M1 Macrophage-Derived Exosomal MicroRNA-326 Menekan Progresi Sel Karsinoma Hepatoseluler Melalui Mediasi Jalur Pensinyalan NF-κB
Abstrak
Mengumpulkan bukti telah menunjukkan bahwa microRNA (miR) yang berasal dari eksosom turunan makrofag M1 dapat mengatur perkembangan karsinoma hepatoseluler (HCC). Namun, efek miR-326 yang berasal dari eksosom turunan makrofag M1 pada HCC belum dilaporkan. Oleh karena itu, tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengeksplorasi mekanisme miR-326 eksosom dari makrofag M1 dalam mengatur perkembangan sel HCC. RT-qPCR mendeteksi ekspresi miR-326 dalam garis sel HCC. Ekspresi miR-326 di HCC diubah oleh transfeksi, dan efek miR-326 pada ekspresi CD206 dan NF-κB, proliferasi sel, pembentukan koloni, migrasi, apoptosis, dan invasi terdeteksi. Selanjutnya, eksosom diisolasi dari makrofag M1. RT-qPCR mengidentifikasi ekspresi miR-326 dalam eksosom turunan makrofag M1. ekspresi miR-326 dalam eksosom turunan makrofag M1 diubah oleh transfeksi. Eksosom turunan makrofag M1 dikultur bersama dengan sel HCC untuk mengetahui efeknya pada kemajuan biologis sel HCC. Akhirnya, percobaan in vivo dilakukan untuk memverifikasi hasil in vitro. MiR-326 berkurang dalam sel HCC dan diperkaya dalam eksosom turunan makrofag M1. MiR-326 yang mengatur lebih tinggi akan menghambat proliferasi sel HCC, pembentukan koloni, migrasi, invasi, dan ekspresi CD206 dan NF-κB serta mendorong apoptosis, dan menghambat pertumbuhan tumor HCC in vivo , sementara down-regulating miR-326 menunjukkan efek yang berlawanan. Eksosom turunan makrofag M1 menghambat proliferasi sel HCC, pembentukan koloni, migrasi, invasi, dan ekspresi CD206 dan NF-κB serta meningkatkan apoptosis, sementara ekspresi berlebih miR-326 meningkatkan efek eksosom turunan makrofag M1 pada sel HCC. Terungkap bahwa miR-326 eksosom yang diturunkan makrofag M1 menekan proliferasi, migrasi dan invasi serta memajukan apoptosis HCC melalui regulasi ekspresi NF-κB.
Pengantar
Karsinoma hepatoseluler (HCC) adalah kanker paling umum kelima secara global dan kanker hati primer yang paling umum [1]. Dimanifestasikan oleh data dari China National Cancer Registry, angka kematian kanker hati primer terdaftar ketiga, sedangkan insiden keempat di antara keganasan umum [2]. Faktor risiko utama untuk HCC adalah infeksi kronis virus hepatitis C dan virus hepatitis B, bahan makanan yang terkontaminasi aflatoksin, obesitas, merokok, asupan alkohol berat dan diabetes tipe 2 [3]. Kemoembolisasi transarterial adalah pengobatan yang mapan untuk HCC pada stadium menengah, yang meningkatkan kelangsungan hidup pada sebagian besar pasien HCC pada stadium menengah atau lanjut [4]. Saat ini, diagnosis HCC sangat tergantung pada biomarker serum dan teknik pencitraan [5]. Tingkat kelangsungan hidup 5 tahun terkait HCC hanya sekitar 60%, dan insidennya meningkat dari tahun ke tahun dalam beberapa tahun terakhir [6]. Karena itu, meneliti target terapi yang akurat merupakan prioritas dalam pengobatan HCC.
Makrofag adalah sel efektor dan pengatur utama sistem kekebalan tubuh, mengerahkan fungsi yang sangat besar pada remodeling dan perbaikan jaringan, dan melakukan fungsi metabolisme yang mengatur di hampir semua jaringan secara in vivo [7]. Makrofag M1 memberikan efek pemicu tumor dan meningkatkan motilitas sel HCC [8]. Eksosom adalah vesikel diskoid dengan diameter 40-150 nm [9]. Menurut Xu et al., microRNAs exosomal (miRNAs) memiliki fungsi pada proliferasi, invasif, metastasis dan resistensi obat HCC melalui modulasi ekspresi gen dalam sel target [10]. Sebuah penelitian telah menunjukkan bahwa miR-326 yang mengandung eksosom bisa menjadi target klinis potensial pada multiple sclerosis [11]. MiRNA dapat bertindak sebagai onkogen atau penghambat tumor melalui modulasi sejumlah besar ekspresi gen yang dikodekan protein melalui degradasi mRNA dan penyumbatan translasi dalam urutan tertentu [12]. Sebuah penelitian telah membahas bahwa miR-326 menekan pertumbuhan sel HCC melalui mengganggu perkembangan siklus sel serta meningkatkan apoptosis, selain itu menekan invasi sel melalui penurunan fenotipe transisi epitel-mesenkim [13]. Studi lain telah melaporkan bahwa miR-326 bisa menjadi target terapi potensial untuk pengobatan pasien HCC [14]. Oleh karena itu, penelitian ini membahas mekanisme miR-326 eksosom yang mengatur invasi dan migrasi sel HCC.
Bahan dan Metode
Pernyataan Etika
Semua hewan percobaan telah sesuai dengan Panduan Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium oleh Komite Internasional. Protokol tersebut telah disetujui oleh Komite Penggunaan Perawatan Hewan Institusional dari Rumah Sakit Ketiga Universitas Jilin.
Induksi dan Identifikasi Makrofag
Garis sel monositik manusia THP-1 (Kunming Institute of Zoology, CAS, Kunming, China) dikultur dalam media RPMI 1640 (Gibco, CA, USA; Thermo Fisher Scientific, MA, USA) yang mengandung 10% serum janin sapi yang tidak diaktifkan panas ( FBS). Sel THP-1 direaksikan dengan 150 ng/mL phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA; P8139, Sigma-Aldrich, SF, CA, USA) dan diinkubasi dalam media RPMI selama 24 jam untuk mendapatkan makrofag M0. Kemudian, morfologi sel sebelum dan sesudah induksi diamati dengan pewarnaan Wright. Sel THP-1 dan makrofag yang diinduksi disuspensikan kembali dalam 5 L PBS, dijatuhkan pada kaca objek, diwarnai dengan larutan pewarna Wright dan dicampur dengan larutan buffer pada 1:2. Dicelup selama 10 menit dan dibilas dengan air mengalir, sel diamati di bawah mikroskop. Selain itu, penanda makrofag M0 (CD68 dan CD206) diukur dengan reverse transcription kuantitatif polymerase chain reaction (RT-qPCR). Selanjutnya, makrofag diinduksi menjadi makrofag M1 melalui inkubasi dengan 20 ng/mL Interferon (IFN)-γ (#285-IF; R&D Systems, MN, USA) dan 10 pg/mL LPS (#8630; Sigma-Aldrich) selama 18 H. Marka makrofag M1 (IDO1 dan IL-12 p35) diperiksa dengan RT-qPCR [15].
Ekstraksi Eksosom
Eksosom diekstraksi dengan kit pemisahan eksosom (ExoEasy Maxi Kit, Qiagen, Hilden, Jerman). Supernatan makrofag dikumpulkan ke dalam tabung sentrifus 15 mL dalam kondisi aseptik dan disaring dengan film penyaringan 0,8-μM. Supernatan sel di masing-masing kelompok ditambahkan dengan buffer XBP (1:1) dan kemudian disentrifugasi dengan kolom sentrifugasi afinitas membran exoEasy pada 500g . Sel dilengkapi dengan 10 mL buffer XWP dan disentrifugasi dengan 3000–5000g . Kolom sentrifugasi afinitas membran exoEasy ditetaskan dengan buffer eluting 400 L XE dan disentrifugasi pada 500g . Buffer elusi dipindahkan ke kolom sentrifugasi afinitas membran exoEasy dan disentrifugasi pada 500g . Buffer eluting disimpan selama 24 jam pada suhu 4 °C dan kemudian digunakan untuk identifikasi. Sisanya disimpan pada suhu − 80 °C.
Pengamatan TEM dan Analisis Pelacakan Nanopartikel (NTA)
Eksosom yang diperoleh di atas dijatuhkan dalam jaring tembaga membran yang didukung karbon dan ditambahkan dengan asam fosfotungstat 2%. Sampel diamati di bawah TEM, dan gambar optimal dikumpulkan dan dianalisis.
Kotoran dan partikel dalam PBS dihilangkan dengan filter mikropori 0,22-μM. Menurut kepadatan partikel eksosom, PBS yang disaring diencerkan ke konsentrasi yang sesuai dan dideteksi menggunakan detektor nanopartikel Nanosight NS300 (Malvern, Westborough, MA, USA).
Setelah identifikasi, eksosom turunan makrofag yang ditransfeksi dengan inhibitor miR-326 dan kontrol negatif (NC) inhibitor miR-326, miR-326 mimik dan miR-326 mimik NC diekstraksi dengan kit pemisahan eksosom (Invitrogen).
RT-qPCR
Total RNA diekstraksi dengan Trizol Reagent (Thermo Fisher), dan PCR real-time dilakukan menggunakan SYBR-Green PCR Master Mix (Roche) dan ABI 7500 Real-Time PCR System (Life Technologies, Grand Island, NY, USA ). Urutan primer ditunjukkan pada Tabel 1. Analisis kuantitatif dilakukan dengan menggunakan metode 2
−△△Ct
.
Analisis Western Blot
Protein total sel dan eksosom diekstraksi. Konsentrasi protein ditentukan dengan kit asam bicinchoninic (BCA) (Boster Biological Technology Co. Ltd., Wuhan, Hubei, Cina). Protein ditambahkan dengan buffer sampel dan direbus pada 95 ° C, dan masing-masing sumur diisi dengan 30 g. Protein dipisahkan dengan elektroforesis gel poliakrilamida 10% (Boster Biological Technology) dan dielektroblot ke membran polivinilidena fluorida, yang diikuti dengan penyegelan dalam albumin serum sapi 5% (BSA). Membran ditetaskan dengan antibodi primer terhadap CD63 (1:1000, Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, Ames, IA, USA), CD181 (1:1000, R&D Systems), GAPDH (1:2000, Jackson ImmunoResearch Laboratories, PA, USA) dan dengan antibodi sekunder (1:500, Jackson ImmunoResearch Laboratories) yang diberi label oleh horseradish peroxidase. Gambar diperoleh dengan sistem pencitraan pemindaian fluoresensi inframerah dua warna Odyssey, dan nilai pita abu-abu diukur dengan perangkat lunak analisis gambar Quantity One.
Kultur dan Penyaringan Sel
Garis sel hati normal HL-7702 dan garis sel HCC manusia BEL-7404, HepG2, SMMC-7721 dan QGY-7703 dipilih dan dikultur dalam Gibco RPMI Media 1640 dengan 10% serum janin sapi (FBS), penisilin (100 U/mL ) dan streptomisin (100 mg/mL). Ekspresi MiR-326 terdeteksi oleh RT-qPCR, dan garis sel yang sesuai disaring.
Pelabelan Eksosom dan Pengambilan Eksosom
Eksosom disuspensikan kembali dengan 250 L Pengencer C dan ditriturasi dengan hati-hati agar tidak merusak membran eksosom. Pewarna PKH67 (1 L, Sigma-Aldrich) ditambahkan ke 250 L Pengencer C hingga mencapai 500 L dan diinkubasi. Solusinya ditambahkan dengan 500 L 1% BSA dan diinkubasi pada 37 ° C selama 1 menit. Eksosom diperoleh dengan sentrifugasi pada 120.000g 4°C selama 2 jam. Eksosom berlabel PKH67 diperoleh dengan sentrifugasi pada 120.000g 4°C selama 2 jam. Eksosom disuspensi ulang dengan media RPMI-1640 6 mL menghindari cahaya. Kemudian, eksosom berlabel dikultur bersama dengan sel HCC selama 12 jam. Setelah itu, media kultur dikeluarkan dan dicuci dengan PBS selama 3 kali, 5 menit/waktu, dan eksosom berlabel fluoresen yang tidak diserap secara internal oleh sel HCC dicuci bersih. Eksosom diikat dengan paraformaldehyde 4% dan diwarnai dengan 4′-6-diamidino-2-phenylindole. Setelah penyegelan, distribusi fluoresensi diamati dengan mikroskop laser confocal.
Pengelompokan dan Perawatan Sel
Sel HepG2 dan sel SMMC-7721 diunggulkan di pelat 12-sumur pada 0,5-1 × 10
6
sel / sumur. Dengan pertemuan 50-60%, sel ditransfeksi dengan Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Sel-sel HepG2 didistribusikan ke dalam kelompok miR-326-mimik (ditransfeksi dengan miR-326 mimik) dan kelompok mimik-NC (ditransfeksi dengan miR-326 mimik NC). Sel SMMC-7721 dimasukkan ke dalam kelompok penghambat miR-326 (ditransfeksi dengan inhibitor miR-326) dan kelompok penghambat NC (ditransfeksi dengan inhibitor miR-326 NC). miR-326-mimic, miR-326-inhibitor dan NCs-nya dicampur dengan Lipofectamine 2000 untuk transfeksi. Sel HepG2 dan sel SMMC-7721 tanpa pengobatan ditetapkan sebagai kelompok kosong. miR-326-mimic, miR-326-inhibitor dan NC-nya dirancang dan disusun oleh Guangzhou RibBio Co., Ltd. (Guangzhou, China) (Tabel 1).
Kokultur Eksosom Berasal Makrofag M1 dengan Sel HCC
Konsentrasi protein suspensi eksosom turunan makrofag M1 dideteksi dengan metode BCA, dan volume suspensi eksosom yang sesuai dengan protein 50 g dihitung. Sel HepG2 dan sel SMMC-7721 diunggulkan dalam pelat 12-sumur pada 1 × 10
5
sel/mL per sumur. Sel HepG2 didistribusikan ke dalam 4 kelompok:kelompok kontrol (sel HepG2 tidak dikultur bersama dengan eksosom), kelompok eksosom (Exo) (sel HepG2 dikultur bersama dengan eksosom yang diturunkan dari makrofag M1, kelompok mimik Exo-miR-326 (HepG2 sel-sel dikultur bersama dengan eksosom turunan makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 mimik), kelompok peniru Exo-NC (sel HepG2 dikultur bersama dengan eksosom turunan makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326 meniru NC). Sel SMMC-7721 juga dikelompokkan menjadi 4 kelompok:kelompok kosong (sel SMMC-7721 tidak dikultur bersama dengan eksosom), kelompok Exo (sel SMMC-7721 dikultur bersama dengan eksosom yang diturunkan dari makrofag M1, Exo-miR-326- kelompok inhibitor (sel SMMC-7721 dikultur bersama dengan eksosom turunan makrofag M1 yang ditransfeksi dengan inhibitor miR-326), kelompok inhibitor Exo-NC (sel SMMC-7721 dikultur bersama dengan eksosom turunan makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR- 326 inhibitor NC).
Sel-sel dipisahkan dengan tripsin dan diunggulkan pada pelat 96-sumur dengan kepadatan sel 4 × 10
4
sel per sumur. Media kultur ditinggalkan setelah kultur 12, 24, 36, 48, 60 jam, masing-masing. Diinkubasi dengan 500 L 0,5 g/L larutan MTT, sel ditambahkan dengan 200 L larutan dimetil sulfoksida, ditriturasi dan ditetaskan. Nilai kepadatan optik (OD, 490 nm) diukur dengan pembaca pelat mikro.
Uji Pembentukan Koloni
Dikultur selama 24 jam dan dipisahkan dengan tripsin, sel-sel diunggulkan dalam cawan kecil 35 mm dengan 300 sel per cawan. Larutan diganti setiap 3 hari. Setelah 10 hari kultur, sel difiksasi dengan 40 g/L
−1
paraformaldehyde dan dicelup dengan 1 g/L
−1
larutan kristal violet dan dikeringkan. Jumlah koloni (lebih dari 50 sel) dihitung di bawah mikroskop.
Pengujian Transwell
Sel (1 × 10
5
) disuspensikan dengan 200 L media kultur kosong. Eksperimen dilakukan sesuai dengan instruksi ruang Transwell (Corning Glass Works, Corning, N.Y., USA) (matrigel diperlukan untuk eksperimen invasi, tetapi tidak untuk eksperimen migrasi). RPIM 1640 (10% FBS, 600 L) ditambahkan ke ruang bawah. Ruang atas dan bawah dipisahkan oleh membran Transwell yang dilapisi oleh matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). Dibiakkan selama 24 jam, bilik itu difiksasi dengan alkohol 95%. Setelah pewarnaan dengan larutan kristal violet, sel diamati di lima bidang visual di bawah mikroskop.
Flow Cytometry
Siklus sel:sel-sel dipisahkan oleh tripsin. Sel (1 × 10
6
) disuspensikan dengan 0,5 mL PBS dan ditriturasi menjadi suspensi tunggal. Dicampur dengan 4,5 mL etanol 70% pra-dingin di atas es, sel disentrifugasi pada 3000g , dibilas dengan 5 mL PBS dan disentrifugasi lagi pada 3000g . Selanjutnya, sel disuspensikan dengan 1 mL larutan pewarnaan PI/Triton X-100 (20 g PI/0,1% Triton X-100) yang mengandung 0,2 mg RnaseA. Siklus sel dideteksi dengan flow cytometry.
Apoptosis sel:Sel tripsin (1 × 10
6
) disuspensikan dengan 1 mL PBS, ditriturasi dan disentrifugasi pada 3000g . Sel dibilas secara bergantian dengan buffer inkubasi (10 mmol/L Hepes/NaOH, pH 7,4, 140 mmol/L NaCl, 5 mmol/L CaCl2 ) dan disentrifugasi pada 3000g . Selanjutnya, sel diinkubasi dengan larutan penanda 100 L (FITC-Annexin V dan PI ditambahkan ke buffer inkubasi hingga mencapai 1 g/mL), disentrifugasi pada 3000g , dicuci sekali dengan buffer inkubasi dan ditetaskan dengan larutan fluorescent (SA-FLOUS). Apoptosis sel dideteksi dengan flow cytometry. Panjang gelombang flow cytometry adalah 488 nm, dan fluoresensi FITC terdeteksi oleh band filter pada 515 nm, sedangkan PI dengan panjang gelombang lebih besar dari 560 nm. Hasilnya dianalisis secara otomatis oleh komputer.
Xenograft Tumor pada Tikus Telanjang
Empat puluh ekor mencit (College of Animal Science, Jilin University, Jilin, China) umur 4–6 bln dibagi secara acak ke dalam 8 kelompok, dengan masing-masing kelompok 5 ekor mencit. Tikus diberi makan di laboratorium hewan kelas bebas patogen tertentu selama 1 w, dan pakan, bantal, dan botol air diganti tepat waktu. Status kesehatan mencit harus diamati setiap hari. Satu minggu kemudian, sel HCC disiapkan ke dalam suspensi sel dan disuntikkan secara subkutan ke leher dan punggung dengan 0,1 mL suspensi sel (1 × 10
6
). Pertumbuhan tumor diamati setelah 3-5 hari. Tikus telanjang ditimbang setiap 4 hari, dan volume tumor diukur. Tikus telanjang di-eutanasia 20 hari setelah injeksi.
Analisis Statistik
Semua data diinterpretasikan dengan software SPSS 17.0 (SPSS Statistics, Chicago, IL, USA). Data pengukuran ditunjukkan sebagai mean ± standar deviasi. Perbandingan antara dua kelompok dirumuskan oleh t -test, sedangkan perbandingan antara beberapa kelompok dinilai dengan analisis varians satu arah (ANOVA). P nilai < 0,05 menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik.
Hasil
Identifikasi Makrofag M1 dan Eksosom
Pewarnaan Wright digunakan untuk mengamati morfologi sel THP-1 yang diinduksi oleh PMA. Digambarkan bahwa volume sel THP-1 sebelum induksi kecil dan proporsi karioplasma lebih tinggi; morfologi sel setelah induksi tidak teratur, volume menjadi lebih besar, dan proporsi karioplasma menurun; sitoplasma lebih kaya dan berwarna biru muda, dengan partikel berlimpah dan sedikit vakuola; nukleus berwarna merah keunguan dan sering condong ke satu sisi, menunjukkan bahwa sel memiliki karakteristik morfologi khas makrofag (Gbr. 1a).
Identifikasi makrofag M1 dan eksosom. a Pewarnaan Wright untuk mengamati morfologi sel THP-1 sebelum dan sesudah perlakuan PMA. b Ekspresi CD68 dan CD206 dalam sel THP-1 dan sel THP-1 yang diobati dengan PMA terdeteksi oleh RT-qPCR; c morfologi makrofag dan makrofag M1. d Ekspresi IDO1 dan IL-12 p35 dalam makrofag M0 dan LPS dan makrofag M0 yang diobati dengan INF-γ terdeteksi oleh RT-qPCR. e TEM untuk pengamatan eksosom. f Deteksi distribusi ukuran partikel eksosom oleh NTA. g Pita protein CD63 dan CD181. Di panel b, *P < 0,05 versus THP-1 sel; Di panel d, *P < 0,05 versus makrofag M0. Data pengukuran digambarkan sebagai mean ± standar deviasi (N = 3), perbandingan antara dua kelompok dilakukan dengan uji t
Untuk memverifikasi lebih lanjut keberhasilan induksi makrofag, ekspresi CD68 dan CD206 sebelum dan sesudah induksi diuji dengan RT-qPCR. Dimanifestasikan bahwa ekspresi CD68 dan CD206 meningkat sejak induksi PMA, menunjukkan PMA berhasil menginduksi sel THP-1 menjadi makrofag M0 (Gbr. 1b). Kemudian, makrofag M0 dipolarisasi menjadi makrofag M1 dengan induksi LPS dan INF-γ. Morfologi, dan penanda permukaan makrofag tipe M1 Ekspresi makrofag IDO1 dan IL-12 p35 diamati dan diuji. Makrofag M0 menunjukkan morfologi perlekatan yang beragam dan tidak beraturan, berbentuk bulat, elips atau spindel. Morfologi makrofag yang dirangsang oleh IFN-γ ditunjukkan dengan lebih banyak pseudopoda dan tonjolan serta fusiformis (Gbr. 1c). RT-qPCR menguraikan (Gbr. 1d) bahwa setelah pengobatan LPS dan INF-γ, makrofag M1 menunjukkan peningkatan penandanya (IDO1 dan IL-12p35).
Selanjutnya, eksosom yang berasal dari makrofag diamati oleh TEM. Terungkap bahwa eksosom yang berasal dari makrofag kaya dan bentuknya bulat atau oval, dengan struktur membran, ukuran seragam dan sedikit polutan (Gbr. 1e). NTA menunjukkan bahwa eksosom dengan puncak terpusat dari kurva MODE dan linier halus memiliki diameter yang lebih terkonsentrasi dan lebih sedikit pengotor (Gbr. 1f). Analisis Western blot melaporkan bahwa versus makrofag, protein penanda spesifik CD63 dan ekspresi CD181 meningkat pada eksosom yang berasal dari makrofag (Gbr. 1g). Hasil ini menunjukkan bahwa kami berhasil menginduksi monosit untuk berdiferensiasi menjadi makrofag dan mempolarisasikannya menjadi makrofag M1.
Eksosom Berasal Makrofag M1 Mengirimkan miR-326 ke Sel HCC dan Mempengaruhi Ekspresi miR-326 di Sel HCC
Untuk memverifikasi apakah eksosom yang berasal dari makrofag M1 mengangkut miR-326 ke sel HCC, sel HepG2 dan SMMC-7721 dikultur bersama dengan eksosom. Dapat diketahui bahwa sejumlah besar eksosom diasimilasi oleh sel HepG2 dan SMMC-7721 pada transfeksi 4 jam di bawah mikroskop fluoresensi (Gbr. 2a, b).
Eksosom turunan makrofag M1 mengirimkan miR-326 ke sel HCC dan memengaruhi ekspresi miR-326 dalam sel HCC. a Serapan eksosom turunan M1 makrofag oleh sel HepG2. b Penyerapan eksosom turunan makrofag M1 oleh sel SMMC-7721. c Perbandingan ekspresi miR-326 eksosom makrofag pada masing-masing kelompok sebelum dan sesudah induksi INF-γ dan LPS. d ekspresi miR-326 dalam garis sel HCC (BEL-7404, HepG2, SMMC-7721, QGY-7703) dan garis sel hepatosit normal manusia HL-7702 terdeteksi oleh RT-qPCR. e RT-qPCR mendeteksi efek miR-326 meniru pada ekspresi miR-326 dalam sel HepG2. f RT-qPCR mendeteksi efek inhibitor miR-326 pada ekspresi miR-326 dalam sel SMMC-7721. g RT-qPCR mendeteksi efek miR-326 miR-326 miR-326 miR-326 yang diturunkan dari miR-326 eksosom yang diturunkan dari makrofag pada ekspresi miR-326 dalam sel HepG2. h RT-qPCR mendeteksi efek dari miR-326 inhibitor-transfected M1 makrofag yang diturunkan eksosom pada ekspresi miR-326 dalam sel SMMC-7721. Di panel c, *P <0,05 versus makrofag M0; Di panel d, *P <0,05 versus sel HL-7702; Di panel e, *P <0,05 versus kelompok peniru NC; Di panel f, *P <0,05 versus kelompok NC-inhibitor; Di panel g, *P <0,05 versus kelompok kontrol, #P <0,05 versus kelompok peniru Exo-NC; Di panel h, *P <0,05 versus kelompok kontrol, #P <0,05 versus kelompok penghambat Exo-NC. Data pengukuran digambarkan sebagai mean ± standar deviasi (N = 3), perbandingan antara beberapa kelompok dilakukan dengan analisis varians satu arah
Selanjutnya, miR-326-mimic/inhibitor ditransfusikan ke dalam makrofag dan memeriksa ekspresi miR-326 dalam eksosomnya sebelum dan sesudah transfeksi. Ditampilkan bahwa versus eksosom dari makrofag M0, ekspresi miR-326 dinaikkan dalam eksosom turunan makrofag M1. Ekspresi miR-326 yang meningkat terlihat pada eksosom turunan makrofag M1 dengan pengobatan miR-326-mimic. Ekspresi MiR-326 berkurang pada eksosom turunan makrofag M1 dengan pengobatan inhibitor miR-326 (Gbr. 2c).
Kemudian, ekspresi miR-326 dalam garis sel HCC diuji. Seperti yang dimanifestasikan, ekspresi miR-326 menurun dalam sel BEL-7404, HepG2, SMMC-7721 dan QGY-7703 dibandingkan dengan sel HL-7702, di antaranya sel HepG2 bermanifestasi dengan ekspresi terendah, sedangkan sel SMMC-7721 dengan ekspresi tertinggi (Gbr. 2d).
Diikuti oleh itu, miR-326-mimic dan miR-326-inhibitor masing-masing ditransfusikan ke dalam sel HepG2 dan SSMC-7721, dan memeriksa efeknya pada ekspresi miR-326. MiR-326 meniru peningkatan ekspresi miR-326 dalam sel HepG2, sementara inhibitor miR-326 mengurangi ekspresi miR-326 dalam sel SSMC-7721 (Gbr. 2e, f).
Selanjutnya, eksosom dari makrofag M1 yang ditransfeksi dengan miR-326-mimic dan miR-326-inhibitor masing-masing dikultur bersama dengan sel HepG2 dan SSMC-7721. Disoroti bahwa kultur bersama dengan eksosom meningkatkan ekspresi miR-326 dalam sel HCC, eksosom yang diturunkan dari makrofag M1 miR-326-mimik yang diturunkan lebih lanjut meningkatkan ekspresi miR-326 dalam sel HepG2, sementara miR-326-inhibitor-transfeksi makrofag M1 -eksosom yang diturunkan menurunkan ekspresi miR-326 dalam sel SSMC-7721 (Gbr. 2g, h). Disarankan bahwa eksosom turunan makrofag M1 mengirimkan miR-326 ke sel HCC dan memengaruhi ekspresi miR-326 dalam sel HCC.
M1 Makrofag-Derived Exosomal miR-326 Mengurangi Proliferasi Sel dan Kemampuan Pembentukan Koloni di Sel HCC
Dalam mengeksplorasi efek miR-326 eksosom pada proliferasi sel HCC, uji MTT dan pembentukan koloni dilakukan untuk memeriksa proliferasi sel HCC. Disarankan bahwa dalam sel HepG2, restorasi miR-326 mengganggu proliferasi sel dan kemampuan pembentukan koloni (Gbr. 3a, e, f). Eksosom turunan makrofag M1 menghalangi sel HepG2 untuk berkembang biak dan membentuk koloni. MiR-326 miR-326 yang ditransfeksi oleh makrofag eksosom M1 yang diturunkan lebih lanjut mengganggu proliferasi sel dan kemampuan pembentukan koloni (Gbr. 3c, i, j).
M1 makrofag exosomal miR-326 menghambat proliferasi sel dan pembentukan koloni dalam sel HCC. a Uji MTT mendeteksi efek transfeksi miR-326 meniru pada proliferasi sel HepG2. b Uji MTT mendeteksi efek transfeksi inhibitor miR-326 pada proliferasi sel SMMC-7721. c Uji MTT mendeteksi efek kultur bersama dengan miR-326 miR-326 miR-326 miR-326 eksosom turunan makrofag M1 pada proliferasi sel HepG2. d Uji MTT mendeteksi efek kultur bersama dengan eksosom turunan makrofag M1 yang ditransfeksi miR-326 inhibitor pada proliferasi sel SMMC-7721. e Uji pembentukan koloni mendeteksi efek transfeksi miR-326 meniru pada kemampuan pembentukan koloni sel HepG2. f Jumlah koloni sel HepG2. g Uji pembentukan koloni mendeteksi efek transfeksi inhibitor miR-326 pada kemampuan pembentukan koloni sel SMMC-7721. h Jumlah koloni sel SMMC-7721. saya Uji pembentukan koloni mendeteksi efek kultur bersama dengan miR-326 miR-326 miR-326 miR-326 eksosom turunan makrofag M1 pada kemampuan pembentukan koloni sel HepG2. j Jumlah koloni sel HepG2 yang diobati dengan eksosom. k Uji pembentukan koloni mendeteksi efek kultur bersama eksosom turunan makrofag M1 yang ditransfeksi miR-326 inhibitor pada kemampuan pembentukan koloni sel SMMC-7721. l Jumlah koloni sel SMMC-7721 yang diobati dengan eksosom. Di panel a dan f, *P <0,05 versus kelompok peniru NC; Di panel b dan h, *P <0,05 versus kelompok NC-inhibitor; Di panel c dan j, *P <0,05 versus kelompok kontrol, #P <0,05 versus kelompok peniru Exo-NC; Di panel d dan l, *P <0,05 versus kelompok kontrol, #P <0,05 versus kelompok penghambat Exo-NC. Data pengukuran digambarkan sebagai mean ± standar deviasi (N = 3), perbandingan antara beberapa kelompok dilakukan dengan analisis varians satu arah
Dalam sel SMMC-7721, knockdown miR-326 meningkatkan proliferasi sel dan kemampuan pembentukan koloni (Gbr. 3b, g, h). Dalam sel SMMC-7721 yang diobati dengan eksosom turunan makrofag M1, proliferasi sel dan kemampuan pembentukan koloni menurun. MiR-326-inhibitor-transfected M1 makrofag-eksosom yang diturunkan lebih lanjut mendorong proliferasi sel dan kemampuan pembentukan koloni (Gbr. 3d, k, l). Diisyaratkan bahwa miR-326 yang berasal dari eksosom turunan makrofag M1 menghambat proliferasi sel HCC.
M1 Makrofag-Derived Exosomal miR-326 Menekan Migrasi dan Invasi Sel HCC
Kemudian, efek miR-326 eksosom pada invasi dan migrasi sel HCC diperiksa. Diperlihatkan bahwa dalam sel HepG2, restorasi miR-326 membatasi invasi dan migrasi (Gbr. 4a-c). Eksosom yang diturunkan makrofag M1 mengganggu sel HepG2 untuk menyerang dan bermigrasi Invasi dan migrasi semakin terdegradasi ketika sel HepG2 dikultur bersama dengan miR-326-mimic-transfected M1 macrophages-derived exosomes (Gbr. 4g-i).
M1 makrofag exosomal miR-326 menghambat migrasi dan invasi sel HCC. a Uji transwell mendeteksi efek transfeksi miR-326 meniru pada invasi sel HepG2. b Uji transwell mendeteksi efek transfeksi miR-326 meniru migrasi sel HepG2. c Jumlah invasi dan migrasi sel HepG2. d Uji transwell mendeteksi efek transfeksi inhibitor miR-326 pada invasi sel SMMC-7721. e Uji transwell mendeteksi efek transfeksi inhibitor miR-326 pada migrasi sel SMMC-7721. f Jumlah invasi dan migrasi sel SMMC-7721. g Uji transwell mendeteksi efek kultur bersama dengan miR-326 miR-326 miR-326 miR-326 eksosom turunan makrofag M1 yang diturunkan pada invasi sel HepG2. h Uji transwell mendeteksi efek kultur bersama dengan miR-326 miR-326 miR-326 miR-326 eksosom turunan makrofag M1 yang diturunkan pada migrasi sel HepG2. saya Jumlah invasi dan migrasi sel HepG2 yang dikultur bersama dengan eksosom turunan makrofag M1 j Uji transwell mendeteksi efek kultur bersama dengan eksosom turunan makrofag M1 yang ditransfeksi miR-326 pada invasi sel SMMC-7721. k Uji transwell mendeteksi efek kultur bersama dengan eksosom turunan makrofag M1 yang ditransfeksi miR-326 inhibitor pada migrasi sel SMMC-7721. l Jumlah invasi dan migrasi sel SMMC-7721 yang dikultur bersama dengan eksosom turunan makrofag M1. Di panel c, *P <0,05 versus kelompok peniru NC; Di panel f, *P <0,05 versus kelompok NC-inhibitor; Di panel i, *P <0,05 versus kelompok kontrol, #P <0,05 versus kelompok peniru Exo-NC; Di panel l, *P <0,05 versus kelompok kontrol, #P <0,05 versus kelompok penghambat Exo-NC. Data pengukuran digambarkan sebagai mean ± standar deviasi (N = 3), perbandingan antara beberapa kelompok dilakukan dengan analisis varians satu arah
Knockdown MiR-326 menghasilkan peningkatan invasi dan migrasi sel SMMC-7721 (Gbr. 4d-f). Ketika diobati dengan eksosom turunan makrofag M1, sel SMMC-7721 diperlihatkan dengan penurunan invasi dan migrasi. Namun, invasi dan migrasi sel SMMC-7721 didorong pada kultur bersama dengan eksosom turunan makrofag M1 yang ditransfeksi-inhibitor miR-326 (Gbr. 4j-l). Hal ini tersirat bahwa miR-326 yang berasal dari eksosom makrofag M1 menghambat invasi dan migrasi sel HCC.
M1 Macrophage-Derived Exosomal miR-326 Promotes Apoptosis of HCC Cells
When examining the effect of exosomal miR-326 on the cell cycle and apoptosis of HCC cells, PI single staining and Annexin V-FITC/PI double staining were applied. It was illustrated that miR-326 overexpression increased cells arrested at G0/G1 phase, reduced cells arrested at S and G2/M phases and raised apoptosis in HepG2 cells (Fig. 5a–d). Co-culturing with M1 macrophages-derived exosomes increased cells arrested at G0/G1 phase, reduced cells arrested at S and G2/M phases and raised cell apoptosis of HepG2 cells. Co-cultivation with exosomes from M1 macrophages transfected with miR-326-mimic further enhanced these effects (Fig. 5i–l).
M1 macrophage exosomal miR-326 promotes apoptosis of HCC cells. a , b Flow cytometry detected the effect of transfection of miR-326 mimic on HepG2 cell cycle; c , d flow cytometry detected the effect of transfection of miR-326 mimic on HepG2 cell apoptosis; e , f flow cytometry detected the effect of transfection of miR-326 inhibitor on SMMC-7721 cell cycle; g , h flow cytometry detected the effect of transfection of miR-326 inhibitor on SMMC-7721 cell apoptosis; saya , j flow cytometry detected the effects of co-culture of with miR-326 mimic-transfected M1 macrophage-derived exosomes on HepG2 cell cycle; k , l flow cytometry detected the effect of co-culture with miR-326 mimic-transfected M1 macrophage-derived exosomes on HepG2 cell apoptosis; m , n flow cytometry detected the effect of co-culture with miR-326 inhibitor-transfected M1 macrophage-derived exosomes on SMMC-7721 cell cycle; o , p , flow cytometry detected the effect of co-culture with miR-326 inhibitor-transfected M1 macrophage-derived exosomes on SMMC-7721 cell apoptosis. In panel b and d, *P <0.05 versus the NC-mimic group; In panel f and h, *P <0.05 versus the NC-inhibitor group; In panel j and l, *P <0.05 versus the control group, #P <0.05 versus the Exo-NC-mimic group; In panel n and p, *P <0.05 versus the controlgroup, #P <0.05 versus the Exo-NC-inhibitor group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation (N = 3), comparisons among multiple groups were conducted by one-way analysis of variance
In SMMC-7721 cells, miR-326 down-regulation reduced cells arrested at G0/G1 phase, elevated cells arrested at S and G2/M phases, and declined cell apoptosis (Fig. 5e–h). Untransfected M1 macrophages-derived exosomes increased cells arrested at G0/G1 phase, reduced cells arrested at S and G2/M phases, and heightened cell apoptosis. MiR-326-inhibitor-transfected M1 macrophages-derived exosomes degraded cells arrested at G0/G1 phase, elevated cells arrested at S and G2/M phases, and decreased cell apoptosis (Fig. 5m–p). Briefly, it is summarized that miR-326 derived from M1 macrophage exosomes arrests cell cycle in G0/G1 phase and induces cell apoptosis in HCC.
M1 Macrophage-Derived Exosomal miR-326 Declines CD206 and NF-κB Expression in HCC Cells
Next, the potential mechanism of miR-326 derived from M1 macrophage exosomes in the biological progress of HCC cells was explored. NF-κB is the key link between inflammation and cancer. Many regulatory proteins and miRNAs could inhibit the excessively activated NF-κB signaling to suppress cancer [16]. Such a beneficial effect may include the polarization of M2 macrophages into M1 macrophages. CD206 and NF-κB expression in HepG2 and SMMC-7721 cells was tested by RT-qPCR. It was suggested that miR-326 restoration decreased CD206 and NF-κB expression in HepG2 cells, while miR-326 knockdown enhanced CD206 and NF-κB expression in SMMC-7721 cells (Fig. 6a, b). Moreover, co-culture with M1 macrophage exosomes significantly reduced CD206 and NF-κB expression in HepG2 cells, while co-culture with M1 macrophage exosomes-overexpressing miR-326 further decreased CD206 and NF-κB expression. Treated with untransfected M1 macrophages-derived exosomes, CD206 and NF-κB expression was decreased in SMMC-7721 cells. Co-cultured with miR-326-inhibitor-transfected M1 macrophages-derived exosomes, SMMC-7721 cells were featured by heightened CD206 and NF-κB expression (Fig. 6c, d). It was concluded that miR-326 from M1 macrophage exosomes played a tumor suppressor by inhibiting NF-κB in HCC cells.
M1 macrophage exosomal miR-326 declines CD206 and NF-κB expression in HCC cells. a RT-qPCR detected the effect of transfection of miR-326 mimic on the expression of CD206 and NF-κB in HepG2 cells; b RT-qPCR detected the effect of transfection of miR-326 inhibitor on the expression of CD206 and NF-κB in SMMC-7721 cells. c RT-qPCR detected the effect of co-culture with miR-326 mimic-transfected M1 macrophage-derived exosomes on the expression of CD206 and NF-κB in HepG2 cells; d RT-qPCR detected the effect of co-culture with miR-326 inhibitor-transfected M1 macrophage-derived exosomes on the expression of CD206 and NF-κB in SMMC-7721 cells. In panel a, *P <0.05 versus the NC-mimic group; In panel b, *P <0.05 versus the NC-inhibitor group; In panel c, *P <0.05 versus the control group, #P <0.05 versus the Exo-NC-mimic group; In panel d, *P <0.05 versus the control group, #P <0.05 versus the Exo-NC-inhibitor group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation (N = 3), comparisons among multiple groups were conducted by one-way analysis of variance
miR-326 from M1 Macrophage Exosomes Inhibits HCC Tumor Growth In Vivo
Finally, the in vivo results were validated through tumor xenografts. As displayed, miR-326 overexpression decreased volume and weight of tumors in HepG2 cells (Fig. 7a–c). In mice transplanted with HepG2 cells co-cultured with exosomes, the treatment with M1 macrophage exosomes significantly reduced the tumor volume and weight of HepG2 cells, while treatment with M1 macrophages-overexpressing miR-326 further reduced the tumor volume and weight of HepG2 cells (Fig. 7g–i).
M1 macrophage exosomal miR-326 reduces the volume and weight of HCC tumor in vivo. a –c The effect of transfection of miR-326 mimic on the tumor volume and tumor of nude mice xenografted with HepG2 cells. d –f The effect of transfection of miR-326 inhibitor on the tumor volume and tumors of nude mice xenografted with SMMC-7721 cells. g –i The effect of co-culture with miR-326 mimic-transfected M1 macrophage-derived exosomes on the tumor volume and tumor of nude mice xenografted with HepG2 cells. j –l The effect of co-culture with miR-326 inhibitor-transfected M1 macrophage-derived exosomes on the tumor volume and tumor of nude mice xenografted with SMMC-7721 cells. In panel b and c, *P <0.05 versus the NC-mimic group; In panel e and f, *P <0.05 versus the NC-inhibitor group; In panel h and i, *P <0.05 versus the control group, #P <0.05 versus the Exo-NC-mimic group; In panel k and l, *P <0.05 versus the control group, #P <0.05 versus the Exo-NC-inhibitor group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation (n = 5), comparisons among multiple groups were conducted by one-way analysis of variance
In SMMC-7721 cells, miR-326 suppression increased volume and weight of tumors (Fig. 7d–f). Untransfected M1 macrophages-derived exosomes obstructed tumor growth in volume and weight of SMMC-7721 cells. Co-cultured with miR-326 inhibitor-transfected M1 macrophages-derived exosomes, SMMC-7721 cells were injected into mice and caused elevations in tumor volume and weight (Fig. 7j–l). Summarily, miR-326 derived from M1 macrophage exosomes depressed tumor growth of HCC in vivo.
Discussion
HCC is a common cancer that is characterized with high morbidity and mortality, difficult early diagnosis and treatment, poor prognosis and 5-year survival rate [17]. Recently, a study has highlighted that the lowly expressed lncRNA cox-2 declines the ability of M1 macrophages to suppress HCC cell growth, invasiveness, angiogenesis migration and promote apoptosis [18]. Hu et al. have discussed that miR-326 is obviously degraded in HCC tissues and cell lines, while down-regulated miR-326 is connected to the TNM stage, lymph node metastasis and differentiation of HCC patients [14]. It is customarily considered that HCC cells-derived exosomes can form a fertile environment to facilitate HCC cells growth, invasiveness and metastasis as well as development of drug resistance [19]. The current study was designed to explore the mechanism of exosomal miR-326 in regulating invasion and migration of HCC cells.
Our results indicated that miR-326 expression decreased in HCC cells but increased in exosomes. A recent study has pointed out that miR-326 expression is declined in HCC tissues [20]. Another study has presented miR-326 expression is notably reduced in HCC cell lines and tissues and its down-regulation predicts a poor prognosis in HCC [13]. It is reported that miR-326 acts a tumor-suppression role and is greatly depressed in HCC cells [21]. All these aforementioned evidences are in line with our findings. A study has purported that in comparison with the controls, miR-326 expression is raised in Tconv-derived exosomes which is observed in relapsing–remitting multiple sclerosis patients [11].
Other results emerge from our data that highly expressed exosomal miR-326 reduced cell proliferation, colony formation, migration and invasion as well as facilitated apoptosis of HCC cells in vitro and reduced the volume and weight of HCC tumor in vivo. It has been suggested previously that HCC cell growth can be suppressed via overexpression of miR-326, and HCC cell migration and invasion ability are markedly attenuated through elevating miR-326 [21]. It is reported that the up-regulated miR-326 expression suppresses HCC cell growth and invasiveness as well as stimulates cell apoptosis in vitro [14]. Besides that, a prior study has verified that overexpression of miR-326 declined tumor growth in vivo [13]. A study has revealed that ectopic expressed miR-326 markedly attenuates cell growth, and suppresses cellular migration and invasiveness in non-small cell lung cancer cell lines [22]. Moreover, it is found that miR-326 decreases profibrotic genes like MMP-9, implying its repressive function in cancer cell proliferation [23]. Also, it is presented that miR-326 represses Bcl-2 protein expression and elevates Bax expression so as to affect the apoptosis [24]. Similar to our findings, there are some miRNAs interacting with exosomes to play a role in HCC development. It is displayed that highly expressed exosomal miR-638 can repress the proliferation of HCC cells, involving the potential impact on carcinogenesis [25]. Another study also proves that HCC cells-derived exosomal miR-451a suppresses tumor angiogenesis via disrupting endothelial functions as apoptosis, tube formation, migration and permeability [26]. A prior research generally confirms that when treated with the overexpression of miR-744 exosomes, the proliferation of HCC cells is dramatically suppressed [27].
Conclusion
To briefly conclude, our study provides evidence that M1 macrophage-derived exosomal miR-326 suppresses proliferation, migration and invasion as well as advances apoptosis of HCC cells, supplying a new insight in a novel target therapy for HCC. Due to the limited sample size and limited known researches, the exact mechanism of miR-326 is not fully elucidated, and therefore, further large-scale studies are required to illustrate the underlying mechanism.
