Eksosom miR‑326 dari Makrofag M1 Menekan Perkembangan Karsinoma Sel Hepat melalui Sinyal NF‑κB
Abstract
Bukti yang semakin menumpuk telah menunjukkan bahwa mikroRNA (miR) yang berasal dari eksosom makrofag M1 dapat mengatur perkembangan karsinoma sel hepat (HCC). Namun, efek miR-326 yang berasal dari eksosom makrofag M1 terhadap HCC belum pernah dilaporkan. Oleh karena itu, tujuan penelitian ini adalah untuk mengeksplorasi mekanisme eksosom miR-326 dari makrofag M1 dalam mengatur perkembangan sel HCC. RT-qPCR mendeteksi ekspresi miR-326 pada baris sel HCC. Ekspresi miR-326 pada HCC diubah melalui transiksi, dan efek miR-326 terhadap ekspresi CD206 dan NF-κB, proliferasi sel, pembentukan kolon, migrasi, apoptosis dan invasi dideteksi. Selanjutnya, eksosom diisolasi dari makrofag M1. RT-qPCR mengidentifikasi ekspresi miR-326 pada eksosom yang berasal dari makrofag M1. Ekspresi miR-326 pada eksosom yang berasal dari makrofag M1 diubah melalui transiksi. Eksosom yang berasal dari makrofag M1 dikultur bersama sel HCC untuk mengetahui efeknya terhadap perkembangan biologis sel HCC. Terakhir, eksperimen in vivo dilakukan untuk memverifikasi hasil in vitro. MiR-326 menurun pada sel HCC dan terkaya pada eksosom yang berasal dari makrofag M1. Pengregulasi naik miR-326 akan menghambat proliferasi, pembentukan kolon, migrasi, invasi, dan ekspresi CD206 dan NF-κB serta mempromosikan apoptosis, dan menghambat pertumbuhan tumor HCC in vivo, sedangkan pengregulasi turun miR-326 menunjukkan efek yang sebaliknya. Eksosom yang berasal dari makrofag M1 menghambat proliferasi, pembentukan kolon, migrasi, invasi, dan ekspresi CD206 dan NF-κB serta meningkatkan apoptosis, sementara ekspresi berlebih miR-326 meningkatkan efek eksosom yang berasal dari makrofag M1 terhadap sel HCC. Terungkap bahwa eksosom miR-326 makrofag M1 menekan proliferasi, migrasi dan invasi serta memajukan apoptosis HCC melalui penurunan ekspresi NF-κB.
Pendahuluan
Karsinoma sel hepat (HCC) adalah kanker kelima paling umum di dunia dan kanker hati primer paling umum [1]. Ditunjukkan oleh data dari Registrasi Nasional Kanker Tiongkok, tingkat mortalitas kanker hati primer berada di peringkat ketiga, sementara incidensinya berada di peringkat keempat di antara kanker umum [2]. Faktor risiko utama untuk HCC adalah infeksi kronis virus hepatitis C dan virus hepatitis B, makanan yang terkontaminasi aflatoksin, obesitas, merokok, asupan alkohol yang berlebihan dan diabetes tipe 2 [3]. Kemebolan kemoterapi transarterial adalah pengobatan yang terjangkau untuk HCC pada tahap menengah, yang meningkatkan kelangsungan hidup pada mayoritas pasien HCC pada tahap menengah atau lanjutan [4]. Saat ini, diagnosis HCC terutama bergantung pada biomarker serum dan teknik citra [5]. Tingkat kelangsungan hidup 5 tahun terkait HCC hanya sekitar 60%, dan incidensinya meningkat tiap tahun dalam beberapa tahun terakhir [6]. Dengan demikian, penelitian untuk target terapeutik yang akurat adalah prioritas dalam pengobatan HCC.
Makrofag adalah sel efektor dan regulator utama sistem imun, memerankan fungsi besar dalam remodeling dan perbaikan jaringan, serta melakukan fungsi metabolis terkoordinasi dalam hampir semua jaringan in vivo [7]. Terungkap bahwa makrofag M1 memiliki efek yang mendukung tumor dan meningkatkan mobilitas sel HCC [8]. Eksosom adalah vesikel cakram dengan diameter 40–150 nm [9]. Menurut Xu et al., mikroRNA (miRNA) eksosom memiliki fungsi pada proliferasi, invasivitas, metastasis dan resistensi obat HCC melalui modulasi ekspresi gen dalam sel target [10]. Sebuah studi telah menunjukkan bahwa eksosom yang mengandung miR-326 bisa menjadi target klinis potensial dalam sklerosis multiplex [11]. miRNA dapat bertindak sebagai onkogen atau inhibitor tumor melalui modulasi ekspresi sejumlah besar gen yang dikodekan protein dengan degradasi mRNA dan pemblokiran translasi dalam urutan spesifik [12]. Sebuah studi telah membahas bahwa miR-326 menekan pertumbuhan sel HCC melalui gangguan progresi siklus sel serta peningkatan apoptosis, selain menekan invasi sel melalui penurunan fenotipa transisi epitel–mesenkim [13]. Sebuah studi lainnya telah melaporkan bahwa miR-326 bisa menjadi target terapeutik potensial untuk pengobatan pasien HCC [14]. Oleh karena it, studi ini membahas mekanisme eksosom miR-326 dalam mengatur invasi dan migrasi sel HCC.
Bahan dan Metode
Pernyataan Etika
Semua eksperimen hewan dilakukan sesuai dengan Pedoman Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium oleh Komite Internasional. Protokol disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Rumah Sakit Ketiga Universitas Jilin.
Induksi dan Identifikasi Makrofag
Baris sel monosit manusia THP-1 (Institut Zoologi Kunming, CAS, Kunming, Tiongkok) dikultur dalam medium RPMI 1640 (Gibco, CA, Amerika Serikat; Thermo Fisher Scientific, MA, Amerika Serikat) yang mengandung serum fetal sapi (FBS) yang diinaktivasi panas sebesar 10%. Sel THP-1 direaksi dengan 150 ng/mL asetat forbol 12-miristat 13 (PMA; P8139, Sigma-Aldrich, SF, CA, Amerika Serikat) dan diinkubasi dalam medium RPMI selama 24 jam untuk mendapatkan makrofag M0. Kemudian, morfologi sel sebelum dan setelah induksi diamati dengan pewarnaan Wright. Sel THP-1 dan makrofag yang diinduksi dicampur kembali dalam 5 μL PBS, dititikkan pada kaca objek, diwarnai dengan larutan pewarna Wright dan dicampur dengan larutan penyangga dalam rasio 1:2. Setelah diwarnai selama 10 menit dan dicuci dengan air yang mengalir, sel diamati di bawah mikroskop. Selain itu, penanda makrofag M0 (CD68 dan CD206) diukur dengan reaksi transkripsi terbalik rantai polimerase kuantitatif (RT-qPCR). Selanjutnya, makrofag diinduksi menjadi makrofag M1 melalui inkubasi dengan 20 ng/mL Interferon (IFN)-γ (#285-IF; R&D Systems, MN, Amerika Serikat) dan 10 pg/mL LPS (#8630; Sigma-Aldrich) selama 18 jam. Penanda makrofag M1 (IDO1 dan IL-12 p35) diperiksa dengan RT-qPCR [15].
Ekstraksi Eksosom
Eksosom diekstrak dengan kit pemisahan eksosom (ExoEasy Maxi Kit, Qiagen, Hilden, Jerman). Sop makrofag dikumpulkan ke dalam tabung sentrifugasi 15 mL dalam kondisi steril dan difilter melalui filter 0,8-μM. Sop sel dalam setiap kelompok ditambahkan dengan larutan XBP (1:1) kemudian disentrifugasi dengan kolom sentrifugasi afinitas membran exoEasy pada 500g. Sel ditambahkan dengan 10 mL larutan XWP dan disentrifugasi pada 3000–5000g. Kolom sentrifugasi afinitas membran exoEasy diinkubasi dengan 400 μL larusi elusi XE dan disentrifugasi pada 500g. Larusi elusi dipindahkan ke kolom sentrifugasi afinitas membran exoEasy dan disentrifugasi pada 500g. Larusi elusi disimpan selama 24 jam pada 4 °C kemudian digunakan untuk identifikasi. Sisa disimpan pada −80 °C.
Pengamatan TEM dan Analisis Pelacakan Nanopartikel (NTA)
Eksosom yang dihasilkan dititikkan pada jaringan tembaga yang didukung karbon dan ditambahkan dengan asam fosfotungstik 2%. Sampel diamati di bawah TEM, dan citra optimal dikumpulkan dan dianalisis.
Impuritas dan partikel dalam PBS dihilangkan oleh filter mikroporus 0,22-μM. Sesuai dengan kepadatan partikel eksosom, PBS yang difilter dicampur dengan konsentrasi yang sesuai dan terdeteksi menggunakan detektor nanopartikel Nanosight NS300 (Malvern, Westborough, MA, Amerika Serikat).
Setelah identifikasi, eksosom makrofag yang ditransfeksi dengan inhibitor miR-326 dan kontrol negatif (NC) inhibitor miR-326, miR-326 mimic dan NC miR-326 diekstrak dengan kit pemisahan eksosom (Invitrogen).
RT-qPCR
Total RNA diekstrak dengan Reagen Trizol (Thermo Fisher), dan reaksi PCR real-time dilakukan menggunakan SYBR-Green PCR Master Mix (Roche) dan Sistem PCR Real-Time ABI 7500 (Life Technologies, Grand Island, NY, Amerika Serikat). Urutan primer ditunjukkan dalam Tabel 1. Analisis kuantitatif dilakukan dengan metode 2−△△Ct.
Analisis Western Blot
Total protein sel dan eksosom diekstrak. Konsentrasi protein ditentukan dengan kit asam bisonikotinat (BCA) (Boster Biological Technology Co. Ltd., Wuhan, Hubei, Tiongkok). Protein ditambahkan dengan larutan sampel dan direbus pada 95 °C, dan setiap lubang diisi dengan 30 µg. Protein dipisahkan dengan elektroforesis gel akrilamida 10% (Boster Biological Technology) dan ditransfer ke membran fluorida poliviniliden, yang kemudian dilapisi dengan serum albumina sapi (BSA) 5%. Membran diinkubasi dengan antibodi primer terhadap CD63 (1:1000, Developmental Studies Hybridoma Bank, Universitas Iowa, Ames, IA, Amerika Serikat), CD181 (1:1000, R&D Systems), GAPDH (1:2000, Jackson ImmunoResearch Laboratories, PA, Amerika Serikat) dan dengan antibodi sekunder (1:500, Jackson ImmunoResearch Laboratories) yang dilabeli dengan peroksidase hirudonik. Citra diperoleh dengan sistem citra inframerah ganda Odyssey, dan nilai abu-abu pita diukur dengan perangkat lunak analisis citra Quantity One.
Kultur dan Saringan Sel
Baris sel hati normal HL-7702 dan baris sel kanker hati manusia BEL-7404, HepG2, SMMC-7721 dan QGY-7703 dipilih dan dikultur dalam Gibco RPMI Media 1640 dengan 10% serum fetal sapi (FBS), penicilin (100 U/mL) dan streptomisin (100 mg/mL). Ekspresi miR-326 dideteksi dengan RT-qPCR, dan baris sel yang sesuai disaring.
Labeling Eksosom dan Pengambilan Eksosom
Eksosom dicampur kembali dengan 250 μL Pengencer C dan dihaluskan dengan lembut untuk menghindari kerusakan pada membran eksosom. Warna PKH67 (1 μL, Sigma-Aldrich) ditambahkan ke 250 μL Pengencer C untuk mencapai 500 μL dan diinkubasi. Larutan ditambahkan dengan 500 μL BSA 1% dan diinkubasi pada 37 °C selama 1 menit. Eksosom diperoleh dengan sentrifugasi pada 120.000g 4 °C selama 2 jam. Eksosom yang dilabeli dengan PKH67 diperoleh dengan sentrifugasi pada 120.000g 4 °C selama 2 jam. Eksosom dicampur kembali dengan 6 mL medium RPMI-1640 menghindari cahaya. Kemudian, eksosom yang dilabeli dikultur bersama sel HCC selama 12 jam. Setelah itu, medium kultur dihilangkan dan dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali, 5 menit/kali, dan eksosom floresen yang tidak diserap secara internal oleh sel HCC dicuci bersih. Eksosom dikunci dengan paraformaldehida 4% dan diwarnai dengan 4′-6-diamidino-2-fenilindol. Setelah ditutup, distribusi fluoresensi diamati dengan mikroskop konfokal laser.
Pengelompokan dan Pengobatan Sel
Sel HepG2 dan SMMC-7721 ditanam pada piring 12-lubang pada 0,5–1 × 106 sel/lubang. Dengan kemenjuran 50–60%, sel ditransfeksi dengan Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Sel HepG2 dibagi menjadi kelompok miR-326-mimic (ditransfeksi dengan miR-326 mimic) dan kelompok NC-mimic (ditransfeksi dengan miR-326 mimic NC). Sel SMMC-7721 dialokasikan ke kelompok miR-326-inhibitor (ditransfeksi dengan miR-326 inhibitor) dan kelompok NC-inhibitor (ditransfeksi dengan miR-326 inhibitor NC). miR-326-mimic, miR-326-inhibitor dan NC mereka dicampur dengan Lipofectamine 2000 untuk transiksi. Sel HepG2 dan SMMC-7721 tanpa perawatan apapun ditetapkan sebagai kelompok kosong. miR-326-mimic, miR-326-inhibitor dan NC mereka dirancang dan disusun oleh Guangzhou RibBio Co., Ltd. (Guangzhou, Tiongkok) (Tabel 1).
Kultur Bersama Eksosom Makrofag M1 dengan Sel HCC
Konsentrasi protein suspensi eksosom makrofag M1 dideteksi dengan metode BCA, dan volume suspensi eksosom yang sesuai dengan 50 μg protein dihitung. Sel HepG2 dan SMMC-7721 ditanam pada piring 12-lubang pada 1 × 105 sel/mL per lubang. Sel HepG2 dibagi menjadi 4 kelompok: kelompok kontrol (sel HepG2 tidak dikultur bersama eksosom), kelompok eksosom (Exo) (sel HepG2 dikultur bersama eksosom makrofag M1), kelompok Exo-miR-326-mimic (sel HepG2 dikultur bersama eksosom makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 mimic), kelompok Exo-NC-mimic (sel HepG2 dikultur bersama eksosom makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 mimic NC). Sel SMMC-7721 juga dialokasikan ke 4 kelompok: kelompok kosong (sel SMMC-7721 tidak dikultur bersama eksosom), kelompok Exo (sel SMMC-7721 dikultur bersama eksosom makrofag M1), kelompok Exo-miR-326-inhibitor (sel SMMC-7721 dikultur bersama eksosom makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 inhibitor), kelompok Exo-NC-inhibitor (sel SMMC-7721 dikultur bersama eksosom makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 inhibitor NC).
Sel dilepas dengan tripsin dan ditanam pada piring 96-lubang dengan kepadatan sel 4 × 104 sel per lubang. Medium kultur dihilangkan setelah dikultur selama 12, 24, 36, 48, 60 jam, masing-masing. Diinkubasi dengan 500 μL larutan MTT 0,5 g/L, sel ditambahkan dengan 200 μL larutan dimetil sulfoksida, diaduk dan diinkubasi. Nilai kepadatan optik (OD, 490 nm) diukur dengan pembaca mikropiring.
Uji Pembentukan Koloni
Setelah dikultur selama 24 jam dan dilepas dengan tripsin, sel ditanam pada piring kecil 35 mm dengan 300 sel per piring. Larutan diganti setiap 3 hari. Setelah 10 hari kultur, sel dikunci dengan paraformaldehida 40 g/L−1 dan diwarnai dengan larutan kristal violet 1 g/L−1 dan dikeringkan. Jumlah koloni (lebih dari 50 sel) dihitung di bawah mikroskop.
Uji Transwell
Sel (1 × 105) dicampur kembali dengan 200 μL medium kultur kosong. Eksperimen dilakukan sesuai dengan instruksi kamar Transwell (Corning Glass Works, Corning, N.Y., Amerika Serikat) (matrigel diperlukan untuk eksperimen invasi, tetapi tidak untuk eksperimen migrasi). RPIM 1640 (10% FBS, 600 μL) ditambahkan ke kamar bawah. Kamar atas dan bawah dipisahkan oleh membran Transwell yang dilapisi matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, Amerika Serikat). Setelah dikultur selama 24 jam, kamar dikunci dengan alkohol 95%. Setelah diwarnai dengan larutan kristal violet, sel diamati dalam lima bidang pandangan di bawah mikroskop.
Situsometri Aliran
Siklus sel: sel dilepas dengan tripsin. Sel (1 × 106) dicampur kembali dengan 0,5 mL PBS dan dihaluskan menjadi suspensi tunggal. Dicampur dengan 4,5 mL etanol 70% yang sudah didinginkan pada es, sel disentrifugasi pada 3000g, dicuci dengan 5 mL PBS dan disentrifugasi lagi pada 3000g. Kemudian, sel dicampur kembali dengan 1 mL larutan pewarnaan PI/Triton X-100 (20 μg PI/0,1% Triton X-100) yang mengandung 0,2 mg RnaseA. Siklus sel terdeteksi dengan situsometri aliran.
Apoptosis sel: Sel yang di-tripsinkan (1 × 106) dicampur kembali dengan 1 mL PBS, dihaluskan dan disentrifugasi pada 3000g. Sel dicuci secara berurutan dengan larutan penyangga (10 mmol/L Hepes/NaOH, pH 7,4, 140 mmol/L NaCl, 5 mmol/L CaCl₂) dan disentrifugasi pada 3000g. Selanjutnya, sel diinkubasi dengan 100 μL larutan penandaan (FITC-Annexin V dan PI ditambahkan ke larutan penyangga hingga mencapai 1 μg/mL), disentrifugasi pada 3000g, dicuci sekali dengan larutan penyangga dan diinkubasi dengan larutan fluoresen (SA-FLOUS). Apoptosis sel terdeteksi dengan situsometri aliran. Panjang gelombang situsometri aliran adalah 488 nm, dan fluoresensi FITC terdeteksi dengan filter pita pada 515 nm, sementara PI dengan panjang gelombang lebih dari 560 nm. Hasil dianalisis secara otomatis oleh komputer.
Tumor Xenograft pada Tikus Nuda
Empat puluh tikus (Fakultas Ilmu Hewan, Universitas Jilin, Jilin, Tiongkok) berusia 4–6 minggu diacak ke dalam 8 kelompok, dengan 5 tikus per kelompok. Tikus dipelihara di laboratorium hewan bebas patogen spesifik selama 1 minggu, dan pakan, bantal serta botol air diganti tepat waktu. Status kesehatan tikus harus diamati setiap hari. Satu minggu kemudian, sel HCC disiapkan menjadi suspensi sel dan disuntik subkutan pada leher dan punggung dengan 0,1 mL suspensi sel (1 × 106). Pertumbuhan tumor diamati setelah 3–5 hari. Tikus nuda ditimbang setiap 4 hari, dan volume tumor diukur. Tikus nuda diutanasi 20 hari setelah suntikan.
Analisis Statistik
Semua data diinterpretasikan dengan perangkat lunak SPSS 17.0 (SPSS Statistics, Chicago, IL, Amerika Serikat). Data pengukuran ditunjukkan sebagai mean ± simpangan baku. Perbandingan antara dua kelompok dirumuskan dengan uji t, sementara perbandingan di antara beberapa kelompok dievaluasi dengan analisis variansi satu arah (ANOVA). Nilai P < 0,05 menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik.
Hasil
Identifikasi Makrofag M1 dan Eksosom
Pewarnaan Wright digunakan untuk mengamati morfologi sel THP-1 yang diinduksi oleh PMA. Terlihat bahwa volume sel THP-1 sebelum induksi kecil dan proporsi sitoplasma lebih tinggi; morfologi sel setelah induksi tidak teratur, volume menjadi lebih besar, dan proporsi sitoplasma menurun; sitoplasma lebih kaya dan berwarna biru muda, dengan partikel yang melimpah dan sedikit vakola; inti berwarna merah ungu dan sering miring ke satu sisi, menunjukkan bahwa sel memiliki ciri morfologi tipikal makrofag (Gambar 1a).
Identifikasi makrofag M1 dan eksosom. a Pewarnaan Wright untuk mengamati morfologi sel THP-1 sebelum dan setelah perawatan PMA. b Ekspresi CD68 dan CD206 pada sel THP-1 dan sel THP-1 yang dirawati PMA terdeteksi oleh RT-qPCR; c morfologi makrofag dan makrofag M1. d Ekspresi IDO1 dan IL-12 p35 pada makrofag M0 dan makrofag M0 yang dirawati LPS serta INF-γ terdeteksi oleh RT-qPCR. e TEM untuk pengamatan eksosom. f Deteksi distribusi ukuran partikel eksosom dengan NTA. g Pita protein CD63 dan CD181. Pada panel b, *P < 0,05 versus sel THP-1; Pada panel d, *P < 0,05 versus makrofag M0. Data pengukuran digambarkan sebagai mean ± simpangan baku (N = 3), perbandingan antara dua kelompok dilakukan dengan uji t
Untuk memverifikasi lebih lanjut keberhasilan induksi makrofag, ekspresi CD68 dan CD206 sebelum dan setelah induksi diuji dengan RT-qPCR. Terungkap bahwa ekspresi CD68 dan CD206 meningkat sejak induksi PMA, menunjukkan bahwa PMA berhasil menginduksi sel THP-1 menjadi makrofag M0 (Gambar 1b). Kemudian, makrofag M0 dipolarisasi menjadi makrofag M1 dengan induksi LPS dan INF-γ. Morfologi, dan ekspresi penanda permukaan makrofag tipe M1 IDO1 dan IL-12 p35 diamati dan diuji. Makrofag M0 menunjukkan morfologi menempel yang beraneka ragam dan tidak teratur, menunjukkan bentuk bulat, elips atau fusiform. Morfologi makrofag yang dituntaskan oleh IFN-γ menunjukkan lebih banyak pseudopoda dan proyeksi serta fusiform (Gambar 1c). RT-qPCR menguraikan (Gambar 1d) bahwa setelah perawatan LPS dan INF-γ, makrofag M1 menunjukkan peningkatan penandanya (IDO1 dan IL-12p35).
Selanjutnya, eksosom yang berasal dari makrofag diamati dengan TEM. Terungkap bahwa eksosom yang berasal dari makrofag melimpah dan bentuknya bulat atau oval, dengan struktur membran, ukuran seragam dan sedikit polutan (Gambar 1e). NTA menunjukkan bahwa eksosom dengan puncak terpusat kurva MODE dan garis linear halus memiliki diameter yang lebih terpusat dan sedikit impuritas (Gambar 1f). Analisis Western blot melaporkan bahwa dibandingkan dengan makrofag, ekspresi protein penanda spesifik CD63 dan CD181 meningkat pada eksosom yang berasal dari makrofag (Gambar 1g). Hasil ini menunjukkan bahwa kami berhasil menginduksi monosit untuk diferensiasi menjadi makrofag dan memolarisirnya menjadi makrofag M1.
Eksosom Makrofag M1 Mengirim miR-326 ke Sel HCC dan Mempengaruhi Ekspresi miR-326 pada Sel HCC
Untuk memverifikasi apakah eksosom yang berasal dari makrofag M1 mengangkut miR-326 ke sel HCC, sel HepG2 dan SMMC-7721 dikultur bersama eksosom. Dapat dikenali bahwa sejumlah besar eksosom diserap oleh sel HepG2 dan SMMC-7721 setelah transiksi 4 jam di bawah mikroskop fluoresen (Gambar 2a, b).
Eksosom makrofag M1 mengirim miR-326 ke sel HCC dan mempengaruhi ekspresi miR-326 pada sel HCC. a Pengambilan eksosom makrofag M1 oleh sel HepG2. b Pengambilan eksosom makrofag M1 oleh sel SMMC-7721. c Perbandingan ekspresi miR-326 eksosom makrofag di setiap kelompok sebelum dan setelah induksi INF-γ dan LPS. d Ekspresi miR-326 pada baris sel HCC (BEL-7404, HepG2, SMMC-7721, QGY-7703) dan baris sel hepatosit manusia normal HL-7702 terdeteksi oleh RT-qPCR. e RT-qPCR mendeteksi efek miR-326 mimic terhadap ekspresi miR-326 pada sel HepG2. f RT-qPCR mendeteksi efek miR-326 inhibitor terhadap ekspresi miR-326 pada sel SMMC-7721. g RT-qPCR mendeteksi efek eksosom makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 mimic terhadap ekspresi miR-326 pada sel HepG2. h RT-qPCR mendeteksi efek eksosom makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 inhibitor terhadap ekspresi miR-326 pada sel SMMC-7721. Pada panel c, *P < 0,05 versus makrofag M0; Pada panel d, *P < 0,05 versus sel HL-7702; Pada panel e, *P < 0,05 versus kelompok NC-mimic; Pada panel f, *P < 0,05 versus kelompok NC-inhibitor; Pada panel g, *P < 0,05 versus kelompok kontrol, #P < 0,05 versus kelompok Exo-NC-mimic; Pada panel h, *P < 0,05 versus kelompok kontrol, #P < 0,05 versus kelompok Exo-NC-inhibitor. Data pengukuran digambarkan sebagai mean ± simpangan baku (N = 3), perbandingan di antara beberapa kelompok dilakukan dengan analisis variansi satu arah
Selanjutnya, miR-326-mimic/inhibitor ditransfeksi ke dalam makrofag dan memeriksa ekspresi miR-326 pada eksosom mereka sebelum dan setelah transaksi. Ditunjukkan bahwa dibandingkan dengan eksosom dari makrofag M0, ekspresi miR-326 meningkat pada eksosom makrofag M1. Ekspresi miR-326 yang meningkat terlihat pada eksosom makrofag M1 dengan perawatan miR-326-mimic. Ekspresi miR-326 berkurang pada eksosom makrofag M1 dengan perawatan miR-326-inhibitor (Gambar 2c).
Kemudian, ekspresi miR-326 pada baris sel HCC diuji. Seperti yang diungkapkan, ekspresi miR-326 menurun pada sel BEL-7404, HepG2, SMMC-7721 dan QGY-7703 dibandingkan dengan sel HL-7702, di antaranya sel HepG2 menunjukkan ekspresi terendah, sementara sel SMMC-7721 dengan ekspresi tertinggi (Gambar 2d).
Selanjutnya, miR-326-mimic dan miR-326-inhibitor ditransfeksi ke dalam sel HepG2 dan SMMC-7721, masing-masing, dan memeriksa efeknya terhadap ekspresi miR-326. miR-326 mimic meningkatkan ekspresi miR-326 pada sel HepG2, sementara miR-326 inhibitor mengurangi ekspresi miR-326 pada sel SMMC-7721 (Gambar 2e, f).
Selanjutnya, eksosom dari makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326-mimic dan miR-326-inhibitor dikultur bersama sel HepG2 dan SMMC-7721, masing-masing. Disoroti bahwa kultur bersama dengan eksosom meningkatkan ekspresi miR-326 pada sel HCC, eksosom makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326-mimic meningkatkan lebih lanjut ekspresi miR-326 pada sel HepG2, sementara eksosom makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326-inhibitor menurunkan ekspresi miR-326 pada sel SMMC-7721 (Gambar 2g, h). Disarankan bahwa eksosom makrofag M1 mengirim miR-326 ke sel HCC dan mempengaruhi ekspresi miR-326 pada sel HCC.
Eksosom miR-326 Makrofag M1 Mengurangi Proliferasi Sel dan Kemampuan Pembentukan Koloni pada Sel HCC
Dalam mengeksplorasi efek eksosom miR-326 terhadap proliferasi sel HCC, uji MTT dan pembentukan koloni dilakukan untuk memeriksa proliferasi sel HCC. Disarankan bahwa pada sel HepG2, pemulihan miR-326 mengganggu proliferasi sel dan kemampuan pembentukan koloni (Gambar 3a, e, f). Eksosom makrofag M1 menghambat sel HepG2 untuk berkembang biak dan membentuk koloni. Eksosom makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 mimic lebih lanjut mengganggu proliferasi sel dan kemampuan pembentukan koloni (Gambar 3c, i, j).
Eksosom miR-326 makrofag M1 menghambat proliferasi sel dan pembentukan koloni pada sel HCC. a Uji MTT mendeteksi efek transaksi miR-326 mimic terhadap proliferasi sel HepG2. b Uji MTT mendeteksi efek transaksi miR-326 inhibitor terhadap proliferasi sel SMMC-7721. c Uji MTT mendeteksi efek kultur bersama dengan eksosom makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 mimic terhadap proliferasi sel HepG2. d Uji MTT mendeteksi efek kultur bersama dengan eksosom makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 inhibitor terhadap proliferasi sel SMMC-7721. e Uji pembentukan koloni mendeteksi efek transaksi miR-326 mimic terhadap kemampuan pembentukan koloni sel HepG2. f Jumlah koloni sel HepG2. g Uji pembentukan koloni mendeteksi efek transaksi miR-326 inhibitor terhadap kemampuan pembentukan koloni sel SMMC-7721. h Jumlah koloni sel SMMC-7721. i Uji pembentukan koloni mendeteksi efek kultur bersama dengan eksosom makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 mimic terhadap kemampuan pembentukan koloni sel HepG2. j Jumlah koloni sel HepG2 yang dirawati dengan eksosom. k Uji pembentukan koloni mendeteksi efek kultur bersama eksosom makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 inhibitor terhadap kemampuan pembentukan koloni sel SMMC-7721. l Jumlah koloni sel SMMC-7721 yang dirawati dengan eksosom. Pada panel a dan f, *P < 0,05 versus kelompok NC-mimic; Pada panel b dan h, *P < 0,05 versus kelompok NC-inhibitor; Pada panel c dan j, *P < 0,05 versus kelompok kontrol, #P < 0,05 versus kelompok Exo-NC-mimic; Pada panel d dan l, *P < 0,05 versus kelompok kontrol, #P < 0,05 versus kelompok Exo-NC-inhibitor. Data pengukuran digambarkan sebagai mean ± simpangan baku (N = 3), perbandingan di antara beberapa kelompok dilakukan dengan analisis variansi satu arah
Pada sel SMMC-7721, knockdown miR-326 meningkatkan proliferasi sel dan kemampuan pembentukan koloni (Gambar 3b, g, h). Pada sel SMMC-7721 yang dirawati dengan eksosom makrofag M1, proliferasi sel dan kemampuan pembentukan koloni menurun. Eksosom makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 inhibitor lebih lanjut mendorong proliferasi sel dan kemampuan pembentukan koloni (Gambar 3d, k, l). Disinyalir bahwa miR-326 yang berasal dari eksosom makrofag M1 menghambat proliferasi sel HCC.
Eksosom miR-326 Makrofag M1 Menekan Migrasi dan Invasi Sel HCC
Kemudian, efek eksosom miR-326 terhadap invasi dan migrasi sel HCC diperiksa. Ditunjukkan bahwa pada sel HepG2, pemulihan miR-326 membatasi invasi dan migrasi (Gambar 4a–c). Eksosom makrofag M1 mengganggu sel HepG2 untuk menyerang dan bermigrasi. Invasi dan migrasi lebih terdegradasi ketika sel HepG2 dikultur bersama eksosom makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 mimic (Gambar 4g–i).
Eksosom miR-326 makrofag M1 menghambat migrasi dan invasi sel HCC. a Uji Transwell mendeteksi efek transaksi miR-326 mimic terhadap invasi sel HepG2. b Uji Transwell mendeteksi efek transaksi miR-326 mimic terhadap migrasi sel HepG2. c Jumlah invasi dan migrasi sel HepG2. d Uji Transwell mendeteksi efek transaksi miR-326 inhibitor terhadap invasi sel SMMC-7721. e Uji Transwell mendeteksi efek transaksi miR-326 inhibitor terhadap migrasi sel SMMC-7721. f Jumlah invasi dan migrasi sel SMMC-7721. g Uji Transwell mendeteksi efek kultur bersama dengan eksosom makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 mimic terhadap invasi sel HepG2. h Uji Transwell mendeteksi efek kultur bersama dengan eksosom makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 mimic terhadap migrasi sel HepG2. i Jumlah invasi dan migrasi sel HepG2 yang dikultur bersama eksosom makrofag M1. j Uji Transwell mendeteksi efek kultur bersama dengan eksosom makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 inhibitor terhadap invasi sel SMMC-7721. k Uji Transwell mendeteksi efek kultur bersama dengan eksosom makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 inhibitor terhadap migrasi sel SMMC-7721. l Jumlah invasi dan migrasi sel SMMC-7721 yang dikultur bersama eksosom makrofag M1. Pada panel c, *P < 0,05 versus kelompok NC-mimic; Pada panel f, *P < 0,05 versus kelompok NC-inhibitor; Pada panel i, *P < 0,05 versus kelompok kontrol, #P < 0,05 versus kelompok Exo-NC-mimic; Pada panel l, *P < 0,05 versus kelompok kontrol, #P < 0,05 versus kelompok Exo-NC-inhibitor. Data pengukuran digambarkan sebagai mean ± simpangan baku (N = 3), perbandingan di antara beberapa kelompok dilakukan dengan analisis variansi satu arah
Knockdown miR-326 menghasilkan peningkatan invasi dan migrasi sel SMMC-7721 (Gambar 4d–f). Ketika dirawati dengan eksosom makrofag M1, sel SMMC-7721 menunjukkan invasi dan migrasi yang menurun. Namun, invasi dan migrasi sel SMMC-7721 ditingkatkan pada kultur bersama dengan eksosom makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 inhibitor (Gambar 4j–l). Disinyatkan bahwa miR-326 yang berasal dari eksosom makrofag M1 menghambat invasi dan migrasi sel HCC.
Eksosom miR-326 Makrofag M1 Mempromosikan Apoptosis Sel HCC
Dalam memeriksa efek eksosom miR-326 terhadap siklus sel dan apoptosis sel HCC, pewarnaan tunggal PI dan pewarnaan ganda Annexin V-FITC/PI diterapkan. Diilustrasikan bahwa ekspresi berlebih miR-326 meningkatkan sel yang terperangkap pada fase G0/G1, mengurangi sel yang terperangkap pada fase S dan G2/M serta meningkatkan apoptosis pada sel HepG2 (Gambar 5a–d). Kultur bersama dengan eksosom makrofag M1 meningkatkan sel yang terperangkap pada fase G0/G1, mengurangi sel yang terperangkap pada fase S dan G2/M serta meningkatkan apoptosis sel HepG2. Kultur bersama dengan eksosom dari makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 mimic lebih lanjut meningkatkan efek ini (Gambar 5i–l).
Eksosom miR-326 makrofag M1 mempromosikan apoptosis sel HCC. a, b Situsometri aliran mendeteksi efek transaksi miR-326 mimic pada siklus sel HepG2; c, d situsometri aliran mendeteksi efek transaksi miR-326 mimic pada apoptosis sel HepG2; e, f situsometri aliran mendeteksi efek transaksi miR-326 inhibitor pada siklus sel SMMC-7721; g, h situsometri aliran mendeteksi efek transaksi miR-326 inhibitor pada apoptosis sel SMMC-7721; i, j situsometri aliran mendeteksi efek kultur bersama dengan eksosom makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 mimic pada siklus sel HepG2; k, l situsometri aliran mendeteksi efek kultur bersama dengan eksosom makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 mimic pada apoptosis sel HepG2; m, n situsometri aliran mendeteksi efek kultur bersama dengan eksosom makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 inhibitor pada siklus sel SMMC-7721; o, p, situsometri aliran mendeteksi efek kultur bersama dengan eksosom makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 inhibitor pada apoptosis sel SMMC-7721. Pada panel b dan d, *P < 0,05 versus kelompok NC-mimic; Pada panel f dan h, *P < 0,05 versus kelompok NC-inhibitor; Pada panel j dan l, *P < 0,05 versus kelompok kontrol, #P < 0,05 versus kelompok Exo-NC-mimic; Pada panel n dan p, *P < 0,05 versus kelompok kontrol, #P < 0,05 versus kelompok Exo-NC-inhibitor. Data pengukuran digambarkan sebagai mean ± simpangan baku (N = 3), perbandingan di antara beberapa kelompok dilakukan dengan analisis variansi satu arah
Pada sel SMMC-7721, pengurangan miR-326 mengurangi sel yang terperangkap pada fase G0/G1, meningkatkan sel yang terperangkap pada fase S dan G2/M, dan menurunkan apoptosis sel (Gambar 5e–h). Eksosom makrofag M1 yang tidak ditransfeksi meningkatkan sel yang terperangkap pada fase G0/G1, mengurangi sel yang terperangkap pada fase S dan G2/M, dan meningkatkan apoptosis sel. Eksosom makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 inhibitor menurunkan sel yang terperangkap pada fase G0/G1, meningkatkan sel yang terperangkap pada fase S dan G2/M, dan menurunkan apoptosis sel (Gambar 5m–p). Singkatnya, diringkas bahwa miR-326 yang berasal dari eksosom makrofag M1 menghentikan siklus sel pada fase G0/G1 dan menginduksi apoptosis sel pada HCC.
Eksosom miR-326 Makrofag M1 Menurunkan Ekspresi CD206 dan NF-κB pada Sel HCC
Selanjutnya, mekanisme potensial miR-326 yang berasal dari eksosom makrofag M1 dalam perkembangan biologis sel HCC dieksplorasi. NF-κB adalah taut kunci antara inflamasi dan kanker. Banyak protein regulator dan miRNA dapat menghambat sinyal NF-κB yang teraktivasi berlebihan untuk menekan kanker [16]. Efek bermanfaat ini mungkin termasuk polarisasi makrofag M2 menjadi makrofag M1. Ekspresi CD206 dan NF-κB pada sel HepG2 dan SMMC-7721 diuji dengan RT-qPCR. Disarankan bahwa pemulihan miR-326 menurunkan ekspresi CD206 dan NF-κB pada sel HepG2, sementara knockdown miR-326 meningkatkan ekspresi CD206 dan NF-κB pada sel SMMC-7721 (Gambar 6a, b). Selain itu, kultur bersama dengan eksosom makrofag M1 secara signifikan mengurangi ekspresi CD206 dan NF-κB pada sel HepG2, sementara kultur bersama dengan eksosom makrofag M1 yang overexpresi miR-326 lebih lanjut menurunkan ekspresi CD206 dan NF-κB. Dirawati dengan eksosom makrofag M1 yang tidak ditransfeksi, ekspresi CD206 dan NF-κB menurun pada sel SMMC-7721. Dikultur bersama dengan eksosom makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 inhibitor, sel SMMC-7721 ditandai dengan ekspresi CD206 dan NF-κB yang meningkat (Gambar 6c, d). Disimpulkan bahwa miR-326 dari eksosom makrofag M1 bertindak sebagai penahan tumor dengan menghambat NF-κB pada sel HCC.
Eksosom miR-326 makrofag M1 menurunkan ekspresi CD206 dan NF-κB pada sel HCC. a RT-qPCR mendeteksi efek transaksi miR-326 mimic terhadap ekspresi CD206 dan NF-κB pada sel HepG2; b RT-qPCR mendeteksi efek transaksi miR-326 inhibitor terhadap ekspresi CD206 dan NF-κB pada sel SMMC-7721. c RT-qPCR mendeteksi efek kultur bersama dengan eksosom makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 mimic terhadap ekspresi CD206 dan NF-κB pada sel HepG2; d RT-qPCR mendeteksi efek kultur bersama dengan eksosom makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 inhibitor terhadap ekspresi CD206 dan NF-κB pada sel SMMC-7721. Pada panel a, *P < 0,05 versus kelompok NC-mimic; Pada panel b, *P < 0,05 versus kelompok NC-inhibitor; Pada panel c, *P < 0,05 versus kelompok kontrol, #P < 0,05 versus kelompok Exo-NC-mimic; Pada panel d, *P < 0,05 versus kelompok kontrol, #P < 0,05 versus kelompok Exo-NC-inhibitor. Data pengukuran digambarkan sebagai mean ± simpangan baku (N = 3), perbandingan di antara beberapa kelompok dilakukan dengan analisis variansi satu arah
miR-326 dari Eksosom Makrofag M1 Menghambat Pertumbuhan Tumor HCC In Vivo
Terakhir, hasil in vivo divalidasi melalui tumor xenograft. Seperti ditampilkan, ekspresi berlebih miR-326 menurunkan volume dan bobot tumor pada sel HepG2 (Gambar 7a–c). Pada tikus yang ditanam dengan sel HepG2 yang dikultur bersama eksosom, perawatan dengan eksosom makrofag M1 secara signifikan mengurangi volume dan bobot tumor sel HepG2, sementara perawatan dengan makrofag M1 yang overexpresi miR-326 lebih lanjut mengurangi volume dan bobot tumor sel HepG2 (Gambar 7g–i).
Eksosom miR-326 makrofag M1 mengurangi volume dan bobot tumor HCC in vivo. a–c Efek transaksi miR-326 mimic terhadap volume dan bobot tumor tikus nuda yang ditanam dengan sel HepG2. d–f Efek transaksi miR-326 inhibitor terhadap volume dan bobot tumor tikus nuda yang ditanam dengan sel SMMC-7721. g–i Efek kultur bersama dengan eksosom makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 mimic terhadap volume dan bobot tumor tikus nuda yang ditanam dengan sel HepG2. j–l Efek kultur bersama dengan eksosom makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 inhibitor terhadap volume dan bobot tumor tikus nuda yang ditanam dengan sel SMMC-7721. Pada panel b dan c, *P < 0,05 versus kelompok NC-mimic; Pada panel e dan f, *P < 0,05 versus kelompok NC-inhibitor; Pada panel h dan i, *P < 0,05 versus kelompok kontrol, #P < 0,05 versus kelompok Exo-NC-mimic; Pada panel k dan l, *P < 0,05 versus kelompok kontrol, #P < 0,05 versus kelompok Exo-NC-inhibitor. Data pengukuran digambarkan sebagai mean ± simpangan baku (n = 5), perbandingan di antara beberapa kelompok dilakukan dengan analisis variansi satu arah
Pada sel SMMC-7721, penindasan miR-326 meningkatkan volume dan bobot tumor (Gambar 7d–f). Eksosom makrofag M1 yang tidak ditransfeksi menghambat pertumbuhan tumor pada volume dan bobot sel SMMC-7721. Dikultur bersama dengan eksosom makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 inhibitor, sel SMMC-7721 disuntik ke dalam tikus dan menyebabkan peningkatan volume dan bobot tumor (Gambar 7j–l). Singkatnya, miR-326 yang berasal dari eksosom makrofag M1 menekan pertumbuhan tumor HCC in vivo.
Diskusi
HCC adalah kanker umum yang ditandai dengan morbiditas dan mortalitas tinggi, diagnosis dan pengobatan dini yang sulit, prognosis buruk dan tingkat kelangsungan hidup 5 tahun [17]. Terakhirnya, sebuah studi telah menyoroti bahwa lncRNA yang ekspresinya rendah cox-2 menurunkan kemampuan makrofag M1 untuk menekan pertumbuhan sel HCC, invasivitas, angiogenesi migrasi dan mempromosikan apoptosis [18]. Hu et al. telah membahas bahwa miR-326 jelas menurun pada jaringan HCC dan baris sel, sementara miR-326 yang menurun terkait dengan stadia TNM, metastasi kelenjar limfatik dan diferensiasi pasien HCC [14]. Biasanya dipercaya bahwa eksosom yang berasal dari sel HCC dapat membentuk lingkungan yang subur untuk memfasilitasi pertumbuhan sel HCC, invasivitas dan metastasi serta perkembangan resistensi obat [19]. Studi saat ini dirancang untuk mengeksplorasi mekanisme eksosom miR-326 dalam mengatur invasi dan migrasi sel HCC.
Hasil kami menunjukkan bahwa ekspresi miR-326 menurun pada sel HCC tetapi meningkat pada eksosom. Studi terbaru telah menyoroti bahwa ekspresi miR-326 menurun pada jaringan HCC [20]. Studi lainnya telah menyajikan bahwa ekspresi miR-326 secara signifikan menurun pada baris sel dan jaringan HCC serta pengurangannya memprediksi prognosis buruk pada HCC [13]. Dilaporkan bahwa miR-326 bertindak sebagai penahan tumor dan sangat terdepresi pada sel HCC [21]. Semua bukti yang disebutkan di atas selaras dengan temuan kami. Studi telah menyatakan bahwa dibandingkan dengan kontrol, ekspresi miR-326 meningkat pada eksosom Tconv yang diamati pada pasien sklerosis multiplex remiten-remitis [11].
Hasil lain muncul dari data kami bahwa eksosom miR-326 yang ekspresinya tinggi mengurangi proliferasi sel, pembentukan koloni, migrasi dan invasi serta memfasilitasi apoptosis sel HCC in vitro dan mengurangi volume dan bobot tumor HCC in vivo. Disarankan sebelumnya bahwa pertumbuhan sel HCC dapat ditekan melalui overexpresi miR-326, dan kemampuan migrasi dan invasi sel HCC secara signifikan ditekan melalui peningkatan miR-326 [21]. Dilaporkan bahwa ekspresi miR-326 yang naik menekan pertumbuhan dan invasivitas sel HCC serta merangsang apoptosis sel in vitro [14]. Selain itu, studi sebelumnya telah memverifikasi bahwa overexpresi miR-326 menurunkan pertumbuhan tumor in vivo [13]. Studi telah mengungkapkan bahwa miR-326 yang ekspresi ektropik secara signifikan mengurangi pertumbuhan sel, dan menekan migrasi serta invasivitas sel pada baris sel kanker paru non-sel kecil [22]. Selain itu, ditemukan bahwa miR-326 menurunkan gen profibrotik seperti MMP-9, yang menyiratkan fungsi repressive dalam proliferasi sel kanker [23]. Juga, disajikan bahwa miR-326 menekan ekspresi protein Bcl-2 dan meningkatkan ekspresi Bax sehingga mempengaruhi apoptosis [24]. Mirip dengan temuan kami, ada beberapa miRNA yang berinteraksi dengan eksosom untuk memainkan peran dalam perkembangan HCC. Ditampilkan bahwa eksosom miR-638 yang ekspresinya tinggi dapat menekan proliferasi sel HCC, melibatkan dampak potensial pada karsinogenesis [25]. Studi lainnya juga membuktikan bahwa eksosom miR-451a yang berasal dari sel HCC menekan angiogenesi tumor melalui gangguan fungsi endotel sebagai apoptosis, pembentukan tabung, migrasi dan permeabilitas [26]. Studi sebelumnya secara umum mengonfirmasi bahwa ketika dirawati dengan overexpresi eksosom miR-744, proliferasi sel HCC secara signifikan ditekan [27].
Kesimpulan
Untuk menyimpulkan secara singkat, studi kami memberikan bukti bahwa eksosom miR-326 makrofag M1 menekan proliferasi, migrasi dan invasi serta memajukan apoptosis sel HCC, menyediakan wawasan baru dalam terapi target baru untuk HCC. Karena ukuran sampel yang terbatas dan penelitian yang diketahui terbatas, mekanisme pasti miR-326 belum sepenuhnya diungkap, dan oleh karena itu, studi skala besar lebih lanjut diperlukan untuk mengilustrasikan mekanisme yang mendasarinya.
