Aktivitas Antibakteri Larutan Kitosan/Nanopartikel Perak yang Disiapkan In Situ Terhadap Strain Staphylococcus aureus yang Tahan Methicillin

Metode

Materi

Perak nitrat, asam L-askorbat, dan setrimonium bromida (C₁₆ H₃₃ )N(CH₃ )₃ Br (CTAB) dibeli dari Sigma-Aldrich dan digunakan saat diterima. Jahe (Zingiber officinale , Zingiber ace ) rimpang dibeli di supermarket lokal (Poznan, Polandia). Kitosan 200 kDa, derajat deasetilasi 82% dibeli dari CJSC “Bioprogress” (Rusia, Moskow) dan digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut. Air ultra murni (resistivitas> 17 MΩcm ^− 1 ) dari sistem air GZY-P10 digunakan selama percobaan. Semua media dan disk dengan antibiotik dibeli dari Hi Media (India).

Persiapan In Situ Larutan Kitosan/Ag NP

Untuk menyiapkan larutan kitosan/Ag in situ, NP Ag disintesis dan dimodifikasi terlebih dahulu.

Sintesis Ag NP

NP Ag disintesis melalui metode reduksi kimia menggunakan pendekatan kimia hijau. Mengikuti pendekatan ini, kami menggunakan jahe (Zingiber officinale ) ekstrak sebagai surfaktan dan asam askorbat (vitamin C) sebagai reduktor. Untuk membuat ekstrak rimpang jahe, 250 g rimpang dicuci bersih dengan air suling kemudian dipotong kecil-kecil. Rimpang jahe cincang disimpan dalam larutan air-etanol (250 ml, rasio 1:1) selama 5 hari (pada suhu kamar, di tempat gelap). Kemudian, supernatan disaring secara vakum (melalui kertas saring Whatman) dan disimpan (pada 4°C). Untuk mensintesis NP Ag, perak nitrat (840 mg) dilarutkan dalam air (20 ml) dan ekstrak rimpang jahe (20 ml) ditambahkan. Kemudian, campuran larutan asam L-askorbat (10%, 10 ml) dan ekstrak jahe (20 ml) ditambahkan ke dalam larutan perak nitrat di bawah kemudi magnet. Campuran reaksi menjadi gelap. Kemudian dipanaskan (60 °C, 1,5 jam) di bawah refluks. Kemudian, NP Ag yang baru disintesis dicuci dengan air, hingga pH mencapai 7, menggunakan sentrifugasi (4000 rpm, 30 mnt).

Untuk meningkatkan aktivitas antimikroba dan dispersibilitas NP Ag, modifikasi permukaan NP Ag oleh CTAB, yang terkenal karena sifat aktif permukaan dan antiseptiknya, dilakukan [17]. Biasanya, dispersi Ag NP (3 ml, 76,4 mg/ml) dicampur dengan larutan CTAB (20 ml, 6,7 mg/ml) dan disonikasi (3 jam). Kemudian, supernatan dikumpulkan untuk pengukuran UV-Vis dan NP Ag dicuci dengan air, menggunakan sentrifugasi (4000 rpm, 30 menit), tiga kali. Kandungan CTAB dalam supernatan ditentukan menggunakan teknik spektrofotometri (UV-Vis) dengan memantau intensitas puncak 190 nm. Adsorptivitas NP Ag (dalam mg/g) terhadap CTAB dihitung dari perbedaan antara kandungan CTAB awal dalam larutan dan kandungannya dalam supernatan setelah interaksi dengan sampel. Konten adsorptivitas dan pemuatan CTAB dihitung dari persamaan berikut:

Adsorptivitas (mg/g) = (berat CTAB dalam larutan − berat CTAB dalam supernatan)/(berat NP Ag),

Konten pemuatan CTAB (%) = (1 − (berat NP Ag)/(berat CTAB memuat NP Ag)) × 100%.

Persiapan In Situ Larutan Kitosan/Ag NP

Untuk mendapatkan larutan NP kitosan/Ag, kitosan 200 kDa (1 g) dilarutkan dalam asam asetat 2% (100 ml) pada suhu kamar selama 24 jam untuk membentuk larutan kitosan 1%. Dua sampel NP Ag digunakan dalam percobaan—NP Ag murni dan NP Ag-CTAB.

Karakterisasi Fisikokimia NP Ag dan Kitosan

Studi difraksi sinar-X serbuk (XRD) dilakukan pada difraktometer Empyrean (PANalytical), menggunakan radiasi Cu Kα (1,54 Å), pemintal transmisi refleksi (tahap sampel), dan detektor 3D PIXcel, yang beroperasi di geometri Bragg–Brentano . Pemindaian 2Theta direkam pada suhu kamar dengan sudut mulai dari 10° hingga 95° dengan ukuran langkah 0,007°, dalam mode pemindaian berkelanjutan.

Pengukuran mikroskop elektron transmisi (TEM) dilakukan menggunakan mikroskop elektron transmisi JEM-ARM-200F yang beroperasi pada tegangan akselerasi 200 kV.

Spektrum inframerah diperoleh dengan menggunakan spektrometer Tensor 27 (Bruker Optik) yang dilengkapi dengan sumber global dan detektor MCT. Sampel disiapkan menggunakan kalium bromida sebagai bahan matriks dan dicampur dalam proporsi 1 mg sampel hingga 200 mg KBr. Pelet disiapkan menggunakan teknik standar di bawah tekanan 10 ton/cm ² dengan laras berdiameter 16 mm. Pengukuran dilakukan pada suhu kamar. Untuk setiap spektrum, 512 pemindaian dalam rentang spektrum 4000–400 cm ^− 1 diambil dengan resolusi 4 cm ^− 1. Data diproses menggunakan paket perangkat lunak Opus.

Pengukuran spektrofotometri (UV–Vis) dilakukan menggunakan Spektrometer UV/VIS/NIR Lambda 950 (Perkin Elmer) pada panjang gelombang 200–800 nm dengan air sebagai larutan yang dirujuk.

Uji Mikrobiologi

Budaya Bakteri

Kultur bakteri dikumpulkan dari daerah meatus nasi tengah dan dari tenggorokan 70 pasien rawat inap dengan menggunakan kapas ujung kapas steril. Spesimen segera diangkut ke laboratorium dalam media transpor dan kemudian diinokulasi pada agar darah. Kultur bakteri diidentifikasi secara morfologis dan biokimiawi dengan prosedur laboratorium standar menurut Manual Metode Bakteriologi Umum di laboratorium bakteriologis Universitas Negeri Sumy. Kami mengisolasi 50 Staphylococcus aureus ketegangan. Setiap kultur menjalani pewarnaan Gram dan diuji produksi katalase, koagulase bebas, pigmen kuning, fermentasi manitol, pertumbuhan pada konsentrasi garam tinggi, dan produksi lipase pada media agar kuning telur (Hi Media, Mumbai).

Uji Kerentanan Antimikroba

Tes kerentanan antibiotik dilakukan pada semua S . aureus isolat untuk menentukan profil resistensi antibiotik mereka. Metode difusi cakram Kirby-Bauer digunakan untuk menilai kerentanan antibiotik dari isolat. Uji kepekaan antimikroba dilakukan pada agar Muller-Hinton terhadap azitromisin, levofloksasin, klaritromisin, ciprofloxacin, dan methicillin (Komite Nasional untuk Standar Laboratorium Klinis, 1999). Kultur semalam yang segar disiapkan dan digunakan dalam pengujian. Strain standar S . aureus ATCC 25923 digunakan sebagai kontrol. Sebuah alikuot (100 L) dari masing-masing suspensi isolat dioleskan pada agar Mueller Hinton. Cakram antibiotik ditekan dengan lembut ke agar Mueller Hinton yang diinokulasi untuk memastikan kontak yang erat dengan permukaan, dan pelat diinkubasi secara aerobik pada suhu 37 ° C selama 18-24 jam. Diameter zona hambat diukur. Strain klinis dikategorikan sebagai rentan dan resisten menurut kriteria evaluasi yang dikembangkan oleh pedoman Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) [24]. Strain Staphylococcus aureus yang ditemukan resisten terhadap methicillin disaring sebagai MRSA.

Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum Solusi NP Kitosan-Ag

Aktivitas antimikroba larutan kitosan, NP Ag, dan larutan NP kitosan-Ag ditentukan sesuai dengan rekomendasi NCCLS (1999) dengan menggunakan metode pengenceran makro kaldu. Kami menentukan konsentrasi hambat minimum (MIC) untuk larutan uji terhadap setiap Staphylococcus aureus yang resistan terhadap methicillin (total 10 galur MRSA). Tabung dengan konsentrasi terendah yang sepenuhnya menghambat pertumbuhan visual bakteri (tanpa kekeruhan) dianggap sebagai MIC.

Secara singkat, pada awalnya, tujuh konsentrasi NP Ag murni dan NP Ag / CTAB disiapkan menggunakan kaldu nutrisi dengan metode pengenceran serial 2 kali lipat. Ada tiga baris identik dari setiap jenis pengenceran Ag NP. Kemudian, di setiap tabung setiap baris, kami menambahkan 1, 2, atau 3 ml larutan kitosan 1%. Konsentrasi akhir kitosan dan Ag NP dalam tabung uji ditunjukkan pada Tabel 1.

Strain bakteri uji ditumbuhkan dalam kaldu yang sesuai, dicuci sekali dalam larutan garam steril, dan diencerkan dalam air suling. Konsentrasi bakteri distandarisasi menjadi kepadatan optik 0,08 pada 600 nm (sekitar 1,5 × 10 ⁸ UFC/mL) menggunakan skala McFarland. Kemudian, 100 μl S . aureus Suspensi diinokulasikan ke dalam tabung berisi Ag NPs, larutan kitosan, dan larutan Ag NPs-kitosan. Tabung berisi media pertumbuhan dan sampel yang diuji tanpa inokulum digunakan sebagai kontrol. Semua tabung diinkubasi secara aerobik pada suhu 37°C selama 24 jam. Semua tindakan adalah rangkap tiga.

Hasil

Karakterisasi NP Ag dan Kitosan yang Digunakan untuk Pembuatan Larutan In Situ

Sebagian NP Ag yang disintesis dimodifikasi oleh CTAB (Ag/CTAB NPs) (untuk meningkatkan bioaktivitas dan stabilitas dispersi Ag NP). Adsorpsi NP Ag terhadap CTAB ditemukan sebesar 70,0 mg/g yang sesuai dengan konten CTAB dalam sampel sekitar 6,54%.

Hasil pengukuran XRD NP Ag menunjukkan adanya empat puncak tajam pada 38,15, 44,33, 64,48, 77,47, dan 81,54 °2Theta (Gbr. 1a). Menurut Database Struktur Kristal Mineralogist Amerika (AMCSD) [5], puncak ini dikaitkan dengan perak. Puncak lebar antara 12.00–21.06 °2Theta dapat dikaitkan dengan senyawa organik yang berasal dari sintesis (asam L-askorbat dan jahe). Pola XRD kitosan (Gbr. 1a, inset) menunjukkan puncak difraksi pada kira-kira 9 dan 20 °2Theta, yang merupakan sidik jari khas kitosan semikristalin [5]. Kristalinitas kitosan dihasilkan dari ikatan hidrogen antara hidroksil yang sesuai dan N gugus -asetil. Setiap puncak kristal mencirikan struktur kristalografi, yang dihasilkan dari keberpihakan paralel dan antiparalel rantai atau lembaran polimer. Kitosan semikristalin memiliki daerah amorf dan kristal.

Karakterisasi NP Ag dan kitosan. a Pola XRD, b Spektrum FTIR, c Spektrum absorbansi UV–Vis dari Ag NP (air), d Gambar TEM NP Ag

Spektrum FTIR kitosan dan NP Ag ditunjukkan pada Gambar 1b. Spektrum kitosan menunjukkan pita lebar dan intensif pada 3450–3200 cm ^− 1 (getaran ulur OH ikatan hidrogen) tumpang tindih dengan pita regangan NH, pita regangan CH pada 2783 cm ^− 1 , dan pita untuk amida I pada 1652 cm ^− 1 (Gbr. 1b). Getaran lentur gugus metilen dan metil juga terlihat di ν = 1375 cm ^− 1 dan ν = 1426 cm ^− 1 , masing-masing. Penyerapan dalam kisaran dari 1160 hingga 1000 cm ^− 1 telah dikaitkan dengan getaran gugus CO. Band yang berlokasi di dekat ν = 1150 cm ^− 1 berhubungan dengan vibrasi asimetris CO pada jembatan oksigen yang dihasilkan dari deasetilasi kitosan. Garis di dekat 1080–1025 cm ^− 1 dikaitkan dengan ν _CO dari cincin COH, COC, dan CH₂ OH. Puncak kecil di ~ 890 cm ^− 1 sesuai dengan goyangan struktur sakarida kitosan [11, 13].

Spektrum FTIR NP Ag mengungkapkan beberapa puncak intensif pada 1226, 1366, 1636, 1714, 2851, 2924, dan 3438 cm ^− 1 . Yang terakhir dikaitkan dengan gugus OH yang terikat-H. Puncaknya pada 1226 dan 1366 cm ^− 1 disebabkan oleh getaran tekuk CO dan CH; puncak ganda pada 1636 dan 1714 cm ^− 1 menunjukkan adanya gugus C=C dan C=O (getaran regangan). Puncaknya pada 2851 dan 2924 cm ^− 1 terkait dengan getaran uluran CH [13]. Adanya gugus organik pada permukaan NP Ag disebabkan oleh senyawa organik yang digunakan untuk sintesisnya, yaitu asam L-askorbat dan jahe yang dikenal dengan spektrum FTIR [10]. Jika kita membandingkan spektrum yang terakhir dengan NP Ag, orang mungkin memperhatikan bahwa puncak ganda pada 1636 dan 1714 cm ^− 1 melekat pada spektrum asam L-askorbat dan bergeser biru. Puncak jahe paling intensif terletak dalam 1000–1200 cm ^− 1 (Vibrasi COC) tidak diekspresikan secara intensif dalam spektrum Ag NPs. Oleh karena itu, asam L-askorbat memainkan peran utama dalam reduksi ion perak, mentransfer dua elektron dan berubah menjadi asam dehidroaskorbat [29]. Pergeseran biru posisi puncak asam L-askorbat memberikan bukti adanya ikatan kimia molekul ini pada permukaan Ag NP.

Spektrum absorbansi UV–Vis dari NP Ag yang terdispersi dalam air (Gbr. 1c) menunjukkan puncak asimetris pada kira-kira 387 nm. Puncak dalam 387-420 nm dikenal sebagai puncak karakteristik untuk NP Ag dan biasanya dikaitkan dengan efek resonansi plasmon permukaan [30]. Asimetri puncak ini (dataran tinggi) dapat dianggap berasal dari pengendapan cepat NP Ag. Puncak di sekitar 264 nm juga dikenal untuk NP Ag dan biasanya terkait dengan transisi elektron ke keadaan energi yang lebih tinggi yang berjalan di NP Ag [38]. Di sisi lain, spektrum UV-Vis asam L-askorbat juga mengungkapkan puncak pada 255 nm [4]. Oleh karena itu, puncak pada 264 nm dalam spektrum NP Ag dapat dianggap sebagai puncak pergeseran merah asam L-askorbat yang mengonfirmasi keberadaan molekul yang terikat secara kimia ini pada permukaan NP Ag.

Sangat menarik bahwa spektrum UV–Vis dari NP Ag/CTAB (Gbr. 1c, garis biru) mengungkapkan puncak simetris pada 417 nm. Ini menegaskan bahwa stabilitas NP Ag dalam air ditingkatkan karena modifikasi permukaan oleh molekul CTAB.

Pengukuran TEM mengungkapkan bahwa NP Ag memiliki bentuk bulat dan sebagian besar berukuran 10–12 nm (Gbr. 1d).

Aktivitas Antibakteri dari Larutan Kitosan/Ag NP yang Disiapkan In Situ Terhadap Strain Tahan Methicillin dari Staphylococcus aureus

MIC NP Ag murni dan NP Ag/CTAB terhadap 100% MRSA adalah 9,6 μg/ml. Konsentrasi terendah menunjukkan aktivitas yang lebih rendah (Tabel 2). Larutan kitosan menunjukkan aktivitas antibakteri dengan MIC 6 μg/ml terhadap 100% galur klinis MRSA. Di antara mereka, 60% galur memiliki larutan kitosan MIC 3.3 dan 5 μg/ml.

Efek penghambatan larutan NP kitosan-Ag terhadap MRSA disajikan pada Gambar. 2a. Ditemukan bahwa larutan kitosan-Ag NP menunjukkan kemanjuran antimikroba yang unggul dibandingkan dengan bentuk murninya. Pada saat yang sama, persiapan in situ larutan NP/CTAB kitosan-Ag (kitosan 6.0 μg/ml, NP Ag/CTAB) tidak dimungkinkan karena pengendapan komponen:pembentukan aglutinasi cincin abu-abu-hitam dan pemisahan komponen menjadi dua fase. Aktivitas antibakteri tidak dapat dievaluasi dalam kasus ini. Mempertimbangkan hasil yang tidak diharapkan dari pencampuran kitosan dan CTAB dan aktivitas antibakteri terendah dari Ag NPs-CTAB (lihat Gambar 2b), kami menyimpulkan bahwa modifikasi permukaan Ag NP oleh CTAB tidak menjanjikan. Kehadiran molekul CTAB pada permukaan Ag NP meningkatkan stabilitas dispersi air, namun secara signifikan menurunkan aktivitas antimikroba dan menyebabkan pengendapan larutan.

Persentase galur sensitif MRSA setelah perawatan. Solusi NP Kitosan-Ag (a ) dan larutan kitosan-AgNPs-CTAB (b ). 3,3, 5, dan 6 μg/ml—ini adalah konsentrasi kitosan dalam larutan

Diskusi

Toksisitas mengacu pada setiap dampak berbahaya pada organisme selama paparan nanopartikel dan garamnya. Jika tujuannya adalah untuk mensterilkan atau mendisinfeksi organisme tertentu, toksisitas dapat diartikan sebagai hasil positif (antibakteri, antivirus) [15]. Kebutuhan mendasar saat ini dalam nanoteknologi adalah pengembangan metode yang ramah lingkungan dan dapat diandalkan untuk sintesis nanopartikel logam. Kami telah menegaskan penggunaan agen pereduksi biologis yang alami, murah, dan bahan ramah lingkungan untuk memproduksi nanopartikel perak, untuk menghindari adanya pelarut berisiko dan beracun [37]. Penggunaan Ag NPs sebagai agen terapeutik terbatas karena sitotoksisitasnya terhadap sel mamalia. Beberapa faktor dapat mempengaruhi pengaruh NP Ag terhadap mikroorganisme, seperti ukuran, bentuk, stabilitas, dan konsentrasi NP Ag [4].

Dalam penelitian kami, kami memperoleh NP Ag dengan ukuran 5–18 nm. Ini adalah salah satu parameter paling mendasar yang mempengaruhi sifat optik [39], antimikroba [27], dan antivirus Ag NPs [21]. Partikel yang lebih kecil menunjukkan aktivitas antibakteri yang lebih besar. Beberapa penelitian mengungkapkan bahwa NP yang lebih besar dari 10 nm terakumulasi pada permukaan seluler dan mengganggu permeabilitas seluler; namun, NP yang lebih kecil dari 10 nm menembus ke dalam bakteri, mempengaruhi DNA dan enzim yang menyebabkan kematian sel [14]. Sangat menarik untuk dicatat bahwa meskipun sebagian besar hasil membuktikan bahwa hipotesis toksisitas meningkat dengan penurunan ukuran partikel, ada juga data eksperimen yang menunjukkan bahwa NP yang lebih kecil kurang toksik atau tidak memiliki toksisitas yang bergantung pada ukuran [15]. Ada banyak penelitian yang menunjukkan aktivitas antimikroba NP Ag dengan kisaran ukurannya dari 3 hingga 100 nm [19].

Seperti disebutkan sebelumnya, efek kitosan pada stabilitas dan sifat antimikroba dari NP Ag yang disintesis dievaluasi. Sebelum pengujian kerentanan, nanopartikel yang disintesis menjadi sasaran metode karakterisasi yang berbeda untuk menentukan kemurniannya. Penelitian kami menunjukkan bahwa NP Ag dalam konsentrasi 9,6 μg/ml efektif melawan 100% galur MRSA dan CTAB tidak meningkatkan efektivitas NP Ag.

Kitosan diketahui memiliki aktivitas antibakteri yang signifikan terhadap bakteri spektrum luas [2]. Meskipun demikian, beberapa laporan menunjukkan bahwa kitosan murni tidak mencegah infeksi parah [3]. Beberapa publikasi telah melaporkan berbagai kombinasi kitosan dan perak dengan sifat antimikroba yang lebih baik [11]. Nanokomposit perak-kitosan diusulkan sebagai pelapis untuk aplikasi rekayasa biomedis dan pengemasan makanan dan aplikasi pembalut luka [2, 3]. Tetapi ada data terbatas tentang efek antibakteri larutan kitosan-Ag NPs terhadap MRSA [34]. Data kami menunjukkan bahwa pencampuran sederhana NP Ag dalam larutan kitosan dapat meningkatkan aktivitas antibakteri kedua komponen. Kami mendapatkan peningkatan dari semua aktivitas antibakteri zat yang diselidiki. KHM kitosan adalah 3,3 μg/ml dan MIC Ag NP murni dan Ag NP dengan CTAB MIC masing-masing adalah 1,2 dan 2,4 g/ml. Kaur dkk. (2013) juga melaporkan aktivitas antibakteri nanokomposit perak/kitosan terhadap S . aureus , di mana mereka menunjukkan hasil yang serupa [36], tetapi mereka tidak menentukan MIC. Temuan ini menunjukkan keefektifan larutan NP kitosan-Ag, tetapi kami tidak melihat keuntungan CTAB sebagai agen antibakteri. Sebaliknya, penelitian lain menunjukkan bahwa Ag NP yang distabilkan dengan CTAB memiliki efek antibakteri yang nyata terhadap S . aureus dan Escherichia coli . Mungkin, dalam percobaan kami, kitosan terhubung dengan CTAB yang menurunkan efek Ag NP untuk sel bakteri.

Kesimpulan

Dalam penelitian ini, aktivitas larutan NP kitosan-Ag yang disiapkan secara in situ dengan rasio komponen yang berbeda diuji terhadap MRSA yang diisolasi dari pasien. Hasil kami menunjukkan bahwa pencampuran sederhana larutan kitosan dan NP Ag mengurangi konsentrasi penghambatan minimal zat menjadi 2 dan 4 kali lipat (3,3 dan 1,2 g/ml), masing-masing. Hasil ini sangat menjanjikan dan dapat dianggap sebagai solusi efektif dalam memerangi bakteri yang resistan terhadap obat. Ini juga merupakan kemajuan menuju pengobatan yang dipersonalisasi. Studi sitotoksisitas masa depan larutan kitosan-Ag NP akan memberikan jawaban tentang dosis yang sesuai untuk penggunaan klinis.

Singkatan

NP Ag:

Nanopartikel perak

ARI:

Infeksi saluran pernapasan akut

CTAB:

Cetrimonium bromida

FTIR:

Spektroskopi inframerah transformasi Fourier

MRSA:

A galur Staphylococcus aureus yang resisten terhadap eticillin

TEM:

Mikroskop elektron transmisi

UV–Vis:

Spektroskopi ultraviolet–tampak

XRD:

difraksi sinar-X

Efek Annealing pada Mikrostruktur dan Pengerasan Paduan Vanadium yang Diimplan Helium-Hidrogen Secara Berurutan Sintesis Sonokimia Satu Langkah yang Mudah dan Sifat Fotokatalitik dari Komposit Titik Kuantum Grafena/Ag3PO4