Deteksi microRNA-335-5p pada Permukaan Elektroda Interdigitasi untuk Penentuan Tingkat Keparahan Aneurisma Aorta Perut
Abstrak
Aneurisma aorta perut (AAA) mengacu pada pembesaran arteri bawah aorta perut, dan identifikasi alat deteksi dini sangat diperlukan untuk diagnosis. Dalam studi saat ini, permukaan penginderaan elektroda interdigitated (IDE) digunakan untuk mengidentifikasi miRNA-335-5p, yang mencerminkan pembentukan AAA. Keseragaman bahan silika diamati dengan profilometri 3D, dan permukaan sangat konduktif yang dimodifikasi secara kimia meningkatkan deteksi melalui mode IV. MiRNA-335-5p yang ditargetkan terdeteksi dengan cara yang bergantung pada dosis dan berdasarkan regresi linier dan analisis 3σ, sensitivitas ditentukan menjadi 1 fM dengan probe terbiotinilasi. Spesifisitas yang tinggi ditunjukkan dengan membedakan urutan target dari urutan noncomplementary dan single dan triple-mismatched. Keluaran ini menunjukkan deteksi kinerja tinggi miRNA-335-5p dengan reproduktifitas yang baik untuk menentukan tingkat keparahan AAA.
Pengantar
Aneurisma aorta perut (AAAs) adalah penyakit yang mengancam jiwa yang didefinisikan sebagai aorta perut dengan diameter> 3 cm atau lebih besar dari normal [1, 2]. Kondisi ini terjadi dengan aterosklerosis atau penumpukan plak, yang melemahkan dinding aorta perut dan menghasilkan tonjolan ke luar, mirip dengan balon. Seiring waktu, dinding arteri melebar, dan situasi ini sebanding dengan penuaan selang taman. Tekanan dari darah yang dipompa melalui aorta menyebabkan area yang melemah ini menonjol keluar, yang disebut aneurisma. AAA terbentuk ketika bagian aorta yang melemah menyebabkan komplikasi [3,4,5,6]. AAA dapat menyebabkan kematian yang disebabkan oleh pecahnya aneurisma kecil. Saat ini, pemeriksaan fisik, angiogram tomografi aksial terkomputerisasi, pencitraan resonansi magnetik, dan sonografi ultrasound digunakan untuk mendiagnosis kondisi ini [7,8,9,10]. Namun, tidak ada metode deteksi untuk AAA, yang biasanya diidentifikasi saat menganalisis masalah kesehatan lainnya. Situasi ini mengakibatkan keterlambatan identifikasi AAA, yang pada akhirnya menyebabkan masalah kesehatan yang tidak perlu. Untuk mengatasi masalah ini, peneliti perlu mengembangkan metode deteksi dini, dan salah satu strategi potensial adalah pengembangan sistem penginderaan.
Deteksi dini, cepat, dan sensitif penyakit secara kuantitatif adalah tujuan penting untuk diagnosis klinis. Platform biosensing saat ini telah memenuhi beberapa tuntutan dan memerlukan pengaturan dan pelatihan laboratorium yang tepat. Dengan demikian, sebagian besar metode tidak portabel, yang diperlukan untuk deteksi titik perawatan yang ideal [11, 12]. Selanjutnya, untuk membantu dokter dalam pengambilan keputusan secara akurat dan cepat, analisis perubahan kadar biomarker sangat diperlukan. Biomarker yang beredar yang diekspresikan di area tertentu harus diselidiki lebih lanjut untuk mendiagnosis AAA dan mengikuti kemajuan pengobatan. Identifikasi jenis biomarker yang beredar ini akan membantu mendiagnosis penyakit dan melakukan tindak lanjut pasien setelah perawatan. Untuk memenuhi kebutuhan tersebut, penelitian ini mengusulkan untuk menghasilkan sensor biomarker yang sesuai untuk AAA. Sensor (elektroda interdigitasi) yang diusulkan dalam penelitian ini memiliki potensi untuk analisis kinerja tinggi dengan berbagai biomarker. Ini adalah sistem dielektroda dengan celah dan jari alternatif yang beroperasi di bawah pengukuran dielektrik [13,14,15].
Biomarker dapat berupa biomolekul apa saja, yang meliputi DNA, RNA, protein, karbohidrat, lipid, dan bentuk modifikasinya [16, 17]. Selain itu, para peneliti telah mengusulkan bahwa biomarker yang berbeda, seperti RNA noncoding, diekspresikan dalam sistem seluler, tetapi mereka tidak akan diterjemahkan menjadi protein [18]. RNA noncoding biasanya tidak diterjemahkan menjadi protein dan umumnya memiliki urutan pendek [18,19,20,21]. Kelas yang berbeda dari RNA noncoding, seperti microRNA (miRNA), RNA ribosom, RNA transfer, RNA nukleolar kecil, RNA nuklir kecil, RNA telomerase, snRNA, RNA Xist, RNA kubah, dan RNA 7SL, telah dilaporkan. miRNA berfungsi terutama dalam regulasi transkripsi dan pasca transkripsi ekspresi gen dan sering mengakibatkan pembungkaman gen [22]. Baru-baru ini, para peneliti menggambarkan pentingnya miRNA untuk prediksi AAA dan melaporkan penurunan ekspresi miRNA-335-5p pada pasien AAA [23]. Telah terbukti bahwa kombinasi faktor klinis dan ekspresi microRNA secara drastis meningkatkan prediksi penyakit dan menunjukkan peningkatan akurasi [24]. Para peneliti secara khusus berfokus pada miRNA-335-5p, yang menunjukkan kisaran minimal yang signifikan pada individu dengan AAA yang tumbuh cepat [2, 23]. Selain itu, penurunan level miRNA-335-5p meningkatkan kepercayaan deteksi pertumbuhan AAA. Dengan kata lain, keluaran negatif (tingkat yang lebih tinggi) dari miR-335-5p menunjukkan tingkat keparahan AAA dan meminimalkan penyaringan yang melelahkan. Temuan ini ditunjukkan oleh Wanhainen et al. [23] dan mengungkapkan bahwa miRNA adalah biomarker yang berguna untuk menyaring AAA dan menghilangkan risiko AAA yang tumbuh cepat. Studi saat ini menunjukkan penerapan deteksi miRNA-335-5p oleh sensor elektroda interdigitasi (IDE) untuk menentukan tingkat keparahan AAA pada individu yang terkena.
Bahan dan Metode
Reagen dan Biomolekul
Streptavidin, 1,1′-carbonyldiimidazole (CDI), dan larutan buffer fosfat (PBS) dibeli dari Sigma-Aldrich, USA. Ethanolamine dibeli dari Fisher Scientific, UK. Semua oligo disintesis secara komersial dari Apical Scientific Sdn. Bhd., Malaysia.
Desain Pola pada Chrome Mask
Awalnya, pola sensor dielektrik dirancang menggunakan perangkat lunak AutoCAD. Dimensi yang diinginkan adalah panjang 7500 μm, lebar 4100 μm, 20 pasangan celah jari, ukuran celah 85 μm, ukuran elektroda 100 μm, ketebalan elektroda 40 nm, dan panjang jari 4000 μm. Pola itu dicetak pada masker foto kosong dan ditempelkan pada permukaan kaca krom. Kaca krom ini dipasang di bawah sistem paparan UV untuk prosedur transfer pola. Substrat silikon dioksida yang diendapkan dengan film tipis aluminium ditempatkan berlawanan arah dengan kaca krom dan disinari dengan sinar UV selama 10 s. Pola dipindahkan diikuti dengan proses pengembangan menggunakan pengembang resist.
Fabrikasi Elektroda Interdigitasi
Elektroda permukaan diproduksi melalui proses fabrikasi mikroelektronik konvensional untuk fabrikasi permukaan sebagai berikut:(i) Wafer 4-inci dengan oksida asli yang ada disiapkan. (ii) Wafer dibersihkan menggunakan buffered oxide etch (BOE) dan larutan piranha untuk menghilangkan oksida asli dan kontaminan anorganik. (iii) Lapisan oksida setebal 2800- ditumbuhkan melalui oksidasi termal basah selama satu jam pada suhu 1000 °C. (iv) Wafer dengan lapisan oksida dibagi menjadi empat untuk penanganan yang lebih baik. (v) Lapisan logam diendapkan dengan l sebagai lapisan adhesi untuk lapisan konduktif. Lapisan aluminium (40 nm) diproduksi pada panjang 3 cm dengan diameter 0,5 mm melalui metode deposisi fisik berbasis evaporator termal, (vi) Lapisan photoresist positif adalah spin coat pada substrat, (vii) Wafer itu soft-baked pada 90 °C selama 60 s. (viii) Wafer disejajarkan dengan topeng krom dan disinari dengan sinar UV selama 10 detik. (ix) Wafer dibilas dalam larutan pengembang RD6 dalam waktu 15 detik untuk menghilangkan area yang tidak terpapar, menghasilkan pola elektroda interdigitasi (IDE) dengan oksida. (x) Wafer dipanggang keras pada suhu 90 °C selama 120 s. (xi) Wafer digores menggunakan aqua regia untuk menghilangkan area terbuka dari kedua lapisan. (xii) Pola permukaan dihasilkan, dan photoresist yang tersisa dicuci menggunakan aseton. Kemudian, analisis nanoprofilometri 3D (Hawk 3D-profilometry, USA) dilakukan untuk mengamati gambar celah yang jelas antara elektroda. Pengukuran arus (A) dilakukan menggunakan Keithley 6487 dengan sapuan linier 0 hingga 2 V pada langkah 0,1 V (pada 20 s).
Fungsionalisasi Kimia Permukaan:Strategi Streptavidin-Biotin Tetravalen
Untuk fungsionalisasi kimia permukaan, permukaan silika awalnya dicuci bersih dengan 1 M kalium hidroksida (pH 9.0) untuk mengaktifkan permukaan. Permukaan ini dimodifikasi lebih lanjut oleh CDI (0,5 M) dengan masa inkubasi 1 h untuk bereaksi dengan 100 nM streptavidin (untuk 1 h), diencerkan dari stok asli dalam 10 mM phosphate-buffered saline (PBS; pH 7.4). Mengikuti langkah ini, ruang yang tidak bereaksi diblokir menggunakan 1 M etanolamin (untuk 1 h). Kemudian, streptavidin tetravalen direaksikan dengan 1 μM probe terbiotinilasi miRNA-335-5p (selama 10 min) pada suhu kamar. Setelah menyelesaikan setiap modifikasi, permukaan dicuci bersih dengan PBS kecuali dinyatakan lain.
Mendesain Probe dan Urutan Target dari miRNA-335-5p
MiRNA-335-5p panjang penuh (5′-UGUUUUGAGCGGGGGUCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGUUUGUCAUAAACCGUUUUUCAUUAUUGCUCCUGACCUCCUCUCAUUUGCUAUAUUCA-3′) dengan kode aksesi MIMAT0000765, telah dikumpulkan dari bank data. Wilayah yang diinginkan untuk penelitian ini sebagai target adalah 5′-UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU-3′. Untuk menangkap wilayah target miRNA-335-5p, probe dirancang sebagai 5′-ACAUUUUUCGUUAUUGCUCUUG-3′. Pada ujung 3′, biotin ditandai untuk berinteraksi dengan streptavidin yang diimobilisasi pada permukaan penginderaan. Struktur sekunder miRNA-335-5p full-length diprediksi oleh perangkat lunak mfold online (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold).
Interaksi Probe-Target:Urutan miRNA-335-5p
Setelah pengikatan probe terbiotinilasi ke permukaan streptavidin seperti yang dijelaskan di atas, urutan miRNA-335-5p target berinteraksi (selama 10 menit) pada suhu kamar sekitar dari femtomolar rendah ke konsentrasi nanomolar rendah. Konsentrasi ini berkisar dari 1 fM hingga 1 nM dengan pengenceran serial 10 kali lipat dalam PBS. Lampiran diuji secara independen dari konsentrasi yang lebih rendah ke yang lebih tinggi, dan setelah pembentukan dupleks, permukaan dicuci dengan volume 5 kali lipat PBS, dan pengukuran dilakukan.
Pengukuran IV
Karakterisasi kelistrikan dilakukan dengan pengukuran I-V menggunakan Picoammeter Keithley 6487 dengan suplai tegangan/arus. Pengukuran dicatat pada volt yang disebutkan di atas pada permukaan telanjang diikuti oleh pada setiap modifikasi kimia permukaan. Demikian pula, untuk analisis interaktif antara probe dan target miRNA-335-5p pada setiap konsentrasi, pengukuran dilakukan setelah langkah pencucian dengan 10 volume reaksi. Semua modifikasi, interaksi, dan pengukuran dipertahankan dalam kondisi basah kecuali dinyatakan lain.
Hasil dan Diskusi
Fabrikasi Sensor IDE dan Analisis Permukaan
Studi saat ini menggunakan miRNA-335-5p sebagai alat untuk menjelaskan tingkat keparahan AAA dengan analisis interaktif pada sensor elektroda interdigitated (IDE) (Gbr. 1). Untuk analisis interaktif dengan probe dan target yang dirancang dari panjang penuh miRNA-335-5p, permukaan IDE dirancang dan dibuat menggunakan teknik fotolitografi konvensional. Modifikasi permukaan langkah demi langkah dilakukan dan diukur dengan ammeter (Gbr. 2b, c). Penyelarasan topeng yang dirancang untuk pembuatan IDE dan keseragaman dikonfirmasi oleh analisis nanoprofilometri 3D resolusi tinggi. Pengamatan ini menegaskan bahwa fabrikasi dan jarak antara setiap jari sejajar dengan baik (Gbr. 2d). IDE memiliki ukuran elektroda ~100 μm dengan jarak ~85 μm, dan jaringan interkalasi besar dengan jutaan biomarker secara seri/paralel terbentuk. Untuk memastikan keberhasilan IDE yang dibuat, kami menggunakan perangkat telanjang yang berbeda untuk menentukan reproduktifitas di bawah sistem dielektrik. Sistem ini mengukur getaran molekuler antara dielektroda yang disebabkan oleh momen dipol (Gbr. 2c). IDE dielektrik ini adalah sistem yang diterima dengan baik yang telah banyak digunakan untuk berbagai analisis biomolekuler dan kimia [15, 25,26,27,28]. Dalam studi ini, semua modifikasi kimia permukaan dan analisis interaktif diukur dengan mode arus IV.
Representasi deteksi miRNA-335-5p pada IDE. Probe dan target yang dirancang ditampilkan bersama dengan formasi dupleks pada permukaan IDE
Pengukuran permukaan pada IDE. a Langkah-langkah pengukuran. b Modus pengukuran. Pola IDE dan sistem penghubung ditampilkan. Pengukuran dielektrik juga ditampilkan. c Mekanisme permukaan selama pengukuran. Sebuah momen dipol ditampilkan. d Profil profilometri 3D dari IDE yang dibuat
Perakitan Molekul Permukaan Kepadatan Tinggi:Strategi Streptavidin-Biotin
Lampiran molekuler kepadatan tinggi pada permukaan penginderaan atau biochip telah terbukti sangat penting dan sangat bergantung pada fungsionalisasi permukaan [29, 30]. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan permukaan yang sesuai yang dibutuhkan untuk sejumlah besar akomodasi molekuler, yang wajib untuk ekspresi gen, penemuan, dan analisis molekuler. Untuk aplikasi potensial ini, pembuatan permukaan sistem analitik memerlukan penggabungan molekul yang tepat untuk melumpuhkannya dalam format yang sesuai. Permukaan material ini dipelajari untuk menyelidiki mekanisme interaksi permukaan, karena harganya murah dan memberikan berbagai tingkat kepadatan pengepakan, morfologi, dan ketebalan. Temuan ini akan memfasilitasi perlekatan molekul yang tepat dan mencegah hilangnya aktivitas biomolekuler. Selanjutnya, orientasi yang tepat dari imobilisasi biomolekuler dipertahankan dengan konfirmasi struktural sekunder yang tepat.
Untuk mencapai molekul berdensitas tinggi di permukaan, awalnya kami mencuci permukaan silika secara menyeluruh dengan larutan alkali dan memodifikasinya dengan CDI. Untuk menangkap probe biotinilasi tingkat tinggi pada permukaan CDI, kami melumpuhkan probe dengan streptavidin. Streptavidin adalah protein tetravalen dengan empat situs untuk mengikat biotin dan dianggap sebagai molekul afinitas tinggi dalam ilmu biologi [31, 32]. Permukaan IDE memiliki level saat ini 2.08E− 10 A, dan setelah lampiran CDI, meningkat menjadi 9.2E− 06 A. Temuan ini dengan jelas menunjukkan bahwa permukaan IDE yang dimodifikasi oleh CDI sesuai untuk analisis kami. Ketika streptavidin ditambahkan, level saat ini lebih ditingkatkan menjadi 2.36E− 05 A. Dengan menggunakan strategi ini, kami melumpuhkan lebih banyak probe terbiotinilasi yang dirancang dari miRNA-335-5p full-length pada permukaan IDE (Gbr. 3a). Interaksi biotin dilakukan setelah langkah pemblokiran pada permukaan IDE untuk menutupi area yang tidak bereaksi. Dengan setiap modifikasi permukaan, perubahan arus ditentukan (Gbr. 3b). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3c, setelah penambahan etanolamina, perubahan saat ini adalah 2,53E− 05 A, dan ketika 1 nM urutan penangkapan terbiotinilasi ditambahkan, tingkat arus diturunkan menjadi 1,29E− 08 A. arus mengkonfirmasi imobilisasi probe tangkapan pada permukaan penginderaan IDE. Umumnya, oligonukleotida untai tunggal membawa muatan yang lebih negatif dengan tulang punggung fosfat 5-karbonasi yang terbuka (penyelidik), sedangkan muatan bersih etanolamina adalah netral, seperti yang dinyatakan oleh pemasok. Perbedaan muatan yang besar ini menghasilkan variasi nyata dalam arus terukur, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3c. Selanjutnya, parameter ini dikembalikan lagi pada pembentukan dupleks dengan untai target. Temuan ini disebabkan pengurangan paparan tulang punggung fosfat, dan muatan positif tambahan berasal dari nukleobasa dalam untai miRNA (Gbr. 4a).
a Struktur sekunder yang diprediksi dari miRNA-335-5p. MiRNA-335-5p full-length ditampilkan dengan daerah batang dan lingkaran. Wilayah target yang dipilih untuk analisis interaktif ditunjukkan. b Pengukuran I-V pada IDE untuk modifikasi kimia dan biologi permukaan (lingkaran hitam, telanjang; lingkaran merah, CDI; lingkaran biru tua, streptavidin; lingkaran hijau, ethanolamine). Gambar sisipan ditampilkan secara diagram. c Pengukuran I-V pada IDE untuk pemasangan probe. (lingkaran hijau, ethanolamine; lingkaran merah tua, probe). Gambar untuk komplikasi AAA ditampilkan sebagai sisipan gambar
Analisis interaktif probe dan target. a Interaksi dosis tinggi dari probe dan miRNA-335-5p (target). (lingkaran merah tua, probe; lingkaran hitam, target). b Analisis tergantung dosis miRNA-335-5p. Pengujian dari femtomolar bawah ke kisaran nanomolar bawah. (lingkaran merah tua, probe; lingkaran oranye, 1 fM; lingkaran biru, 10 fM; lingkaran hijau, 100fM; lingkaran ungu, 1 pM; lingkaran merah muda, 10 pM; lingkaran biru muda, 100 pM; lingkaran hitam, 1 nM)
Analisis Interaktif Bergantung Dosis pada IDE
Setelah pemasangan probe terbiotinilasi pada permukaan penginderaan, analisis interaktif target dilakukan dengan dosis yang berbeda. Validasi ini dilakukan dari rentang femtomolar rendah hingga nanomolar rendah. Untuk memastikan kisaran ini, kami melakukan analisis awal dengan 1 nM sekuens miRNA-335-5p target. Setelah penambahan 1 nM dari urutan miRNA-335-5p target pada permukaan yang dimodifikasi probe tangkapan, level saat ini diubah dari 1,29 E− 08 A menjadi 1,29E− 07 A (Gbr. 4a); hasil ini menunjukkan bahwa hibridisasi terjadi antara probe penangkapan dan urutan target. Setelah konfirmasi ini, untuk menentukan batas deteksi, kami mentitrasi urutan target dari 1 fM ke 1 nM, yang turun secara independen pada permukaan yang dimodifikasi probe tangkapan. Perubahan saat ini terdeteksi sebelum dan sesudah imobilisasi. Perbedaan arus untuk hibridisasi 1 fM, 10 fM, 100 fM, 1 pM, 10 pM, 100 pM, dan 1 nM masing-masing adalah 2.87, 3.87, 5.04, 6.88, 8.59, 11.21, dan 11.61E− 08 A. Berdasarkan hasil yang diperoleh, perubahan arus tergantung dosis yang jelas terdeteksi di semua konsentrasi yang diuji dari urutan target (Gbr. 4b).
Kinerja Analisis Tinggi:Sensitivitas, Spesifisitas, dan Reproduksibilitas
Berdasarkan hasil di atas dengan peningkatan yang bergantung pada konsentrasi, analisis regresi linier dilakukan. Sensitivitas deteksi diperkirakan menggunakan perhitungan 3σ, dan turun pada 1 fM (Gbr. 5a, b). Konsentrasinya kurang dari 1 fM, menunjukkan sinyal latar belakang dan nilai yang lebih rendah. Selanjutnya, analisis spesifisitas dilakukan untuk membedakan urutan target dari urutan nonkomplementer dan tunggal dan rangkap tiga. Jelas bahwa probe yang dirancang menunjukkan reaksi yang lebih kuat dengan urutan pelengkap miRNA-335-5p yang sempurna daripada urutan lainnya (Gbr. 6a). Urutan ketidakcocokan tunggal menghasilkan respons arus yang lebih tinggi daripada urutan nonkomplementer dan triple-mismatched karena pembentukan dupleks parsial oleh urutan ketidakcocokan tunggal pada urutan probe. Analisis reproduktifitas dilakukan dengan semua modifikasi kimia dan biologi pada permukaan IDE dalam rangkap tiga, dan data dirata-ratakan. Data rata-rata menunjukkan bahwa tidak ada perubahan yang signifikan ketika eksperimen yang berbeda dilakukan (Gbr. 6b). Selanjutnya, untuk mendukung kinerja IDE, karakteristik metode yang tersedia saat ini dibandingkan (Tabel 1).
Ketergantungan dosis. a Interaksi tergantung dosis dari miRNA-335-5p dengan probe. b Analisis regresi linier dengan konsentrasi miRNA-335-5p yang berbeda. LOD dianggap sebagai konsentrasi analit terendah terhadap sinyal latar belakang (S/N =3:1)
Analisis kinerja tinggi. a Analisis spesifisitas. Urutan target didiskriminasikan dari urutan ketidakcocokan nonkomplementer dan tunggal dan rangkap tiga. b Tes reproduktifitas. Nilai rata-rata ditampilkan dengan eksperimen rangkap tiga
Kesimpulan
Pengembangan metode analisis menggunakan biomarker biologis membantu dalam mendiagnosis AAA selama pemeriksaan fisik. Dalam penelitian saat ini, deteksi yang dimediasi miRNA-335-5p untuk memprediksi tingkat keparahan AAA dikembangkan, karena miRNA-335-5p ditemukan diekspresikan dengan AAA. Output dari deteksi IDE yang dihasilkan ditampilkan lebih rendah ke tingkat deteksi yang lebih tinggi untuk memfasilitasi prediksi keparahan AAA. Tingkat deteksi yang lebih rendah adalah 1 fM dengan spesifisitas dan reproduktifitas tinggi untuk analisis kinerja tinggi. Metode tetravalen streptavidin-biotin yang digunakan dalam penelitian ini menghasilkan keluaran yang baik dan dapat digunakan untuk analisis biomarker lainnya.
