesimpulan analisis kualitatif dari 6 penentuan garis sel bahwa endositosis NP BPSi memiliki kemampuan meningkatkan nilai pH dalam endo/lisosom, karena melemahnya sinyal fluoresen merah (Gbr. S4 dan S5). Namun, setelah mengulangi percobaan beberapa kali mengikuti protokol operasi produk, kami hampir tidak menganalisis secara kuantitatif nilai pH pasti yang menurun di antara garis sel yang berbeda sebelum atau setelah memberi makan dengan NP BPSi karena tidak ada korelasi antara intensitas dan nilai pH yang ditetapkan.
PDMPO kemudian digunakan sebagai solusi yang lebih baik untuk menunjukkan perubahan nilai pH setelah endositosis BPSi, yang memperkenalkan teknik pencitraan rasio dalam pengukuran kuantitatif pH. PDMPO [2-(4-pyridyl)-5-((4-(2-dimethylaminoethy-laminocarbamoyl) methoxy) phenyl) oxazole] dicirikan sebagai probe pH asidotropik dual-eksitasi dan emisi ganda. Ini memancarkan fluoresensi hijau intens pada pH rendah dan memberikan fluoresensi biru intens pada pH tinggi. Fluoresensi unik yang bergantung pada pH ini menjadikan PDMPO sebagai probe pH yang ideal untuk organel asam dengan pKa = 4.47. PDMPO secara selektif melabeli organel asam (seperti lisosom) sel hidup dan dua puncak emisi yang berbeda dapat digunakan untuk memantau fluktuasi pH sel hidup dalam pengukuran rasio. Namun, kami masih gagal dalam mengukur nilai pH di 6 baris sel sebelum dan sesudah pemberian makan BPSi. Seperti hasil yang ditunjukkan pada Gambar. S6, tidak ada perbedaan signifikan yang diamati pada semua 6 baris sel sebelum dan sesudah pemberian makan BPSi. Meskipun korelasi telah ditetapkan antara Rasio Biru/Hijau dan nilai pH (Gbr. S7), korelasi nonlinier dari pH 4–5 membuat metode PDMPO gagal dalam analisis kuantitatif endo/lisosom sebelum dan sesudah pemberian BSi.
Dari data dua indikator pH komersial di atas, pertama-tama kami menunjukkan dugaan kami bahwa nanopartikel berhias PEG dengan amida pada rantai PEG dapat membuat pH endo/lisosom meningkat karena sifat basa amida. Namun, tanpa analisis kuantitatif dari perubahan pH yang tepat (rentang pH 0,1), kami masih tidak dapat menetapkan korelasi antara status autofagi dan nilai pH endo/lisosom, sehingga gagal dalam prediksi autofagi.
Berdasarkan penelitian kami sebelumnya pada nanopartikel yang dapat terurai sendiri [13, 14] [15, 22], kami mempertahankan konsentrasi amonium hidroksida yang sama dalam etanol 75%, tetapi menyesuaikan konsentrasi MB dan TEOS. Dua seri jumlah TEOS telah ditetapkan sebagai 100 μL dan 80 μL, untuk mendapatkan ketebalan cangkang dan ukuran pori yang berbeda. Sepuluh seri jumlah MB telah ditetapkan untuk mendapatkan ukuran struktur berongga tengah dan efisiensi pemuatan MB yang berbeda.
Jumlah MB dan TEOS yang ditambahkan dalam protokol seperti yang dijelaskan pada Tabel 1 di bawah ini.
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2a, b, ukuran partikel nano meningkat dengan meningkatnya jumlah MB, baik dalam konsentrasi TEOS (100 μL dan 80 μL). Pada konsentrasi MB yang sama, ukuran partikel meningkat dengan meningkatnya jumlah TEOS. Moreover, with the increase of the TEOS amount, the shell thickness grew up, which has been proved by the element mapping (shown as Fig. 2c). The polydispersity index (PDI) and surface charge of the nanoparticles are shown in Fig. S8 and Table S1. The morphology studies predicted that with the increase of MB amount, the loading efficiency will grow up, leading to the faster release profile, while with the increase of TEOS amount, the release will slow down. And we need to find out the appropriate MB and TEOS concentration, with which we could obtain the optimized nanoparticle systems, that we may be able to make the MB release profile linear correlated with the pH changes.
Morphology characterization of 10 different self-decomposable nanoparticles with specific MB or TEOS amount. a STEM figures. b Nanoparticle size distribution analysis. c Si mapping of 10 self-decomposable nanoparticles. Scale bars in all figures are 100 nm. The size distribution analysis was performed by randomly chosen 100 nanoparticles from STEM figures and measured by ImageJ software. Data was presented as mean ± S.D.
The MB loading efficiency was determined by UV-Vis spectrum. The standard curve (Fig. S9) of MB was firstly drawn using series concentrations of MB solution (from 6.25 to 46.88 μg/mL), with the equation as y = 67.63x + 0.10919, R
2
= 0.9987. As calculated with the equation above, we obtain MB loading efficiency of 10 self-decomposable nanoparticles with specific parameters, detailed data shown in Fig. S10.
Before the study of the MB release profiles in different pH solutions, the release profiles in pure water have been studied. As shown in Fig. S11 and Fig. S12, all the nanoparticles with TEOS amount of 80 μL presented increased MB release along with the duration increase, which was reflected by the UV–Vis absorption. Moreover, with the MB encapsulated amount increase, the growth trend of MB release becomes more significant. Also, the release velocity grows faster. However, as the TEOS amount increase to 100 μL, the particle surface became more densed and the release becomes slower when the MB amount below 3.0 mg; almost no increase trend could be observed in the MB release in water during 14 days of release. As long as the MB amount increases to above 4.0 mg, an obvious increase trend of MB release could be observed. One thing to be noticed is that the nanoparticle parameter of both NPs7.5/80 and NPs6.0/100 presented solid growth as the time prolongs, almost showed a linear increase trend during the first 7 days, and then reached the platform.
Then, we focused on the MB release behavior in different pH buffers to figure out whether self-decomposable nanoparticles with specific parameters could have the linear pH-dependent MB release.
Firstly, we carried out the MB release experiments at pH 4.0 buffer solution. From Fig. S13, we could easily reach the conclusion that with the same TEOS amount of 100 μL, the MB release velocity presented a similar trend was observed in the 5 nanoparticle systems of TEOS at 80 μL (Fig. S14), the center positive correlation with the MB encapsulated amount.
Concentrated MB diffuses into the surrounding solution via diffusion due to concentration difference. The bigger concentration gradient makes the faster MB release. Compared with the MB release in pure water, we found that the acidic environment speeded up the release of MB (Fig. S13 and S14 compared with Fig. S11 and S12), indicating that the MB release is not only driven by diffusion; however, in acidic solutions, electrostatic repulsion is also an important driven force due to the positive charge nature of MB. We then calculated the release percentage of each nanoparticle parameter according to the MB loading efficiency, MB standard curve, and the dilution ratio at measurements. The release percentage reflected the release speed of MB in pH 4.0 acidic solution, and the results (Fig. 3) showed that only the release percentage of NPs7.5/80 presented linear release in pH 4.0 solution. Other nanoparticle systems with specific MB and TEOS parameters showed similar release trends, and the release percentage did not have a linear growth. One exception is NPs6/100 , and the MB release reached the platform in only 72 h; thus, it was hard to tell whether the MB release could grow linear before that duration at this stage.
MB release percentage of 10 series self-decomposable nanoparticles after a specific duration in pH 4.0 buffer. All experiments were triple repeated, and the data were shown as mean ± S.D.
Meanwhile, we tested the MB release profiles in near-neutral and alkali buffers (pH 6.86 and pH 9.18). The results in both Fig. S15, S16, Fig. S17, and S18 demonstrated that the MB release slowed down with the solution pH increase to 6.86; moreover, with the central MB concentration increased, the MB release percentage decreased. At pH 9.18, all nanoparticles with 10 specific parameters presented a very slow MB release (Fig. S19 and S20); no matter in UV–Vis absorption or the release percentage, the trend was similar with the one in pH 6.86 buffer, but with even lower release percentage. So, it was clear that the self-decomposable nanoparticles only presented MB release linear growth in acidic solutions. We thought back to the endo/lysosomes pH, from 4 to 5, which is exactly the pH range of MB linear growth as a function of time in a specific MB/TEOS parameter. Thus, we get more confident that the self-decomposable nanoparticle system may be an accurate measuring tool for quantitative determining the endo/lysosome average pH, then provide evidence on the exact pH value of autophagy status.
The precondition of using the specific self-decomposable nanoparticles as an endo/lysosome pH indicator is that the nanoparticles stay stable in the endo/lysosome during the whole measurement process. Secondly, the MB release in endo/lysosome should occur smoothly when the measurement carried out.
The colocalization of the nanoparticle in the endo/lysosomes by cell TEM study and the MB release in 6 different cell lines were studied. From the cell TEM results, all of the 10 series nanoparticles stayed in the endo/lysosomes without escaping, after 24-h incubation with the HepG-2 cells (Fig. 4). Since the diameter of HepG2 cells used in Fig. 4 is about 10–20 μm and the diameter of MB@SiO2 nanoparticles is between 75 and 200 nm, it will be very difficult to clarify the nanoparticle morphologies using the images with low magnification (as shown in Fig. S21). We also investigated the intracellular location of the nanoparticles in the other 5 cell lines, and 4 nanoparticles were randomly selected to demonstrate the nanoparticles were trapped in the endo/lysosomes (Fig. S22). The nanoparticles with all parameters showed a central hollow structure in all other 5 cell lines after 24-h incubation, indicating the MB release. Moreover, under more precise observation, we noticed the MB release may be different due to different hollow sizes, pointing to the fact that (1) the endo/lysosome pH in different cells is different and (2) the MB release from the nanoparticles is very sensitive to the endo/lysosomes pH, especially for the NPs6/100 and NPs7.5/80 . From Fig. S23, we can find that nanoparticles have already realized the endocytosis and stayed in the vesicles 2 h after nanoparticle feeding, then nanoparticles gradually accumulated in lysosomes.
The colocalization of the nanoparticle in the endo/lysosomes by cell TEM study after 12 and 24 h incubation with the 10 series nanoparticles. The scale bar is 200 nm in the TEM images
We then evaluated the correlation between the pH values and the OD values in pH 4.0–4.8. From the results in Fig. 5 and Fig. S24, for NPs6/100 and NPs7.5/80 nanoparticle systems, the MB release presented a linear decrease as a function of pH in the pH range from 4.0 to 4.8.
MB release as a function of pH values in NPs6/100 and NPs7.5/80 after specific incubation duration, 6 h, 12 h, and 24 h. The linear correlation equations were also calculated for 6 h and 12 h for MB release from both NPs6/100 and NPs 7.5/80 as a function of pH values. All experiments were carried out triplicated, and the data were shown as mean ± S.D.
We then converted the OD value to the MB release percentage according to the MB loading efficiency and feeding amount. As shown in Fig. S25, in the first 6 h, the MB release percentage in NPs6/100 and NPs7.5/80 nanoparticle systems also presented as a function of pH values. We then calculated the residual sum of squares and Pearson’s related coefficient at 6 h and 12 h release duration, respectively, as the residual sum of squares present a negative correlation with closeness of linear fitting, while the closer the absolute value of Pearson’s related coefficient to 1, the more linear it is. As shown in Table S2 and S3, the highest degree of linearity is the fitting of NPs6.0/100 nanoparticle systems, followed by the one of NPs7.5/80 at 6 h release.
Till then, we were so excited by the results that the method for precisely monitoring the pH values has been established, especially with the accuracy less than or equal to 0.1 pH value interval. That means, we have great possibilities to figure out the correlation between endo/lysosome pH values and the autophagy status, which is of great significance for better studying the autophagy mechanism and predicting the autophagy process. As we can see in Fig. S26, the MB release in HepG-2 cells have already reached the plateau after incubation for 4 h. Thus, we chose 6 h as the observation time point.
We then carefully investigated the MB release of NPs6.0/100 in 6 cell lines in the nanoparticle cell interaction duration of 6 h, including liver cancer HepG-2 cell line, colon cancer HCT8, HCT 15, and HCT 116 cell lines, lung cancer A549 cell line, and myomelanocytic cancer B16 cell line.
As shown in Table 2, we clearly differentiate the endo/lysosomes in 6 cancer cell lines, with the accuracy at 0.01 pH values, which is impossible to be done with the commercial intraocular pH indicator kits.
Moreover, we re-evaluated pH values in endo/lysosomes of the HepG2 cells before and after cultured with BPSi nanoparticles. We reached the conclusion that BPSi uptake significantly increases the endo/lysosome pH values, from 4.70 ± 0.09 to 5.59 ± 0.05, perfectly illustrating the reason for BPsi uptaken induced the autophagy initially then terminated the autophagy flux. The intracellular uptake of BPSi makes the quantities of the endo/lysosomes increased, which was consistent with the results of gene sequencing, that autophagy-related genes (TFEB-CLEAR) were activated. Meanwhile, the autophagy termination by the increased pH values in endo/lysosomes also coincide with the results of p62 proteins upregulation in Western blot study.
Diskusi
Nanoparticles can generally cause autophagy in cells [23], and studies have shown that the autophagic response to nanoparticles presenting a neutral or anionic surface involves enhanced clearance of autophagic cargo. Cell exposure to nanoparticles presenting a cationic surface, on the other hand, results in transcriptional upregulation of the TFEB pathway, but also causes lysosomal dysfunction, ultimately resulting in blockage of autophagic flux [7]. And our results are in consistent with these previous conclusions. In our study, we found that the expression of autophagy-related genes and proteins in HepG2 cells has been increased after feeding of BPSi nanoparticles through transcriptome sequencing, RT-qPCR, and Western experiments. However, the expression level of autophagy-related P62 protein does not decrease as the autophagy is activated. We suspect that the PEG-amine on the surface of BPSi nanoparticles raises the pH value of the lysosome, resulting in inhibition of P62 degradation. Existing lysosomal pH indicators cannot verify our guess. To accurately measure the lysosomal pH of living cells, we established a new method for endo/lysosomes pH qualitative determination based on self-decomposable nanoparticle systems. Ten nanoparticle systems with specific MB/TEOS parameters were employed for obtaining optimized pH sensitively responsive measurement method. The radial MB concentration gradient from inner out served as a major driving force for MB release. The drug release proceeded with simultaneously carrier decomposition, which was driven by a diffusion-controlled mechanism. Moreover, as the pH value decreases, the hydrogen ion concentration increases, and the enhanced electrostatic interaction promotes inner MB to release faster than in neutral solution [24]. The optimized central hollow nanoparticle system could release the central concentrated MB as a linear function of precise pH values in the range of pH 4.0–4.8, which is exactly the pH of lysosomes. Finally, by this qualitative pH indicator based on self-decomposable nanoparticles, we have succeeded in the detection of the average pH values of lysosomes in 6 cell lines. Moreover, by this system, we can qualitatively differentiate the pH changes of lysosomes before and after BPSi nanoparticle endocytosis by HepG-2 cells, clarifying the mechanism of the autophagy occurrence and then termination after BPSi endocytosis. The self-decomposable nanoparticle systems pave a brand new way for studying the luminal pH values, providing new tools to know better of the cell signaling and metabolism, and then providing new ways and methods for the treatment of cancer [25, 26].
Conclusion
In this study, we found that BPSi can promote cell autophagy through transcriptome sequencing, but the amino groups on the surface of the nanoparticles can increase the pH of the lysosome and inhibit the degradation of autophagic flow. Thus, the lysosome pH significantly influences the autophagy stages. And precisely acquiring the information of lysosome pH will promote the perceiving of autophagy. However, the existing fluorescent lysosomal pH indicators could only determine a wide range of lysosomal pH; thus, we established a precise lysosomal pH indicator based on the self-dissociation system. By adjusting the synthesis parameters of MB@SiO2 , the release of MB loaded on the nanoparticles was linearly and negatively correlated with pH. And the nanoparticles mainly stay in the lysosome after entering the cell. By measuring the amount of MB released in the cells, the pH value of the lysosome can be calculated exactly according to the linear function. The established precise pH indicator provided a brand new tool and methodology to precisely study the lysosome pH values and further acquire more information on autophagy.
Ketersediaan Data dan Materi
All data generated or analyzed during this study are included in this published article and its supplementary information files.
