Nanosphera Silika Berongga Terkapsulasi Peroksidase Lidah Kuda untuk Penginderaan ROS Intracelluler

Abstrak

Spesies reaktif oksigen (ROS) berperan penting dalam sinyalisasi sel, namun produksi berlebihan mengakibatkan kerusakan oksidatif. Oleh karena itu, kuantifikasi ROS secara presisi pada sel hidup sangat penting untuk biologi dasar dan diagnostik klinis. Sond fluorogenik tradisional yang dipasangkan dengan peroksidase lidah kuda (HRP) menderita permeabilitas membran yang buruk pada HRP. Di sinilah kami menghadirkan nanosphera silika berongga terkapsulasi peroksidase lidah kuda (HRP@HSNs) yang diproduksi melalui pendekatan sol-gel berbentuk mikroemulsi. Nanoreaktor ini mempertahankan aktivitas enzimatik yang kuat, dengan mudah melewati membran sel, dan menunjukkan kompatibilitas biologis yang baik. Penggabungan HRP@HSNs dengan sond dihidrorodamin 123 (DHR123) memungkinkan deteksi kualitatif dan semi-kuantitatif peroksida hidrogen (H₂O₂) intracellular dalam makrofag RAW 264.7 yang diaktifkan. Platform ini dapat dengan mudah difungsionalkan dengan ligan target, menawarkan kemampuan citra ROS spesifik organelle atau tipe sel.

Latar Belakang

ROS—termasuk anion superoxide, peroksida hidrogen, radikal hidroksil, oksigen tunggal, dan peroksinitrit—dihasilkan secara kontinu selama metabolisme aerobik, terutama dari rantai transportasi elektron mitokondria. Pertahanan antioksidan, baik enzimatik (misalnya, dismutase superoxide, katalase, peroksidase) maupun non-enzimatik (vitamin A, C, E, urat, bilirubin), biasanya menutralisir spesies ini. Ketidakseimbangan mengakibatkan stres oksidatif, merusak DNA, lipid, protein, dan berkontribusi pada penyakit seperti diabetes, kanker, kardiovaskular, dan gangguan neurodegeneratif (Alzheimer, Parkinson).

Perkembangan terbaru dalam mikroskopi fluorescensi telah memungkinkan citra ROS sel tunggal non-invasif, terutama melalui sond rasio atau berbasis intensitas yang menjadi fluoresen setelah oksidasi prekursor non-fluoresen. Spesifisitas sangat penting; misalnya, sond berbasis boranat menargetkan H₂O₂ melalui oksidasi bioortogonal. Namun, banyak sond tidak stabil in vivo, memiliki penetrasi jaringan yang buruk, dan dengan cepat dibuang melalui ginjal. Strategi seperti penstabil penambatan, sensor yang dikodekan genetik, pelapor bioluminesensial, atau tracer PET telah dieksplorasi. Formulasi nano meningkatkan citra ROS dengan meningkatkan spesifisitas dan sensitivitas.

Enzim dengan aktivitas katalitik tinggi adalah biosensor yang kuat, namun bentuk bebasnya kurang stabil dan tidak memiliki permeabilitas membran, yang membatasi penggunaan intracellular. Sensor HRP berbasis elektrode tidak cocok untuk citra sel hidup. Enkapsulasi HRP dalam cangkung nanopartikel dapat melindungi enzim dan memfasilitasi pengiriman intracellular, seperti yang ditunjukkan dengan nanosphera silika berongga (HSNs). Studi ini mengevaluasi HRP@HSNs untuk deteksi ROS intracellular, menilai pemuatan, aktivitas, penyerapan sel, sitotoksisitas, dan citra fungsional dalam makrofag.

Metode/Eksperimen

Kimia dan Reagen

Desana, n-heksanol (98 %), ammonium hidroksida (35 % w/w), TEOS (98 %), APTMS (95 %), FITC, dan reagen lainnya diperoleh dari ACROS dan Sigma-Aldrich. HRP (type VI-A), DHR123, PMA, dan H₂O₂ (35 %) dibeli dari Cayman dan SHOWA Chemical Industry. Semua reagen digunakan sebagaimana adanya.

Sintesis Nanosphera Silika Berongga (HSNs)

HSNs disiapkan dengan mikroemulsi minyak-dalam-air dengan pelucuran selektif, mengikuti protokol dari karya kami sebelumnya. Secara singkat, 20 mL desana, 1,63 mL CA-520, dan 550 µL n-heksanol diaduk pada 650 rpm, kemudian 350 µL air ditambahkan untuk membentuk mikroemulsi. APTMS (25 µL, 200 µL dalam 1,4 mL etanol) dan TEOS (100 µL) diperkenalkan, diikuti oleh 250 µL amonia 35 % pada 20 °C. Setelah 10 jam, etanol 95 % menstabilkan emulsi; nanopartikel silika padat (SSNs) dikoleksi melalui sentrifugasi (11.000 rpm, 20 menit). SSN dilucuri dalam air pada 40 °C selama 40 menit untuk menghasilkan cangkung berongga, kemudian dicuci dan disimpan dalam etanol 99,5 %.

Sintesis Nanosphera Silika Berongga Terkapsulasi Peroksidase Lidah Kuda (HRP@HSNs)

Prosedur mencerminkan sintesis HSN, mengganti 350 µL air dengan 350 µL HRP air (10 mg mL⁻¹). HRP@HSNs disimpan dalam air deionis pada 4 °C.

Sintesis FITC-HSNs dan HRP@FITC-HSNs

Untuk memperkenalkan fluoresensi hijau, FITC-APTMS (10 mg FITC, 200 µL APTMS dalam 1,4 mL etanol, 18 jam, gelap) menggantikan APTMS etanolik dalam sintesis, menghasilkan FITC-HSNs dan HRP@FITC-HSNs.

Efisiensi Tangkapan HRP dan Kemampuan Pemuatan

HRP dilabeli dengan RITC untuk menciptakan RITC-HRP, yang kemudian terkapsulasi untuk membentuk RITC-HRP@HSNs. Setelah melarutkan dalam NaOH 1 M, fluoresensi diukur (Hitachi F-4500, λ_ex = 543 nm, λ_em = 550–650 nm) dan dibandingkan dengan kalibrasi. Efisiensi tangkapan (%) = (massa RITC-HRP dalam nanosphera / RITC-HRP awal) × 100; kemampuan pemuatan (µg HRP mg⁻¹ HSNs) dihitung sesuai dengan itu.

Uji Aktivitas HRP

Aktivitas HRP diukur menggunakan substrat kromogenik TMB. Larutan enzim (HRP asli dan HRP@HSN) dicampur dengan TMB 20 µM dan H₂O₂ 20 µM dalam buffer fosfat/sitrat (pH 5,2). Absorbansi pada 655 nm direkam dengan pembaca BioTek Synergy; aktivitas diperoleh dari kalibrasi HRP asli.

Uji Reaktivitas dengan Berbagai ROS

DHR123 (20 µM) dengan atau tanpa HRP@HSNs (50 µg mL⁻¹) diinkubasi dengan 100 µM ROS (H₂O₂, TBHP, superoxide, •OH, •OtBu) dalam DMEM (pH 7,4). Fluoresensi (λ_ex = 488 nm, λ_em = 530 nm) diukur setiap 5 menit selama 120 menit.

Kultur Sel dan Uji Kehidupan

Makrofag RAW264.7 dikultur dalam DMEM + 10 % FBS + antibiotik pada 37 °C, 5 % CO₂. Untuk kehidupan, 2 × 10⁵ sel/well ditanam pada plate 24-lubang; setelah 24 jam, sel diekspose terhadap 0–200 µg mL⁻¹ nanopartikel dalam DMEM bebas serum selama 2 jam. Reagen WST-1 (Clontech) digunakan untuk menilai kehidupan (450 nm, referensi 650 nm) dengan pembaca Bio-Rad 680.

Analisis Penyerapan Sel

1 × 10⁶ sel RAW264.7/well diinkubasi dengan 0–200 µg mL⁻¹ nanopartikel berlabel FITC selama 2 jam. Setelah mencuci dan tripsinisasi, penyerapan dikuantifikasi melalui sitometrika aliran; natrium tripan mematikan fluoresensi selular eksternal.

Sitometrika Aliran Produksi ROS dalam Makrofag yang Dipercepat PMA

Setelah ekspos nanopartikel selama 2 jam dan pemuatan DHR123 selama 30 menit, sel dipercepat dengan 1 µg mL⁻¹ PMA selama 1 jam sebelum analisis pada FACS Canto II.

Analisis Kuantitatif

Plate 96-lubang ditanami dengan 3 × 10⁴ sel RAW264.7/well. Setelah perawatan nanopartikel selama 2 jam dan inkubasi PMA (bervariasi) + DHR123 (20 µM) selama 1 jam, fluoresensi (λ_ex = 488 nm, λ_em = 530 nm) diukur. Kurva kalibrasi (H₂O₂ + HRP@HSN) memungkinkan konversi fluoresensi menjadi konsentrasi H₂O₂.

Karakterisasi

TEM (JEOL JEM-1200 EX II, 100 kV) mengonfirmasi inti berongga 45 nm; pewaran asetat uranil memverifikasi HRP di dalam rongga. Pencaran cahaya dinamis (Malvern Zetasizer Nano ZS) menilai ukuran hidrodinamis dan potensial zeta; sel dicitrakan dengan Zeiss Axio Observer Z1.

Hasil dan Pembahasan

Desain dan Sintesis HSNs dan HRP@HSNs

HRP@HSNs dihasilkan melalui kimia sol-gel yang dikatalisis amonia dalam mikroemulsi w/o (Skim 1). TEM (Gambar 1) menunjukkan sphera monodisperse 45 nm; pewaran asetat uranil mengonfirmasi enkapsulasi HRP di dalam rongga berongga. DLS menunjukkan diameter hidrodinamis 188 ± 4 nm (HSNs) dan 184 ± 6 nm (HRP@HSNs) dalam air, yang meningkat menjadi 1,8–1,7 µm dalam DMEM bebas serum karena aglomerasi. Albumin serum sapi (BSA) mengurangi aglomerasi ini, menghasilkan partikel stabil 195–197 nm.

Efisiensi Tangkapan HRP dan Kemampuan Pemuatan

Enkapsulasi RITC-HRP menghasilkan sekitar 6 % efisiensi tangkapan pada pemuatan 11–33 nmol; kemampuan pemuatan tertinggi mencapai 12,5 ± 1,2 µg HRP mg⁻¹ HSN pada masukan 33,3 nmol. Meskipun efisiensi cukup rendah, ini menunjukkan bahwa HRP dapat dipertahankan dalam nanorongga, dan pemuatan dapat diatur oleh konsentrasi enzim.

Sitotoksisitas dan Penyerapan Sel

Uji WST-1 menunjukkan tidak ada penurunan signifikan dalam proliferasi RAW264.7 setelah ekspos 2 jam atau 26 jam terhadap hingga 200 µg mL⁻¹ HSNs atau HRP@HSNs, menunjukkan sitotoksisitas rendah. Partikel berlabel FITC mencapai efisiensi pelabelan >80 % pada >50 µg mL⁻¹ setelah 2 jam, mengonfirmasi pengiriman intracellular yang efisien tanpa mengorbankan kehidupan sel.

Reaktivitas HRP@HSNs terhadap Berbagai ROS

Uji aktivitas HRP menunjukkan sekitar 40 % retensi aktivitas asli setelah enkapsulasi, kemungkinan karena keterbatasan difusi melalui cangkung silika. Dalam uji bebas sel, DHR123 sendirian tidak merespons H₂O₂ atau superoxide tetapi bereaksi kuat dengan •OH dan •OtBu. HRP atau HRP@HSNs secara signifikan meningkatkan fluoresensi untuk semua ROS yang diuji, dengan sinyal yang lebih tinggi dari HRP asli yang berkorelasi dengan aktivitas yang lebih besar. Rasio fluoresensi relatif pada 60 menit menunjukkan bahwa kedua varian HRP meningkatkan deteksi H₂O₂ dan superoxide, mengonfirmasi bahwa nanorongga mempertahankan fungsi katalitik sambil mengizinkan difusi substrat.

Deteksi ROS Intracellular dengan HRP@HSNs

Sel RAW264.7 yang dirawat terlebih dahulu dengan HRP@HSNs (2 jam) dan dimuat dengan DHR123 (30 menit) menunjukkan fluoresensi yang jauh lebih tinggi setelah stimulasi PMA dibandingkan kontrol. Sitometrika aliran menunjukkan peningkatan >2 kali lipat fluoresensi R123 dalam sel yang dipercepat; HRP@HSNs menyediakan aktivitas katalitik tambahan, sedangkan HSN polos menghasilkan kenaikan fluoresensi yang ringan, mungkin mencerminkan respons stres seluler. Intensitas fluoresensi meningkat bergantung pada dosis baik terhadap PMA (0,1–2 µg mL⁻¹) dan HRP@HSNs (50–200 µg mL⁻¹). Citra konfokal representatif mengonfirmasi citra ROS intracellular yang ditingkatkan (Fig. 3d).

Aplikasi HRP@HSNs untuk Analisis Kuantitatif H₂O₂

Menggunakan kurva kalibrasi H₂O₂ eksternal (0,625–15 µM), H₂O₂ intracellular yang dihasilkan oleh sel RAW264.7 yang dipercepat PMA dikuantifikasi. Sel yang dirawat dengan 100 µg mL⁻¹ HRP@HSNs dan 20 µM DHR123, kemudian diekspose terhadap 0,1–2 µg mL⁻¹ PMA, menghasilkan konsentrasi H₂O₂ endogen sekitar 10 µM pada ≥0,25 µg mL⁻¹ PMA. Pengukuran semi-kuantitatif ini menunjukkan utilitas platform untuk menilai stres oksidatif dalam sel hidup.

Kesimpulan

Kami telah merancang nanosphera silika berongga yang terkapsulasi HRP aktif, menciptakan sensor ROS intracellular yang kuat. Cangkung silika berlubang memungkinkan substrat kecil mencapai enzim yang terkapsulasi sambil melindungi HRP dari proteolisis. Digabungkan dengan DHR123, HRP@HSNs memberikan deteksi semi-kuantitatif yang ditingkatkan dari H₂O₂ endogen dalam makrofag di bawah stres oksidatif. Fungsionalisasi permukaan dengan antibodi atau peptida akan memungkinkan targetisasi spesifik organelle atau sel tumor, dan muatan alternatif (misalnya, nanokatalis atau sond boranat) dapat memperluas repertoire sensing. Nanoreaktor ini mewakili platform serbaguna untuk citra, kuantifikasi, dan pengiriman terapi target yang bersamaan dalam penelitian biomedis dan diagnostik klinis.

Singkatan

APTMS

3-Aminopropiltrietoksisilana

BSA

Albumin Serum Sapi

DHR123

Dihidrorodamin 123

DLS

Pencaran Cahaya Dinamis

FITC

Fluoresien Isotiosinat

HRP

Peroksidase Lidah Kuda

HSNs

Nanosphera Silika Berongga

Igepal CA-520

Polioksietilena (5) Isooktilfenil Eter

mETC

Rantai Transportasi Elektron Mitokondria

PET

Tomografi Emisi Pozitron

PMA

Phorbol 12-Miristat 13-Asetat

R123

Rodamin 123

RITC

Rodamin B Isotiosinat

ROS

Spesies Reaktif Oksigen

SSN

Nanopartikel Silika Padat

TBHP

Hidroperoksida Tert-butil

TEM

Mikroskopi Elektron Transmisi

TEOS

Ortosilikat Tetraetil

TMB

3,3′,5,5′-Tetrametilbenzidin