Pembentukan spesies oksigen reaktif dalam larutan berair yang mengandung nanopartikel GdVO4:Eu3+ dan kompleksnya dengan metilen biru

Abstrak

Dengan surat ini, kami melaporkan studi tentang radikal bebas dan generasi spesies oksigen reaktif (ROS) dalam larutan air yang mengandung gadolinium orthovanadate GdVO₄ :Eu³⁺ nanopartikel (VNPs) dan kompleksnya dengan fotosensitizer metilen biru (MB). Aktivitas katalitik dipelajari di bawah iradiasi UV-Vis dan sinar-X dengan tiga metode (uji diena terkonjugasi, radikal OH·, dan deteksi oksigen tunggal). Telah ditunjukkan bahwa kompleks VNPs-MB mengungkapkan efisiensi tinggi generasi ROS di bawah iradiasi UV-Vis terkait dengan efisiensi tinggi generasi OH· radikal oleh VNP dan generasi oksigen singlet oleh MB karena transfer energi eksitasi nonradiatif dari VNP ke molekul MB . Berlawanan dengan di bawah iradiasi sinar-X, OH yang kuat^. pemulungan radikal oleh VNP telah diamati.

Latar Belakang

Terapi radiasi (RT) tetap merupakan komponen penting dari pengobatan kanker dengan sekitar 50% dari semua pasien kanker menerima RT selama perjalanan penyakit mereka [1,2,3]. Mekanisme pasti kematian sel akibat radiasi masih merupakan bidang penyelidikan aktif. Pemutusan untai ganda DNA nuklir dianggap sebagai efek seluler terpenting dari radiasi yang menyebabkan hilangnya integritas reproduksi sel yang ireversibel dan akhirnya kematian sel [4]. Kerusakan radiasi tersebut dapat disebabkan oleh (i) ionisasi langsung dan (ii) ionisasi tidak langsung melalui radikal bebas dan spesies oksigen reaktif (ROS), spesies kimia reaktif yang mengandung oksigen, terbentuk dari radiolisis air seluler dan molekul oksigen [2,3, 4]. Dalam terapi klinis, kerusakan umumnya pengion tidak langsung. Dalam prosesnya, air kehilangan elektron dan menjadi sangat reaktif. Kemudian, melalui reaksi berantai tiga langkah, air secara berurutan diubah menjadi sejumlah radikal dan produk molekuler:elektron terhidrasi ($ {e}_{aq}^{-}\Big) $, atom hidrogen( H ^∙ ), radikal hidroksil OH·, radikal hidroperoksil ($ {HO}_2^{.}\Big) $, hidrogen peroksida (H₂ O₂ ), dan molekul hidrogen (H₂ ) [5, 6]. Elektron terhidrasi dan atom hidrogen adalah agen pereduksi kuat. Sebaliknya, radikal hidroksil adalah spesies oksidatif yang sangat kuat dan segera menghilangkan elektron dari molekul mana pun yang dilaluinya, mengubah molekul itu menjadi radikal bebas dan dengan demikian menyebarkan reaksi berantai [5]. Ketika oksigen molekul terlarut disajikan dalam air yang diiradiasi, reduksinya menghasilkan radikal superoksida ($ {O}_2^{.-} $) dan merupakan prekursor sebagian besar ROS lainnya termasuk oksigen singlet (¹ O₂ ) [7].

Baru-baru ini, telah ditunjukkan bahwa nanopartikel (NPs) dengan nomor atom tinggi (Au, Ag, Hf, Gd, Ti) [8,9,10,11], semikonduktor NP (oksida logam TiO₂ ZnO, CuO, CeO₂ , Al₂ O₃; titik kuantum ZnS, ZnS, LaF₃ , dll.) [8, 12,13,14], dan beberapa NP anorganik (karbon nanotube) [15, 16] meningkatkan efisiensi RT. Prinsip-prinsip teoritis interaksi sinar-X-NP dijelaskan dengan baik [8, 12, 14]. Interaksi kaskade foton energi tinggi dengan kisi NP terjadi melalui efek fotolistrik dan efek hamburan Compton terutama. Compton, Foto-, atau Auger-elektron dapat menginduksi emisi elektron sekunder, yang dapat lepas ke lingkungan dan akan ditangkap oleh akseptor (yaitu, air, biomolekul, oksigen, nitrogen oksida) yang terlokalisasi di dekat permukaan NP dan menginduksi radikal biomolekuler dan produksi ROS [8, 12, 14]. Efek radiosensitisasi NP dikaitkan dengan radikal biomolekuler dan generasi ROS sebagai tahap akhir interaksi sinar-X dengan NP. Dalam NP semikonduktor, seperti NP oksida logam, efek sitotoksik yang terkait dengan generasi ROS dapat juga diinduksi oleh iradiasi UV [17,18,19,20]. Mekanismenya adalah ketika NP disinari dengan sinar UV (energi lebih besar dari celah pita), pemisahan muatan diinduksi menghasilkan lubang (h⁺ ) pada pita valensi dan elektron (e⁻ ) dalam pita konduktor. Elektron dan hole masing-masing menunjukkan kemampuan mereduksi dan mengoksidasi yang tinggi [18]. Elektron dapat bereaksi dengan molekul oksigen untuk menghasilkan radikal superoksida ($ {O}_2^{\cdotp -} $) melalui proses reduktif, sedangkan hole dapat mengabstraksi elektron dari air dan/atau ion hidroksil menghasilkan radikal hidroksil (OH ·) melalui proses oksidatif [18,19,20]. Untuk TiO₂ , CeO₂ , Al₂ O₃ , dan partikel nano ZnO, ¹ O₂ generasi melalui oksidasi $ {O}_2^{\cdotp -} $ dilaporkan [18, 21, 22].

Satu lagi pendekatan untuk meningkatkan efisiensi terapi kanker (terapi fotodinamik, PDT) menggunakan NP gemilang diusulkan oleh Chen dan Zhang [23]. Pendekatan ini menggabungkan NP tereksitasi sinar-X (bersinar) dan molekul fotosensitizer (PS). NP yang gemilang berfungsi sebagai transduser energi yang mentransfer energi yang diperoleh dari penyinaran sinar-X ke PS yang menghasilkan oksigen tunggal untuk penghancuran tumor. Pendekatan ini memungkinkan pengobatan kanker dalam dan meningkatkan PDT dan RT. Hingga saat ini, berbagai NP kilau dan kompleksnya dengan PS telah dipelajari sebagai agen fotodinamik yang diinduksi sinar-X [12, 14, 23,24,25,26,27,28].

Baru-baru ini, kami telah melaporkan pembuatan kompleks berdasarkan NP gadolinium orthovanadate yang cemerlang yang didoping dengan ion europium GdVO₄ :Eu³⁺ (VNPs) dan methylene blue (MB) photosensitizer dan studi transfer energi eksitasi elektronik di kompleks [29]. Ditunjukkan bahwa karena konversi energi eksitasi yang efektif dalam kompleks, mereka dapat menjadi prospektif sebagai agen fotodinamik yang dapat diinduksi sinar-X. Tujuan dari makalah ini adalah untuk mempelajari efisiensi pembentukan ROS dalam larutan air yang mengandung VNPs dan kompleksnya dengan MB di bawah iradiasi UV dan sinar-X.

Eksperimental

Bahan kimia

Gadolinium klorida GdCl₃ ·6H₂ O (99,9%), europium klorida EuCl₃ ·6H₂ O (99,9%), dinatrium EDTA·2Na (99,8%), dan natrium anhidrat metavanadat NaVO₃ (96%) diperoleh dari Acros organic (USA) dan semuanya digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut. Natrium hidroksida NaOH (99%) dibeli dari Macrohim (Ukraina). Natrium orthovanadat Na₃ VO₄ larutan diperoleh dengan menambahkan larutan NaOH 1 M dalam larutan encer NaVO₃ hingga pH = 13. L-a-phosphatidylcholine (PC) dari kuning telur, pewarna kationik 3,7-bis(dimethylamino)phenazathionium chloride (methylene blue (MB), M_w = 373,90 g/mol), 1,2-Benzopyrone (Coumarin, M_w = 146,14 g/mol) dibeli dari Sigma-Aldrich (AS) dan digunakan saat diterima. Garam dinatrium asam antrasena-9,10-dipropionat (ADPA, M_w = 366.32 g/mol) diperoleh dari koleksi pewarna Dr. Igor Borovoy (Institute for Scintillation Materials, NAS of Ukraina) dengan kemurnian yang dikendalikan oleh kromatografi lapis tipis. Semua bahan kimia lainnya memiliki tingkat analitis.

Sintesis GdVO₄ :Eu³⁺ larutan koloid

Larutan koloid berair dari nanopartikel gadolinium orthovanadate yang didoping dengan ion europium Gd_0,9 Eu_0,1 VO₄ (GdVO₄ :Eu³⁺ ) disintesis menurut metode yang dilaporkan sebelumnya [30]. Pertama, 0,4 mL larutan berair gadolinium klorida (1 M) dicampur dengan 0,05 mL europium klorida (1 M) kemudian 49,55 mL air suling ganda ditambahkan ke dalam campuran. Kemudian, larutan yang diperoleh dicampur dengan 37,5 mL larutan dinatrium EDTA (0,01 M). Kemudian, 37,5 mL Na₃ VO₄ (0,01 M) dialirkan setetes demi setetes (рН = 10,5). Campuran diaduk secara intensif dengan menggunakan magnetic stirrer dan dipanaskan di atas penangas air di bawah refluks kondensor selama 24 jam pada 100 °С. Diperoleh larutan transparan tidak berwarna menyebarkan cahaya di bawah penerangan samping (kerucut Tyndall). Kemudian, larutan didinginkan dan didialisis dengan air selama 24 jam untuk menghilangkan kelebihan ion. Untuk tujuan ini, larutan yang diperoleh dimurnikan dalam kantung dialisis (Cellu Sep T2, membran dengan berat molekul cut-off 12 KDa, ukuran pori ~ 2,5 nm) dan ditempatkan dalam gelas 2 L dengan air suling. Setelah setiap 6 jam, air disegarkan.

Instrumentasi dan karakterisasi

VNP yang disintesis dikarakterisasi menggunakan mikroskop elektron transmisi (mikroskop elektron TEM-125 K, Selmi, Ukraina) dan metode hamburan cahaya dinamis (penganalisis ZetaPALS, Brookhaven Instruments Corp., USA). Spektrum serapan diukur menggunakan spektrometer Specord 200 (Analytic Jena, USA). Fluoresensi dan spektrum eksitasi fluoresensi diambil dengan spektrofluorimeter Lumina (Thermo Scientific, USA).

Persiapan kompleks VNP–MB

Solusi untuk investigasi disiapkan sebagai berikut. Pertama, larutan stok MB dalam air (1 mmol/L) disiapkan. Untuk mendapatkan larutan berair VNPs–MB, sejumlah larutan stok pewarna dan larutan berair VNP yang diperlukan ditambahkan ke dalam labu dan diaduk dengan hati-hati menggunakan rotavapor (Rotavapor R-3, Buchi) selama 1 jam hingga kloroform menguap sempurna. Kemudian, 1 mL larutan berair VNP ditambahkan ke dalam labu dan dikocok perlahan selama 1 jam untuk pembentukan kompleks VNP-MB. Konsentrasi MB dalam larutan yang diperoleh adalah 10 mol/L. Konsentrasi nanopartikel adalah 0,1, 1, atau 10 mg/mL.

Deteksi spesies radikal bebas dan oksigen aktif

Pembentukan ROS di bawah iradiasi UV/X-ray larutan berair yang mengandung kompleks VNPs, MB, atau VNPs-MB dideteksi secara spektroskopi menggunakan beberapa metode.

Uji pembentukan diena terkonjugasi

Oksidasi lipid di bawah iradiasi UV diukur menggunakan suspensi liposom PC. Vesikel lipid PC Unilamellar dibuat dengan metode ekstrusi [31]. Secara singkat, jumlah PC yang sesuai (25 mg/ml) dalam kloroform ditempatkan dalam labu dan dikeringkan sampai penguapan kloroform lengkap menggunakan rotavapor (Rotavapor R-3, Buchi). Film pewarna lipid tipis kemudian dihidrasi dengan 10,8 ml air suling ganda. Suspensi lipid yang diperoleh akhirnya diekstrusi melalui filter polikarbonat ukuran pori 100 nm menggunakan ekstruder mini (Avanti Polar Lipids, Inc., USA). Konsentrasi PC adalah 1,2 mmol/L. Untuk uji pembentukan diena terkonjugasi, 1 mL suspensi liposom PC dicampur dengan 1 mL larutan air VNPs (larutan air MB atau larutan air VNP–MB). Konsentrasi MB akhir adalah 10 μmol/L dan VNP, 1 g/L. Konsentrasi PC dalam larutan adalah 0,6 mmol/L. Larutan berair yang diperoleh ditempatkan dalam kuvet kuarsa (10 × 10 mm) dan diiradiasi dengan lampu merkuri 250 W (band pass l = 310–400 nm, fluks cahaya 43 W/cm² ) selama 30 mnt. Kemudian, absorbansi suspensi dicatat pada 234 nm (maksimum diena terkonjugasi) menggunakan spektrofotometer Specord 200 (Analytik Jena, Jerman). Konsentrasi diena terkonjugasi yang terbentuk dalam air tanpa aditif apa pun (kompleks NP, MB, atau VNPs-MB) diambil sebagai kontrol. Setiap titik percobaan adalah nilai rata-rata dari setidaknya tiga tes independen. Pemrosesan statistik dilakukan dengan menggunakan paket perangkat lunak Statistika v. 5.0 (StatSoft, USA).

OH· deteksi radikal

Untuk mendeteksi pembentukan radikal hidroksil dalam larutan di bawah iradiasi UV, kumarin digunakan sebagai molekul probe. Kumarin bereaksi dengan OH· radikal menghasilkan 7-hidroksikumarin yang sangat berfluoresensi [32, 33]. Prosedur percobaan adalah sebagai berikut. Larutan berair kumarin (0,1 mmol/L) dicampur dengan MB (10 μmol/L), VNP (0,1, 1 atau 10 g/L), atau larutan berair VNP–MB. Larutan berair yang diperoleh ditempatkan dalam kuvet kuarsa (10 × 10 mm) dan disinari dengan laser He-Cd λ _kecuali = 325 nm selama 1 jam. Dalam kasus penyinaran sinar-X, kuvet disinari dari atas (dari bagian terbuka) dengan sinar-X menggunakan peralatan ISOVOLT 160 Titan E dengan katoda tungsten selama 30 menit. Tegangan pada tabung adalah 30 kV (20 mA). Jarak dari tabung sinar-X ke sampel yang diiradiasi adalah 25 cm. Spektrum fluoresensi (tereksitasi pada 325 nm) larutan direkam dengan spektrofluorimeter Lumina (Thermo Scientific, USA). Intensitas relatif fluoresensi 7-hidroksikumarin dianalisis.

Deteksi oksigen tunggal

¹ O₂ produksi dalam larutan yang mengandung kompleks VNPs, MB, atau VNPs-MB dianalisis pada evaluasi spektrum fluoresensi ADPA [34, 35]. Pengukuran dilakukan dalam kuarsa kuvet (10 × 10 mm). Larutan berair ADPA (10 μmol/L) dicampur dengan larutan berair MB (10 μmol/L), NP (1 g/L), atau VNP–MB dalam kuvet. Solusinya diiradiasi pada 457 nm menggunakan High Stability Blue Solid State Laser MBL-457, 50 mW (Changchun New Industries Optoelectronics Tech. Co., Ltd.). Emisi fluoresensi ADPA yang tereksitasi pada 378 nm dikumpulkan pada skala waktu yang berbeda (0, 10, 20, 30, 40, dan 60 menit) menggunakan spektrofluorimeter Lumina (Thermo Scientific, USA).

Hasil dan diskusi

Karakteristik VNP yang disintesis

Gambar 1 a dan File tambahan 1:Gambar S1 menunjukkan gambar TEM dari VNP yang disintesis dengan histogram distribusi samping dan pola XRD, yang mendukung GdVO₄ :Eu³⁺ struktur kristal NP. GdVO yang disintesis₄ :Eu³⁺ NP berbentuk seperti gelendong dengan ukuran 8 × 25 nm ± 5 nm dan struktur fase tetragonal jenis zirkon. Muatan negatif pada permukaan NP (potensial adalah 18,75 ± 0,15 mV, pH = 7.8) disebabkan oleh gugus karboksilat dari penstabil dinatrium EDTA yang digunakan selama sintesis. Diameter hidrodinamik kelebihan GdVO₄ :Eu³⁺ nanopartikel adalah 44,0 ± 0,3 nm. Spektrum penyerapan GdVO₄ :Eu³⁺ NP mewakili pita lebar intens dalam rentang spektral 250–350 nm yang sesuai dengan transfer muatan dari ligan oksigen ke atom vanadium dalam kelompok $ {VO}_4^{3-} $ (Gbr. 1b) [36 ]. Doping GdVO₄ NP dengan Eu³⁺ ion memberikan fluoresensi yang kuat untuk VNPs dalam kisaran spektral merah, yang diatur oleh transisi dalam konfigurasi f-elektron ion europium [37] (tidak akan dibahas dalam makalah ini).

Gambar TEM (a ), spektrum serapan (b ), dan ketergantungan energi (αhv )² (c ) dari GdVO₄ :Eu³⁺ nanopartikel

Diketahui bahwa ukuran NP mempengaruhi celah energi optik pada bahan semikonduktor. Energi celah pita, E _g , dapat diperkirakan dari panjang gelombang tepi serapan transisi antar pita menurut hubungan Tauc [38]:

$$ {\left(a\mathrm{hv}\right)}^{\left(1/n\right)}=A\cdot \left(\mathrm{hv}-{E}_g\right), $ $ (1)

di mana a adalah koefisien absorpsi, hv adalah energi foton yang datang, A adalah konstanta bebas energi (parameter tailing pita), dan n adalah konstanta (faktor daya dari mode transisi), yang bergantung pada sifat material (kristal atau amorf). Nilai n menunjukkan sifat transisi, n = 1/2 untuk transisi langsung yang diizinkan, n = 3/2 untuk transisi terlarang langsung, n = 2 untuk transisi tidak langsung yang diizinkan, dan n = 3 untuk transisi terlarang tidak langsung [39]. GdVO₄ adalah semikonduktor celah langsung, yang n = 1/2 [40] Jadi, Persamaan. (1) dapat ditulis ulang sebagai:

$$ {\left(\alpha \mathrm{hv}\right)}^2=A\cdot \left(\mathrm{hv}-{E}_g\right) $$ (2)

Koefisien penyerapan (a ) dihitung dari absorbansi sebagai a = 2.303S /l , di mana D adalah absorbansi dan l adalah panjang jalur optik.

Gambar 1c mewakili ketergantungan energi dari (a hv)² untuk GdVO₄ . yang disintesis :Eu³⁺ nanopartikel. Nilai celah pita E _g ditentukan oleh ekstrapolasi bagian linier dari (a hv)² kurva versus energi foton hv ke nol. Nilai yang diperoleh E _g = 4.13 eV lebih tinggi dari yang dilaporkan untuk GdVO₄ :Eu³⁺ bubuk dengan ukuran kristal mulai dari 14,4 hingga 43 nm (3,56–3,72 eV) [41, 42]. Kami menduga mungkin karena perbedaan dalam metode sintesis yang digunakan dalam kasus kami memberikan NP yang lebih kecil dengan pita serapan yang sempit dan bergeser biru dibandingkan dengan yang diperoleh dengan metode hidrotermal atau Pechini.

Pembentukan radikal bebas yang diinduksi foto (uji diena terkonjugasi)

Secara umum diterima bahwa jenis pohon ROS ($ \mathrm{OH}\cdotp, {\mathrm{O}}_2^{\cdotp -} $, dan ¹ O₂ ) menghasilkan dalam sistem NP di bawah iradiasi UV berkontribusi terhadap stres oksidatif utama dalam sistem biologis [43, 44]. Meskipun aktivitas fotokatalitik NP oksida logam seperti TiO₂ , ZnO, CuO, CeO₂ , Al₂ O₃ , dan Fe₂ O₃ dijelaskan dengan baik [17,18,19,20], sedikit penelitian telah mempelajari aktivitas fotokatalitik ReVO₄ NP [45,46,47,48]. Ditunjukkan bahwa ReVO₄ NP efektif dalam penghancuran fotokatalitik polutan organik. Namun, belum ada penelitian yang mempelajari jenis ROS yang dihasilkan oleh ReVO₄ NP di bawah iradiasi UV.

Untuk meniru lingkungan biologis, kami menggunakan suspensi liposom PC dan mendeteksi pembentukan radikal bebas di bawah iradiasi UV dalam suspensi yang mengandung kompleks MB, VNPs, atau VNPs-MB pada oksidasi lipid (uji pembentukan diena terkonjugasi) [49,50,51]. Oksidasi lipid oleh oksigen molekuler melalui reaksi berantai radikal dapat dimulai dengan radiasi pengion ketika ROS dan radikal bebas muncul dalam sistem [43, 44]. Reaksi berantai radikal yang melibatkan asam lemak tak jenuh ganda menyebabkan penataan ulang ikatan rangkap yang mengarah ke diena terkonjugasi. Diena terkonjugasi yang dihasilkan menunjukkan pita serapan pada 234 nm yang dapat dideteksi secara fotometrik. Gambar 2 menunjukkan konsentrasi relatif diena terkonjugasi yang terbentuk dalam suspensi lipid yang mengandung kompleks MB, VNP, atau VNP–MB. Dapat dilihat bahwa dalam semua larutan, konsentrasi diena terkonjugasi meningkat dibandingkan dengan suspensi liposom PC murni. Namun, efisiensi proses ini berbeda. Metilen biru adalah salah satu molekul fotosensitizer konvensional dengan serapan utama maksimal λ _maks = 665 nm dan pita serapan yang kurang intens dalam rentang spektral UV (File tambahan 1:Gambar S2). Di bawah iradiasi UV MB, dua proses fotokimia utama dapat terjadi [34, 52]. MB yang dieksitasi oleh sinar UV mengalami proses persilangan antarsistem (Q _p =0,54 [53]) ke status triplet berumur panjang (³ MB^* ) dan bereaksi dengan molekul oksigen (³ O₂ ) membentuk oksigen singlet (¹ O₂ ):

$$ {\mathrm{MB}}^{+}+ hv\to {}^3{\mathrm{MB}}^{+^{\ast }} $$ (3) $$ {}^3{\ mathrm{MB}}^{+^{\ast }}+{}^3{\mathrm{O}}_2\to {\mathrm{MB}}^{+}+{}^1{\mathrm{O }}_2 $$ (4)

Efisiensi relatif pembentukan diena terkonjugasi dalam suspensi lipid:1 - tanpa aditif; 2 - dengan MB; 3 - dengan VNP; 4 - dengan kompleks VNPs-MB

Proses fotokimia kedua dapat terjadi pada konsentrasi MB yang tinggi. Molekul MB keadaan dasar dapat bekerja sebagai agen pereduksi yang menyumbangkan elektron ke triplet MB dan membentuk radikal semi-reduksi (MB·) dan radikal semi-reduksi, masing-masing (MB^{· 2+} ) [52]:

$$ {}^3{\mathrm{MB}}^{+^{\ast }}+{\mathrm{MB}}^{+}\to \mathrm{MB}\cdotp +{\mathrm{MB} }^{\cdotp 2+} $$ (5)

Oksidasi MB· oleh oksigen molekuler yang mengembalikan pewarna keadaan dasar dan menghasilkan produksi radikal superoksida ($ {O}_2^{\cdotp -} $):

$$ \mathrm{MB}\cdotp +^3{\mathrm{O}}_2\kern0.5em \to {\mathrm{MB}}^{+}+{O}_2^{\cdotp -} $$ (6)

Oksigen singlet dan radikal superoksida, serta radikal MB yang terbentuk pada Reaksi (4)–(6) dapat mempengaruhi proses oksidasi lipid. Dalam larutan encer di mana tidak ada pembentukan dimer MB yang diamati ([MB] < 20 μM), Reaksi (3) dan (4) akan mendominasi [52]. Namun, dalam kompleks VNPs-MB karena peningkatan konsentrasi MB dalam permukaan VNPs [29], proses fotokimia kedua dapat terjadi. Jadi, peningkatan pembentukan diena terkonjugasi dalam suspensi lipid yang mengandung MB dapat dijelaskan oleh aksi MB sebagai ¹ O₂ photogenerator di bawah iradiasi UV. Perlu dicatat bahwa efisiensi proses ini jauh lebih kecil daripada di bawah eksitasi MB dalam panjang gelombang panjang penyerapan maksimum.

Dalam penangguhan yang mengandung GdVO₄ :Eu³⁺ nanopartikel, oksidasi lipid lebih efektif. Efek ini dapat dianggap berasal dari perilaku fotokatalitik VNP di bawah iradiasi UV. Elektron pita penghantar (e⁻ ) dan lubang pita valensi (h⁺ ) terbentuk di bawah iradiasi UV (E> E _g ) dapat berinteraksi dengan molekul oksigen dan molekul air yang teradsorpsi pada permukaan NP dengan reaksi berikut [18, 20, 47]:

$$ {}^3{\mathrm{O}}_2+{e}^{-}\to \kern0.5em {\mathrm{O}}_2^{.-} $$ (7) $$ {\mathrm {H}}_2\mathrm{O}+{\mathrm{h}}^{+}\to \mathrm{OH}\cdot $$ (8)

Ion hidroksil yang terbentuk selama fotolisis air dan teradsorpsi pada permukaan NP juga dapat berinteraksi dengan lubang untuk menghasilkan radikal hidroksil:

$$ {\mathrm{OH}}^{-}+{\mathrm{h}}^{+}\to \mathrm{OH}\cdot $$ (9)

Selain itu, oksidasi $ {O}_2^{\cdotp -} $ menghasilkan oksigen tunggal [18, 21, 22]:

$$ {\mathrm{O}}_2^{\cdotp -}+{\mathrm{h}}^{+}{\to}^1{\mathrm{O}}_2 $$ (10)

Reaksinya dengan ion hidrogen mengarah pada pembentukan hidrogen peroksida:

$$ 2{\mathrm{O}}_2^{\cdotp -}+2{\mathrm{H}}^{+}\to {\mathrm{H}}_2{\mathrm{O}}_2 $$ (11)

sebagai hasil interaksinya dengan elektron radikal hidroksil dan ion hidroksil dapat terbentuk:

$$ {\mathrm{H}}_2{\mathrm{O}}_2+{\mathrm{e}}^{-}\to \mathrm{OH}\cdot +{\mathrm{O}\mathrm{H} }^{-} $$ (12)

Dengan demikian, peningkatan efisiensi konsentrasi diena terkonjugasi dalam suspensi yang mengandung VNP (Gbr. 2, kolom 3) dapat dianggap berasal dari produk yang dihasilkan melalui Reaksi (7)–(12) dan memfasilitasi oksidasi lipid.

Dalam suspensi lipid yang mengandung kompleks VNPs–MB, konsentrasi diena terkonjugasi tertinggi dapat dijelaskan oleh produk yang dihasilkan baik melalui Reaksi (3)–(6) dan Reaksi (7)–(12) (Gbr. 2, kolom 4). Selain itu, dalam kompleks VNPs-MB dalam Reaksi (3) dan (4), generasi oksigen singlet dapat terjadi baik karena eksitasi MB langsung dan melalui transfer energi eksitasi nonradiatif dari VNPs ke MB yang lebih efektif dalam komposisi ini [29].

Deteksi radikal hidroksil

Langkah selanjutnya adalah memeriksa lebih tepat efisiensi OH· dan ¹ O₂ generasi dalam solusi di bawah iradiasi UV/X-ray. Coumarin digunakan sebagai molekul probe untuk memvalidasi penampilan radikal hidroksil dalam larutan yang sedang dipertimbangkan. Diketahui bahwa radikal OH· merupakan salah satu produk utama fotolisis/radiolisis air di bawah penyinaran sinar UV/X [5, 6]. Dalam larutan air, radikal OH· berinteraksi dengan molekul kumarin untuk membentuk produk 7-hidroksikumarin yang sangat berfluoresensi (lihat skema pada Gambar. 3) yang dapat dideteksi secara spektroskopi dengan munculnya pita baru (λ _maks ~ 460 nm) bergeser ke arah wilayah spektral panjang gelombang panjang sehubungan dengan pita fluoresensi kumarin (λ _maks ~ 400 nm), Gbr. 3 [32, 33]. Semakin tinggi konsentrasi radikal OH· dalam larutan, semakin efektif oksidasi kumarin dan, akibatnya, semakin kuat pita panjang gelombangnya. Dengan demikian, analisis intensitas relatif dari pita panjang gelombang panjang dapat memberikan informasi tentang konsentrasi radikal OH· dalam larutan di bawah pengaruh berbagai faktor.

Reaksi kumarin dengan radikal hidroksil membentuk fluoresen 7-hidroksikumarin. Spektrum fluoresensi normal dari larutan air kumarin, λ _kecuali = 325 nm

Spektrum emisi fluoresensi larutan air kumarin yang mengandung kompleks MB, VNPs, atau VNPs–MB yang diukur setelah 1 jam penyinaran UV disajikan pada Gambar 3. Ditunjukkan bahwa penyinaran UV larutan air kumarin tanpa aditif (kontrol) memicu pembentukan pita fluoresensi panjang gelombang baru yang menunjukkan pembentukan radikal OH· dan oksidasi kumarin (Gbr. 3). Dengan adanya molekul MB dalam larutan, intensitas relatif pita ini tidak berubah yang menunjukkan tidak ada efek tambahan MB pada pembentukan radikal OH· (Gbr. 3). Dalam larutan yang mengandung VNP, intensitas pita 7-hidroksikumarin sangat meningkat (Gbr. 3) karena aktivitas fotokatalitik VNP di bawah iradiasi UV, Reaksi (8), (9) dan (12). Perhatikan bahwa puncak tajam sekitar 535–540 nm termasuk dalam fluoresensi ion europium di GdVO₄ :Eu³⁺ nanopartikel (transisi intrakonfigurasi). Dalam larutan yang mengandung kompleks VNPs–MB, intensitas relatif pita 7-hidroksikumarin sekitar dua kali lebih kecil dibandingkan dengan larutan yang mengandung VNP yang menunjukkan produksi radikal OH· yang kurang efektif (Gbr. 3). Itu dapat dijelaskan oleh fakta bahwa adsorpsi pewarna MB dalam permukaan VNP dapat mencegah adsorpsi molekul air dan ion hidroksil dan, akibatnya, mengurangi aktivitas fotokatalitik VNP terkait pembentukan radikal OH melalui Reaksi (8) dan (9). Selain itu, dalam kompleks VNPs-MB, sebagian energi yang teradsorpsi ditransfer secara nonradiatif ke molekul MB [29] yang juga menurunkan efisiensi produksi pasangan elektron-lubang dan, akibatnya, kemampuan VNP untuk pembentukan radikal OH· dalam kompleks tersebut.

Hasil yang tidak terduga diamati di bawah iradiasi sinar-X dari larutan yang mengandung VNP (Gbr. 4). Berlawanan dengan kasus penyinaran UV, kami mengamati bahwa intensitas relatif pita 7-hidroksikumarin menurun dibandingkan dengan larutan kumarin air tanpa nanopartikel yang menunjukkan pemulungan radikal OH· yang terbentuk dalam larutan sebagai hasil radiolisis air. Efek yang diamati sangat tergantung pada konsentrasi VNP (Gbr. 4). Perlu dicatat bahwa diskusi utama mengenai kemampuan nanopartikel untuk berfungsi sebagai pemulung ROS difokuskan terutama pada CeO₂ nanocrystals (nanoceria) [54,55,56,57]. Fitur utama yang memaksa nanoceria untuk bertindak sebagai pemulung ROS umumnya dikaitkan dengan kandungan kekosongan oksigen yang tinggi dan Ce³⁺ ion dalam nanoceria dan peralihannya antara keadaan oksidasi 3+ dan 4+. Namun, ketergantungan kritis aktivitas biologis nanoceria pada ukuran dan mekanisme regenerasi diri masih dalam diskusi [54,55,56,57]. Kami juga mencatat bahwa efek perlindungan dari GdVO₄ :Eu³⁺ dan CeO₂ NP terhadap kerusakan akibat sinar-X diamati pada kelompok kami sebelumnya dalam eksperimen in vivo [57]. Sejauh pengetahuan kami, kemampuan GdVO₄ :Eu³⁺ nanopartikel untuk menyapu radikal OH· yang dihasilkan dalam larutan air di bawah iradiasi sinar-X telah diamati untuk pertama kalinya dan memerlukan penelitian lebih lanjut yang lebih mendalam.

Spektrum fluoresensi yang dinormalisasi dari larutan air kumarin yang mengandung konsentrasi VNP berbeda yang direkam setelah penyinaran sinar-X 30 menit

Pembuatan oksigen tunggal

Untuk mengevaluasi efisiensi kompleks VNP–MB dari ¹ O₂ generasi dalam air, kami menggunakan metode oksidasi ADPA berbasis oksigen singlet dengan pembentukan ADPAO endoperoksida non-fluoresen₂ (Gbr. 5). Jadi, dengan adanya oksigen singlet, fluoresensi ADPA padam secara ireversibel. Kami harus mencatat bahwa di bawah iradiasi UV, molekul ADPA mengalami photobleaching kuat yang mempersulit identifikasi MB, VNP, atau VNPs-kompleks dampak MB yang terkait dengan ¹ O₂ generasi. Untuk mengatasi kelemahan ini, kami menerapkan penyinaran laser pada 457 nm, yang cocok dengan salah satu puncak eksitasi Eu³⁺ ion yang didoping dalam GdVO₄ nanocrystals (File tambahan 1:Gambar S3). Gambar 5 menunjukkan bahwa molekul ADPA tidak mengalami reaksi fotokimia pada penyinaran cahaya 457 nm. Dalam larutan yang mengandung MB, sedikit penurunan intensitas ADPA dalam waktu dapat diamati (Gbr. 5) yang terkait dengan sedikit eksitasi MB pada panjang gelombang ini dan tindakan sebagai fotosensitizer menurut Reaksi (3) dan (4). Efek yang sama diamati untuk larutan yang mengandung VNP (Gbr. 5) dan dapat dianggap berasal dari pembentukan $ {O}_2^{\cdotp -} $ radikal pada permukaan VNP (Reaksi (7)) diikuti dengan oksidasi menurut Reaksi (10) dengan generasi oksigen singlet. Pendinginan fluoresensi ADPA yang lebih kuat diamati pada kompleks VNPs-MB. Efisiensi proses ini dua kali lebih tinggi daripada solusi dengan MB atau VNP. Efisiensi yang lebih tinggi dari generasi oksigen singlet dalam larutan yang mengandung kompleks VNPs–MB dikaitkan dengan transfer energi dari VNP ke MB dalam kompleks, di mana VNP berfungsi sebagai transduser energi untuk fotosensitizer MB.

Reaksi ADPA dengan oksigen singlet membentuk endoperoksida ADPAO₂ . Pemutihan foto ADPA setelah penyinaran dengan λ = 457 nm in water solutions

Unfortunately, due to ADPA sensor instability, we were not successful to measure the efficiency of the ¹ O₂ generation in water solution under X-ray excitation.

Conclusions

The efficiency of ROS generation in water solutions containing GdVO₄ :Eu³⁺ nanoparticles and their complexes with MB have been analyzed under UV-Vis and X-ray irradiation by three methods (conjugated dienes test, OH· radical, and singlet oxygen detection). Complexes VNPs–MB reveal high efficiency of ROS generation under UV-Vis irradiation associated with both high efficiency of OH· radicals generation by VNPs and ¹ O₂ generation by MB due to nonradiative excitation energy transfer from VNPs to MB molecules. For the first time, the strong OH· radicals scavenging by VNPs has been observed under X-ray irradiation. Our observation indicates that VNPs–MB complexes can be potentially used to activate photodynamic therapy.