Horseradish Peroxidase-Encapsulated Hollow Silica Nanospheres untuk Penginderaan Intraseluler Spesies Oksigen Reaktif
Abstrak
Spesies oksigen reaktif (ROS) memiliki peran penting dalam pensinyalan sel dan homeostasis. Kelebihan produksi ROS dapat menyebabkan kerusakan oksidatif pada berbagai biomolekul dan struktur seluler. Oleh karena itu, mengembangkan pendekatan yang mampu memantau dan mengukur ROS dalam sel hidup penting untuk diagnosis fisiologi dan klinis. Beberapa probe fluorogenik permeabel sel yang dikembangkan berguna untuk mendeteksi ROS saat berhubungan dengan horseradish peroxidase (HRP). Skenario intraseluler mereka bagaimanapun terhalang oleh sifat enzim yang tidak dapat ditembus membran. Di sini, pendekatan baru untuk penginderaan intraseluler ROS dengan menggunakan nanosfer silika berongga yang dienkapsulasi lobak peroksidase (disebut HRP@HSNs), dengan aktivitas katalitik yang memuaskan, permeabilitas membran sel, dan biokompatibilitas, disiapkan melalui metode mikroemulsi.
HRP @ HSN ini, dikombinasikan dengan probe selektif atau ligan penargetan, dapat diramalkan sebagai alat pendeteksi ROS dalam organel atau tipe sel tertentu. Dengan demikian, dihydrorhodamine 123-coupled HRP@HSNs digunakan untuk analisis kualitatif dan semi-kuantitatif dari H2 fisiologis. O2 tingkat dalam makrofag RAW 264,7 yang diaktifkan. Kami membayangkan bahwa HSN yang mengenkapsulasi enzim aktif ini dapat dikonjugasikan dengan probe selektif dan ligan penargetan untuk mendeteksi ROS pada organel atau tipe sel tertentu yang diinginkan.
Latar Belakang
Spesies oksigen reaktif (ROS) yang terdiri dari molekul radikal dan non-radikal, seperti anion superoksida, hidrogen peroksida, radikal hidroksil, oksigen singlet, dan peroksinitrit, terus diproduksi selama metabolisme aerobik. ROS seluler terutama dihasilkan dari rantai transpor elektron mitokondria (mETC) dan biasanya diimbangi oleh enzimatik (seperti superoksida dismutase, katalase, dan peroksidase) dan non-enzimatik (misalnya, vitamin A, C, dan E; urat; dan bilirubin ) pertahanan antioksidan [1]. Namun, ketidakseimbangan dalam produksi ROS dapat menyebabkan stres oksidatif dan kerusakan selanjutnya pada DNA, asam lemak, protein, dan komponen seluler lainnya, yang berpotensi berkontribusi terhadap diabetes [2], kanker [3], dan gangguan kardiovaskular [4], dan gangguan neurodegeneratif. [5] seperti penyakit Alzheimer dan penyakit Parkinson. Pencitraan langsung dan kuantifikasi ROS dalam sel hidup sangat diinginkan tetapi sangat menantang.
Kemajuan dalam mikroskop fluoresen [6, 7] telah memungkinkan pengembangan pengukuran noninvasif dan pencitraan evolusi ROS pada tingkat sel tunggal. Untuk mendeteksi ROS, sebagian besar probe dirancang untuk mengukur perubahan intensitas fluoresensi atau pergeseran panjang gelombang emisi (yaitu, metode rasiometrik) setelah oksidasi molekul aromatik profluoresen atau deproteksi senyawa bertopeng menjadi produk fluoresen [8]. Spesifisitas untuk jenis ROS tertentu sangat penting ketika merancang probe yang berhasil; misalnya, oksidasi boronat digunakan sebagai pendekatan reaksi bioortogonal untuk mempelajari kimia hidrogen peroksida dalam sistem kehidupan [9]. Untuk mengeksplorasi dinamika spatio-temporal dari ROS, beberapa probe berbasis boronat yang terkonjugasi dengan bagian fosfonium bermuatan positif dihasilkan untuk penargetan mitokondria [10, 11]. Namun, potensi mereka untuk pencitraan in vivo dibatasi oleh ketidakstabilan mereka dalam lingkungan biologis, penetrasi penghalang jaringan yang rendah, dan eliminasi yang cepat dari tubuh melalui sistem kemih [12,13,14]. Untuk mengatasi masalah tersebut, beberapa strategi telah dikembangkan baik dengan mencangkok secara kimia struktur penstabil tambahan ke probe [15] (misalnya, rantai trietilen glikol), mengembangkan indikator berbasis protein fluoresen yang dikodekan secara genetik [16], atau menerapkan berbasis reaksi. reporter bioluminescent [17] atau positron emission tomography (PET) probe untuk pencitraan molekuler ROS [18]. Selain itu, beberapa studi komprehensif menyoroti formulasi nano sebagai pertimbangan desain yang penting dan menunjukkan bahwa probe berbasis nanopartikel dapat memberikan wawasan mekanistik dan strategi inovatif untuk menggambarkan ROS pada organisme hidup dengan spesifisitas dan sensitivitas tinggi [19,20,21,22]. Enzim dengan aktivitas katalitik tinggi dan selektivitas substrat yang berbeda juga telah digunakan sebagai alat diagnostik klinis untuk mengidentifikasi analit target. Namun, kurangnya stabilitas yang bertahan lama dan kesulitan dalam menembus membran biologis enzim bebas sering membatasi aplikasinya dalam lingkungan biologis yang kompleks. Meskipun penerapan elektroda tidak cocok untuk pengujian intraseluler atau pencitraan in vivo, banyak upaya telah dilakukan untuk mengembangkan biosensor yang digabungkan dengan horseradish peroxidase (HRP) untuk menentukan H2 O2 berdasarkan metode elektrokimia [23, 24].
Dalam karya ini, nanoreaktor enzimatik, terdiri dari HRP yang dienkapsulasi dalam nanosfer silika berongga 45 nm, disintesis dengan rute mikroemulsi air dalam minyak (w/o) diikuti dengan proses etsa ringan [25]. Sebelumnya, kami menunjukkan bahwa nanomaterial berongga tersebut dapat mempertahankan aktivitas stabil dari enkapsulasi enzim dan nanokatalis sekaligus melindungi terhadap proteolisis dan sintering, masing-masing [26, 27]. Dalam karya ini, kami mengevaluasi kegunaan potensial mereka sebagai biosensor intraseluler dengan mempelajari efisiensi jebakan enzim, kapasitas pemuatan, reaktivitas dan selektivitas peroksida, serapan seluler, toksisitas, dan efek proliferasi HRP@HSNs. Menggunakan dihydrorhodamine 123 (DHR123) sebagai substrat, yang biasanya digabungkan dengan HRP untuk mendeteksi produksi hidrogen peroksida intraseluler, interaksi antara HRP@HSNs dan berbagai jenis ROS dalam larutan air diselidiki dengan flow cytometry dan mikroskop fluoresensi. Lebih lanjut, ditunjukkan bahwa pemanfaatan HRP@HSNs dengan DHR123 dapat secara bersamaan mencitrakan dan mengukur H2 fisiologis O2 kadar dalam makrofag RAW264.7 yang dirangsang oleh phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA). Secara bersama-sama, nanoreaktor enzimatik dari HRP@HSNs memiliki potensi untuk pencitraan sel inflamasi terkait ROS in vivo dan komponen yang dienkapsulasi dapat diperluas ke beberapa enzim yang berbeda [28], nanopartikel [26], dan molekul pengenalan untuk aplikasi sinergis.
Metode/Eksperimental
Bahan Kimia dan Reagen
Dekan, n -heksanol (98%), amonium hidroksida (NH4 OH, 35 berat%), tetraetil ortosilikat (TEOS, 98%), 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS, 95%), dan isomer fluorescein isothiocyanate (FITC) dibeli dari ACROS. Polioksietilen (5) isooctylphenyl ether (Igepal CA-520), HRP tipe VI-A (HRP), 3,3′5,5′-tetramethylbenzidine (TMB), asam sitrat, dimetil sulfoksida (DMSO), dan rhodamin B isothiocyanate ( RITC) dibeli dari Sigma-Aldrich. 2-(4-Iodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolium dibeli dari Clontech. DHR123 dan PMA dibeli dari Cayman Chemical. Hidrogen peroksida (H2 O2 , 35%) dibeli dari SHOWA Chemical Industry. Larutan tert-butil hidroperoksida (70% dalam H2 O) dibeli dari Aldrich. Besi (II) perklorat (Fe(ClO4 )2 ) dibeli dari Alfa Aesar. Air deionisasi ultra murni (D.I.) dihasilkan oleh sistem Millipore Milli-Q Plus. Semua reagen digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut.
Sintesis Hollow Silica Nanospheres (HSN)
HSN disintesis oleh sistem mikroemulsi terbalik disertai dengan metode etsa selektif seperti yang dijelaskan dalam penelitian kami sebelumnya [25, 29]. Biasanya, 20 mL dekana sebagai fase minyak, 1,63 mL CA-520 sebagai surfaktan, dan 550 μL n -heksanol sebagai ko-surfaktan dicampur serta diaduk secara magnetis dengan batang pengaduk berlapis PTFE 2 cm pada 650 rpm. Setelah itu, 350 μL D.I. air ditambahkan ke dalam campuran pada suhu kamar, menghasilkan sistem mikroemulsi air dalam minyak (w/o). Selanjutnya, 25 L larutan etanol APTMS (200 L APTMS dalam 1,4 mL etanol absolut) dan 100 L TEOS ditambahkan sambil diaduk. Setelah diaduk selama 10 menit, 250 μL amonia berair (35% berat) dimasukkan ke dalam sistem dengan pengadukan pada 20 °C. Setelah 10 jam, 95% etanol ditambahkan untuk mengacaukan sistem mikroemulsi dan nanopartikel silika padat (SSNs) dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 11.000 rpm selama 20 menit. Untuk mendapatkan HSN, SSN ditangguhkan di D.I. air sambil diaduk pada suhu 40 °C selama 40 menit. Selanjutnya, HSN dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 11.000 rpm selama 20 menit dan dicuci dengan etanol 95% beberapa kali. Akhirnya, HSN disuspensikan dan disimpan dalam etanol 99,5%.
HRP@HSNs disintesis dengan metode berdasarkan penelitian kami sebelumnya [27, 28]. Biasanya, sintesisnya mirip dengan prosedur di atas, kecuali 350 μL D.I. air diganti dengan 350 L HRP encer (90 L 10 mg/mL larutan HRP dalam 350 L air D.I.). Setelah sintesis, HRP@HSNs disimpan di D.I. air pada 4 °C.
Sintesis FITC-HSN dan HRP@FITC-HSN
HSNs dan HRP@HSNs dengan pewarna fluorescein pemancar hijau yang tergabung (ditunjuk FITC-HSNs dan HRP@FITC-HSNs) disintesis mirip dengan prosedur di atas, kecuali bahwa larutan APTMS etanol digantikan oleh FITC-APTMS. Larutan FITC-APTMS etanol dibuat dengan mencampur 10 mg FITC dan 200 μL APTMS dengan 1,4 mL etanol absolut dalam kondisi gelap selama 18 jam pada suhu kamar.
Efisiensi Penjebakan HRP dan Kapasitas Pemuatan HRP@HSN
Pertama, campuran yang terdiri dari HRP (6 mg dalam 500 μL air D.I.) dan RITC (3 mg dalam 350 μL DMSO) diaduk dalam kondisi gelap selama 24 jam pada 4°C. Setelah itu, campuran dipindahkan ke membran dialisis yang terdiri dari selulosa yang diregenerasi dengan berat molekul cutoff 12~14 kDa. Kemudian, untuk menghilangkan RITC yang tidak bereaksi, kantong dialisis didialisis terhadap 1 L D.I. air dan diaduk perlahan selama 3 hari. Terakhir, HRP berlabel RITC (ditunjuk sebagai RITC-HRP) digunakan untuk mensintesis RITC-HRP@HSN.
Untuk menentukan kapasitas pemuatan HRP, RITC-HRP@HSN dilarutkan dalam 1 mL NaOH (1 M) selama 1 jam, dan jumlah RITC-HRP yang terperangkap dihitung dari kurva kalibrasi yang dibuat dengan memplot intensitas fluoresensi versus konsentrasi RITC-HRP. Fluoresensi diukur dengan Instrumen Hitachi F-4500 pada panjang gelombang eksitasi 543 nm dan panjang gelombang emisi 550~650 nm. Efisiensi penjeratan HRP dan kapasitas pemuatan HRP@HSNs didefinisikan sebagai berikut:efisiensi penjeratan (%) = massa RITC-HRP dalam RITC-HRP@HSNs/massa awal RITC-HRP; dan kapasitas pemuatan = massa RITC-HRP dalam HRP-RITC@HSNs/massa RITC-HRP@HSNs.
Pengujian Aktivitas HRP
Untuk mendeteksi aktivitas enzim peroksidase, substrat kromogenik TMB digunakan. TMB dapat diubah menjadi produk berwarna ketika dioksidasi oleh HRP menggunakan hidrogen peroksida sebagai agen pengoksidasi. Pertama, berbagai konsentrasi HRP asli dan HRP@HSN disiapkan dalam buffer fosfat dan sitrat (pH 5,2). Kemudian, setiap larutan dilengkapi dengan 50 μL larutan TMB (20 μM dalam DMSO) dan 50 L H2 O2 (20 μM dalam air D.I.). Reaksi dipantau dengan mengukur absorbansi pada 655 nm menggunakan pembaca pelat mikro (BioTek Synergy Hybrid Reader). Aktivitas HRP yang dienkapsulasi dalam HSN dihitung dari kurva kalibrasi HRP asli.
Pengujian Reaktivitas HRP@HSN terhadap Berbagai ROS
DHR123 (20 μM) sendiri atau dicampur dengan HRP@HSNs (50 μg/mL) diinkubasi dengan berbagai jenis ROS (100 μM) dalam 100 μL larutan DMEM (pH 7,4). Emisi fluoresensi pada 530 nm (λex = 488 nm) dipantau setiap 5 menit selama 120 mnt pertama. ROS yang diselidiki diperoleh sebagai berikut:hidrogen peroksida (H2 O2 ) dan tert-butil hidroperoksida (TBHP) dibuat dari larutan berair 32 dan 70% yang tersedia secara komersial, masing-masing. Superoksida (O2
•−
) dihasilkan dari 10 mM stok kalium superoksida (KO2 ) di DMEM. Radikal hidroksil (•OH) dan radikal tert-butoksi (•OtBu) dihasilkan dari reaksi 1 mM Fe(ClO4 )2 dengan 100 μM H2 O2 atau 100 μM TBHP, masing-masing.
Uji Kultur dan Viabilitas Sel
Garis sel makrofag tikus RAW264.7 diperoleh dari ATCC. Sel RAW264.7 dipertahankan dalam DMEM dengan 10% FBS, 100 U/mL penisilin, dan 100 μg/mL streptomisin (Gibco) pada 37 °C dalam 5% CO2 suasana. Biasanya, 2 × 10
5
Sel RAW264.7 per sumur diunggulkan dalam pelat 24-sumur untuk uji viabilitas. Setelah 24 jam, sel dicuci dua kali dengan PBS dan diinkubasi dengan jumlah yang berbeda (0, 50, 100, dan 200 g/mL) suspensi nanopartikel dalam DMEM bebas serum selama 2 jam. Untuk uji sitotoksisitas, sel yang diberi perlakuan nanopartikel dicuci dua kali dengan media kultur diikuti dengan inkubasi dengan reagen WST-1 (Clontech) pada suhu 37°C selama 2 jam. Untuk uji proliferasi, sel setelah perlakuan dengan nanopartikel selama 2 jam dibiarkan tumbuh dalam media pertumbuhan biasa selama 24 jam diikuti dengan inkubasi dengan reagen WST-1. Viabilitas sel ditentukan oleh pewarna formazan yang dihasilkan oleh sel hidup, dan absorbansi pada 450 nm diukur, dengan panjang gelombang referensi 650 nm, menggunakan pembaca lempeng mikro (Bio-Rad, model 680).
Analisis Serapan Sel
RAW264.7 sel pada 1 × 10
6
per sumur diunggulkan di piring enam sumur semalaman. Kemudian, makrofag RAW264.7 diperlakukan dengan jumlah yang berbeda (0, 50, 100, dan 200 g/mL) suspensi nanopartikel dalam media DMEM bebas serum selama 2 jam. Setelah itu, sel dicuci tiga kali dengan PBS dan dipisahkan dengan larutan tripsin-EDTA. Penyerapan nanopartikel oleh makrofag RAW264.7 diperiksa dengan flow cytometry. Trypan blue digunakan untuk memadamkan fluoresensi nanopartikel yang teradsorpsi ke membran luar sel.
Analisis Aliran Sitometri Produksi ROS dalam Makrofag RAW264.7 Terstimulasi PMA
Biasanya, setelah 2 jam pengobatan makrofag RAW264.7 dengan nanopartikel, sel dicuci tiga kali dengan PBS diikuti dengan inkubasi dengan 20 μM DHR123 dalam DMEM bebas serum selama 30 menit. Kemudian, sel RAW264.7 dicuci dengan PBS dan diinkubasi dengan media kultur yang mengandung PMA pada konsentrasi yang berbeda selama 1 jam. Setelah dicuci, makrofag RAW264.7 diambil dan dianalisis dengan flow cytometer FACS Canto II.
Analisis Kuantitatif
RAW264.7 sel pada 3 × 10
4
per sumur diunggulkan di piring 96-sumur untuk pengujian semi-kuantitatif. Setelah inkubasi dengan 50 L 100 g/mL suspensi nanopartikel dalam DMEM bebas serum selama 2 jam, sel yang diobati dengan nanopartikel diperlakukan dengan 50 L DMEM bebas serum yang mengandung konsentrasi PMA yang berbeda, dan 20 μM DHR123 untuk tambahan 1 jam pada 37 °C. Pada saat yang sama, standar eksternal H2 O2 dicampur dengan 50 μg/mL HRP@HSN digunakan untuk mengembangkan kurva kalibrasi dengan memplot intensitas fluoresensi versus konsentrasi H2 O2 . Intensitas fluoresensi diukur dengan pembaca pelat mikro (BioTek Synergy Hybrid Reader) dengan eksitasi pada 488 nm dan emisi pada 530 nm. Dengan menggunakan kurva kalibrasi yang ditetapkan, jumlah H2 O2 di RAW264.7 sel yang distimulasi dengan berbagai jumlah PMA dihitung.
Karakterisasi
Gambar mikroskop elektron transmisi (TEM) diambil pada JEOL JEM-1200 EX II yang beroperasi pada 100 kV. Gambar direkam dengan kamera CCD GatanOrius. Sampel didispersikan dalam etanol 95% dan dijatuhkan ke kisi tembaga berlapis karbon, dan kemudian dikeringkan dan diperiksa. Untuk memverifikasi HRP dalam bola berongga, sampel pewarnaan negatif diaduk dalam uranil asetat (UA) 1% berair selama 1 jam, dan kemudian disentrifugasi untuk menghilangkan sisa asam urat. Akhirnya, sampel didispersikan dalam etanol dan dijatuhkan ke kisi tembaga untuk pencitraan. Penghamburan cahaya dinamis (DLS) dan pengukuran potensial zeta dilakukan pada Zetasizer Nano ZS (Malvern, UK). Gambar optik sel RAW264.7 diperoleh dengan mikroskop terbalik Zeiss Axio Observer Z1.
Hasil dan Diskusi
Desain dan Sintesis HSN dan HRP@HSN
Biasanya, HSNs dan HRP@HSNs disintesis melalui proses sol-gel terkatalis amonia yang dikombinasikan dengan sistem mikroemulsi air-dalam-minyak (w/o) menurut metode kami sebelumnya [27, 28]. Skema 1 mengilustrasikan sintesis HRP@HSN. Menurut gambar TEM (Gbr. 1), HSN dengan dan tanpa HRP yang dienkapsulasi menunjukkan diameter rata-rata 45 nm (File tambahan 1:Gambar S1). Pewarnaan UA dengan jelas menunjukkan peningkatan kerapatan elektron di dalam HRP@HSN, tetapi tidak ada pewarnaan yang diamati di luar HRP@HSN (Gbr. 1b), yang menunjukkan bahwa enzim HRP berhasil dijebak di dalam rongga interior HRP@HSN.
Gambar TEM dari a nanosfer silika berongga (HSN), b HSN diwarnai dengan uranil asetat, c lobak peroksidase-enkapsulasi HSN (HRP@HSNs), dan d HRP@HSNs diwarnai dengan uranil asetat. Sisipan:tampilan yang diperbesar
Pengukuran DLS dan analisis potensi zeta yang dilakukan pada suhu kamar ditunjukkan pada Tabel 1. Data DLS menunjukkan bahwa HSN dan HRP@HSN memberikan potensi zeta positif dalam air (pH ~ 6,5) dengan diameter hidrodinamik 188 ± 4 dan 184 ± 6 nm dalam air, masing-masing. Namun, ketika nanopartikel didispersikan dalam DMEM bebas serum, diameter hidrodinamik meningkat menjadi 1767 ± 94 nm untuk HSNs dan 1598 ± 127 nm untuk HRP@HSNs. Ini menunjukkan tingkat kecil agregasi HSN, tetapi mereka masih ditangguhkan dengan baik di media. Sementara itu, potensi zeta negatif dari kedua nanopartikel yang diukur dalam media menyiratkan bahwa beberapa ion dan biomolekul dari lingkungan biologis mungkin telah teradsorpsi ke permukaan nanopartikel [30, 31]. Dalam kondisi ini, permukaan nanopartikel bermuatan positif ditutupi oleh zat bermuatan negatif, yang dengan cepat menyebabkan agregasi nanopartikel melalui interaksi elektrostatik. Untuk mengurangi agregasi non-spesifik dan meningkatkan stabilitas koloid nanopartikel, bovine serum albumin (BSA) diperkenalkan ke media biologis [28]. Selanjutnya, diameter hidrodinamik HSN dan HRP@HSN menunjukkan penurunan diameter hidrodinamik yang cukup besar masing-masing menjadi 197 ± 43 dan 195 ± 19 nm.
Efisiensi Penjebakan HRP dan Kapasitas Pemuatan HRP@HSN
Untuk menyelidiki efisiensi dan kapasitas pemuatan jebakan HRP, HRP berlabel fluorescent dye (RITC) disiapkan (ditunjuk RITC-HRP). Intensitas fluoresensi RITC-HRP@HSNs diukur dengan menangguhkan nanopartikel dalam 1 M NaOH, dan jumlah RITC-HRP yang dienkapsulasi ditentukan menurut kurva kalibrasi yang dibuat dengan memplot intensitas fluoresensi versus konsentrasi RITC-HRP asli. dalam kondisi yang sama (File tambahan 1:Gambar S2). Untuk mempelajari efek konsentrasi enzim pada efisiensi jebakan dan kapasitas pemuatan, tiga jumlah berbeda dari HRP (11,1, 22,2, dan 33,3 nmol) diperkenalkan ke sintesis. Perlu dicatat bahwa dalam kisaran konsentrasi ini, terlepas dari berapa banyak enzim yang dimasukkan, efisiensi penjeratan enzim untuk masing-masing dari tiga kasus adalah sekitar 6%. Efisiensi yang rendah ini mungkin disebabkan oleh fakta bahwa hanya sebagian kecil dari tetesan mikroemulsi yang berinti dan tumbuh menjadi HSN; sebagian besar tetesan mikroemulsi tidak berinti dan tetap dalam ukuran kecil ~ 8 nm [25]. Pekerjaan di masa depan mungkin diperlukan untuk meningkatkan efisiensi pemuatan. Namun, kapasitas pemuatan HRP dari HRP@HSNs secara bertahap meningkat menjadi 12,5 ± 1,2 μg HRP/mg HSNs ketika 33,3 nmol HRP digunakan (File tambahan 1:Tabel S1). Hal ini menunjukkan bahwa kapasitas pemuatan HRP dapat dikontrol oleh jumlah enzim yang ada dalam reaksi.
Sitotoksisitas dan Serapan Seluler dari HSN dan HRP@HSN
Untuk mengevaluasi sitotoksisitas in vitro dari HSNs dan HRP@HSNs, viabilitas sel diperiksa dengan uji WST-1. Seperti yang ditunjukkan pada File tambahan 1:Gambar S3, tidak ada perubahan signifikan dalam proliferasi sel RAW264.7 yang diamati setelah perlakuan nanopartikel selama 2 jam, atau 2 jam diikuti dengan kultur 24 jam tambahan. Tidak ada efek nyata pada fungsi mitokondria seluler yang disebabkan oleh nanopartikel silika yang ditemukan pada titik waktu yang ditunjukkan, terlepas dari ada atau tidaknya HRP di dalam HSN.
Selanjutnya, HSN terkonjugasi FITC dan HRP @ HSN masing-masing disiapkan untuk menyelidiki efek konsentrasi nanopartikel pada pelabelan RAW264.7. Hasil flow cytometric (File tambahan 1:Gambar S4) menunjukkan bahwa sel RAW264.7 berhasil diberi label dengan FITC-HSN dan HRP@FITC-HSN pada konsentrasi berbeda selama 2 jam dalam media bebas serum. Dalam kedua kasus, peningkatan efisiensi pelabelan yang bergantung pada dosis ditemukan, dan lebih dari 80% sel RAW264.7 diberi label oleh paparan nanopartikel pada konsentrasi> 50 μg/mL selama 2 jam. Properti seperti pelabelan intraseluler efisiensi tinggi dengan waktu inkubasi singkat, dosis nanopartikel yang relatif rendah, dan non-sitotoksisitas membuat HRP@HSN cocok untuk deteksi intraseluler ROS.
Reaktivitas HRP@HSN terhadap Berbagai ROS
Menurut uji aktivitas enzim HRP menggunakan TMB sebagai substrat, sekitar 40% dari aktivitas enzim awal tetap pada enkapsulasi HRP berikutnya menjadi HSN. Penurunan aktivitas spesifik yang diamati dari enzim yang dienkapsulasi (mol substrat yang dikonversi per unit enzim per unit waktu) dapat dihasilkan dari keterbatasan perpindahan massa, yang terjadi ketika substrat melintasi cangkang silika menuju HRP [32]. Namun demikian, strategi enkapsulasi menyediakan fitur tambahan, misalnya, cangkang silika berpori dapat melindungi HRP terhadap proteolisis sambil memungkinkan pengangkutan molekul kecil reaktan dan produk [26, 27]. Secara keseluruhan, reaktivitas yang diamati dari HRP@HSNs terhadap ROS, dievaluasi dengan memasukkan probe fluoresen (DHR123), dapat dihasilkan dari kombinasi afinitas nanopartikel serta properti intrinsik HRP untuk ROS.
Sistem bebas sel digunakan untuk menghasilkan berbagai ROS yang relevan secara biologis, termasuk hidrogen peroksida (H2 O2 ), TBHP, radikal hidroksil (•OH), radikal tert-butoksi (•OtBu), dan superoksida (O2 •
−
). Pertama, DHR123 diinkubasi dengan panel ROS tanpa kehadiran dan keberadaan HRP atau HRP@HSN diikuti dengan mengukur intensitas fluoresensi produk rhodamine 123 (R123). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2, terlepas dari jenis ROS yang digunakan, intensitas fluoresensi diukur dengan cara yang bergantung pada waktu (30, 60, 90, dan 120 menit). Namun, perbedaan nyata dalam intensitas di antara berbagai ROS bergantung pada sifat intrinsik DHR123. Di satu sisi, sesuai dengan penelitian sebelumnya [33], Gambar 2a menunjukkan bahwa tidak ada H2 O2 atau O2 •
−
dapat mengoksidasi DHR123 menjadi R123. Selain itu, DHR123 menunjukkan reaktivitas yang lebih tinggi untuk •OtBu dan •OH radikal atas ROS lainnya. Dengan aktivitas katalitik HRP, peningkatan luar biasa dalam intensitas fluoresensi diamati dengan adanya HRP asli dan HRP@HSN seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2b, c. Tercatat bahwa intensitas fluoresensi yang lebih tinggi yang ditemukan dalam kasus HRP asli dibandingkan dengan HRP@HSN pada waktu reaksi yang sama berkorelasi positif dengan aktivitas enzim yang diamati.
a –c Intensitas fluoresensi tergantung waktu dari reaksi spesies oksigen reaktif (ROS) terpilih dengan a dihydrorhodamine 123 (DHR123), b DHR123 + horseradish peroxidase (HRP), dan c DHR123 + HSN yang dienkapsulasi peroksidase lobak (HRP@HSNs). d Peningkatan rasio intensitas reaksi ROS terpilih dengan DHR123 + HRP dan DHR123 + HRP@HSNs pada 1 jam. Data yang ditampilkan adalah untuk 20 μM DHR123, 400 ng/mL HRP, 50 μg/mL HRP@HSN, dan 100 μM ROS. (*p < 0,05 versus kelompok kontrol pada titik waktu yang sesuai)
Untuk memungkinkan perbandingan langsung antara berbagai ROS, data pada interval waktu 60 menit dipilih dan dilaporkan sebagai intensitas fluoresensi relatif yang dinormalisasi ke kontrol (File tambahan 1:Gambar S5). Analisis selanjutnya dari rasio intensitas yang ditingkatkan ditunjukkan dengan membagi intensitas fluoresensi relatif DHR123 + HRP atau DHR123 + HRP@HSNs dengan DHR123 (Gbr. 2d). Dalam kedua kasus yang mengandung HRP, tren serupa dari rasio intensitas yang ditingkatkan pada berbagai ROS serta peningkatan signifikan dalam reaktivitas DHR123 terhadap H2 O2 dan O2 •
−
diamati, menunjukkan bahwa HRP yang dienkapsulasi memberikan aktivitas enzim intrinsik tingkat tinggi, dan cangkang silika HRP@HSN memungkinkan pengangkutan molekul kecil untuk melakukan biokatalisis selektif.
Deteksi ROS Intraseluler dengan HRP@HSNs
Untuk menilai fungsi deteksi ROS dari HRP@HSN di dalam sel, makrofag RAW264.7 diinkubasi dengan HRP@HSN selama 2 jam diikuti dengan pencucian dan kemudian diinkubasi dengan DHR123 (20 μM) selama 30 menit. Selanjutnya, sel dicuci dan diperlakukan dengan PMA (1 μg/mL) selama 1 jam tambahan. Diketahui bahwa merangsang makrofag dengan PMA menghasilkan produksi superoksida, yang diubah menjadi hidrogen peroksida oleh superoksida dismutase atau dengan dismutasi spontan [34,35,36]. Dengan demikian, PMA dapat berfungsi sebagai stimulan untuk menghasilkan H2 O2 dalam makrofag RAW264.7 untuk mengevaluasi H2 intra intraseluler O2 -kemampuan penginderaan HRP@HSNs. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3a, kedua kasus makrofag RAW264.7 yang dikultur sendiri dan dikultur dengan HSN menunjukkan fluoresensi yang lemah dalam analisis flow cytometric, yang menunjukkan bahwa sel yang tidak distimulasi menghasilkan tingkat basal ROS yang lemah, di mana tidak ada ROS signifikan yang diinduksi dalam keberadaan HSN. Selain itu, sel yang diobati dengan HRP@HSN menunjukkan peningkatan intensitas yang signifikan (Gbr. 3a), menunjukkan bahwa HRP@HSN yang dikirim memberikan aktivitas katalitik ekstra di dalam sel.
a Analisis flow cytometry dari makrofag RAW264.7 yang distimulasi dengan dan tanpa phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) di hadapan dan tidak adanya nanopartikel. b PMA dan c konsentrasi horseradish peroxidase-encapsulated HSNs (HRP@HSNs) secara bergantung mengubah fluoresensi makrofag RAW264.7. d Gambar fluoresensi representatif dari makrofag RAW264.7 pada kondisi yang ditunjukkan. Bilah skala 50 μm
Untuk percobaan stimulasi, sel yang diobati dengan PMA biasanya menghasilkan tingkat fluoresensi R123 lebih dari dua kali lipat dibandingkan dengan sel yang tidak distimulasi. Selain itu, sel yang diobati dengan HRP @ HSN memiliki tingkat fluoresensi tertinggi, diikuti oleh HSN dan kemudian sel saja. Tercatat bahwa mengobati makrofag RAW264.7 yang distimulasi dengan HSN menghasilkan sedikit peningkatan intensitas fluoresensi dibandingkan dengan kontrol. Hasil ini menunjukkan bahwa respon stres seluler dipicu sangat cepat, dan sensitif terhadap rangsangan eksternal, termasuk paparan nanopartikel [37]. Selain itu, baik PMA (0,1, 0,25, 0,5, 1, dan 2 μg/mL) dan HRP@HSNs (50, 100, dan 200 μg/mL) menginduksi ekspresi R123 dengan cara yang bergantung pada dosis, seperti terlihat pada Gambar . 3b, c.
Sesuai dengan analisis aliran cytometric, Gbr. 3d menampilkan gambar fluoresensi representatif dari makrofag RAW264.7 yang distimulasi dengan dan tanpa PMA dengan adanya dan tidak adanya nanopartikel. Sistem ini mampu memvisualisasikan H2 end endogen O2 generasi dalam sel RAW264.7, dan intensitas fluoresensi terlemah diamati pada sel yang diobati dengan HRP @ HSN diikuti oleh stimulasi PMA. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4a, viabilitas sel makrofag RAW264.7 dengan adanya stimulan PMA atau H2 eksogen O2 diperiksa dengan tes WST-1. Sedangkan ROS telah terlibat dalam apoptosis [38], hanya sedikit efek pada viabilitas sel yang ditemukan pada titik waktu yang ditunjukkan, membuat analisis semi-kuantitatif berikut praktis dan bermakna.
a Uji WST-1 dari makrofag RAW 264,7 setelah perawatan H2 ex eksogen O2 atau stimulasi dengan phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA) selama 1 jam. b Deteksi konsentrasi H2 O2 diproduksi secara endogen oleh makrofag RAW264.7 di bawah berbagai konsentrasi stimulan PMA dengan adanya lobak peroksidase-enkapsulasi berongga silika nanospheres (HRP@HSNs) dan dihydrorhodamine 123 (DHR123). Inset:a calibration curve obtained from the external standards of H2 O2 mixed with HRP@HSNs and DHR123
Application of HRP@HSNs In Vitro for Quantitative Analysis of H2 O2
To evaluate the capacity of HRP@HSNs for quantifying endogenous hydrogen peroxide produced in PMA-stimulated RAW264.7 cells, a calibration curve from the exogenous H2 O2 experiment, with a detection range of 0.625~15 μM, was established by microplate measurements (Fig. 4b, inset). The standard calibration curve appears to be linear as expected. Then, RAW264.7 cells were treated with 100 μg/mL of HRP@HSNs for 2 h, followed by co-incubation with various concentrations of PMA and 20 μM of DHR123 at 37 °C for 1 h. After that, the concentration of H2 O2 endogenously produced by PMA-stimulated RAW264.7 cells was determined by measuring the fluorescence intensity, followed by conversion using the established calibration curve. Notably, because most of the HRP@HSNs were uptaken within the cells, the H2 O2 -triggered fluorescence of R123 could be attributed to intracellular enzyme-catalyzed reactions rather than the extracellular contribution. Although H2 O2 is able to diffuse across biomembranes, due to its limited diffusion and rapid enzymatic consumption inside cells, concentration gradients of H2 O2 are formed across membranes [39, 40]. Typically, under normal physiological conditions, H2 O2 has an extracellular concentration estimated at 10
− 7
~10
− 6
M, which is about 10-fold higher than that observed in intracellular fluid [1, 41, 42]. In pathological conditions, extracellular concentrations of H2 O2 are in the range of 10~50 μM and are additionally elevated to as high as 10
− 4
M in apoptosis [1]. As shown in Fig. 4b and Additional file 1:Table S2, endogenous hydrogen peroxide caused by PMA-stimulated RAW264.7 cells was created in a dose-dependent manner and produced at levels of about 10 μM when the concentration of PMA used exceeded 0.25 μg/mL. Taken together, these results indicate that HRP@HSNs were capable of detecting semi-quantitatively endogenous the concentration of hydrogen peroxide of RAW264.7 macrophages under oxidative stress conditions.
Kesimpulan
In summary, we have demonstrated that hollow silica nanospheres encapsulating HRP can be synthesized via a microemulsion-templating system and act as intracellular fluorescent ROS sensors. The shells of HRP@HSNs are permeable to small molecules, such as the enzyme substrates, which allows them to react with large enzyme payloads in the hollow cavity. Both the effective intracellular delivery and satisfactory catalytic activity of HRP@HSNs significantly enhance reduction-triggered fluorescence and constitute the ability of semi-quantitative measurements of endogenous H2 O2 in RAW264.7 macrophages under oxidative stress conditions.
Because the concentration and location of H2 O2 in eukaryotic cells strongly rely on the types of cells, and cellular compartments [1], specific targeting of tumor cells or organelles could further be achieved by surface modification of HRP@HSNs with monoclonal antibodies or peptides. Also, non-enzymatic H2 O2 detection could be realized by replacing the interior nanoreactors of HRP with nanoparticles [43, 44] or boronate-based fluorescent probes [42, 45]. Future efforts should be devoted to maximizing the sensitivity and specificity for H2 O2 as well as enabling more informative designs of next-generation nanomaterials. Such hollow capsules could be a promising platform for modern nanomedicines that aims to simultaneously image, sensing, and deliver therapeutic molecules specifically to defective cells.
