hGC33-Modified dan Sorafenib-Loaded Nanopartikel memiliki Efek Anti-Hepatoma Sinergis dengan Menghambat Jalur Sinyal Wnt
Abstrak
Pemberian inhibitor spesifik tumor merupakan tantangan dalam pengobatan kanker. Nanopartikel yang dimodifikasi antibodi dapat mengirimkan obat yang dimuat ke sel tumor yang mengekspresikan antigen spesifik terkait tumor secara berlebihan. Di sini, kami membuat nanopartikel polimer polietilen glikol-b-PLGA bermuatan sorafenib yang dimodifikasi dengan antibodi hGC33 menjadi glypican-3 (GPC3 +), protein membran yang diekspresikan secara berlebihan pada karsinoma hepatoseluler. Kami menemukan bahwa NP yang dimodifikasi hGC33 (hGC33-SFB-NP) menargetkan GPC3
+
sel karsinoma hepatoseluler (HCC) dengan secara khusus mengikat GPC3 pada permukaan sel HCC, menghambat transduksi sinyal yang diinduksi Wnt, dan menghambat sel HCC di G0/1 dengan menurunkan ekspresi cyclin D1, sehingga melemahkan migrasi sel HCC dengan menghambat epitel- transisi mesenkim. hGC33-SFB-NP menghambat migrasi, perkembangan siklus, dan proliferasi sel HCC dengan menghambat jalur Ras/Raf/MAPK dan jalur Wnt bersama-sama dengan molekul GPC3. hGC33-SFB-NP menghambat pertumbuhan kanker hati in vivo dan meningkatkan tingkat kelangsungan hidup tikus pembawa tumor. Kami menyimpulkan bahwa hGC33 meningkatkan penargetan SFB-NP ke sel HCC. hGC33-SFB-NP secara sinergis menghambat perkembangan HCC dengan memblokir jalur Wnt dan jalur Ras/Raf/MAPK.
Pengantar
Glypican3 (GPC3) adalah proteoglikan heparan sulfat yang diekspresikan pada permukaan sel melalui mekanisme yang melibatkan jangkar gliserofosfatidilinositol [1]. Meskipun GPC3 diekspresikan dalam berbagai jaringan selama perkembangan, ekspresinya setidaknya sebagian dihambat di sebagian besar jaringan dewasa oleh metilasi DNA di wilayah promotor [2]. Namun, protein GPC3 diekspresikan secara berlebihan pada sekitar 70% pasien karsinoma hepatoseluler (HCC) [3, 4] dan merangsang transduksi sinyal Wnt klasik [5] melalui interaksi dengan ligan Wnt, yang mendorong pengikatan Wnt/frizzled untuk mendorong pertumbuhan HCC [6] . Aktivasi jalur pensinyalan Wnt klasik adalah salah satu peristiwa yang paling sering dikaitkan dengan transformasi ganas HCC [7, 8]. Berdasarkan kemampuan GPC3 untuk meningkatkan pensinyalan Wnt, kami berhipotesis bahwa ekspresi berlebihan GPC3 mendorong pertumbuhan HCC dengan merangsang jalur Wnt klasik.
Antibodi monoklonal terapeutik yang mengenali epitop di bagian terminal-C dari GPC3 (524–563) (hGC33), yang mengenali epitop terminal-C dari GPC3 (524–563), menghambat pertumbuhan tumor pada xenograf subkutan HepG2 dan Huh- 7 pada tikus [9, 10]. hGC33 telah dimanusiakan oleh transplantasi wilayah keputusan komplementer, dan efek antikankernya sama efektifnya dengan hGC33 untuk xenotransplantasi HepG2, dan hGC33 telah digunakan dalam uji klinis [11]. Hasil ini menunjukkan bahwa hGC33 memiliki aktivitas antitumor yang penting, dan pengobatan anti-GPC3 akan secara langsung menghambat proliferasi dan/atau kelangsungan hidup sel HCC dengan memblokir Wnt dan/atau jalur pensinyalan lainnya.
Namun, karena patogenesis HCC yang kompleks, kemanjuran memblokir GPC3 saja terbatas [12]. Oleh karena itu, menjelajahi mekanisme rinci patogenesis HCC dan mengidentifikasi biomarker yang menjanjikan untuk diagnosis dan prognosis HCC dapat membantu memberikan target terapi yang efektif dan meningkatkan prognosis pasien. Antibodi anti-GPC3 telah diusulkan untuk meningkatkan sensitivitas HCC terhadap agen kemoterapi [13]. Aktivitas anti-tumor hGC33 dalam kombinasi dengan obat kemoterapi standar telah dievaluasi baru-baru ini [14]. Sorafenib adalah obat HCC target oral baru yang dapat secara langsung menghambat proliferasi sel tumor dengan memblokir jalur pensinyalan sel yang dimediasi oleh RAF/MEK/ERK untuk mengekang pertumbuhan tumor [15, 16]. Namun, distribusi sorafenib in vivo yang tidak ditargetkan dan sinyal Wnt yang diaktifkan secara abnormal di HCC membatasi efektivitas obat dan meningkatkan efek sampingnya [14,15,16]. Wnt mengikat reseptor dalam keluarga Frizzled untuk mengaktifkan transduksi sinyal intraseluler yang mengatur proliferasi sel, apoptosis, dan migrasi sel, dan menyebabkan resistensi obat pada banyak tumor, seperti HCC [17,18,19].
Dalam model xenotransplantasi HepG2, kombinasi hGC33 dan sorafenib lebih efektif dalam menghambat pertumbuhan tumor daripada sorafenib saja [15], dan penghantaran obat dengan polimer nanocarrier telah menerima banyak perhatian dalam pengobatan kanker. Pembawa nano obat anti kanker dapat mencegah distribusi nonspesifik dan degradasi nonspesifik in vivo, meningkatkan bioavailabilitas obat dan penargetan anti tumor, dan menyederhanakan evaluasi farmakokinetik dan pengobatan [15, 16]. Dalam berbagai nanopartikel berbasis polimer, formulasi berbasis poli (asam co glikolat laktat) (PLGA) dianggap sebagai pembawa obat yang ideal dan aman [17, 18]. Dalam hal ini, poli(etilen glikol)-b -poli(d,l-laktida-ko-glikolida) (PEG-b -PLGA) didasarkan pada polietilen glikol dan kopolimer PLGA, yang aman dan tidak beracun setelah hidrolisis, dan telah disetujui oleh US Food and Drug Administration [19,20,21,22]. Oleh karena itu, injeksi intravena dengan nanocarrier PEG-b Kopolimer -PLGA adalah strategi yang menjanjikan untuk mencapai pengiriman yang ditargetkan dan meningkatkan kemanjuran. Selanjutnya, penerapan antibodi spesifik hGC33 terhadap molekul GPC3 pada membran sel HCC tidak hanya dapat meningkatkan pengiriman penargetan nanodrug in vitro dan in vivo [18, 19], tetapi juga memblokir Wnt dan/atau jalur sinyal lain yang terhubung dengan GPC3, menghambat proliferasi dan/atau kelangsungan hidup sel kanker, dan dapat mencapai aktivitas anti-tumor sinergis.
Dalam penelitian ini, kami mengeksplorasi apakah kopolimer yang dimodifikasi antibodi hGC33 PEG-b -PLGA nanopartikel dapat memfasilitasi pengiriman pengiriman sorafenib (hGC33-SFB-NP) ke HCC in vivo dan in vitro, dan meningkatkan efisiensi pengobatan HCC melalui penargetan aktif HCC untuk mengubah farmakokinetik obat. Menurut ukuran partikel, potensi zeta, morfologi partikel, efisiensi penjeratan obat, kapasitas pemuatan obat, dan pelepasan obat in vitro, NP yang ditargetkan dikarakterisasi secara komprehensif. Kemampuan penargetan in vitro ditandai dengan serapan sel dari sel hepatoma HepG2. Biodistribusi dan efek terapi sinergis dari hGC33-SFB-NP pada HCC dievaluasi dengan membandingkan sorafenib dan SFB-NP. Hasil kami menunjukkan bahwa hGC33-SFB-NP dapat menargetkan GPC3
+
HCC. Dapat menghambat perkembangan siklus sel, proliferasi sel, dan invasi tumor dengan menghambat jalur sinyal Wnt dan Ras/Raf/MAPK dan secara sinergis menghambat perkembangan kanker hati.
Bahan dan Metode
Materi
Antibodi hGC33, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), 4′,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI), 5,5′,6 ,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl-benzimidazolyl carbocyanine iodide (JC-1), dan dimethyl sulfoxide (DMSO) diperoleh dari Sigma—Aldrich, Inc. (St. Louis, MO). 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etil-karbodiimida hidrokloridadan N -hidroksisuksinimida diperoleh dari Qiyun Biotech (Guangzhou, Cina). Kit kuantifikasi protein asam bicinchoninic (BCA), kumarin-6, dan kit deteksi apoptosis Annexin V-FITC/PI dibeli dari Beyotime Biotechnology (Shanghai, China). PEG-b -PLGA-maleimide diblock copolymer (mal-PEG-b -PLGA; 25.000–30.000 Da, PLGA, LA:GA, b/b; PEG, 13-15%) dibeli dari Polyscitech (West Lafayette, IN, USA). Kit antibodi PI3K (9655#), kit antibodi p-Akt (9916#), kit antibodi mTOR (9964#), kit antibodi keluarga Bcl-2 (9942#), kit antibodi apoptosis (9915#), dan anti-kambing sekunder. antibodi kelinci dan anti-tikus dibeli dari Cell Signal Technology (Danvers, MA, USA); cyclin B1 dan cyclin-dependent kinase dibeli dari Abcam Biological Technology (USA). Antibodi terhadap fosfo-Rb, cyclin D1, pos pemeriksaan kinase 1 (CHK1), P53, gen kerentanan kanker payudara terfosforilasi 1 (p-BRCA1), RAD51, sitokrom C, dan matriks metaloproteinase (MMP2 dan MMP9) dibeli dari Abcam (AS) . Semua bahan kimia, reagen, dan pelarut tingkat analitis lainnya diperoleh dari pemasok standar dan digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut.
Sel dan Hewan
Garis sel HCC HepG2 (diperoleh dari koleksi kultur tipe Amerika (Manassas, VA, USA) dikultur dalam media DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) dilengkapi dengan 10% FBS (HyClone, Logan, UT, USA) dan 80 U/ml penisilin dan 80 μg/ml streptomisin dalam atmosfer yang dilembabkan dengan 5% CO2 pada 37 °C. Tikus telanjang BALB/C, dengan berat 20–22 g (5–6 minggu) disediakan oleh Nanjing Junke Biotechnology Co., Ltd. (China). Tikus telanjang BALB/C dipelihara di ruangan SPF. Semua perawatan dan perawatan hewan dilakukan sesuai dengan persyaratan perawatan hewan dari Universitas Sains dan Teknologi Anhui. Semua protokol eksperimental telah ditinjau dan disetujui oleh komite etik eksperimen hewan dari Universitas Sains dan Teknologi Anhui (No. Persetujuan:2019dw013).
Persiapan NP
Untuk mempersiapkan NP, mal-PEG-b -PLGA dan SFB atau kumarin-6 ditimbang dan dilarutkan dalam fase organik (3:2 v/v diklorometana/aseton). Larutan ditambahkan ke dalam larutan polivinil alkohol (PVA) (5% b/v) setetes demi setetes dengan vorteks kontinu. Campuran disonikasi secara intermiten dengan probe sonicator (daya keluaran 550 W, 8 kali) di atas es untuk membuat emulsi minyak-air. Emulsi ditambahkan ke dalam larutan PVA (1% b/v) dengan pengadukan magnetis. NP SFB dan kumarin-6 dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 8000 rpm selama 30 menit dan dicuci tiga kali dalam air Milli-Q.
Untuk menghasilkan hGC33-NP melalui ikatan tioeter yang dibentuk oleh reaksi maleimida dengan residu sulfhidril bebas dalam antibodi hGC33, antibodi hGC33 dicampur dengan NP yang difungsikan maleimida pada rasio molar 5:1 (hGC33:mal-PEG-b -PLGA) dan diinkubasi pada suhu 4 °C selama 16 jam dengan pengadukan terus menerus. hGC33 dikonjugasikan ke NP melalui reaksi gugus sulfhidril pada antibodi hGC33 dengan gugus maleimida dari rantai PEG. Antibodi tak terkonjugasi dihilangkan dengan melewati kolom Sepharose CL-4B. Konjugasi protein yang efisien dikonfirmasi dengan kit BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).
Karakterisasi Nanopartikel (NP)
Morfologi, Ukuran Partikel, Efisiensi Enkapsulasi (EE), dan Stabilitas NP
Morfologi NP dievaluasi dengan mikroskop elektron transmisi (TEM, H-600; Hitachi, Tokyo, Jepang). hGC33-NP bebas obat dan NP bebas obat direkam dengan spektrofotometer FTIR (Thermo Nicolet, Madison, WI, USA) menggunakan kalium bromida. Ukuran partikel rata-rata dan potensi zeta NP dikarakterisasi dengan Malvern Zetasizer ZEN3600 Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK) pada 20 °C. Efisiensi enkapsulasi obat (EE) dan efisiensi konten pemuatan obat (LC) dinilai dengan ultrafiltrasi. Sampel dimasukkan ke dalam perangkat ultrafiltrasi (100 kMWCO; Sartorius, Göettingen, Jerman) dan disentrifugasi pada 8000 rpm selama 25 menit pada 4 °C untuk menghilangkan obat bebas. Volume yang sama dari setiap sampel dilarutkan dalam asetonitril untuk mengkonfirmasi jumlah total obat. Konsentrasi diukur dengan kromatografi cair kinerja tinggi. Panjang gelombang serapan adalah 266 nm. Rumus berikut digunakan untuk menghitung EE obat (%) dari NP:(berat obat yang terperangkap/berat total obat) × 100%. LC (%) dihitung sebagai (berat obat yang dienkapsulasi/berat NP) × 100%. Untuk memahami stabilitas NP pada suhu kamar, perubahan ukuran NP dievaluasi dengan hamburan cahaya dinamis (DLS) pada titik waktu yang telah ditentukan (0,5, 1, 2, 4, 8, 12 jam, 16 jam, 20 jam, dan 24 jam). h) pada 25 °C.
In Vitro Drug Release of Drug and Cellular Uptake Assay
Obat dari NP diselidiki menggunakan tas dialisis dengan berat molekul cutoff 10 kDa. Secara singkat, 1 mL NP dimasukkan ke dalam kantong dialisis (MWCO 8,000–10,000 Da; Spectrum Labs Inc., CA, USA). Kantong dialisis direndam dalam PBS dan diaduk dengan pengaduk magnet pada suhu 25 °C. Profil pelepasan obat NP diukur dalam 100 mL larutan buffer fosfat 0,2 M (PBS; pH =-7,4) selama 7 hari. Konsentrasi obat dalam sampel diukur dengan kromatografi cair kinerja tinggi. Dalam penelitian selanjutnya, hGC33-coumarin 6-NP yang memiliki ukuran partikel yang sama dengan hGC33-SFB-NP digunakan untuk mengevaluasi penargetan hGC33-SFB-NP. HepG2 (GPC3
+
), dan Li-7 (GPC3
−
) diinkubasi dengan hGC33-coumarin 6-NP selama 0,5, 2, atau 4 jam pada 37 °C dalam 5% CO2, masing-masing. Sel-sel yang dikultur bersama dicuci dan difiksasi dengan formaldehida 4% selama 10 menit; inti sel diwarnai dengan 5 g/mL Hoechst 33.342 selama 15 menit untuk menemukan NP intraseluler. Mikroskop confocal untuk menganalisis gambar nanopartikel intraseluler dianalisis dengan mikroskop confocal (Olympus FV1000; Olympus Corporation, Tokyo, Jepang).
Efek Seluler In Vitro
Sitotoksisitas hGC33(Ab) bebas, SFB bebas, hGC33-null-NP, atau hGC33-SFB-NP ditentukan menggunakan uji MTT. HepG2(GPC3
+
) sel dan Li-7 (GPC3
−
) sel-sel dalam fase logaritmik diunggulkan ke dalam pelat 96-sumur dengan kepadatan 4000 sel per sumur diikuti dengan inkubasi selama 48 jam pada 37 °C dalam 5% CO2 . Sel diperlakukan dengan hGC33, SFB gratis, hGC33-null-NP, atau hGC33-SFB-NP selama 48 jam pada 37°C dalam 5% CO2 . Setelah ko-kultivasi untuk waktu tertentu, aktivitas proliferasi anti-sel ditentukan dengan uji MTT seperti yang dijelaskan [20]. Absorbansi masing-masing sumur diukur pada 490 nm dan dihitung setengah dari nilai konsentrasi hambat maksimum (IC 50) dengan SPSS 17.0.
Pengukuran Kemampuan Invasi Sel
Sel dalam fase pertumbuhan logaritmik diunggulkan ke pelat 6-sumur dengan kepadatan 5 × 10
4
sel/sumur, digores dengan suction head, dan diganti dengan media biakan bebas serum. Penyembuhan luka dicatat pada 0 jam, 24 jam, dan 48 jam pada kelompok kontrol dan kelompok eksperimen. Pada saat yang sama, jumlah sel yang sama diinokulasi ke dalam ruang Transwell dan diperlakukan dengan hGC33 bebas, SFB bebas, hGC33-null-NP, atau hGC33-SFB-NP. Lima ratus mikroliter media FBS 10% ditambahkan ke ruang bawah. Setelah inkubasi selama 24 jam, ruang Transwell dikeluarkan, dan sel difiksasi dengan paraformaldehida 4%, dan diwarnai dengan kristal violet 0,1%. Ukuran penyembuhan luka dan jumlah sel migrasi dihitung untuk mengevaluasi kemampuan migrasi.
Penentuan Siklus Sel
Setelah inkubasi semalaman di pelat 6-sumur, sel-sel diperlakukan dengan hGC33 (Ab) gratis, SFB gratis, hGC33-null-NP, atau hGC33-SFB-NP selama 24 jam, kemudian dikumpulkan dan difiksasi dengan etanol. Setelah pewarnaan dengan propidium iodida, flow cytometry dilakukan, dan siklus sel dianalisis dengan modifit 3.0 (Verity Software House, Topsham, ME).
Western Blotting
Untuk mengevaluasi status aktivasi jalur sinyal dan ekspresi molekul target, sel diinkubasi semalaman dalam pelat 6-sumur, dan hGC33 bebas, SFB bebas, hGC33-null-NP, atau hGC33-SFB-NP diterapkan selama 24 jam. . Sel-sel dari setiap kelompok perlakuan dikumpulkan, dan protein diekstraksi dan diukur. Konsentrasi protein diukur dan dikalibrasi dengan BCA protein kit (Biosharp, Hefei, China). Protein sampel dipisahkan dengan dua belas elektroforesis gel alkil sulfat poliakrilamida, dipindahkan ke membran PVDF, dan disegel dengan susu bebas lemak. Antibodi pertama (diencerkan 1:1000) diinkubasi semalaman pada suhu 4 C, dan antibodi kedua (1:2000) diinkubasi selama 1 jam pada suhu kamar. Pita divisualisasikan dengan substrat ECL (Thermo Fisher Scientific Waltham, MA, USA), dan gambar ditampilkan dengan sistem analisis gambar gel, dan -aktin digunakan sebagai kontrol.
Aktivitas Anti-Tumor Di Vivo
Telah ditentukan penghambatan hGC33 bebas, SFB bebas, hGC33-null-NP, SFB-NP, dan hGC33-SFB-NP terhadap pertumbuhan HCC in vivo. Menurut peraturan dan pedoman kesehatan hewan dari komite etik Universitas Teknologi Anhui, semua percobaan dilakukan pada tikus BALB/c dalam kandang di ruang kontrol suhu (23 ± 2 °C) dengan 12 j/12 h cahaya/ siklus gelap. Suspensi 50 l yang mengandung 5 × 10
6
Sel-sel HepG2 hidup disuntikkan secara subkutan ke dalam perut kanan tikus BALB/c betina berusia 5 minggu (20–22 g). Saat volume tumor mencapai sekitar 50 mm
3
, mencit dibagi secara acak menjadi 6 kelompok (10 ekor dalam setiap kelompok). Kontrol salin normal NS (200 mg/kg null NP dalam 200 L PBS), hGC33-null-NP (hGC33-null-NP dalam 200 L PBS, setara dengan hgc33 = 100 μg/kg/waktu), hGC33 gratis (hGC33 dalam 200 L PBS, 100 μg/kg/waktu), SFB gratis (dosis SFB:8 mg/kg/waktu), SFB-NP (dosis SFB:8 mg/kg/waktu), dan hGC33-SFB-NP (setara dengan SFB = 8 mg/kg/waktu, hGC33 = 100 μg/kg/waktu) disuntikkan melalui vena ekor setiap 2 hari selama 10 kali. Berat dan ukuran tumor mencit diukur setiap empat hari. Rumus perhitungan volume tumor adalah volume = 0.5 × L × A
2
, di mana L dan W masing-masing mewakili panjang dan lebar tumor. Empat minggu setelah pemberian, hewan dibius dengan dietil eter, dan ukuran dan berat tumor diukur. Selain itu, tumor, jantung, hati, ginjal, paru-paru, dan limpa diangkat, difiksasi dengan larutan paraformaldehyde 4%, dimasukkan ke dalam parafin, dipotong, dan diwarnai dengan hematoxylin dan eosin untuk mengevaluasi perubahan histologis dengan mikroskop digital.
Analisis Statistik
Data disajikan sebagai mean ± standar deviasi (SD) dan dievaluasi dengan analisis varians dengan SPSS 18.0. Perbandingan statistik berpasangan dilakukan menggunakan uji t Student dua sisi. Perbedaan dianggap signifikan secara statistik untuk P < 0,05.
Hasil
Karakterisasi NP dan Pelepasan Obat In Vitro
Karena diameter dan sifat permukaan NP mempengaruhi serapan sel, pelepasan obat, dan distribusi NP in vivo, kami mengkarakterisasi NP yang disiapkan dengan parameter yang sesuai. Morfologi, ukuran partikel, dan distribusi ukuran partikel polimer SFB-NP, hGC33-null-NP, dan hGC33-SFB-NP dirangkum dalam Gambar 1. Morfologi hGC33-SFB-NP diamati dengan mikroskop elektron transmisi (Gbr. . 1a) menunjukkan inti kaku dengan tepi kabur, yang menunjukkan bahwa hGC33 ada di permukaan NP. Ukuran partikel SFB NP, hGC33-null-NP, dan hGC33-SFB-NP berkisar antara 100 hingga 150 nm dan memiliki distribusi ukuran partikel unimodal yang khas. Diameter rata-rata hGC33-SFB-NP (120.2 ± 10.2 nm) sedikit lebih besar dari hGC33-null-NP, SFB-NP, dan null NP (Gbr. 1a, Tabel 1). Film tipis bulat tidak jelas dengan permukaan tunggal hadir pada permukaan hGC33-SFB-NP dan hGC33-null-NP, yang menunjukkan bahwa antibodi hGC33 hadir pada permukaan NP. Peningkatan ukuran untuk hGC33-SFB-NP dan hGC33-null-NP mengkonfirmasi keberadaan film hGC33. Sintesis hGC33-SFB-NP dikonfirmasi dengan
1
H-NMR (Gbr. 1b) sebelum preparasi NP. Puncak pada 5,2 ppm dan 1,58 ppm ditetapkan pada proton -CH3 asam laktat; puncak pada 4,8 ppm ditetapkan pada -OCH2- dari asam glikolat; dan puncak pada 3,6–3,8 ppm ditetapkan pada proton -CH2CH2O- dari unit pengulangan PEG. Kimia permukaan PEG-b -PLGA dan Ab-PEG-b -PLGA NP juga dipelajari dengan spektroskopi FTIR (Gbr. 2c). Dalam spektrum PEG-b -PLGA polimer, pita kuat sekitar 1750 cm
−1
berasal dari bentangan gugus karbonil (C = O) dalam rantai PLGA. Pita pada 2880 cm
−1
disebabkan oleh peregangan gugus -CH dalam rantai PEG. Pada saat yang sama, puncak muncul pada 2520 cm
−1
yang kami kaitkan dengan puncak peregangan -SH dari antibodi hGC33.
1
Hasil H NMR dan FTIR menunjukkan bahwa antibodi dicangkokkan pada tulang punggung PEG-b -polimer PLGA.
Karakterisasi NP. a karakterisasi TEM NP, bilah skala menunjukkan 100 nM; b yang
1
Spektrum H NMR sintetis hGC33-PLGA-b -PEG dalam CDCl3; c Spektrum FTIR dari hGC33-PEG-b -PLGA dan PEG-b - PLN; d profil pelepasan kumulatif dari SFB-NP dan hGC33-SFB-NP di PBS (pH = 7.4) pada 37 °C; e perubahan ukuran NP yang diinkubasi dalam media DMEM yang mengandung 10% FBS selama 14 hari; f perubahan ukuran NP yang diinkubasi dalam PBS selama 14 d. SFB, sorafenib; TEM, mikroskop elektron transmisi; NP, nanopartikel;
1
H NMR,
1
Spektroskopi resonansi magnetik nuklir-H; FTIR, spektroskopi inframerah transformasi Fourier
Ekspresi GPC3 dan penyerapan hGC33-coumarin6-NP dalam sel Li-7 dan HepG2. Sel-sel, diinokulasi dalam cawan kultur, dicuci dengan PBS dan diinkubasi dengan 100 g/ml hGC33-coumarin6-NP dalam DMEM selama 2, 4, dan 8 jam. Nukleus diwarnai dengan DAPI, dan sel-sel difiksasi dan dideteksi dengan mikroskop pemindaian laser confocal. GPC3 tidak terdeteksi dalam sel Li-7, tetapi sangat diekspresikan dalam sel HepG2 seperti yang dideteksi oleh imunositokimia. Bilah skala menunjukkan 50 μM
Menariknya, nanopartikel hGC33-SFB-NP dan SFB-NP dalam media DMEM yang mengandung 10% FBS (pH = 7.4) memiliki pelepasan obat yang cepat hingga sekitar 4 hari, kemudian pelepasan obat yang relatif lambat dan stabil; pelepasan kumulatif SFB dari hGC33-SFB-NP dan SFB-NP selama 20 hari berturut-turut adalah sekitar 77% dan 65% (Gbr. 1d). Perbedaannya mungkin karena molekul hidrofilik pada permukaan PEG-b -PLGA matriks, yang dapat mempercepat degradasi nanopartikel dengan meningkatkan hidrasi dan dengan demikian mempromosikan hidrolisis. Untuk menentukan stabilitas NP yang disiapkan, NP hGC33-SFB, NP hGC33-null, NP null, dan SFB-NP ditempatkan dalam media DMEM yang mengandung 10% FBS (pH = 7.4) dan dalam PBS (pH = 7.4 ). Ukuran berbagai NP tetap stabil selama lebih dari 2 minggu. SFB dilepaskan dari hGC33-SFB-NP secara berkelanjutan dan stabil selama 14 hari, tetapi ada sedikit perubahan dalam ukuran partikel dalam media DMEM dibandingkan dengan 10% FBS (Gbr. 1e, f). Stabilitas hGC33-SFB-NP akan sesuai untuk SFB yang memiliki peran biologis berkelanjutan.
Potensi zeta yang besar dapat menyebabkan interaksi elektrostatik tolak-menolak yang kuat antara NP dan menjaga stabilitas sistem dispersi NP [23, 24]. Seperti ditunjukkan pada Tabel 1, potensi zeta dari hGC33-SFB-NP, hGC33-null-NP, dan SFB-NP berturut-turut adalah 18.2 ± 2.2 mv, − 18.5 ± 1.8 mv, dan 15.9 ± 2.1 mv, yang mungkin disebabkan oleh muatan negatif yang dihasilkan oleh gugus aldehida, gugus karboksil, dan gugus fosfat dalam glikoprotein antibodi hGC33. NP bermuatan negatif dapat menyebabkan stabilitas suspensi NP yang tinggi. Selain itu, karena permukaan sel bermuatan negatif dalam lingkungan fisiologis normal, NP yang disiapkan menolak sel dengan muatan rendah dan kurang beracun bagi jaringan dan sel. Selain itu, distribusi ukuran null-NP dan SFB-NP (indeks polidispersitas [PDI] 0,18 dan 0,19, masing-masing) sedikit tetapi tidak signifikan lebih kecil dari hGC33-null-NP (PDI = 0.21) dan hGC33-SFB- NP (PDI = 0.23). Dengan demikian, ukuran nanopartikel memiliki keseragaman yang baik. Ukuran partikel, distribusi ukuran partikel, dan potensi zeta NP ditunjukkan pada Tabel 1 sesuai dengan hasil efisiensi enkapsulasi SFB dan konten pemuatan. Antibodi GPC3 tak terkonjugasi hGC33 dihilangkan dengan ultrasentrifugasi, dan efisiensi pengikatan antibodi hGC33 ke NP dievaluasi. Analisis protein BCA menunjukkan bahwa efisiensi pengikatan antibodi hGC33 ke NP adalah 79,5% ± 2,9%.
hGC33-Coumarin 6-NP Secara Efektif Menargetkan GPC3
+Sel HepG2 Garis Sel HCC
Untuk mengetahui apakah antibodi hGC33 nanopartikel masih memiliki kemampuan untuk menargetkan GPC3 secara spesifik, kami menggunakan GPC3
+
HepG2 dan GPC3
−
Sel Li-7 sebagai sel target dan hGC33-coumarin 6-NP sebagai nanopartikel pelacak, dan menginkubasi sel yang berbeda selama 2 jam, 4 jam, dan 8 jam. Sel-sel dicuci dengan PBS 3 kali dan direaksikan dengan DAPI untuk menodai nukleus. Sel-sel diperbaiki dan difoto dengan mikroskop fluoresensi Leica (DMi8, Jerman). Ditemukan bahwa fluoresensi hijau dalam sel HepG2 secara signifikan lebih tinggi daripada di sel Li-7 pada waktu inkubasi yang sama (Gbr. 2), menunjukkan bahwa jumlah hGC33-kumarin 6-NP yang memasuki sel HepG2 secara signifikan lebih tinggi dari itu. dalam sel Li-7. Hasilnya mendokumentasikan bahwa antibodi hGC33 pada hGC33-Coumarin6-NP masih memiliki kemampuan untuk menargetkan GPC3 dan memediasi internalisasi nanopartikel. Ekspresi GPC3 dalam sel HepG2 dan sel Li-7 diperiksa dengan fluoresensi tidak langsung dan pewarnaan sitokimia. Hasilnya menunjukkan bahwa sel HepG2 mengekspresikan GPC3 secara berlebihan, sedangkan sel Li-7 tidak mengekspresikan GPC3 (Gbr. 2).
hGC33-Null-NP Menghambat Proliferasi Sel HepG2
Untuk menentukan apakah NP yang dimodifikasi hGC33 (hGC33-null-NP) dapat menghambat pertumbuhan HCC, kami mengukur penghambatan pertumbuhan sel dari garis sel HCC positif GPC3 HepG2 dan garis sel negatif GPC3 Li-7. Kami menemukan bahwa hGC33-null-NP dan hGC33 menghambat pertumbuhan garis sel HCC positif GPC3 HepG2 setelah 24 jam pengobatan, tetapi hGC33 memiliki efek penghambatan yang lebih signifikan pada sel HepG2 daripada hGC33-null-NP (Gbr. 3a); sebaliknya, hGC33-null-NP dan hGC33 tidak mempengaruhi pertumbuhan garis sel Li-7 negatif GPC3 (Gbr. 3b). Perjalanan waktu representatif dari hGC33-null-NP (setara dengan 0,1 m hgc33) dan hGC33 (0,1 m) pada proliferasi sel HepG2 diilustrasikan pada Gambar. 3c. Karena hGC33 adalah peptida terminal-C yang mengenali GPC3, hGC33 lebih unggul daripada hGC33-null-NP dalam menghambat HepG2. Hasilnya menunjukkan bahwa molekul hGC33 di hGC33-null-NP mungkin memiliki efek penghalang ruang, yang dapat memengaruhi kemampuan pengikatan hGC33 ke epitop.
Proliferasi sel HepG2 dan Li-7 dihambat oleh hGC33, null-NP, dan hGC33-null-NP. a Uji proliferasi sel dilakukan pada sel HepG2 positif GPC3 yang diobati dengan hGC33, null-NP atau hGC33-null-NP; b tes proliferasi sel dilakukan pada sel Li-7 negatif GPC3 yang diobati dengan hGC33, null-NP, dan hGC33-null-NP. Sel-sel diinkubasi dengan 0–2,5 μM hGC33, null-NP, atau hGC33-null-NP selama 1 hari. Proliferasi sel diukur dengan metode MTT dan distandarisasi sebagai sel yang tidak diberi perlakuan. Semua nilai mewakili mean ± SD. Dibandingkan dengan kelompok kontrol (0 μM) tanpa pengobatan antibodi, *P < 0.01; c hasil representatif dari respons HepG2 terhadap hGC33, null-NP, dan hGC33-null-NP dalam pengobatan hGC33 (1.0 μM)
hGC33-Null-NP Menghambat Siklus Sel Sel HepG2
Untuk memahami mekanisme aktivitas molekuler antibodi hGC33 yang dimodifikasi pada nanopartikel hGC33-null-NP, kami mempelajari perkembangan siklus sel HepG2 yang diobati dengan hGC33-null-NP. Dalam garis sel HepG2, hGC33-null-NP dan hGC33 secara signifikan meningkatkan proporsi sel di G1 (Gbr. 4a, b), menunjukkan bahwa hGC33-null-NP dan hGC33 dapat menginduksi penghentian siklus sel pada fase G1. Selain itu, hGC33-null-NP dan hGC33 dapat secara signifikan menurunkan ekspresi cyclinD1 teregulasi dalam sel HepG2 (Gbr. 4c, d).
hGC33-null-NP dan penghentian siklus sel yang diinduksi hGC33 dalam fase G1 dan menghambat ekspresi cyclinD1 dalam sel HepG2. a Diagram siklus sel representatif dari berbagai kelompok yang diobati dengan hGC33-null-NP dan hGC33. b Analisis siklus sel dari berbagai kelompok yang diobati dengan hGC33-null-NP dan hGC33. Sel-sel HCC diinkubasi dengan 0,5 m hGC33 atau hGC33-null-NP (dengan konsentrasi molar hGC33 sebagai referensi). *P < 0,05, fase G1 sel hGC33-null-NP atau hGC33 dibandingkan dengan sel 0 h. c , d Setelah pengobatan hGC33-null-NP atau hGC33, cyclinD1 diturunkan secara signifikan dalam sel HepG2 dibandingkan dengan kelompok kontrol
Aktivasi Ingin di Sel HepG2, Huh-7, dan Li-7
Untuk memahami aktivasi sinyal Wnt/β-Catenin klasik dalam sel HCC, pertama-tama kami mendeteksi ekspresi ligan Wnt dan protein crimp reseptor (frizzled, FZD atau Frz) di berbagai lini sel HCC:HepG2 (GPC3
++
), Huh-7 (GPC
+
), dan Li-7 (GPC3
−
). Hasil penelitian menunjukkan bahwa reseptor Wnt3a dan FZD transduksi jalur -Catenin diekspresikan di semua lini sel, terutama di sel HepG2 dan Huh-7 (Gbr. 5).
Ekspresi Wnt3a, FZD1, dan FZD3 dalam garis sel HCC
hGC33-Null-NP Menghambat Proliferasi Sel Bergantung Transduksi Sinyal Wnt yang Diinduksi oleh Wnt3a
Beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa bagian ekstraseluler GPC3 mungkin merupakan koreseptor Wnt, yang mendorong aktivasi dan transduksi sinyal Wnt/β-Catenin. Oleh karena itu, ketika HepG2 (GPC3
+
), Huh-7 (GPC3
+
), dan Li-7 (GPC3
−
) cells were co-incubated with hGC33 and hGC33-null-NP, the activation of Wnt/β-catenin signal was blocked by hGC33 and hGC33-null-NP, and proliferation of HepG2 and Huh-7, but not Li-7, in Wnt3a-conditioned medium was inhibited. That proliferation of Li-7 cells most likely is due to the absence of GPC3 on the surface of Li-7 cells (Fig. 6). Our results indicate hGC33 and hGC33-null-NP nanoparticles specifically bind to GPC3 molecules on cell membrane. hGC33 and hGC33-null-NP partially neutralize the mitogenic activity of Wnt3a and inhibit the Wnt/β-catenin signaling pathway. However, the inhibition of proliferation by hGC33-null-NP nanoparticles was less than that of hGC33. Perhaps the spatial structure of the nanoparticles interferes with hGC33-null-NP and limits the function of the hGC33 molecule on the nanoparticles so they cannot completely block the interaction between GPC3 and Wnt3a.
GPC3-activated Wnt signal transduction in HCC. Fifty percent Wnt3a DMEM medium was added with anti-wnt3a antibody, hGC33, or hGC33-null-NP. HepG2 (GPC3
++
), Huh-7 (GPC3
+
) and Li-7 (GPC3
−
) cells were co-incubated for 48 h, and cell proliferation was measured by MTT assay. The data were expressed as mean ± SD (*P < 0.01)
hGC33-Null-NP Inhibits Wnt3a-Induced Signal Transduction in HepG2 and Huh-7 Cells
To understand the effect of hGC33-null-NP on Wnt/β-catenin signaling in HCC cells, we extracted the proteins of HepG2 and Huh-7 cells treated with hGC33 or hGC33-null-NP. The results of western blot showed that after hGC33-null-NP treatment, the levels of pYAP and pβ-catenin were increased, but the levels of YAP and β-catenin were decreased. Furthermore, the levels of cyclinD1, CD44, VEGF, and c-MYC in the hGC33-null-NP group were lower than those in the control group, but the level was less than with hGC33 treatment. Similar effects were observed in HepG2 and Huh-7 cells, as shown in Fig. 7.
Inhibition of Wnt3a-induced β-catenin signaling by hGC33-null-NP or hGC33. a Compared with the control group, Wnt/β-catenin signaling pathway in HepG2 and Huh-7 cells treated with hGC33-null-NP or hGC33 was inhibited, and the levels of β-catenin and YAP were decreased, while the increased phosphorylated β-catenin and phosphorylated YAP molecules were unstable, and degraded in cytoplasm. The decreased β-catenin was difficult to maintain in the nucleus and drive the expression of CyclinD1, CD44, VEGF, and c-MYC, which resulted in the decrease of cyclinD1, CD44, VEGF, and c-myc protein levels. b The mechanism pattern of Wnt/β-catenin signaling pathway inhibited by hGC33-null-NP or hGC33
hGC33-SFB-NP or hGC33 Attenuates HCC Cell Migration by Inhibiting Epithelial Mesenchymal Transition (EMT)
HCC is one of the deadliest cancers in the world, and its incidence is steadily increasing. Sorafenib is the only approved standard treatment for patients with advanced HCC, as it has been shown to improve the survival rate of these patients. However, clinical and preclinical observations suggest that sorafenib therapy has limited efficacy due to the rapid development of drug resistance. Therefore, elucidating the mechanism of escape resistance to sorafenib is a major emphasis in HCC research. In recent years, more and more attention has been paid to the role of epithelial mesenchymal transition (EMT) in the progress of HCC and the development of drug resistance. EMT refers to the transformation of epithelial to mesenchymal cells, which endows cells with the ability metastasize and invade, including acquisition of stem cell characteristics, reducing apoptosis and aging, promoting immunosuppression, and participating in the occurrence and development of cancer. The loss of E-cadherin expression is considered a key step in the carcinogenesis and EMT. EMT is a developmental multi-step molecular and cellular reprogramming process that cancer cells use to achieve aggression. This is mainly through down regulating the expression of E-cadherin, keratin, mucin, ZO-1 (tight junction protein); up regulating the expression of vimentin, alpha-smooth muscle actin (α-SMA), FN fibronectin, MMPs (degradation matrix), N-cadherin, snail, slug, twist, Rho, TGF-β, FGF, type I collagen, and type II collagen to achieve the invasion, metastasis, and anti-apoptosis of EMT characteristic tumor. The changes of these protein expressions mainly involve the activation of Wnt/β-catenin and Ras/Raf/MAPK signaling pathways.
Our experiments have shown that hGC33 antibody on the surface of NP vector can inhibit Wnt3a-induced β-catenin signal transduction, and then down regulate the expression of β—catenin, CD44, vascular endothelial growth factor (VEGF), cyclin D1, and c-MYC. Furthermore, hGC33-SFB-NP inhibits the activation of Ras/Raf/MAPK signal pathway and inhibits proliferation and apoptosis of HCC cells. hGC33 and SFB have a synergistic effect, inhibiting EMT and decreasing the migration of HCC cells (Fig. 8).
Effect of hGC33-SFB-NP on EMT inhibition. a Compared with the control group, the hGC33-SFB-NP treatment group had less cell migration. Photographs were taken under an optical microscope (magnification, × 200). The error value represents the standard deviation of three independent experiments. *Compared with the control group, p < 0.01. b Compared with the control group, the EMT-related proteins snail, vimentin, and MMP-2 in HCCs treated with hGC33-SFB-NP decreased, whereas E-cadherin increased. c Molecular mechanism of EMT. EMT, epithelial–mesenchymal transition; MMP-2, matrix metalloproteinase-2; SFB, sorafenib; NP, nanoparticle
hGC33-SFB-NP Inhibits the Growth of Hepatocellular Carcinoma In Vivo and Improves the Survival Rate of Tumor-Bearing Mice
To evaluate the anti-tumor activity of hGC33-SFB-NP in vivo, HepG2 and Huh-7 cells were inoculated subcutaneously into the right abdomen and dorsal side of female BALB/c nude mice, respectively. When the tumor xenograft growth reached about 30 mm
3
, the mice were randomly divided into groups to further evaluate the inhibition of each group (hGC33-SFB-NP, hGC33-null-NP, SFB-NP, free hGC33, free SFB, and control group) HCC effect (n = 5 per group). It can be seen from Fig. 9a, b that hGC33-SFB-NP significantly slowed tumor growth in mice compared with the PBS control and other treatments. Compared with the PBS control, hGC33-null-NP, SFB-NP, free hGC33, and free SFB also had some inhibition of HCC, which is because free hGC33 and free SFB directly inhibit Wnt signal and Ras/Raf/MAPK, respectively. Such pathways can inhibit the proliferation of HCC cells to a certain extent. Although the nanoparticle-modified hGC33 (hGC33-null-NP) is connected to the nanosurface through chemical bonds, it did not affect hGC33′s targeting of GPC3 molecules and inhibition of Wnt activity. Nanoparticle-loaded SFB (SFB-NP), after being endocytosed by cells, was degraded to release SFB from the copolymer to inhibit the growth of HCC. In all, the inhibitory effect of hGC33-SFB-NP on HepG2 cell grafts was, as expected, more than on Huh-7 cell grafts, probably because HepG2 expresses GPC3 molecules.
The effect of hGC33-SFB-NP on xenotransplantation of HCC in nude mice and the changes of mice weight. Liver cancer cells were inoculated subcutaneously on the back of each nude mouse (n = 10). After 10 days, the tumor bearing mice were treated with PBS (control), free hGC33, free SFB, hGC33-null-NP, SFB-NP, and hGC33-SFB-NP. Tumor size (a , b ) and body weight (c , d ) of mice were monitored at designated time points
The body weight of nude mice in each treatment group also was measured, as shown in Fig. 9c, d. The body weight of the control group decreased gradually. The weight of mice in free hGC33, free SFB, SFB-NP, and hGC33-null-NP treatment groups also decreased progressively and not significantly less than in the control group. However, the weight of nude mice bearing HepG2 and Huh-7 treated with hGC33-SFB-NP only slightly decreased, and the weight remained relatively stable during the treatment cycle. These results support that the novel hGC33-SFB-NP nanodrug has no significant toxicity in nude mice, and the SFB loaded on the nanocarrier and the surface modified hGC33 can produce additive or even synergistic anti-tumor effect.
Discussion
To examine the suitability of hGC33-SFB-NP for targeted HCC therapy, we tested the model conjugates for their ability to bind to human glypican-3 on HCC cells in vitro; to inhibit glypican-3-positive HCC cell proliferation, migration, and Wnt/β-catenin signal transduction; and inhibit HCC that overexpress glypican-3 in vivo.
To covalently bind GPC3-specific antibody hGC33 with mal-PEG-b -PLGA nanoparticles, we cross-linked the free sulfhydryl group in the Fc segment of hGC33 with maleimide functionalized PEG-b -PLGA (mal-PEG-b -PLGA) by forming stable thioether bonds. Conjugation is a prerequisite for targeting of GPC3-positive HCC. A series of experiments, including the changes of nanoparticle diameter and zeta potential detected by lens and the intracellular uptake of hGC33-SFB-NP, verified the targeting of hGC33-SFB-NP to HepG2 (GPC3
+
) sel. These results indicated that the binding activity of antibody hGC33 was not altered by the conjugation.
We directly detected the phagocytic effect of GPC3
+
HepG2 and GPC3
−
Li-7 cells on PEG-b -PLGA NP surface-modified hGC33 by confocal microscopy. After HepG2 and Li-7 cells were co-cultured with hGC33-coumarin 6-NP, the green signal intensity in HepG2 cells was significantly higher than in Li-7 cells, indicating that there were more nanoparticles in the HepG2 cells. This finding is consistent with the hGC33 antibody modified on the surface of PEG-b -PLGA NP specifically binding to glypican-3 on the surface of HCC cells and being internalized. The efficiency of hGC33-modified NP internalization depends on the expression level of GPC3 antigen on the cell surface.
We used the standard MTT assay to measure the efficiency of inhibiting the proliferation of hepatoma cells. Both hGC33-null-NP and hGC33 inhibited the growth of the GPC3-positive HCC cell line HepG2, but hGC33-null-NP and hGC33 did not affect the proliferation of GPC3-negative Li-7 cells (Fig. 3b). At the animal level, hGC33-null-NP or hGC33 alone inhibited the growth of Huh-7 and HepG2 xenografts to a certain extent, while hGC33-SFB-NP caused growth arrest of Huh-7 and HepG2 hepatoma xenografts in mice. The finding that hGC33-null-NP significantly inhibited GPC3-positive hepatoma cells showed that the inhibitory effect of PEG-b -PLGA NP surface-modified hGC33 on HCC cell proliferation depends on the expression of GPC3 antigen on the cell surface.
GPC3 regulates many pathways in HCC pathogenesis, including Wnt and YAP signaling [25,26,27]. GPC3 interacts with Wnt ligand and may be a coreceptor for Wnt and facilitate Wnt/Frizzled binding for HCC growth [28, 29]. We further examined the effect of nanodrug surface-modified hGC33 on Wnt signaling pathway in hepatoma cells. Like free hGC33, nanodrug surface-modified hGC33 inhibited the proliferation of hepatoma cells not only by blocking Wnt-induced signal transduction in HepG2 and Huh-7 cells of expressing GPC3, but also by inhibiting Wnt3a-induced β-catenin and YAP signal transduction. Previous studies have shown that YAP expression is regulated by β-catenin at the transcriptional level of HCC [30, 31]. In this study, free hGC33 and nanodrug surface-modified hGC33 inhibited Wnt3a-induced YAP activity, indicating that Yap/TAZ released from β-catenin complex can also initiate classic Wnt signaling transduction [32, 2]. These results indicate that typical Wnt and YAP cross talk through a variety of mechanisms. Compared with hGC33-null-NP and hGC33, hGC33-SFB-NP had stronger anti-proliferation and anti-migration ability in vitro and in vivo. Thus, hGC33 not only determines the specificity of HCC cells, but also increases the inhibitory effect of SFB on the proliferation and migration of HCC cells by blocking the key signals related to tumor growth, such as Wnt/β-catenin and Wnt/YAP signaling pathway.
Conclusion
Antibody hGC33 to glypican-3, a membrane protein that is overexpressed on hepatocellular carcinoma cells, increased binding of sorafenib-loaded polyethylene glycol-b-PLGA polymer nanoparticles (hGC33-SFB-NP) to glypican-3 on the cancer cells. Administration of the antibody-modified nanoparticles synergistically inhibited Wnt-induced signal transduction and Ras/Raf/MAPK signaling pathway; hepatocellular carcinoma cells were arrested in G0/1 phase by down-regulation of cyclin D1 expression, thus attenuating cancer cell migration by inhibiting epithelial–mesenchymal transition. hGC33-SFB-NP inhibited the growth of liver cancer in vivo and improved the survival rate of tumor-bearing mice.
