Nanopartikel Sorafenib Terikib hGC33 Menghambat Hepatoma Secara Sinergis melalui Penekanan Jalur Wnt
Abstract
Pengiriman inhibitor spesifik tumor adalah tantangan dalam pengobatan kanker. Nanopartikel yang dimodifikasi antibodi dapat menyerahkan obat yang dimuatnya ke sel tumor yang overekspresi antgen terkait tumor spesifik. Di sini, kami membangun nanopolimerek polietilen glikol-b-PLGA yang dimuat sorafenib dan dimodifikasi dengan antibodi hGC33 terhadap glipikan-3 (GPC3+), protein membran yang overexpressed pada karsinoma sel hepat. Kami menemukan bahwa NP yang dimodifikasi hGC33 (hGC33-SFB-NP) menargetkan sel karsinoma sel hepat (HCC) GPC3+ dengan secara spesifik terikat pada GPC3 di permukaan sel HCC, menghambat transduksi sinyal yang diinduksi Wnt, dan menghambat sel HCC pada G0/1 melalui penurunan ekspresi siklina D1, sehingga melemahkan migrasi sel HCC melalui inhibisi transisi epitel-mesenkima. hGC33-SFB-NP menghambat migrasi, progresi siklus sel, dan proliferasi sel HCC melalui inhibisi jalur Ras/Raf/MAPK dan jalur Wnt secara bersamaan dengan molekul GPC3, masing-masing. hGC33-SFB-NP menghambat pertumbuhan kanker hati in vivo dan meningkatkan tingkat kelangsungan hidup tikus yang dibawa tumor. Kami menyimpulkan bahwa hGC33 meningkatkan targeting SFB-NP ke sel HCC. hGC33-SFB-NP secara sinergis menghambat perkembangan HCC dengan memblokir jalur Wnt dan jalur Ras/Raf/MAPK.
Pendahuluan
Glipikan3 (GPC3) adalah proteoglikan sulfat hepar yang diekspresi pada permukaan sel melalui mekanisme yang melibatkan ancoran gliserofosfatidilinositol [1]. Meskipun GPC3 diekspresi dalam berbagai jaringan selama perkembangan, ekspresinya setidaknya sebagian terhemat dalam sebagian besar jaringan dewasa oleh metilisasi DNA di wilayah promotor [2]. Namun, protein GPC3 overexpressed pada sekitar 70% pasien karsinoma sel hepat (HCC) [3, 4] dan merangsang transduksi sinyal Wnt klasik [5] melalui interaksi dengan ligan Wnt, yang memfasilitasi ikatan Wnt/frizzled untuk mempromosikan pertumbuhan HCC [6]. Aktivasi jalur sinyal Wnt klasik adalah salah satu peristiwa paling sering yang terkait dengan transformasi maligan HCC [7, 8]. Berdasarkan kemampuan GPC3 untuk meningkatkan sinyal Wnt, kami berhipotesis bahwa overexpression GPC3 mempromosikan pertumbuhan HCC dengan merangsang jalur Wnt klasik.
Antikoklon terapeutik yang mengenali epitop di bagian C-terminal GPC3 (524–563) (hGC33), yang mengenali epitop C-terminal GPC3 (524–563), menghambat pertumbuhan tumor pada xenograft subkutan HepG2 dan Huh-7 pada tikus [9, 10]. hGC33 telah dihumanisasi melalui transplantasi wilayah komplementer, dan efek antikankernya setara dengan hGC33 untuk xenotransplantasi HepG2, dan hGC33 telah digunakan dalam uji klinis [11]. Hasil ini menunjukkan bahwa hGC33 memiliki aktivitas antitumor yang penting, dan pengobatan anti-GPC3 akan secara langsung menghambat proliferasi dan/atau kelangsungan hidup sel HCC dengan memblokir Wnt dan/atau jalur sinyal lainnya.
Namun, karena patogenesis HCC yang kompleks, efektivitas pemblokiran GPC3 saja terbatas [12]. Oleh karena itu, mengeksplorasi mekanisme rinci patogenesis HCC dan mengidentifikasi biomarker yang menjanjikan untuk diagnosis dan prognosis HCC dapat membantu menyediakan target terapeutik yang efektif dan meningkatkan prognosis pasien. Antikoklon anti-GPC3 telah diusulkan untuk meningkatkan sensitivitas HCC terhadap agen kemoterapi [13]. Aktivitas antitumor hGC33 dalam kombinasi dengan obat kimia standar telah dievaluasi terbaru [14]. Sorafenib adalah obat HCC target oral baru yang dapat secara langsung menghambat proliferasi sel tumor dengan memblokir jalur sinyal sel yang diusulkan oleh RAF/MEK/ERK untuk menahan pertumbuhan tumor [15, 16]. Namun, distribusi tidak spesifik sorafenib in vivo dan sinyal Wnt yang diaktifkan secara abnormal pada HCC membatasi efektivitas obat dan meningkatkan efek sampingnya [14,15,16]. Wnt terikat pada reseptor keluarga Frizzled untuk mengaktifkan transduksi sinyal seluler yang mengatur proliferasi sel, apoptosis, dan migrasi sel, dan menyebabkan resistensi obat pada banyak tumor, seperti HCC [17,18,19].
Dalam model xenotransplantasi HepG2, kombinasi hGC33 dan sorafenib lebih efektif dalam menghambat pertumbuhan tumor daripada sorafenib saja [15], dan pengiriman obat dengan nanokarrier polimer telah menerima perhatian besar dalam pengobatan kanker. Nanokarrier yang dimuat obat anticancer dapat mencegah distribusi tidak spesifik dan degradasi tidak spesifik in vivo, meningkatkan ketersediaan obat dan targeting antitumor, serta menyederhanakan evaluasi farmakokinetik dan pengobatan [15, 16]. Dalam berbagai nanopartikel berbasis polimer, formulasi berbasis asam polilaktik koasidl glikolat (PLGA) dianggap sebagai pengobat obat yang ideal dan aman [17, 18]. Dalam hal ini, polietilen glikol-b-poli(d,l-laktida-ko-glikolida) (PEG-b-PLGA) didasarkan pada kopolimer polietilen glikol dan PLGA, yang aman dan nontoksis setelah hidrolisis, dan telah disetujui oleh Badan Pangan dan Obat Amerika Serikat [19,20,21,22]. Oleh karena itu, suntikan intravena dengan nanokarrier kopolimer PEG-b-PLGA adalah strategi yang menjanjikan untuk mencapai pengiriman terpadu dan meningkatkan efikasi. Selain itu, aplikasi antikoklon spesifik hGC33 terhadap molekul GPC3 pada membran sel HCC tidak hanya dapat meningkatkan pengiriman nanop obat targeting in vitro dan in vivo [18, 19], tetapi juga memblokir Wnt dan/atau jalur sinyal lain yang terkait dengan GPC3, menghambat proliferasi dan/atau kelangsungan sel kanker, dan mungkin mencapai aktivitas antitumor sinergis.
Dalam studi ini, kami mengeksplorasi apakah nanopartikel kopolimer PEG-b-PLGA yang dimodifikasi dengan antikoklon hGC33 dapat memfasilitasi pengiriman sorafenib (hGC33-SFB-NP) ke HCC in vivo dan in vitro, dan meningkatkan efisiensi pengobatan HCC melalui targeting aktif HCC untuk mengubah farmakokinetik obat. Sesuai dengan ukuran partikel, potensial zeta, morfologi partikel, efisiensi tangkapan obat, kapasitas muatan obat, dan rilis obat in vitro, nanopartikel target difungsikan secara menyeluruh. Kemampuan targeting in vitro dikarakterisasi oleh penyerapan sel oleh sel hepatoma HepG2. Distribusi bio dan efek terapeutik sinergis hGC33-SFB-NP pada HCC dievaluasi dengan membandingkan sorafenib dan SFB-NP. Hasil kami menunjukkan bahwa hGC33-SFB-NP dapat menargetkan HCC GPC3+. Ini dapat menghambat progresi siklus sel, proliferasi sel, dan invasi tumor dengan menghambat jalur sinyal Wnt dan Ras/Raf/MAPK dan secara sinergis menghambat perkembangan kanker hati.
Bahan dan Metode
Bahan
Antikoklon hGC33, 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida (MTT), 4′,6-diamidino-2-fenilindol, hidroklorida (DAPI), 5,5′,6,6′-tetrakloro-1,1′,3,3′-tetrafenil-benzimidazolil karbosianin iodida (JC-1), dan dimetil sulfoksida (DMSO) diperoleh dari Sigma—Aldrich, Inc. (St. Louis, MO). 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimida hidroklorida dan N-hidroksisuksinima diperoleh dari Qiyun Biotech (Guangzhou, Tiongkok). Kit kuantifikasi protein asam bisonikotinat (BCA), kumarin-6, dan kit deteksi apoptosis Annexin V-FITC/PI dibeli dari Beyotime Biotechnology (Shanghai, Tiongkok). Kopolimer diblok mal-PEG-b-PLGA-maleimid (mal-PEG-b-PLGA; 25.000–30.000 Da, PLGA, LA:GA, w/w; PEG, 13–15%) dibeli dari Polyscitech (West Lafayette, IN, Amerika Serikat). Kit antikoklon PI3K (9655#), kit antikoklon p-Akt (9916#), kit antikoklon mTOR (9964#), kit antikoklon keluarga Bcl-2 (9942#), kit antikoklon apoptosis (9915#), dan antikoklon kambing anti-kelinci dan anti-tikus sekunder dibeli dari Cell Signal Technology (Danvers, MA, Amerika Serikat); siklin B1 dan kinas dependen siklin dibeli dari Abcam Biological Technology (USA). Antikoklon terhadap fosfo-Rb, siklin D1, kinas checkpoint 1 (CHK1), P53, fosfo-gen sensitivitas payudara 1 (p-BRCA1), RAD51, sitokrom C, dan proteinase matriks (MMP2 dan MMP9) dibeli dari Abcam (USA). Semua bahan kimia, reagien, dan pelarut grado analitik lainnya diperoleh dari pemasok standar dan digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut.
Sel dan Hewan
Baris sel karsinoma sel hepat HepG2 (diterima dari Koleksi Jenis Sel Amerika (Manassas, VA, Amerika Serikat) dikultur dalam medium DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, Amerika Serikat) yang dilengkapi dengan 10% FBS (HyClone, Logan, UT, Amerika Serikat) dan 80 U/ml penicilin serta 80 μg/ml streptomisin dalam atmosfer lembap 5% CO2 pada 37 °C. Tikus nuda BALB/C, berat 20–22 g (5–6 minggu) disediakan oleh Nanjing Junke Biotechnology Co., Ltd. (Tiongkok). Tikus nuda BALB/C dipelihara di ruang SPF. Semua perawatan dan perawatan hewan dilakukan sesuai dengan persyaratan perawatan hewan Universitas Ilmu dan Teknologi Anhui. Semua protokol eksperimen telah ditinjau dan disetujui oleh komite etika eksperimen hewan Universitas Ilmu dan Teknologi Anhui (Nomor Persetujuan: 2019dw013).
Persiapan Nanopartikel
Untuk menyiapkan NP, mal-PEG-b-PLGA dan SFB atau kumarin-6 ditimbang dan dilarutkan dalam fase organik (3:2 v/v diklorometana/aseton). Larutan ditambahkan ke dalam larutan alkohol polivinil (PVA) (5% w/v) secara tetes dengan pengadukan berkelanjutan. Campuran di sonikasi secara intermiten dengan sonikator probe (daya keluaran 550 W, 8 kali) di atas es untuk membuat emulsi minyak–air. Emulsi ditambahkan ke dalam larutan PVA (1% w/v) dengan pengadukan magnetik. NP SFB dan kumarin-6 dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 8000 rpm selama 30 menit dan dicuci tiga kali dengan air Milli-Q.
Untuk menghasilkan hGC33-NP melalui ikatan tioeter yang terbentuk dari reaksi maleimid dengan residu sulfhidril bebas pada antikoklon hGC33, antikoklon hGC33 dicampur dengan NP yang difungsikan maleimid dalam rasio molar 5:1 (hGC33: mal-PEG-b-PLGA) dan diinkubasi pada 4 °C selama 16 jam dengan pengadukan berkelanjutan. hGC33 dikonjugasi ke NP melalui reaksi grup sulfhidril pada antikoklon hGC33 dengan grup maleimid rantai PEG. Antikoklon yang tidak dikonjugasi dihilangkan melalui kolom Sepharose CL-4B. Konjugasi protein yang efisien dikonfirmasi dengan kit BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Amerika Serikat).
Karakterisasi Nanopartikel (NP)
Morfologi, Ukuran Partikel, Efisiensi Tangkapan (EE), dan Stabilitas NP
Morfologi NP dievaluasi dengan mikroskop transmisi elektron (TEM, H-600; Hitachi, Tokyo, Jepang). NP bebas obat hGC33-NP dan NP bebas obat direkam dengan spektrofotometer FTIR (Thermo Nicolet, Madison, WI, Amerika Serikat) menggunakan bromida kalium. Ukuran partikel rata-rata dan potensial zeta NP dikarakterisasi dengan Malvern Zetasizer ZEN3600 Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, Inggris) pada 20 °C. Efisiensi tangkapan obat (EE) dan kandungan muatan obat (LC) dievaluasi dengan ultrafiltraksi. Sampel dimuat ke dalam perangkat ultrafiltraksi (100 kMWCO; Sartorius, Göettingen, Jerman) dan disentrifugasi pada 8000 rpm selama 25 menit pada 4 °C untuk menghilangkan obat bebas. Volume yang sama dari setiap sampel dilarutkan dalam asetonitril untuk mengonfirmasi jumlah total obat. Konsentrasi diukur dengan kromatografi cairan berkinerja tinggi. Panjang gelombang absorpsi adalah 266 nm. Rumus berikut digunakan untuk menghitung EE (%) NP: (berat obat yang terperangkap / berat total obat) × 100%. LC (%) dihitung sebagai (berat obat yang terperangkap / berat NP) × 100%. Untuk memahami stabilitas NP pada suhu kamar, perubahan ukuran NP dievaluasi dengan pencaharan cahaya dinamis (DLS) pada titik waktu yang ditentukan (0,5, 1, 2, 4, 8, 12 jam, 16 jam, 20 jam, dan 24 jam) pada 25 °C.
Rilis Obat In Vitro dan Uji Pengambilan Selular
Obat dari NP diselidiki menggunakan kantong dialisis dengan batas berat molekuler 10 kDa. Singkatnya, 1 mL NP dimuat ke dalam kantong dialisis (MWCO 8.000–10.000 Da; Spectrum Labs Inc., CA, Amerika Serikat). Kantong dialisis direndam dalam PBS dan diaduk dengan pengacau magnetik pada 25 °C. Profil rilis obat NP diukur dalam 100 mL larutan penyangga fosfat 0,2 M (PBS; pH = 7,4) selama 7 hari. Konsentrasi obat dalam sampel diukur dengan kromatografi cairan berkinerja tinggi. Dalam studi selanjutnya, NP hGC33-kumarin 6 yang ukuran partikelnya sama dengan hGC33-SFB-NP digunakan untuk mengevaluasi targeting hGC33-SFB-NP. Sel HepG2 (GPC3+) dan Li-7 (GPC3−) diinkubasi dengan NP hGC33-kumarin 6 selama 0,5, 2, atau 4 jam pada 37 °C dalam 5% CO2, masing-masing. Sel yang dikultur bersama dicuci dan dikunci dengan formaldehida 4% selama 10 menit; inti sel diwarnai dengan Hoechst 33.342 5 μg/mL selama 15 menit untuk melokasi NP seluler. Citra nanopartikel seluler dianalisis dengan mikroskop konfokal (Olympus FV1000; Olympus Corporation, Tokyo, Jepang).
Efek Selular In Vitro
Sitikotoksisitas hGC33(Ab) bebas, SFB bebas, hGC33-null-NP, atau hGC33-SFB-NP ditentukan dengan uji MTT. Sel HepG2(GPC3+) dan Li-7 (GPC3−) dalam fase logaritma ditanam ke dalam piring 96-lubang dengan kepadatan 4000 sel per lobang kemudian diinkubasi selama 48 jam pada 37 °C dalam 5% CO2. Sel dirawati dengan hGC33, SFB bebas, hGC33-null-NP, atau hGC33-SFB-NP selama 48 jam pada 37 °C dalam 5% CO2. Setelah dikultur bersama untuk waktu tertentu, aktivitas anti-proliferasi sel ditentukan dengan uji MTT seperti dijelaskan [20]. Absorbansi setiap lobang diukur pada 490 nm dan nilai konsentrasi inhibitor maksimum setengah (IC 50) dihitung dengan SPSS 17.0.
Pengukuran Kemampuan Invasi Sel
Sel dalam fase pertumbuhan logaritma ditanam ke dalam piring 6-lubang dengan kepadatan 5 × 104 sel/lubang, diusap dengan kepala sedotan, dan diganti dengan medium kultur bebas serum. Penyembuhan luka direkam pada 0 jam, 24 jam, dan 48 jam dalam kelompok kontrol dan kelompok eksperimen. Pada saat yang sama, jumlah sel yang sama diinkulasi ke dalam kamar Transwell dan dirawati dengan hGC33 bebas, SFB bebas, hGC33-null-NP, atau hGC33-SFB-NP. 500 mikroliter medium FBS 10% ditambahkan ke kamar bawah. Setelah diinkubasi selama 24 jam, kamar Transwell diambil, sel dikunci dengan paraformaldehida 4%, dan diwarnai dengan kristal violet 0,1%. Ukuran penyembuhan luka dan jumlah sel migrasi dihitung untuk mengevaluasi kemampuan migrasi.
Penentuan Siklus Sel
Setelah diinkubasi selama semalam di piring 6-lubang, sel dirawati dengan hGC33 (Ab) bebas, SFB bebas, hGC33-null-NP, atau hGC33-SFB-NP selama 24 jam, kemudian dikumpulkan dan dikunci dengan etanol. Setelah diwarnai dengan iodida propidium, situsometri aliran dilakukan, dan siklus sel dianalisis dengan modifit 3.0 (Verity Software House, Topsham, ME).
Western Blotting
Untuk mengevaluasi status aktivasi jalur sinyal dan ekspresi molekul target, sel diinkubasi selama semalam di piring 6-lubang, dan hGC33 bebas, SFB bebas, hGC33-null-NP, atau hGC33-SFB-NP diterapkan selama 24 jam. Sel dari setiap kelompok perawatan dikumpulkan, dan protein diekstrak dan diukur. Konsentrasi protein diukur dan dikalibrasi dengan kit protein BCA (Biosharp, Hefei, Tiongkok). Protein sampel dipisahkan dengan elektroforesis gel poliakrilamida sulfat duodekil, ditransfer ke membran PVDF, dan dilapiri dengan susu lemak bebas. Antibodi pertama (dilarutkan 1:1000) diinkubasi selama semalam pada 4 C, dan antibodi kedua (1:2000) diinkubasi selama 1 jam pada suhu kamar. Pita divisualisasikan dengan substrat ECL (Thermo Fisher Scientific Waltham, MA, Amerika Serikat), dan citra ditampilkan dengan sistem analisis citra gel, dan β-aktin digunakan sebagai kontrol.
Aktivitas Anti-Tumor In Vivo
Pembalutan hGC33 bebas, SFB bebas, hGC33-null-NP, SFB-NP, dan hGC33-SFB-NP terhadap pertumbuhan HCC in vivo ditentukan. Sesuai dengan peraturan dan pedoman kesehatan hewan komite etika Universitas Ilmu dan Teknologi Anhui, semua eksperimen dilakukan pada tikus BALB/c dalam kandang di ruang dengan pengaturan suhu (23 ± 2 °C) dengan siklus cahaya/gelap 12 jam/12 jam. Suspensi 50 μl yang mengandung 5 × 106 sel HepG2 hidup disuntik subkutan ke perut kanan tikus BALB/c betina berusia 5 minggu (20–22 g). Ketika volume tumor mencapai sekitar 50 mm3, tikus diacak ke dalam 6 kelompok (10 tikus per kelompok). Kontrol larutan garam normal NS (200 mg/kg null NP dalam 200 μL PBS), hGC33-null-NP (hGC33-null-NP dalam 200 μL PBS, setara dengan hgc33 = 100 μg/kg/kali), hGC33 bebas (hGC33 dalam 200 μL PBS, 100 μg/kg/kali), SFB bebas (dosis SFB: 8 mg/kg/kali), SFB-NP (dosis SFB: 8 mg/kg/kali), dan hGC33-SFB-NP (setara dengan SFB = 8 mg/kg/kali, hGC33 = 100 μg/kg/kali) disuntik melalui vena ekor setiap 2 hari selama 10 kali. Bobot dan ukuran tikus diukur setiap empat hari. Rumus perhitungan volume tumor adalah volume = 0,5 × L × W2, di mana L dan W masing-masing mewakili panjang dan lebar tumor. Empat minggu setelah pemberian, hewan diutanasi dengan eter dietil, dan ukuran serta bobot tumor diukur. Selain itu, tumor, jantung, hati, ginjal, paru-paru, dan lien diambil, dikunci dengan larutan paraformaldehida 4%, disatukan dalam parafin, diiris, dan diwarnai dengan hematoxylin dan eos untuk mengevaluasi perubahan histologis dengan mikroskop digital.
Analisis Statistik
Data disajikan sebagai mean ± simpangan baku (SD) dan dievaluasi dengan analisis variansi dengan SPSS 18.0. Perbandingan statistik pasangan dilakukan menggunakan uji t Student dua arah. Perbedaan dianggap signifikan secara statistik untuk P < 0,05.
Hasil
Karakterisasi NP dan Rilis Obat In Vitro
Karena diameter dan properti permukaan NP mempengaruhi penyerapan sel, rilis obat, dan distribusi NP in vivo, kami memfungsikan NP yang disiapkan dengan parameter yang sesuai. Morfologi, ukuran partikel, dan distribusi ukuran partikel polimer SFB-NP, hGC33-null-NP, dan hGC33-SFB-NP diringkas dalam Gambar 1. Morfologi hGC33-SFB-NP yang diamati dengan mikroskop transmisi elektron (Gambar 1a) menunjukkan inti tegar dengan tepi kabur, yang menunjukkan bahwa hGC33 ada pada permukaan NP. Ukuran partikel SFB NP, hGC33-null-NP, dan hGC33-SFB-NP bervariasi dari 100 hingga 150 nm dan memiliki distribusi ukuran partikel unimodal tipikal. Diameter rata-rata hGC33-SFB-NP (120,2 ± 10,2 nm) sedikit lebih besar daripada hGC33-null-NP, SFB-NP, dan null NP (Gambar 1a, Tabel 1). Film tipis bola tidak jelas dengan satu permukaan ada pada permukaan hGC33-SFB-NP dan hGC33-null-NP, yang menunjukkan bahwa antikoklon hGC33 ada pada permukaan NP. Peningkatan ukuran untuk hGC33-SFB-NP dan hGC33-null-NP mengonfirmasi keberadaan film hGC33. Sintesis hGC33-SFB-NP dikonfirmasi dengan 1H-NMR (Gambar 1b) sebelum pembuatan NP. Puncak pada 5,2 ppm dan 1,58 ppm ditetapkan pada proton -CH3 asam laktat; puncak pada 4,8 ppm ditetapkan pada -OCH2- asam glikolat; dan puncak pada 3,6–3,8 ppm ditetapkan pada proton -CH2CH2O- unit ulang PEG. Kimia permukaan PEG-b-PLGA dan Ab-PEG-b-PLGA NP juga diselidiki dengan spektroskopi FTIR (Gambar 2c). Dalam spektrum polimer PEG-b-PLGA, pita kuat di sekitar 1750 cm−1 berasal dari gerangan grup karbonil (C = O) dalam rantai PLGA. Pita pada 2880 cm−1 disebabkan oleh gerangan grup a –CH dalam rantai PEG. Pada saat yang sama, puncak muncul pada 2520 cm−1 yang kita atributkan pada puncak gerangan -SH antikoklon hGC33. Hasil 1H NMR dan FTIR menunjukkan bahwa antikoklon digraf pada tulang belakang polimer PEG-b-PLGA.
Karakterisasi NP. a Karakterisasi TEM NP, skala batas menunjukkan 100 nM; b spektrum 1H NMR sintesis hGC33-PLGA-b-PEG dalam CDCl3; c spektrum FTIR hGC33-PEG-b-PLGA dan PEG-b-PLGA; d profil rilis kumulatif SFB-NP dan hGC33-SFB-NP dalam PBS (pH = 7,4) pada 37 °C; e perubahan ukuran NP yang diinkubasi dalam medium DMEM yang mengandung 10% FBS selama 14 hari; f perubahan ukuran NP yang diinkubasi dalam PBS selama 14 hari. SFB, sorafenib; TEM, mikroskop transmisi elektron; NP, nanopartikel; 1H NMR, spektroskopi resonansi magnetik nuklir 1H; FTIR, spektroskopi inframerah transformasi Fourier
Ekspresi GPC3 dan penyerapan NP hGC33-kumarin6 pada sel Li-7 dan HepG2. Sel, diinkulasi pada piring kultur, dicuci dengan PBS dan diinkubasi dengan 100 μg/ml NP hGC33-kumarin6 dalam DMEM selama 2, 4, dan 8 jam. Inti diwarnai dengan DAPI, dan sel dikunci dan terdeteksi dengan mikroskop skaning laser konfokal. GPC3 tidak terdeteksi pada sel Li-7, tetapi ekspresi tinggi pada sel HepGse seperti terdeteksi dengan imunositokimia. Skala batas menunjukkan 50 μM
Menariknya, NP hGC33-SFB-NP dan SFB-NP dalam medium DMEM yang mengandung 10% FBS (pH = 7,4) memiliki rilis obat yang cepat hingga sekitar 4 hari, kemudian relatif lambat dan stabil; rilis kumulatif SFB hGC33-SFB-NP dan SFB-NP selama 20 hari adalah sekitar 77% dan 65%, masing-masing (Gambar 1d). Perbedaannya mungkin disebabkan oleh molekul hidrofil pada permukaan matriks PEG-b-PLGA, yang dapat mempercepat degradasi nanopartikel dengan meningkatkan hidrasi dan sehingga mempromosikan hidrolisis. Untuk menentukan stabilitas NP yang disiapkan, hGC33-SFB-NP, hGC33-null NP, null-NP, dan SFB-NP ditempatkan dalam medium DMEM yang mengandung 10% FBS (pH = 7,4) dan dalam PBS (pH = 7,4). Ukuran berbagai NP tetap stabil selama lebih dari 2 minggu. SFB dirilis dari hGC33-SFB-NP secara sosten dan stabil selama 14 hari, tetapi ada perubahan kecil dalam ukuran partikel dalam medium DMEM dibandingkan dengan yang dalam 10% FBS (Gambar 1e, f). Stabilitas hGC33-SFB-NP akan sesuai untuk SFB yang memiliki peran biologis sosten.
Potensial zeta yang besar dapat menyebabkan interaksi refleksi elektrostatis yang kuat antara NP dan mempertahankan stabilitas sistem dispersi NP [23, 24]. Seperti ditunjukkan dalam Tabel 1, potensial zeta hGC33-SFB-NP, hGC33-null-NP, dan SFB-NP adalah − 18,2 ± 2,2 mv, − 18,5 ± 1,8 mv, dan − 15,9 ± 2,1 mv, masing-masing, yang mungkin disebabkan oleh muatan negatif yang dihasilkan oleh grup aldehid, grup karboksil, dan grup fosfat dalam glikoprotein antikoklon hGC33. NP yang bermuatan negatif dapat menyebabkan stabilitas tinggi suspensi NP. Selain itu, karena permukaan sel bermuatan negatif dalam lingkungan fisiologis normal, NP yang disiapkan menolak sel dengan muatan rendah dan kurang toksis terhadap jaringan dan sel. Selain itu, distribusi ukuran null-NP dan SFB-NP (indeks polidispersi [PDI] 0,18 dan 0,19, masing-masing) sedikit tetapi tidak signifikan lebih kecil daripada hGC33-null-NP (PDI = 0,21) dan hGC33-SFB-NP (PDI = 0,23). Oleh karena itu, ukuran nanopartikel memiliki homogenitas yang baik. Ukuran partikel, distribusi ukuran partikel, dan potensial zeta NP ditunjukkan dalam Tabel 1 sesuai dengan hasil efisiensi tangkapan dan kandungan muatan SFB. Antikoklon GPC3 hGC33 yang tidak dikonjugasi dihilangkan melalui ultracentrifugasi, dan efisiensi ikatan antikoklon hGC33 ke NP dievaluasi. Analisis protein BCA menunjukkan bahwa efisiensi ikatan antikoklon hGC33 ke NP adalah 79,5% ± 2,9%.
Efek NP hGC33-Kumarin 6 yang Menargetkan GPC3+ Baris Sel HepG2 HCC
Untuk mengetahui apakah antikoklon hGC33 pada nanopartikel masih memiliki kemampuan untuk secara spesifik menargetkan GPC3, kami menggunakan sel HepG2 GPC3+ dan Li-7 GPC3− sebagai sel target dan NP hGC33-kumarin 6 sebagai nanopartikel penjelajah, dan menginkubasi sel yang berbeda selama 2 jam, 4 jam, dan 8 jam. Sel dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali dan bereaksi dengan DAPI untuk mewarnai inti. Sel dikunci dan difoto dengan mikroskop fluoresen Leica (DMi8, Jerman). Ditemukan bahwa fluoresen hijau pada sel HepG2 secara signifikan lebih tinggi daripada pada sel Li-7 pada waktu inkubasi yang sama (Gambar 2), menunjukkan bahwa jumlah NP hGC33-kumarin 6 yang masuk ke sel HepG2 secara signifikan lebih tinggi daripada pada sel Li-7. Hasil ini mendokumentasikan bahwa antikoklon hGC33 pada NP hGC33-Kumarin6 masih memiliki kemampuan untuk menargetkan GPC3 dan memediasi internalisasi nanopartikel. Ekspresi GPC3 pada sel HepG2 dan Li-7 diperiksa dengan fluoresensi tidak langsung dan pewarnaan sitokimia. Hasil menunjukkan bahwa sel HepG2 overexpression GPC3, sementara sel Li-7 tidak ekspresi GPC3 (Gambar 2).
hGC33-null-NP Menghambat Proliferasi Sel HepG2
Untuk menentukan apakah NP yang dimodifikasi hGC33 (hGC33-null-NP) dapat menghambat pertumbuhan HCC, kami mengukur penahanan pertumbuhan sel baris sel HCC positif GPC3 HepG2 dan baris sel negatif GPC3 Li-7. Kami menemukan bahwa baik hGC33-null-NP maupun hGC33 menghambat pertumbuhan baris sel HCC positif GPC3 HepG2 setelah perawatan selama 24 jam, tetapi hGC33 memiliki efek penahanan yang lebih signifikan pada sel HepG2 daripada hGC33-null-NP (Gambar 3a); sebaliknya, hGC33-null-NP dan hGC33 tidak mempengaruhi pertumbuhan baris sel Li-7 negatif GPC3 (Gambar 3b). Kurs waktu representatif hGC33-null-NP (setara dengan 0,1 μm hgc33) dan hGC33 (0,1 μm) pada proliferasi sel HepG2 diilustrasikan dalam Gambar 3c. Karena hGC33 adalah peptida C-terminal yang mengenali GPC3, hGC33 lebih unggul daripada hGC33-null-NP dalam menghambat HepG2. Hasil ini menunjukkan bahwa molekul hGC33 pada hGC33-null-NP mungkin memiliki efek pemblokiran ruang, yang dapat mempengaruhi kemampuan ikatan hGC33 ke epitop.
Proliferasi sel HepG2 dan Li-7 dihemat oleh hGC33, null-NP, dan hGC33-null-NP. a Uji proliferasi sel dilakukan pada sel HepG2 positif GPC3 yang dirawati dengan hGC33, null-NP, atau hGC33-null-NP; b uji proliferasi sel dilakukan pada sel Li-7 negatif GPC3 yang dirawati dengan hGC33, null-NP, dan hGC33-null-NP. Sel diinkubasi dengan 0–2,5 μM hGC33, null-NP, atau hGC33-null-NP selama 1 hari. Proliferasi sel diukur dengan metode MTT dan distandardkan sebagai sel yang tidak dirawati. Semua nilai mewakili mean ± SD. Dibandingkan dengan kelompok kontrol (0 μM) tanpa perawatan antikoklon, *P < 0,01; c hasil representatif respons HepG2 terhadap hGC33, null-NP, dan hGC33-null-NP dalam perawatan hGC33 (1,0 μM)
hGC33-null-NP Menghambat Siklus Sel HepG2
Untuk memahami mekanisme aktivitas molekuler antikoklon hGC33 yang dimodifikasi pada nanopartikel hGC33-null-NP, kami mempelajari progresi siklus sel HepG2 yang dirawati dengan hGC33-null-NP. Pada baris sel HepG2, hGC33-null-NP dan hGC33 secara signifikan meningkatkan proporsi sel dalam G1 (Gambar 4a, b), menunjukkan bahwa baik hGC33-null-NP maupun hGC33 dapat menginduksi penahanan siklus sel pada fase G1. Selain itu, hGC33-null-NP dan hGC33 dapat secara signifikan menurunkan ekspresi siklinD1 pada sel HepG2 (Gambar 4c, d).
hGC33-null-NP dan hGC33 menginduksi penahanan siklus sel pada fase G1 dan menghambat ekspresi siklinD1 pada sel HepG2. a Diagram siklus sel representatif dari berbagai kelompok yang dirawati dengan hGC33-null-NP dan hGC33. b Analisis siklus sel dari berbagai kelompok yang dirawati dengan hGC33-null-NP dan hGC33. Sel HCC diinkubasi dengan 0,5 μm hGC33 atau hGC33-null-NP (dengan konsentrasi molar hGC33 sebagai referensi). *P < 0,05, fase G1 sel hGC33-null-NP atau hGC33 dibandingkan dengan sel 0 jam. c, d Setelah perawatan hGC33-null-NP atau hGC33, siklinD1 secara signifikan menurun pada sel HepG2 dibandingkan dengan kelompok kontrol
Aktivasi Wnt pada Sel HepG2, Huh-7 dan Li-7
Untuk memahami aktivasi sinyal Wnt/β-Katenin klasik pada sel HCC, kami pertama kali mendeteksi ekspresi ligan Wnt dan reseptor protein keriput (frizzled, FZD atau Frz) pada berbagai baris sel HCC: HepG2 (GPC3++), Huh-7 (GPC+), dan Li-7 (GPC3−). Hasil menunjukkan bahwa Wnt3a dan reseptor FZD yang mentransduksi jalur β-Katenin diekspresi pada semua baris sel, terutama pada sel HepG2 dan Huh-7 (Gambar 5).
Ekspresi Wnt3a, FZD1, dan FZD3 pada baris sel HCC
hGC33-null-NP Menghambat Proliferasi Sel yang Tergantung pada Transduksi Sinyal Wnt yang Diinduksi oleh Wnt3a
Beberapa studi telah menunjukkan bahwa bagian ekstraseluler GPC3 mungkin menjadi reseptor ko Wnt, yang mempromosikan aktivasi dan transduksi sinyal Wnt/β-Katenin. Oleh karena itu, ketika sel HepG2 (GPC3+), Huh-7 (GPC3+), dan Li-7 (GPC3−) diinkubasi bersama dengan hGC33 dan hGC33-null-NP, aktivasi sinyal Wnt/β-katenin diblokir oleh hGC33 dan hGC33-null-NP, dan proliferasi HepG2 dan Huh-7, tetapi tidak Li-7, dalam medium yang dikondisikan Wnt3a dihemat. Kemungkinan besar proliferasi sel Li-7 disebabkan oleh kehadiran GPC3 pada permukaan sel Li-7 (Gambar 6). Hasil kami menunjukkan bahwa nanopartikel hGC33 dan hGC33-null-NP secara spesifik terikat pada molekul GPC3 pada membran sel. hGC33 dan hGC33-null-NP sebagian mematikan aktivitas mitogen Wnt3a dan menghambat jalur sinyal Wnt/β-katenin. Namun, pemblokiran proliferasi oleh nanopartikel hGC33-null-NP lebih sedikit daripada hGC33. Mungkin struktur spasial nanopartikel mengganggu hGC33-null-NP dan membatasi fungsi molekul hGC33 pada nanopartikel sehingga mereka tidak dapat sepenuhnya memblokir interaksi antara GPC3 dan Wnt3a.
Transduksi sinyal Wnt yang diaktifkan GPC3 pada HCC. 50 persen medium DMEM Wnt3a ditambahkan dengan antikoklon anti-wnt3a, hGC33, atau hGC33-null-NP. Sel HepG2 (GPC3++), Huh-7 (GPC3+) dan Li-7 (GPC3−) diinkubasi bersama selama 48 jam, dan proliferasi sel diukur dengan uji MTT. Data dinyatakan sebagai mean ± SD (*P < 0,01)
hGC33-null-NP Menghambat Transduksi Sinyal yang Diinduksi oleh Wnt3a pada Sel HepG2 dan Huh-7
Untuk memahami efek hGC33-null-NP pada sinyal Wnt/β-katenin pada sel HCC, kami mengekstrak protein sel HepG2 dan Huh-7 yang dirawati dengan hGC33 atau hGC33-null-NP. Hasil western blot menunjukkan bahwa setelah perawatan hGC33-null-NP, tingkat pYAP dan pβ-catenin meningkat, tetapi tingkat YAP dan β-catenin menurun. Selain itu, tingkat siklinD1, CD44, VEGF, dan c-MYC pada kelompok hGC33-null-NP lebih rendah daripada kelompok kontrol, tetapi tingkatnya lebih rendah daripada perawatan hGC33. Efek serupa diamati pada sel HepG2 dan Huh-7, seperti ditunjukkan pada Gambar 7.
Pemblokiran sinyal β-katenin yang diinduksi oleh Wnt3a oleh hGC33-null-NP atau hGC33. a Dibandingkan dengan kelompok kontrol, jalur sinyal Wnt/β-katenin pada sel HepG2 dan Huh-7 yang dirawati dengan hGC33-null-NP atau hGC33 dihemat, dan tingkat β-katenin dan YAP menurun, sementara molekul β-katenin fosforilasi dan YAP fosforilasi yang meningkat tidak stabil, dan terdegradasi dalam sitoplasma. β-katenin yang menurun sulit untuk dipertahankan dalam inti dan memacu ekspresi SiklinD1, CD44, VEGF, dan c-MYC, yang mengakibatkan penurunan tingkat protein siklinD1, CD44, VEGF, dan c-myc. b Pola mekanisme jalur sinyal Wnt/β-katenin yang dihemat oleh hGC33-null-NP atau hGC33
hGC33-SFB-NP atau hGC33 Melemahkan Migrasi Sel HCC dengan Menghambat Transisi Epitel-Mesenkim (EMT)
HCC adalah salah satu kanker paling mematikan di dunia, dan incidensinya meningkat secara stabil. Sorafenib adalah pengobatan standar tunggal yang disetujui untuk pasien dengan HCC lanjutan, karena telah terbukti meningkatkan tingkat kelangsungan hidup pasien ini. Namun, observasi klinis dan prklinis menunjukkan bahwa terapi sorafenib memiliki efektivitas yang terbatas karena perkembangan cepat resistensi obat. Oleh karena itu, menguraikan mekanisme escape resistensi terhadap sorafenib adalah penekanan utama dalam penelitian HCC. Dalam beberapa tahun terakhir, perhatian yang lebih besar telah diberikan pada peran transisi epitel-mesenkim (EMT) dalam perkembangan HCC dan perkembangan resistensi obat. EMT merujuk pada transformasi sel epitel menjadi sel mesenchymal, yang memberikan sel kemampuan untuk metasta dan invasi, termasuk perolehan karakteristik sel akar, mengurangi apoptosis dan penuaan, mempromosikan imunosupresi, dan terlibat dalam terjadinya dan perkembangan kanker. Kehilangan ekspresi E-kadherin dianggap sebagai langkah kunci dalam karsinogenesis dan EMT. EMT adalah proses reprogramasi molekuler dan selular multi-tahap perkembangan yang digunakan sel kanker untuk mencapai agresi. Ini terutama melalui penurunan ekspresi E-kadherin, keratin, mukin, ZO-1 (protein jepit rapat); peningkatan ekspresi vimentin, aktin otot halus alfa (α-SMA), FN fibronectin, MMPs (degradasi matriks), N-kadherin, snail, slug, twist, Rho, TGF-β, FGF, kolagen tipe I, dan kolagen tipe II untuk mencapai invasi, metastasi, dan anti-apoptosis tumor karakteristik EMT. Perubahan ekspresi protein ini terutama melibatkan aktivasi jalur sinyal Wnt/β-katenin dan Ras/Raf/MAPK.
Eksperimen kami telah menunjukkan bahwa antikoklon hGC33 pada permukaan vektor NP dapat menghambat transduksi sinyal β-katenin yang diinduksi oleh Wnt3a, dan kemudian menurunkan ekspresi β—katenin, CD44, faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGF), siklin D1, dan c-MYC. Selain itu, hGC33-SFB-NP menghambat aktivasi jalur sinyal Ras/Raf/MAPK dan menghambat proliferasi dan apoptosis sel HCC. hGC33 dan SFB memiliki efek sinergis, menghambat EMT dan mengurangi migrasi sel HCC (Gambar 8).
Efek hGC33-SFB-NP pada inhibisi EMT. a Dibandingkan dengan kelompok kontrol, kelompok perawatan hGC33-SFB-NP memiliki migrasi sel yang lebih sedikit. Foto diambil di bawah mikroskop optik (pengembesan, × 200). Nilai error mewakili simpangan baku dari tiga eksperimen independen. *Dibandingkan dengan kelompok kontrol, p < 0,01. b Dibandingkan dengan kelompok kontrol, protein terkait EMT snail, vimentin, dan MMP-2 pada HCC yang dirawati dengan hGC33-SFB-NP menurun, sementara E-kadherin meningkat. c Mekanisme molekuler EMT. EMT, transisi epitel-mesenkim; MMP-2, proteinase matriks-2; SFB, sorafenib; NP, nanopartikel
hGC33-SFB-NP Menghambat Pertumbuhan Karsinoma Sel Hepat In Vivo dan Meningkatkan Tingkat Kelangsungan Hidup Tikus yang Dibawa Tumor
Untuk mengevaluasi aktivitas antitumor hGC33-SFB-NP in vivo, sel HepG2 dan Huh-7 ditanam subkutan pada perut kanan dan sisi dorsal tikus nuda BALB/c betina, masing-masing. Ketika pertumbuhan xenograft tumor mencapai sekitar 30 mm3, tikus diacak ke dalam kelompok untuk mengevaluasi lebih lanjut inhibi setiap kelompok (hGC33-SFB-NP, hGC33-null-NP, SFB-NP, hGC33 bebas, SFB bebas, dan kelompok kontrol) efek HCC (n = 5 per kelompok). Terlihat dari Gambar 9a, b bahwa hGC33-SFB-NP secara signifikan melambat pertumbuhan tumor pada tikus dibandingkan dengan kontrol PBS dan perawatan lainnya. Dibandingkan dengan kontrol PBS, hGC33-null-NP, SFB-NP, hGC33 bebas, dan SFB bebas juga memiliki beberapa inhibi terhadap HCC, ini karena hGC33 bebas dan SFB bebas secara langsung menghambat sinyal Wnt dan Ras/Raf/MAPK, masing-masing. Jalur tersebut dapat menghambat proliferasi sel HCC hinggaCertain extent. Meskipun antikoklon hGC33 yang dimodifikasi nanopartikel (hGC33-null-NP) terhubung ke permukaan nano melalui ikatan kimia, ini tidak mempengaruhi targeting hGC33 terhadap molekul GPC3 dan inhibi aktivitas Wnt. SFB yang dimuat nanopartikel (SFB-NP), setelah diendositasi oleh sel, terdegradasi untuk merilis SFB dari kopolimer untuk menghambat pertumbuhan HCC. Secara keseluruhan, efek inhibi hGC33-SFB-NP pada xenograft sel HepG2, seperti yang diharapkan, lebih banyak daripada pada xenograft sel Huh-7, kemungkinan karena HepG2 mengekspresi molekul GPC3.
Efek hGC33-SFB-NP pada xenotransplantasi HCC pada tikus nuda dan perubahan bobot tikus. Sel kanker hati ditanam subkutan pada punggung setiap tikus nuda (n = 10). Setelah 10 hari, tikus yang dibawa tumor dirawati dengan PBS (kontrol), hGC33 bebas, SFB bebas, hGC33-null-NP, SFB-NP, dan hGC33-SFB-NP. Ukuran tumor (a, b) dan bobot badan (c, d) tikus dipantau pada titik waktu yang ditetapkan
Bobot badan tikus nuda pada setiap kelompok perawatan juga diukur, seperti ditunjukkan pada Gambar 9c, d. Bobot badan kelompok kontrol menurun secara bertahap. Bobot tikus pada kelompok perawatan hGC33 bebas, SFB bebas, SFB-NP, dan hGC33-null-NP juga menurun secara progresif dan tidak signifikan lebih sedikit daripada kelompok kontrol. Namun, bobot tikus nuda yang dibawa HepG2 dan Huh-7 yang dirawati dengan hGC33-SFB-NP hanya sedikit menurun, dan bobot tetap relatif stabil selama siklus perawatan. Hasil ini mendukung bahwa nanobobot hGC33-SFB-NP yang baru tidak memiliki toksisitas yang signifikan pada tikus nuda, dan SFB yang dimuat pada nanokarrier serta modifikasi permukaan hGC33 dapat menghasilkan efek antitumor aditif atau bahkan sinergis.
Diskusi
Untuk memeriksa keakuratan hGC33-SFB-NP untuk terapi HCC yang ditargetkan, kami menguji konjugat model untuk kemampuan mereka untuk terikat pada glipikan-3 manusia pada sel HCC in vitro; untuk menghambat proliferasi, migrasi, dan transduksi sinyal Wnt/β-katenin sel HCC positif glipikan-3; dan menghambat HCC yang overexpression glipikan-3 in vivo.
Untuk secara kovalen terikat antikoklon spesifik GPC3 hGC33 dengan nanopartikel mal-PEG-b-PLGA, kami menyilangkan grup sulfhidril bebas pada segmen Fc hGC33 dengan mal-PEG-b-PLGA yang difungsikan maleimid dengan membentuk ikatan tioeter stabil. Konjugasi adalah prasyarat untuk targeting HCC positif GPC3. Seri eksperimen, termasuk perubahan diameter nanopartikel dan potensial zeta yang terdeteksi oleh lensa serta penyerapan seluler hGC33-SFB-NP, memverifikasi targeting hGC33-SFB-NP pada sel HepG2 (GPC3+). Hasil ini menunjukkan bahwa aktivitas ikatan antikoklon hGC33 tidak diubah oleh konjugasi.
Kami secara langsung mendeteksi efek fagositik sel HepG2 positif GPC3 dan Li-7 negatif GPC3 pada permukaan NP PEG-b-PLGA yang dimodifikasi hGC33 dengan mikroskop konfokal. Setelah sel HepG2 dan Li-7 dikultur bersama dengan NP hGC33-kumarin 6, intensitas sinyal hijau pada sel HepG2 secara signifikan lebih tinggi daripada pada sel Li-7, menunjukkan bahwa ada lebih banyak nanopartikel pada sel HepG2. Temuan ini konsisten dengan antikoklon hGC33 yang dimodifikasi pada permukaan NP PEG-b-PLGA secara spesifik terikat pada glipikan-3 pada permukaan sel HCC dan diinternalisasi. Efisiensi internalisasi NP yang dimodifikasi hGC33 bergantung pada tingkat ekspresi antigen GPC3 pada permukaan sel.
Kami menggunakan uji MTT standar untuk mengukur efisiensi penahanan proliferasi sel hepatoma. Baik hGC33-null-NP maupun hGC33 menghambat pertumbuhan baris sel HCC positif GPC3 HepG2, tetapi hGC33-null-NP dan hGC33 tidak mempengaruhi proliferasi sel Li-7 negatif GPC3 (Gambar 3b). Pada tingkat hewan, hGC33-null-NP atau hGC33 saja menghambat pertumbuhan xenograft Huh-7 dan HepG2 hinggaCertain extent, sementara hGC33-SFB-NP menyebabkan penahanan pertumbuhan xenograft hepatoma Huh-7 dan HepG2 pada tikus. Temuan bahwa hGC33-null-NP secara signifikan menghambat sel hepatoma positif GPC3 menunjukkan bahwa efek inhibi hGC33 yang dimodifikasi pada permukaan NP PEG-b-PLGA terhadap proliferasi sel HCC bergantung pada ekspresi antigen GPC3 pada permukaan sel.
GPC3 mengatur banyak jalur dalam patogenesis HCC, termasuk Wnt dan YAP sinyal [25,26,27]. GPC3 berinteraksi dengan ligan Wnt dan mungkin menjadi reseptor ko untuk Wnt dan memfasilitasi ikatan Wnt/Frizzled untuk pertumbuhan HCC [28, 29]. Kami lebih lanjut memeriksa efek nanobobot permukaan yang dimodifikasi hGC33 pada jalur sinyal Wnt pada sel hepatoma. Seperti hGC33 bebas, nanobobot permukaan yang dimodifikasi hGC33 menghambat proliferasi sel hepatoma tidak hanya dengan memblokir transduksi sinyal yang diinduksi Wnt pada sel HepG2 dan Huh-7 yang ekspresi GPC3, tetapi juga dengan menghambat transduksi sinyal β-katenin dan YAP yang diinduksi oleh Wnt3a. Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa ekspresi YAP diatur oleh β-katenin pada tingkat transkripsi HCC [30, 31]. Dalam studi ini, hGC33 bebas dan nanobobot permukaan yang dimodifikasi hGC33 menghambat aktivitas YAP yang diinduksi oleh Wnt3a, menunjukkan bahwa Yap/TAZ yang dilepaskan dari kompleks β-katenin juga dapat memulai transduksi sinyal Wnt klasik [32, 2]. Hasil ini menunjukkan bahwa Wnt tipikal dan lintas berkaitan YAP melalui berbagai mekanisme. Dibandingkan dengan hGC33-null-NP dan hGC33, hGC33-SFB-NP memiliki kemampuan anti-proliferasi dan anti-migrasi yang lebih kuat in vitro dan in vivo. Oleh karena itu, hGC33 tidak hanya menentukan spesifisitas sel HCC, tetapi juga meningkatkan efek inhibi SFB terhadap proliferasi dan migrasi sel HCC dengan memblokir sinyal kunci yang terkait dengan pertumbuhan tumor, seperti jalur sinyal Wnt/β-katenin dan Wnt/YAP.
Kesimpulan
Antikoklon hGC33 terhadap glipikan-3, protein membran yang overexpressed pada sel karsinoma sel hepat, meningkatkan ikatan nanopolimerek polietilen glikol-b-PLGA yang dimuat sorafenib (hGC33-SFB-NP) terhadap glipikan-3 pada sel kanker. Pemberian nanopartikel yang dimodifikasi antikoklon secara sinergis menghambat transduksi sinyal yang diinduksi Wnt dan jalur sinyal Ras/Raf/MAPK; sel karsinoma sel hepat terperangkap pada fase G0/1 melalui penurunan ekspresi siklin D1, sehingga melemahkan migrasi sel kanker dengan menghambat transisi epitel-mesenkim. hGC33-SFB-NP menghambat pertumbuhan kanker hati in vivo dan meningkatkan tingkat kelangsungan hidup tikus yang dibawa tumor.
