Pengiriman Tetrahedron DNA Meningkatkan Apoptosis Sel Kanker Usus Besar HT-29 yang Diinduksi Doksorubisin

Metode

Bupati dan Perlengkapan

Rantai oligonukleotida DNA dibeli dari TAKARA di Dalian, Cina. Medium Eagle's (DMEM) dan serum janin sapi yang dimodifikasi Dulbecco dibeli dari Gibco di NY, AS. Penisilin dan streptomisin dibeli dari bioteknologi Beyotime di Shanghai, Cina. Asam folat, doksorubisin, 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2-H -tetrazolium bromide (MTT), dan agarosa dibeli dari Sigma-Aldrich di MO, USA. Semua antibodi dibeli dari Perusahaan Abcam di Shanghai, Cina. Reagen lainnya dibeli dari Sinopharm Chemical Regent Co., Ltd., di Shanghai, Cina.

Spektrofotometer UV-Vis (Thermo Evolution 201) dan inkubator suhu konstan dibeli dari Thermo Fisher di AS; mesin sentrifugal (GT10-1) dibeli dari Beijing Era Beili Centrifuge Co., Ltd.; spektrofotometer fluoresensi (UV-1800) dibeli dari Shimadzu Corporation. Mikroskop pemindaian laser confocal (Visitech) dibeli dari perusahaan Leica; instrumen reaksi berantai polimerase (PCR, T100), elektroforesis protein, dan peralatan elektroforesis asam nukleat dibeli dari Perusahaan Bio-Rad; penganalisis ukuran partikel cahaya dinamis dibeli dari Beckman Company; pelat kultur sel dengan 96-sumur atau 24-sumur dibeli dari Dow Corning Corporation. Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC, Agilent 1200) dengan kolom C18 dibeli dari Agilent Technologies.

Garis sel kanker usus besar manusia HT-29 dipertahankan dalam DMEM yang dilengkapi dengan 10% serum janin sapi, 100 U/mL penisilin, dan 100 μg/mL streptomisin dalam atmosfer yang dilembabkan yang mengandung 95% udara dan 5% karbon dioksida pada 37 °C .

Sintesis dan Pemurnian DNA Tetrahedron

Dalam penyelidikan ini, sintesis mengikuti prosedur skematis pada Gambar. 1, dan urutan DNA untai tunggal (ssDNA) dari DNA tetrahedron disediakan pada Gambar. 1 juga. Secara rinci, setiap ssDNA dilarutkan dalam 0,5× TE buffer, dan nilai optical density (OD) DNA yang sesuai ditentukan dengan spektrofotometer UV pada 260 nm. Buffer TE tambahan ditambahkan untuk membuat empat rantai pada konsentrasi yang sama. Rasio pencampuran empat ssDNA adalah 1:1:1:1 pada 1 μM dalam 100 μL. Reaksi dilakukan dalam mesin polymerase chain reaction (PCR) dengan kondisi siklus:95 °C, 10 menit, didinginkan secara alami hingga 4 °C. Semua DNA untai tunggal dimurnikan dengan HPLC dengan 260 nm sebagai puncak serapan karakteristik. Dalam spektrum HPLC, waktu puncak DNA tetra lebih cepat daripada untai tunggal, dan produk dikumpulkan pada titik waktu yang sesuai.

Diagram skematik asam folat-DNA tetra-Dox, DNA tetra-Dox, dan asam folat-DNA tetra. Urutan DNA untai tunggal dari DNA tetrahedron disediakan. Proses penargetan sel tumor, penetrasi melalui membran sel, dan penyisipan DNA digambarkan

Sintesis dan Karakterisasi Asam Folat-DNA tetra-Dox

Gugus hidrogen bebas Dox dan asam folat dimodifikasi dengan gugus azida dan kemudian digabungkan dengan 3′-OH ssDNA melalui reaksi kimia klik [21]. Saat menambahkan jumlah berbeda dari gugus fungsi yang ditandai ssDNA, rasio gugus fungsi dapat dikontrol secara stoikiometri melalui hibridisasi spesifik rantai samping. Untuk sintesis asam folat-DNA tetra, rasio molar asam folat dan DNA tetrahedron ditetapkan sebagai 1:1. Untuk sintesis DNA tetra-Dox, rasio molar Dox dan DNA tetrahedron ditetapkan sebagai 4:1. Untuk sintesis asam folat-DNA tetra-Dox, rasio molar asam folat, DNA tetrahedron, dan Dox masing-masing ditetapkan sebagai 1:1:3. Semua sintesis dilakukan pada tingkat mikromolar pada suhu 37 °C dan kemudian disimpan pada suhu 4 °C [22].

Pada penelitian ini, rangkaian kompleks DNA tetra dikarakterisasi dengan elektroforesis gel poliakrilamida (PAGE) dengan gel separasi 8% (39% Acr-Bis) untuk memeriksa kemurnian dan ukuran molekul relatif. Sampel terdiri dari struktur DNA tetra yang berbeda dan buffer pemuatan 6x dengan rasio pencampuran 2:1. Sampel diwarnai dan dianalisis setelah elektroforesis gel selama 90 menit pada 110 V. Untuk mengetahui perbedaan ukuran partikel, sampel DNA tetra juga dipindai dengan instrumen hamburan cahaya dinamis (DLS) dengan cahaya dinamis.

DNA tetra-Facilitated Cellular Uptake

Untuk struktur kopling berbeda yang dirancang dalam penelitian ini, tingkat serapan oleh sel HT-29 dibandingkan untuk mengetahui efisiensi penghantaran obat. Efisiensi serapan seluler dievaluasi dan diukur menggunakan spektrum fluoresensi karakteristik Dox, yaitu, cahaya eksitasi pada 470 nm dan cahaya emisi pada 590 nm. Sel HT-29 pada 2 × 10 ⁵ /mL diunggulkan di piring 24-sumur dan dikultur selama 24 jam. Sel diinkubasi dengan berbagai struktur DNA tetra pada 10 μM selama 24 jam. Media kemudian dibuang, dan sel dibilas dengan PBS tiga kali. Untuk fiksasi sel, paraformaldehida 4% segera ditambahkan pada suhu kamar selama 30 menit co-inkubasi, dan sel dibilas dengan PBS tiga kali lagi. Terakhir, pelat 24-sumur diamati dengan mikroskop laser confocal untuk membandingkan efisiensi serapan seluler berdasarkan intensitas cahaya emisi cahaya.

Sitotoksisitas dan Efisiensi Antikanker

Sitotoksisitas dan efisiensi antikanker dievaluasi menggunakan uji MTT, di mana reaksi redoks terjadi antara MTT di DMSO dan suksinat dehidrogenase intraseluler. Sel HT-29 diunggulkan dalam pelat kultur 96 sumur dan dikultur selama 24 jam.

Untuk sitotoksisitas DNA tetra sebagai pembawa obat, medium yang mengandung struktur DNA tetra pada konsentrasi 0–100 μM ditambahkan untuk inkubasi 24- atau 48-jam. Kemudian, 100 μL larutan MTT (5 mg/mL) ditambahkan ke setiap sumur, dan campuran diinkubasi pada suhu 37 °C selama 4 jam. Cairan kemudian dihilangkan, dan sel-sel dilisiskan dan dilarutkan dengan 200 L DMSO. Absorbansi supernatan diukur pada 570 nm dengan Microreader. Sampel HT-29 yang tidak diobati dianggap sebagai kelompok kontrol.

Untuk DNA tetrahedron yang digabungkan dengan asam folat atau Dox, di satu sisi, penelitian difokuskan pada stabilitas, keamanan hayati, dan efisiensi penghambatan; Di sisi lain, apakah Dox dari DNA tetra-Dox memiliki sifat antitumor yang sebanding seperti sebelumnya atau tidak juga dieksplorasi. Oleh karena itu, sitotoksisitas dan efisiensi antitumor kompleks DNA tetra dievaluasi. Kompleks masing-masing pada 100 M diinkubasi dengan sel HT-29. Sampel sel dikumpulkan setiap 6 jam dan kemudian dideteksi dengan uji MTT untuk mengevaluasi pengaruh masa inkubasi. Perhatian khusus diberikan untuk perbedaan efisiensi antikanker yang dihasilkan dari variasi struktur. Selanjutnya, efek konsentrasi pada penghambatan HT-29 setelah diobati dengan asam folat-DNA tetra-Dox dievaluasi pada 0–200 μM melalui uji MTT.

Western Blot dan Flow Sitometri

Untuk mengkarakterisasi apoptosis seluler yang diinduksi oleh Dox yang difasilitasi oleh pengiriman DNA tetra, sampel protein dari sel yang dirawat dipanaskan dan dipecah menggunakan cairan pirolisis, dianalisis dengan 12% SDS-PAGE pada kondisi 100 V pada arus konstan untuk memisahkan sampel, dan kemudian dihapus. ke membran PVDF berdiameter 0,22 m selama 1 jam. Sampel diblokir dengan susu skim selama 1 jam. Setelah dicuci tiga kali dengan PBST, sampel diinkubasi semalaman dengan anticaspase-3 kelinci. Kemudian, sampel diperiksa dengan antibodi sekunder IgG kambing-anti-kelinci selama 1 jam dan kemudian dicuci dengan PBST dan dicitrakan melalui sistem pencitraan protein Bio-Rad. Selanjutnya, GAPDH dipilih sebagai protein referensi internal karena ekspresinya yang stabil dalam sel.

Flow cytometry selanjutnya digunakan untuk mengukur tingkat apoptosis pada konsentrasi dan titik waktu yang dipilih melalui uji MTT. Sel HT-29 diinkubasi dengan inhibitor untuk jangka waktu tertentu dan kemudian diukur melalui sitometri aliran kuantitatif menggunakan metode pewarnaan ganda Annexin V-PI.

Penghitungan Proliferasi Sel

Metode penghitungan sel digunakan untuk mengukur proliferasi sel dengan waktu. Secara rinci, setelah diperlakukan dengan asam folat-DNA tetra-Dox untuk jangka waktu tertentu pada 100 M, sel dicerna oleh 0,25% tripsin selama 30 detik, dan kemudian, volume yang sama dari media lengkap ditambahkan untuk menghentikan reaksi. Supernatan dibuang setelah sentrifugasi pada 1000 rpm selama 3 menit, dan sel disuspensi ulang dengan medium lengkap. Jumlah sel di setiap titik deteksi dicatat di bawah mikroskop optik menggunakan pelat hitung sel, sehingga dapat menggambar kurva proliferasi seluler.

Analisis Statistik

Dalam penelitian ini, signifikansi perbedaan ditentukan dengan menggunakan t . Student uji (dua sisi; dua sampel varians yang sama). P < 0,05 berarti perbedaan yang signifikan antara kelompok yang berbeda.

Hasil

Persiapan Asam Folat-DNA tetra-Dox

Dalam proses sintesis tertentu, Dox dicampur dengan DNA tetrahedron dalam proporsi yang berbeda untuk menyelesaikan pemuatan dan perakitan Dox (w _m = 543.52) dan asam folat (dengan _m = 441.4). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2a, karena Dox dan asam folat adalah monomer dengan berat molekul yang relatif rendah dan serupa, DNA dalam tetrahedron dan konjugat dengan satu molekul fungsional memiliki berat molekul yang kira-kira setara. Namun, perakitan Dox atau asam folat dengan keempat simpul DNA dari tetrahedron membuat ukuran molekul DNA tetra meningkat secara nyata. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2b, sebagian besar ukuran monomer DNA tetrahedral kurang dari 15 nm. Dengan bertambahnya gugus kopling, struktur simetris DNA tetra hancur dan ukuran partikel medium senyawa meningkat secara signifikan. Secara khusus, ekspansi ukuran asam folat-DNA tetra-Dox memperpanjang diameter medium hingga 20 nm.

Karakterisasi DNA tetra dengan konstituen yang berbeda. a Kiri ke kanan:DNA tangga, DNA tetra, asam folat-DNA tetra, asam folat-DNA tetra-Dox, dan DNA tetra-Dox dicitrakan dalam 8% SDS-PAGE. b Distribusi ukuran DNA tetra, asam folat-DNA tetra, asam folat-DNA tetra-Dox, dan DNA tetra-Dox terdeteksi melalui hamburan cahaya dinamis

Efisiensi Pengiriman Obat

Setelah diinkubasi dengan struktur tetra DNA yang berbeda selama 24 jam, efisiensi intraseluler Dox dievaluasi dengan pencitraan fluoresensi, di mana fluoresensi merah intraseluler adalah karakteristik fluoresensi Dox; karenanya, sel yang diinkubasi dengan DNA tetra tidak menunjukkan sinyal fluoresen seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3a, dan sinyal merah dari sel yang diinkubasi dengan asam folat-DNA tetra-Dox dan kompleks DNA tetra-Dox jelas lebih tinggi daripada dengan Dox, yang berarti efisiensi penyerapan seluler Dox yang ditingkatkan secara signifikan yang dihasilkan dari DNA tetra memfasilitasi penetrasi melalui membran, serta stabilitas intraseluler konjugat antara Dox dan DNA tetra.

Efisiensi penyerapan sel HT-29 setelah diinkubasi dengan kompleks yang berbeda selama 24 jam. a Deteksi mikroskop confocal (merah adalah cahaya eksitasi fluoresensi Dox, bilah skala = 10 μm). b Intensitas fluoresensi seluler. **P < 0,05 bila dibandingkan dengan kelompok DNA tetra

Analisis kuantitatif lebih lanjut dari intensitas fluoresensi (Gbr. 3b) membuktikan temuan visual, dan tidak ada perbedaan yang signifikan antara asam folat-DNA tetra-Dox dan kompleks DNA tetra-Dox (P < 0,05). Metodologi co-inkubasi obat dan sel menghambat pameran lengkap dari kemampuan menargetkan asam folat. Konsentrasi relatif tinggi mengkonfirmasi pengenalan spesifik reseptor folat, yang secara teoritis lebih jelas dalam aplikasi in vivo dengan sistem sirkulasi yang kompleks. Singkatnya, pengiriman DNA tetra menjamin efisiensi antikanker dari Dox.

Sitotoksisitas dan Efisiensi Antikanker

Pertama, viabilitas sel HT-29 yang dikoinkubasi dengan konsentrasi DNA tetra yang berbeda diperiksa menggunakan uji MTT. Tidak ada sitotoksisitas yang jelas dari perlakuan DNA tetra dalam sel HT-29 pada 0–100 μM selama 24 dan 48 jam (Gbr. 4a). Oleh karena itu, tetrahedron DNA berukuran nano menyediakan platform pembawa obat yang aman secara hayati.

Sitotoksisitas dan efisiensi antitumor kompleks Dox dan DNA tetra untuk sel HT-29. a Viabilitas sel HT-29 yang diinkubasi dengan DNA tetra pada konsentrasi yang berbeda selama 24 atau 48 jam. b Efisiensi antitumor kompleks Dox pada 100 μM. c Viabilitas sel HT-29 yang diinkubasi dengan asam folat-DNA tetra-Dox pada konsentrasi yang berbeda selama 24 atau 48 jam

Kedua, sebagai akibat dari perbedaan efisiensi pengiriman Dox, asam folat-DNA tetra-Dox dan DNA tetra-Dox menunjukkan efisiensi penghambatan yang lebih signifikan dalam 48 jam (Gbr. 4b). Karena kurangnya komponen antikanker yang efektif, asam tetra-folat DNA menyebabkan penurunan yang dapat diabaikan (< 10%) dari viabilitas selama 48 jam co-inkubasi. Karena Dox tidak dapat menembus membran secara objektif, penurunan viabilitas seluler yang diinduksi Dox lebih sedikit dibandingkan kelompok lain. Khususnya, asam folat-DNA tetra-Dox menunjukkan penurunan yang lebih awal dan signifikan pada 6 jam pasca inkubasi, membuktikan bahwa penargetan asam folat membantu obat untuk ditempatkan di membran, dan membuat efek Dox lebih tepat waktu. Sebaliknya, DNA tetra-Dox mulai terlihat jelas pada 12 jam pasca inkubasi, yang menunjukkan pentingnya kelompok penargetan.

Selanjutnya, sel HT-29 diperlakukan dengan asam folat-DNA tetra-Dox pada 0–200 M untuk mendeteksi konsentrasi efektif (Gbr. 4c). Viabilitas seluler sel HT-29 menurun dengan cepat dengan meningkatnya konsentrasi (0-100 M) kompleks, tetapi tidak ada perbedaan yang signifikan antara konsentrasi 100 dan 200 M, yang menunjukkan cara tetra-DNA asam folat yang bergantung pada dosis. Dox, di mana 100 μM dapat dianggap sebagai konsentrasi efektif untuk efek antitumor. Selain itu, viabilitas seluler berubah secara signifikan dari 24 menjadi 48 jam untuk kelompok 10, 20, dan 50 M, yang menunjukkan bahwa periode waktu inkubasi juga merupakan faktor yang memengaruhi efisiensi antikanker berbasis asam folat-DNA tetra-Dox.

Apoptosis Diinduksi oleh Asam Folat-DNA tetra-Dox

Dengan demikian, berdasarkan uji western blot (Gbr. 5a), ada peningkatan yang signifikan dari ekspresi caspase-3 yang diinduksi oleh asam folat-DNA tetra-Dox dan DNA tetra-Dox, membuktikan bahwa apoptosis adalah cara utama Dox- kematian sel yang diinduksi.

Ekspresi seluler caspase-3 terkait apoptosis setelah dirawat dengan kompleks yang berbeda (a ) dan flow cytometry sel HT-29 setelah diinkubasi dengan DNA tetra, Dox, DNA tetra-Dox, dan asam folat-DNA tetra-Dox (b –e )

Flow cytometry (Gbr. 5b-e) selanjutnya membuktikan bahwa inkubasi 6 jam dengan asam folat-DNA tetra-Dox pada 100 μM menginduksi apoptosis 68,7%. Sedangkan tingkat apoptosis yang diinduksi oleh Dox dan DNA tetra-Dox hanya 32,8 dan 60,5% dengan kondisi inkubasi yang sama.

Penghambatan Proliferasi Sel

Berdasarkan uji MTT, 100 μM adalah konsentrasi efektif untuk induksi apoptosis dan dipilih dalam eksperimen proliferasi seluler. Seperti yang ditunjukkan oleh kurva proliferasi seluler (Gbr. 6), karena proses penyerapan seluler yang memakan waktu, penghambatan proliferasi sel tidak sepenuhnya ditunjukkan selama tahap awal inkubasi bersama. Efek penghambatan yang signifikan ditunjukkan setelah diinkubasi dengan asam folat-DNA tetra-Dox selama lebih dari 6 jam, membuktikan adanya endositosis DNA tetra-enhanced. Sementara itu, 6 jam adalah periode waktu komparatif dengan periode waktu efektif yang dideteksi pada Gambar 4b.

Penghambatan proliferasi sel yang diinduksi oleh inkubasi dengan asam folat-DNA tetra-Dox pada 100 μM untuk periode waktu yang berbeda

Diskusi

Sebagai cara umum modifikasi DNA, reaksi kimia klik memiliki keuntungan dari efisiensi reaksi yang tinggi, kontrol yang baik, dan operasi yang lancar [21]. Elektroforetogram ditampilkan dengan merek tunggal (Gbr. 2a), menunjukkan bahwa produk dengan kemurnian tinggi diperoleh dengan kopling kovalen melalui reaksi kimia klik. Sifat fluoresen Dox membuatnya dapat dilacak secara in vitro dan in vivo; Sementara itu, fluoresensi di dalam sel tumor secara tidak langsung membuktikan stabilitas asam folat-DNA tetra-Dox selama proses penetrasi melalui membran sel. Oleh karena itu, asam folat-DNA tetra-Dox mampu dan stabil untuk aplikasi biomedis.

DNA tetra memiliki kemampuan untuk mengantarkan obat ke dalam sel. Semua sekuens DNA yang digunakan dalam penelitian ini tidak dikodekan untuk informasi genetik apa pun. Dengan demikian, tidak ada efek samping pada ekspresi gen dan metabolisme sel yang dilaporkan dalam semua pemeriksaan. Sementara itu, karena ekspresi reseptor folat yang tinggi pada permukaan sel tumor, asam folat dipilih sebagai molekul penargetan spesifik dari sistem penghantaran obat untuk meningkatkan efisiensi penyerapan kompleks DNA tetra. Namun, dengan keadaan DNA tetra pada konsentrasi yang relatif tinggi, keuntungan dari penargetan reseptor folat tidak sepenuhnya tercermin secara in vitro. Oleh karena itu, untuk aplikasi in vivo, asam folat berpotensi meningkatkan efisiensi penargetan dalam sistem sirkulasi yang kompleks.

Saat ini, obat antikanker umumnya membawa efek samping yang tidak terduga, sehingga penelitian tentang peningkatan kemampuan penargetan sel tumor dan efisiensi pengiriman telah menjadi topik hangat [23,24,25]. Studi sebelumnya menunjukkan bahwa kapasitas DNA tetrahedron untuk membawa obat didasarkan pada kompatibilitas yang baik. DNA tetrahedron adalah wadah buatan dari modifikasi yang menguntungkan dan biokompatibilitas yang tepat. Dalam penelitian ini, keberhasilan penggabungan Dox dan asam folat dengan DNA tetrahedron mencapai efek penghambatan yang memuaskan dan menyebabkan apoptosis sel HT-29 yang jelas. Karena itu DNA tetra dapat dimodifikasi dan digabungkan dengan obat-obatan dan molekul penargetan, pengayaan konsentrasi obat lokal dalam sel tumor direalisasikan. Hasil di atas membuktikan pengenalan yang baik untuk sel tumor dan efek penghambatan yang ditingkatkan terkait melalui pengiriman DNA tetra, dan sistem pengiriman obat berukuran nano ini dapat digunakan lebih luas.

Kesimpulan

Sebagai strategi pengiriman obat yang baru dikembangkan, struktur DNA berukuran nano berbiaya rendah, stabilitas tinggi, dan kelayakan untuk disintesis; Sementara itu, bio-aman karena kurangnya aktivitas kekebalan eksogen. Strategi penggabungan DNA tetrahedron memfasilitasi pengiriman Dox yang ditargetkan, meningkatkan efisiensi antikanker Dox pada sel kanker usus besar, dan memberikan inspirasi dan ide yang menjanjikan untuk desain obat.

Pengaruh Rasio Li/Nb pada Persiapan dan Kinerja Fotokatalitik Senyawa Li-Nb-O Studi In Vitro Pengaruh Nanopartikel Au pada Garis Sel HT29 dan SPEV