Deteksi Lanjutan miRNA-335-5p Menggunakan Elektroda Interdigitated untuk Menilai Tingkat Keparahan Aneurisma Aorta Abdominal
Abstrak
Aneurisma aorta abdominal (AAA) merujuk pada pembesaran arteri bawah aorta abdominal, dan identifikasi alat deteksi awal sangat diperlukan untuk diagnosis. Dalam studi saat ini, permukaan sensor elektroda interdigitated (IDE) digunakan untuk mengidentifikasi miRNA-335-5p, yang mencerminkan pembentukan AAAs. Keseragaman material silika diamati oleh profilometri 3D, dan permukaan konduktif tinggi yang dimodifikasi kimiawi meningkatkan deteksi melalui mode I-V. miRNA-335-5p target terdeteksi secara bergantung pada dosis dan berdasarkan analisis regresi linier dan 3σ, sensitivitas ditetapkan sebesar 1 fM dengan probe biotinilasi. Spesifikitas tinggi ditunjukkan dengan membedakan sekuens target dari sekuens non-komplementer dan sekuens tidak cocok tunggal dan ganda. Output ini menunjukkan deteksi berkinerja tinggi miRNA-335-5p dengan reproduktibilitas yang baik untuk penentuan tingkat keparahan AAA.
Pendahuluan
Aneurisma aorta abdominal (AAA) adalah penyakit yang mengancam nyawa yang didefinisikan sebagai aorta abdominal dengan diameter > 3 cm atau lebih besar dari normal [1, 2]. Kondisi ini terjadi dengan aterosklerosis atau tumpukan plak, yang melemahkan dinding aorta abdominal dan menghasilkan bengkel keluar, mirip dengan balon. Seiring waktu, dinding arteri meluas, dan situasi ini dapat dibandingkan dengan penuaan mangkuk taman. Tekanan dari darah yang memompa melalui aorta menyebabkan area yang melemahkan ini bengkel keluar, yang disebut aneurisma. AAA terbentuk ketika bagian yang melemahkan aorta mengakibatkan komplikasi [3,4,5,6]. AAA dapat menyebabkan kematian akibat pecahnya aneurisma kecil. Saat ini, pemeriksaan fisik, angiografi tomografi komputer axial, citra resonansi magnet, dan ultrasonografi digunakan untuk mendiagnosis kondisi ini [7,8,9,10]. Namun, tidak ada metode deteksi untuk AAA, yang biasanya diidentifikasi saat menganalisis masalah kesehatan lain. Situasi ini mengakibatkan identifikasi AAA yang tertunda, yang pada akhirnya menyebabkan masalah kesehatan yang tidak perlu. Untuk mengatasi masalah ini, peneliti perlu mengembangkan metode deteksi awal, dan satu strategi potensial adalah pengembangan sistem sensor.
Deteksi dini, cepat, dan sensitif penyakit secara kuantitatif adalah tujuan vital untuk diagnosis klinis. Platform biosensing saat ini telah memenuhi beberapa kebutuhan dan memerlukan setting laboratorium dan pelatihan yang tepat. Oleh karena itu, sebagian besar metode tidak portabel, yang diperlukan untuk deteksi titik perawatan ideal [11, 12]. Selanjutnya, untuk membantu dokter dalam pengambilan keputusan dengan cara yang akurat dan cepat, analisis perubahan kadar biomarker sangat diinginkan. Biomarker sirkulasi yang diekspresikan di area tertentu perlu diteliti lebih lanjut untuk mendiagnosis AAA dan mengikuti kemajuan pengobatan. Identifikasi jenis biomarker sirkulasi ini akan membantu mendiagnosis penyakit dan melakukan pengawasan pasien setelah pengobatan. Untuk memenuhi kebutuhan ini, studi ini mengusulkan pembuatan sensor biomarker yang sesuai untuk AAA. Sensor (elektroda interdigitated) yang diusulkan dalam studi ini memiliki potensi untuk analisis berkinerja tinggi dengan berbagai macam biomarker. Ini adalah sistem dielektroda dengan celah dan jari-jari yang bergantian yang beroperasi di bawah pengukuran dielektrik [13,14,15].
Biomarker dapat menjadi biomolekul apa pun, yang mencakup DNA, RNA, protein, karbohidrat, lipid, dan bentuk modifikasi mereka [16, 17]. Selain itu, peneliti telah mengusulkan bahwa berbagai biomarker, seperti RNA non-koding, diekspresikan dalam sistem sel, tetapi tidak akan diterjemahkan menjadi protein [18]. RNA non-koding biasanya tidak diterjemahkan menjadi protein dan umumnya memiliki sekuens pendek [18,19,20,21]. Berbagai kelas RNA non-koding, seperti mikroRNA (miRNA), RNA ribosom, RNA transfer, RNA nukleolus kecil, RNA nukleus kecil, RNA telomerase, snRNA, RNA Xist, RNA vault, dan RNA 7SL, telah dilaporkan. miRNA berfungsi terutama dalam regulasi transkripsi dan pasca-transkripsi ekspresi gen dan sering menghasilkan penggenanan gen [22]. Akhir-akhirnya, peneliti menjelaskan pentingnya miRNA untuk prediksi AAA dan melaporkan penurunan ekspresi miRNA-335-5p pada pasien AAA [23]. Terbukti bahwa kombinasi faktor klinis dan ekspresi mikroRNA secara drastis meningkatkan prediksi penyakit dan menampilkan akurasi yang meningkat [24]. Peneliti khususnya berfokus pada miRNA-335-5p, yang menunjukkan rentang minimal yang signifikan pada individu dengan AAA yang tumbuh cepat [2, 23]. Selain itu, penurunan kadar miRNA-335-5p meningkatkan keyakinan deteksi AAA yang tumbuh. Dengan kata lain, output negatif (kadar yang lebih tinggi) miR-335-5p menunjukkan tingkat keparahan AAA dan meminimalkan saringan yang melelahkan. Temuan ini telah divalidasi oleh Wanhainen et al. [23] dan mengungkapkan bahwa miRNA adalah biomarker yang berguna untuk saringan AAA dan menghilangkan risiko AAA yang tumbuh cepat. Studi saat ini menunjukkan aplikasi deteksi miRNA-335-5p oleh sensor elektroda interdigitated (IDE) untuk menentukan tingkat keparahan AAA pada individu yang penderita.
Bahan dan Metode
Reagen dan Biomolekul
Streptavidin, 1,1′-karbonilimidazola (CDI), dan larutan penyeang fosfat (PBS) dibeli dari Sigma-Aldrich, AS. Etanolamina dibeli dari Fisher Scientific, Inggris. Semua oligo disintesis secara komersial dari Apical Scientific Sdn. Bhd., Malaysia.
Desain Pola pada Masker Krom
Awalnya, pola sensor dielektrik dirancang menggunakan perangkat lunak AutoCAD. Dimensi yang diinginkan adalah panjang 7500 μm, lebar 4100 μm, 20 pasangan celah-jari, ukuran celah 85 μm, ukuran elektroda 100 μm, ketebalan elektroda 40 nm, dan panjang jari 4000 μm. Pola dicetak pada fotomask kosong dan ditempel pada permukaan kaca krom. Kaca krom ini diperbaiki di bawah sistem paparan UV untuk prosedur transfer pola. Substrat dioksida silikon yang dilapisi film tipis aluminium ditempatkan di arah berhadapan dengan kaca krom dan dipaparkan cahaya UV selama 10 s. Pola ditransfer diikuti oleh proses pengembangan menggunakan pengembang resist.
Pembuatan Elektroda Interdigitated
Elektroda permukaan dihasilkan melalui proses mikroelektronik konvensional untuk pembuatan permukaan sebagai berikut: (i) Wafer 4 inci dengan oksida asli yang ada disiapkan. (ii) Wafer dibersihkan menggunakan etsa oksida terpenang (BOE) dan larutan piranha untuk menghapus oksida asli dan kontaminan anorganik. (iii) Lapisan oksida 2800-Å tumbuh melalui oksidasi termal basah selama satu jam pada suhu 1000 °C. (iv) Wafer dengan lapisan oksida dibagi menjadi empat untuk penanganan yang lebih baik. (v) Lapisan logam ditetapkan dengan l sebagai lapisan adhesi untuk lapisan konduktif. Lapisan aluminium (40 nm) dihasilkan pada panjang 3 cm dengan diameter 0,5 mm melalui metode depositasi fisik berbasis penguap termal, (vi) Lapisan fotoresist positif diaplikasikan melalui spin coating pada substrat, (vii) Wafer dijemur lembut pada 90 °C selama 60 s. (viii) Wafer diatur dengan masker krom dan dipaparkan cahaya UV selama 10 s. (ix) Wafer dicuci dalam larutan pengembang RD6 dalam 15 s untuk menghapus area yang tidak terpapar, sehingga terbentuk pola elektroda interdigitated (IDE) dengan oksida. (x) Wafer dijemur keras pada 90 °C selama 120 s. (xi) Wafer dietsa menggunakan arak regia untuk menghapus area yang terpapar dari kedua lapisan. (xii) Pola permukaan dihasilkan, dan fotoresist yang tersisa dicuci dengan aseton. Kemudian, analisis nanoprofilometri 3D (Hawk 3D-profilometri, AS) dilakukan untuk mengamati gambar yang jelas celah di antara elektroda. Pengukuran arus (A) dilakukan menggunakan Keithley 6487 dengan saringan linier 0 hingga 2 V pada langkah 0,1 V (pada 20 s).
Fungsionalisasi Kimia Permukaan: Strategi Streptavidin-Biotin Tetravalen
Untuk fungsionalisasi kimia permukaan, permukaan silika pertama kali dicuci dengan menyeluruh menggunakan kalium hidroksida 1 M (pH 9,0) untuk mengaktifkan permukaan. Permukaan ini lebih lanjut dimodifikasi dengan CDI (0,5 M) dengan periode inkubasi 1 jam untuk bereaksi dengan 100 nM streptavidin (untuk 1 jam), yang dicampur dari stok asli dalam larutan penyeang fosfat (PBS; pH 7,4) 10 mM. Setelah langkah ini, ruang yang tidak bereaksi diblokir menggunakan etanolamina 1 M (untuk 1 jam). Kemudian, streptavidin tetravalen bereaksi dengan 1 μM probe miRNA-335-5p biotinilasi (untuk 10 menit) pada suhu ruangan. Setelah setiap modifikasi selesai, permukaan dicuci dengan menyeluruh menggunakan PBS kecuali dinyatakan lain.
Desain Sekuens Probe dan Target dari miRNA-335-5p
miRNA-335-5p panjang penuh (5′-UGUUUUGAGCGGGGGUCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGUUUGUCAUAAACCGUUUUUCAUUAUUGCUCCUGACCUCCUCUCAUUUGCUAUAUUCA-3′) dengan kode akses MIMAT0000765, telah dikumpulkan dari data bank. Daerah yang diinginkan untuk studi ini sebagai target adalah 5′-UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU-3′. Untuk menangkap daerah target miRNA-335-5p, probe dirancang sebagai 5′-ACAUUUUUCGUUAUUGCUCUUG-3′. Pada ujung 3′, biotin ditandai untuk berinteraksi dengan streptavidin yang diimobilkan pada permukaan sensor. Struktur sekunder miRNA-335-5p panjang penuh diprediksi oleh perangkat lunak mfold online (https://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold).
Interaksi Probe-Target: Sekuens miRNA-335-5p
Setelah probe biotinilasi terikat pada permukaan streptavidin seperti yang dijelaskan di atas, sekuens target miRNA-335-5p berinteraksi (untuk 10 menit) pada suhu ruangan dari konsentrasi femtomolar rendah hingga nanomolar rendah. Konsentrasi ini bervariasi dari 1 fM hingga 1 nM dengan pelarutan berurutan 10 kali dalam PBS. Ikat diuji secara independen dari konsentrasi rendah ke tinggi, dan setelah terbentuknya dupleks, permukaan dicuci dengan volume PBS 5 kali, dan pengukuran dilakukan.
Pengukuran I-V
Karakterisasi listrik dilakukan oleh pengukuran I-V menggunakan Picoammeter Keithley 6487 dengan suplai tegangan/arus. Pengukuran dicatat pada tegangan yang disebutkan di atas pada permukaan polos diikuti oleh pada setiap modifikasi kimia permukaan. Demikian pula, untuk analisis interaktif antara probe dan target miRNA-335-5p pada setiap konsentrasi, pengukuran dilakukan setelah langkah pencucian dengan 10 volume reaksi. Semua modifikasi, interaksi, dan pengukuran dipertahankan dalam kondisi basah kecuali dinyatakan lain.
Hasil dan Pembahasan
Pembuatan Sensor IDE dan Analisis Permukaan
Studi saat ini menggunakan miRNA-335-5p sebagai alat untuk menjelaskan tingkat keparahan AAA dengan analisis interaktif pada sensor elektroda interdigitated (IDE) (Fig. 1). Untuk analisis interaktif dengan probe dan target yang dirancang dari panjang penuh miRNA-335-5p, permukaan IDE dirancang dan dibuat menggunakan teknik litografi konvensional. Modifikasi permukaan bertahap dilakukan dan diukur oleh ammeter (Fig. 2b, c). Penyelarasan masker yang dirancang untuk pembuatan IDE dan keseragamannya dikonfirmasi oleh analisis nanoprofilometri 3D resolusi tinggi. Observasi ini mengonfirmasi bahwa pembuatan dan jarak di antara setiap jari telah disesuaikan dengan baik (Fig. 2d). IDE memiliki ukuran elektroda ~100 μm dengan spasi ~85 μm, dan jaringan intercalasi besar dengan jutaan biomarker dalam seri/paralel terbentuk. Untuk memastikan keberhasilan IDE yang dibuat, kami menggunakan berbagai perangkat polos untuk menentukan reproduktibilitas dalam sistem dielektrik. Sistem ini mengukur getaran molekuler di antara dielektroda yang disebabkan oleh momen dipol (Fig. 2c). IDE dielektrik ini adalah sistem yang diterima luas yang telah banyak digunakan untuk analisis biomolekul dan kimia yang berbeda [15, 25,26,27,28]. Dalam studi ini, semua modifikasi kimia permukaan dan analisis interaktif diukur oleh mode arus I-V.
Representasi deteksi miRNA-335-5p pada IDE. Probe dan target yang dirancang ditampilkan bersama dengan pembentukan dupleks pada permukaan IDE
Pengukuran permukaan pada IDE. a Langkah pengukuran. b Mode pengukuran. Pola IDE dan sistem koneksi ditampilkan. Pengukuran dielektrik juga ditampilkan. c Mekanisme permukaan selama pengukuran. Momen dipol ditampilkan. d Profil profilometri 3D dari IDE yang dibuat
Perkumpulan Molekul Permukaan Tinggi Densitas: Strategi Streptavidin-Biotin
Ikat molekul dengan densitas tinggi pada permukaan sensor atau biochip telah ditunjukkan sebagai krusial dan sangat tergantung pada fungsionalisasi permukaan [29, 30]. Studi ini bertujuan untuk menentukan permukaan yang sesuai untuk jumlah besar akomodasi molekuler, yang wajib untuk ekspresi gen, penemuan, dan analisis molekuler. Untuk aplikasi potensial ini, pembuatan permukaan sistem analisis memerlukan kopling molekul yang tepat untuk mengimobilkan mereka dalam format yang sesuai. Permukaan material ini diteliti untuk menyelidiki mekanisme interaksi permukaan, karena mereka murah dan menyediakan berbagai tingkat kepadatan tumpukan, morfologi, dan ketebalan. Temuan ini akan memfasilitasi ikatan molekuler yang tepat dan mencegah kehilangan aktivitas biomolekul. Selain itu, orientasi yang tepat dari imobilisasi biomolekul dipertahankan dengan konfirmasi struktur sekunder yang tepat.
Untuk mencapai molekul dengan densitas tinggi pada permukaan, kami pertama kali mencuci permukaan silika dengan larutan alkali yang menyeluruh dan memodifikasinya dengan CDI. Untuk menangkap tingkat tinggi probe biotinilasi pada permukaan CDI, kami mengimobilkan probe dengan streptavidin. Streptavidin adalah protein tetravalen dengan empat situs untuk mengikat biotin dan dianggap sebagai molekul afinitas tinggi dalam ilmu kehidupan [31, 32]. Permukaan IDE memiliki tingkat arus 2.08E− 10 A, dan setelah ikatan CDI, meningkat menjadi 9.2E− 06 A. Temuan ini secara jelas menunjukkan bahwa permukaan IDE yang dimodifikasi CDI sesuai untuk analisis kami. Ketika streptavidin ditambahkan, tingkat arus lebih meningkat menjadi 2.36E− 05 A. Dengan strategi ini, kami mengimobilkan sejumlah besar probe biotinilasi yang dirancang dari miRNA-335-5p panjang penuh pada permukaan IDE (Fig. 3a). Interaksi biotin dilakukan setelah langkah pemblokiran pada permukaan IDE untuk menutupi area yang tidak bereaksi. Dengan setiap modifikasi permukaan, perubahan arus ditentukan (Fig. 3b). Seperti yang ditunjukkan pada Fig. 3c, setelah penambahan etanolamina, perubahan arus adalah 2.53E− 05 A, dan ketika 1 nM sekuens tangkapan biotinilasi ditambahkan, tingkat arus menurun menjadi 1.29E− 08 A. Perubahan arus ini mengonfirmasi imobilisasi probe tangkapan pada permukaan sensor IDE. Secara umum, oligonukleotida stranded tunggal membawa muatan negatif lebih besar dengan tulang belakang fosfat karbon 5 yang terpapar (probe), sedangkan muatan neto etanolamina netral, seperti yang dinyatakan oleh pemasok. Perbedaan muatan yang besar ini menghasilkan variasi yang jelas dalam arus yang diukur, seperti yang ditunjukkan pada Fig. 3c. Selanjutnya, parameter ini kembali pada pembentukan dupleks dengan strand target. Ini disebabkan oleh penurunan paparan tulang belakang fosfat, dan muatan positif tambahan berasal dari basa nukleotida dalam strand miRNA (Fig. 4a).
a Prediksi struktur sekunder miRNA-335-5p. miRNA-335-5p panjang penuh ditampilkan dengan wilayah tangkai dan loop. Wilayah target yang dipilih untuk analisis interaktif ditandai. b Pengukuran I-V pada IDE untuk modifikasi kimia dan biologis permukaan (lingkaran hitam, polos; lingkaran merah, CDI; lingkaran biru gelap, streptavidin; lingkaran hijau, etanolamina). Inset gambar ditampilkan secara skematis. c Pengukuran I-V pada IDE untuk ikatan probe. (lingkaran hijau, etanolamina; lingkaran merah tua, probe). Gambar untuk komplikasi AAA ditampilkan sebagai inset gambar
Analisis interaktif probe dan target. a Interaksi dosis tinggi probe dan miRNA-335-5p (target). (lingkaran merah tua, probe; lingkaran hitam, target). b Analisis bergantung pada dosis miRNA-335-5p. Pengujian dari rentang femtomolar rendah hingga nanomolar rendah. (lingkaran merah tua, probe; lingkaran oranye, 1 fM; lingkaran biru, 10 fM; lingkaran hijau, 100 fM; lingkaran ungu, 1 pM; lingkaran muda, 10 pM; lingkaran biru muda, 100 pM; lingkaran hitam, 1 nM)
Analisis Interaktif Bergantung pada Dosis pada IDE
Setelah ikatan probe biotinilasi pada permukaan sensor, analisis interaktif target dilakukan dengan berbagai dosis. Validasi ini dilakukan dari rentang femtomolar rendah hingga nanomolar rendah. Untuk memastikan rentang ini, kami melakukan analisis awal dengan 1 nM sekuens target miRNA-335-5p. Setelah penambahan 1 nM sekuens target miRNA-335-5p pada permukaan yang dimodifikasi probe tangkapan, tingkat arus berubah dari 1.29 E− 08 A menjadi 1.29E− 07 A (Fig. 4a); hasil ini menunjukkan bahwa hibridisasi terjadi antara probe tangkapan dan sekuens target. Setelah konfirmasi ini, untuk menentukan batas deteksi, kami memeram sekuens target dari 1 fM hingga 1 nM, yang ditetapkan secara independen pada permukaan yang dimodifikasi probe tangkapan. Perubahan arus terdeteksi sebelum dan setelah imobilisasi. Perbedaan arus untuk hibridisasi 1 fM, 10 fM, 100 fM, 1 pM, 10 pM, 100 pM, dan 1 nM adalah 2.87, 3.87, 5.04, 6.88, 8.59, 11.21, dan 11.61E− 08 A, masing-masing. Berdasarkan hasil yang diperoleh, perubahan arus bergantung pada dosis yang jelas terdeteksi pada semua konsentrasi yang diuji dari sekuens target (Fig. 4b).
Kinerja Analitik Tinggi: Sensitivitas, Spesifikitas, dan Reproduktibilitas
Berdasarkan hasil di atas dengan peningkatan bergantung pada konsentrasi, analisis regresi linier dilakukan. Sensitivitas deteksi diperkirakan menggunakan perhitungan 3σ, dan jatuh pada 1 fM (Fig. 5a, b). Konsentrasi kurang dari 1 fM, menunjukkan sinyal latar belakang dan nilai lebih rendah. Selanjutnya, analisis spesifikitas dilakukan untuk membedakan sekuens target dari sekuens non-komplementer dan sekuens tidak cocok tunggal dan ganda. Terlihat jelas bahwa probe yang dirancang menunjukkan reaksi yang lebih kuat dengan sekuens komplementer miRNA-335-5p yang sempurna daripada sekuens lain (Fig. 6a). Sekuens tidak cocok tunggal menghasilkan respons arus yang lebih tinggi daripada sekuens non-komplementer dan tidak cocok ganda karena pembentukan dupleks parsial oleh sekuens tidak cocok tunggal pada sekuens probe. Analisis reproduktibilitas dilakukan dengan semua modifikasi kimia dan biologis pada permukaan IDE secara triplicate, dan data dirata-ratakan. Data rata-rata menunjukkan bahwa tidak ada perubahan signifikan ketika berbagai eksperimen dilakukan (Fig. 6b). Selanjutnya, untuk mendukung kinerja IDE, karakteristik metode yang saat ini tersedia dibandingkan (Tabel 1).
Ketergantungan dosis. a Interaksi bergantung pada dosis miRNA-335-5p dengan probe. b Analisis regresi linier dengan berbagai konsentrasi miRNA-335-5p. LOD dianggap sebagai konsentrasi terendah analit terhadap sinyal latar belakang (S/N = 3:1)
Analisis berkinerja tinggi. a Analisis spesifikitas. Sekuens target dibedakan dari sekuens non-komplementer dan sekuens tidak cocok tunggal dan ganda. b Uji reproduktibilitas. Nilai rata-rata ditampilkan dengan eksperimen triplicate
Kesimpulan
Pengembangan metode analitik menggunakan biomarker biologis membantu dalam mendiagnosis AAA selama pemeriksaan fisik. Dalam penelitian saat ini, deteksi miRNA-335-5p untuk prediksi tingkat keparahan AAA dikembangkan, karena miRNA-335-5p ditemukan diekspresikan dengan AAA. Output deteksi IDE yang dihasilkan menampilkan tingkat deteksi rendah hingga tinggi untuk memfasilitasi prediksi tingkat keparahan AAA. Tingkat deteksi terendah adalah 1 fM dengan spesifikitas dan reproduktibilitas tinggi untuk analisis berkinerja tinggi. Metode streptavidin-biotin tetravalen yang digunakan dalam penelitian ini menghasilkan output yang baik dan dapat digunakan untuk analisis biomarker lain.
