Efek Fullerene C60 Terhadap Interaksi Difenil-N-(trikloroasetil)-amidofosfat dengan DNA In Silico dan Aktivitas Sitotoksiknya Terhadap Lini Sel Leukemia Manusia In Vitro
Abstrak
Perwakilan baru dari carbacylamidophosphates - diphenyl-N-(trichloroacetyl)-amidophosphate (HL), yang mengandung dua substituen fenoksi di dekat gugus fosforil, disintesis, diidentifikasi dengan analisis unsur dan spektroskopi IR dan NMR, dan diuji sebagai agen sitotoksik itu sendiri dan dalam kombinasi dengan C60 penuh.
Menurut hasil simulasi molekuler, C60 fullerene dan HL dapat berinteraksi dengan DNA dan membentuk kompleks kaku yang distabilkan dengan menumpuk interaksi gugus fenil HL dengan C60 fullerene dan nukleotida DNA G, serta interaksi HL CCl3 dikelompokkan berdasarkan ikatan ion-π dengan C60 molekul dan dengan ikatan elektrostatik dengan nukleotida DNA G.
Dengan menggunakan uji MTT, aktivitas sitotoksik HL terhadap sel CCRF-CM leukemia manusia dengan IC50 nilai yang terdeteksi pada konsentrasi 10 μM pada 72 jam perawatan sel ditampilkan. Di bawah tindakan gabungan 16 μM C60 fullerene dan HL, nilai IC50 terdeteksi pada konsentrasi HL 5 M yang lebih rendah dan pada periode inkubasi 48 jam sebelumnya, selain itu efek sitotoksik HL diamati pada konsentrasi rendah 2,5 M di mana HL dengan sendirinya tidak memiliki pengaruh pada viabilitas sel. Pengikatan C60 fullerene dan HL dengan alur DNA minor dengan pembentukan kompleks yang stabil dianggap sebagai salah satu kemungkinan alasan penghambatan sinergis mereka terhadap proliferasi sel CCRF-CЕM.
Penerapan C60 fullerene dalam kombinasi dengan 2,5 M HL terbukti tidak memiliki efek berbahaya pada stabilitas struktural membran eritrosit darah. Jadi, tindakan gabungan dari C60 fullerene dan HL dalam konsentrasi rendah mempotensiasi efek sitotoksik HL terhadap sel leukemia manusia dan tidak diikuti oleh efek hemolitik.
Latar Belakang
Perwakilan struktur nano karbon C60 Fullerene terbukti memiliki sifat fisikokimia dan aktivitas biologis yang unik tidak hanya sebagai antioksidan atau fotosensitisasi tetapi juga sebagai modifikator efek toksik obat antikanker karena kemampuannya menembus ke dalam sel dan berfungsi sebagai pembawa obat [1,2,3,4 ]. C60 molekul dapat berinteraksi dengan obat kemoterapi seperti doxorubicin, cisplatin, dan paclitaxel dan dapat membentuk kompleks dengan mereka meningkatkan efek terapeutik [5,6,7,8].
Carbacylamidophosphates (CAPh) adalah molekul organik yang telah menarik perhatian karena struktur khusus, aktivitas biologis, dan perspektif aplikasi biomedis [9,10,11,12]. Kehadiran kelompok peptida dan fosforamida yang digabungkan bersama dalam fragmen C(O)N(H)P(O) molekul menentukan interaksinya dengan molekul biologis dan membran sel. Variasi substituen di dekat gugus fosforil dan karbonil memberikan kemungkinan untuk memodulasi sifat stereokimia dan farmakologi CAPh. Secara khusus, perwakilan CAPh yang berbeda terbukti memiliki aktivitas antineoplastik [13, 14].
Baru-baru ini, kami telah mengkonfirmasi bahwa perwakilan CAPh dimetil-N-(benzoil)-amidofosfat yang digunakan dalam kisaran konsentrasi milimolar menurunkan viabilitas sel leukemia L1210 dan bahwa efek toksiknya difasilitasi oleh C60 fullerene [15]. Kami juga telah menunjukkan bahwa pengenalan substituen aromatik tambahan dan CCl elektronegatif3 kelompok ke dalam struktur CAPh mengakibatkan peningkatan toksisitasnya [16]. Dengan demikian, efek toksik yang signifikan dari dimorfolido-N-trikloroasetilfosforamida ditunjukkan terhadap sel-sel leukemia manusia dari asal yang berbeda, tetapi konsentrasi efektifnya masih tinggi dan tidak ada peningkatan toksisitas setelah tindakan kombinasi dengan C60 fullerene diamati. Sebagai kelanjutan dari penyelidikan ini, kami mensintesis perwakilan baru CAPh diphenyl-N-(trichloroacetyl)-amidophosphate (HL) yang memiliki dua substituen fenoksi, bukan gugus morfolido di dekat gugus fosforil (Gbr. 1).
Struktur difenil-N-(trikloroasetil)-amidofosfat (HL)
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memperkirakan aktivitas biologis difenil-N-(trikloroasetil)-amidofosfat (HL) sendiri atau dalam kombinasi dengan C60 fullerene dengan penggunaan analisis in silico dari interaksinya dengan DNA dan studi in vitro tentang efek sitotoksik terhadap lini sel leukemia manusia.
Untuk meningkatkan kelarutan, kami memperoleh garam natrium dari difenil-N-(trikloroasetil)-amidofosfat (HL) menurut reaksi berikut (Gbr. 2).
Skema kelarutan difenil-N-(trikloroasetil)-amidofosfat (HL) dalam garam natrium
Larutan triklorofosfazotrikloroasetil (0,035 M) dalam 200 ml kloroform ditambahkan perlahan ke dalam suspensi natrium fenolat yang diaduk dengan baik (0,106 M, 12,3 g) dalam 150 ml kloroform (Gbr. 2; tahap 1). Suhu campuran tidak boleh naik di atas 40–50 °C. Pengadukan dilanjutkan selama sekitar 1 jam, kemudian larutan dipanaskan hingga 70 °C dan diaduk selama 20 menit pada kondisi ini. Triphenoxyphosphazothrichloroacetyl produk yang dihasilkan diuapkan. Kemudian, 40 ml NaOH 1 M ditambahkan dan direfluks selama 90 menit (Gbr. 2; tahap 2). Campuran yang dihasilkan diuapkan. Endapan padat natrium HL dicuci tiga kali dietil eter dan direkristalisasi dari i -propanol sebagai bubuk kristal putih (hasil 80%). Kristal tak berwarna dari NaL·3H2 O cocok untuk analisis sinar-X diperoleh dengan i -ProOH:H2 O (9:1 v /v ) larutan penguapan lambat. Senyawa ini stabil di udara, sangat larut dalam air dan alkohol. M.p. 215 °С.
HL diidentifikasi dengan analisis unsur dan spektroskopi IR dan NMR:analisis unsur (C, H, N) dilakukan menggunakan penganalisis unsur EL III Universal CHNOS. Pengukuran spektral IR dilakukan untuk sampel sebagai pelet KBr pada spektrometer FT-IR Perkin–Elmer Spectrum BX dengan resolusi 2 cm
− 1
dan akumulasi 8 pemindaian, yang digabungkan untuk menghasilkan rata-rata artefak penyerapan acak dalam rentang spektral 4000–400 cm
− 1
.
1
Spektrum H NMR dalam larutan DMSO-d6 direkam pada spektrometer NMR AVANCE 400Bruker pada suhu kamar.
HL:IR (cm
−1
):1639 vs, sh (νCO); 1353 s, sh (Amide II); 1194 s, sh (νPO); 941 s, sh (νPN).
1
H NMR (DMSO-d6 ):7,05 (t, 2H, -CH2 ); 7.205, 7.255 (dt, 8H, - dan -CH2 ).
Untuk CCl3 C(O)N(Na)P(O)(OC6 H5 )2 komposisi unsur ditentukan, %:C 40.58, H 2.35, N 3.15; dan dihitung, %:C 40.37, H 2.42, N 3.36.
Sintesis dan Karakterisasi C60 Fullerene
Larutan koloid berair yang sangat stabil dari C60 fullerene (200 μM, kemurnian> 99,5%, ukuran rata-rata nanopartikel hingga 50 nm) disintesis di Technical University of Ilmenau (Jerman) seperti yang dijelaskan dalam [17, 18].
Budaya ell
Eksperimen dilakukan pada garis sel CCRF-CM leukemia sel T akut manusia. Garis sel dibeli dari Koleksi Mikroorganisme dan Kultur Sel Leibniz Institute DSMZ-Jerman:CCRF-CM (ACC 240). Sel dikultur dalam media RPMI 1640 yang dilengkapi dengan 10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin, dan 2 mM Gluthamine, menggunakan 25 cm
2
labu pada suhu 37 °C dengan CO 5%2 dalam inkubator yang dilembabkan.
Sel dalam media RPMI 1640 diinkubasi dengan C60 fullerene (16 μM) atau HL (2,5, 5, dan 10 μM) secara terpisah dan bersama-sama selama 24, 48, dan 72 jam. Kelangsungan hidup sel tanpa penambahan HL atau C60 fullerene diterima sebagai 100% (sampel kontrol mengandung 0,05 M DMSO).
Uji Viabilitas Sel (MTT)
Viabilitas sel dinilai dengan uji reduksi MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazolium bromida] [19]. Pada titik waktu inkubasi yang ditunjukkan, 100 μl alikuot (0,5 × 10
4
sel) ditempatkan ke dalam microplates 96-sumur Sarstedt (Nümbrecht, Jerman), 10 μl larutan MTT (5 mg/ml dalam PBS) ditambahkan ke setiap sumur, dan pelat diinkubasi selama 2 jam lagi pada 37 °C. Media kultur kemudian diganti dengan 100 l DMSO; pembentukan diformazan ditentukan dengan mengukur penyerapan pada 570 nm dengan pembaca lempeng mikro Tecan Infinite M200 Pro (Männedorf, Swiss).
Hewan
Penelitian dilakukan pada tikus putih jantan galur “Wistar” dengan berat badan 170 ± 5 g. Hewan-hewan itu disimpan dalam kondisi standar di vivarium "Institute of Biology and Medicine" ESC, Universitas Nasional Taras Shevchenko di Kyiv. Hewan memiliki akses gratis ke makanan dan air. Semua eksperimen dilakukan sesuai dengan prinsip-prinsip internasional Konvensi Eropa untuk perlindungan hewan vertebrata di bawah kendali Komite Bio-Etika dari lembaga tersebut di atas.
Estimasi Hemolisis Eritrosit
Eritrosit diperoleh dari darah tikus garis “Wistar” yang diheparinisasi dan diencerkan dalam larutan NaCl 0,85% hingga 0,700 o.u. pada 630 nm pada spektrofotometer Scinco (Jerman). Hemolisis eritrosit disebabkan oleh HCl 0,001 N. Kinetika hemolisis diukur secara spektrofotometri (λ = 630 nm) setiap 10 dtk selama 2 mnt. Persentase eritrosit hemolisis dihitung seperti yang disajikan pada [20]. Eritrosit diinkubasi dalam larutan NaCl 0,85% dengan C60 fullerene (16 μM) atau HL (2,5 dan 10 M) secara terpisah dan bersama-sama selama 1 jam. Eritrosit tanpa penambahan HL atau C60 fullerene diterima sebagai 100% (sampel kontrol mengandung 0,05 M DMSO).
Studi In Silico
Molekul DNA heliks ganda digunakan sebagai template dari basis PDB (Protein Data Bank). Interaksi molekul DNA dengan HL secara terpisah dan dalam kombinasi dengan C60 fullerene telah dipelajari. Kami mempertimbangkan struktur molekul DNA berikut:2MIW (CCATCGCTACC - penyisipan senyawa ke dalam alur kecil heliks DNA), 1XRW (CCTCGTCC - penyisipan senyawa ke dalam alur kecil heliks DNA), dan 2M2C (GCGCATGCTACGCG - pengikatan senyawa dengan alur besar dan kecil heliks DNA). Kami menerapkan algoritma docking sistematis (SDOCK+), built-in paket QXP (metode ini menunjukkan semua kemungkinan konformasi dari struktur dipelajari dengan nilai minimal Root mean square deviasi (RMSD)) [21]. Kami menghasilkan 300 kemungkinan kompleks dengan DNA, sepuluh yang terbaik dipilih untuk tahap berikutnya, menggunakan fungsi penilaian, paket QXP bawaan [22].
Interaksi molekul DNA dengan HL secara terpisah dan dalam kombinasi dengan C60 fullerene dicirikan oleh parameter berikut:(1) jumlah ikatan hidrogen, (2) luas permukaan kontak DNA dan struktur yang sesuai, (3) jarak antara DNA dan struktur yang ditambatkan, dan (4) energi total dari struktur pengikat.
Untuk menilai stabilitas kompleks senyawa kimia dengan C60 fullerene, kami melakukan dinamika molekul pendek (MD, 100 ps) menggunakan alat perangkat lunak Gromacs [23] sesuai dengan algoritma Nosé-Poincaré-Anderson (NPA) [24, 25] berdasarkan medan gaya OPLS-AA [26, 27] .
Perhitungan dilakukan pada parameter berikut:suhu (dalam Kelvin) - 300; tekanan (dalam kilopascal) - 100; pengikatan yang melibatkan atom hidrogen atau ligan dibatasi oleh algoritma [25].
Analisis Statistik
Data direpresentasikan sebagai mean ± SD lebih dari empat percobaan independen. Mean (M) dan standar deviasi (SD) dihitung untuk setiap kelompok. Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan ANOVA dua arah diikuti dengan tes pasca Bonferroni. Nilai p < 0,05 dianggap signifikan secara statistik. Pemrosesan dan plot data dilakukan oleh IBM PC menggunakan aplikasi khusus GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc., USA).
Hasil dan Diskusi
Studi In Silico
Interaksi HL dengan DNA
Ditunjukkan bahwa HL dapat berinterkalasi menjadi DNA dan membentuk kompleks yang stabil ketika terikat dalam alur DNA minor melalui nukleotida AGC-GCTA (Gbr. 3a). Dalam hal ini, interaksi susun antara basa nitrogen nukleotida A dan gugus fenil HL serta interaksi elektrostatik antara CCl3 kelompok dan nukleotida C terbentuk. Setelah simulasi MD, nilai RMSD untuk heliks ganda DNA dan HL ditemukan masing-masing sebesar 3,3 dan 1,62 Å. Lingkungan nukleotida HL (GCA-CTA) sebagian berubah dan interaksi penumpukan hilang, sementara ikatan hidrogen terbentuk antara nukleotida G dan gugus CO dari HL.
Interaksi difenil-N-(trikloroasetil)-amidofosfat (HL) dengan molekul DNA:a , b mengikat dengan alur kecil dan besar; c interkalasi ke dalam alur kecil. Struktur DNA yang digunakan dari database PDB:a , b —2M2C dan c —1XRW
Pengikatan HL dengan alur DNA utama terjadi melalui nukleotida TCG-AT (Gbr. 3b). Dalam hal ini, ikatan hidrogen antara gugus CO dari HL dan basa nitrogen dari nukleotida A terbentuk dan interaksi susun antara kedua fenil HL dan basa nitrogen dari nukleotida C dan G terjadi. Selain itu, probabilitas ikatan elektrostatik antara HL CCl3 kelompok dan basa nitrogen dari nukleotida AT muncul.
Setelah simulasi MD, tidak ada perubahan dalam lingkungan nukleotida HL yang terdeteksi. Nilai RMSD untuk DNA dan HL masing-masing adalah 2,77 dan 1,58 Å. Karena itu interaksi susun antara nukleotida C dan gugus fenil menghilang.
Dalam kasus interkalasi HL ke dalam DNA, lingkungannya terdiri dari nukleotida CG-CG (Gbr. 3c). Interaksi susun dengan nukleotida CG muncul:satu gugus fenil dijepit di antara basa nitrogen dan yang lainnya membentuk interaksi susun dengan nukleotida C.
Setelah simulasi MD, nilai RMSD untuk DNA double-helix dan HL masing-masing adalah 1,71 dan 1,89 Å. Lingkungan nukleotida HL tidak berubah. Salah satu gugus fenil membentuk interaksi ion-π dengan basa nitrogen nukleotida G, yang tampaknya tergeser sebesar 1,12 Å.
Parameter energi yang diperoleh membuktikan bahwa energi benturan sterik antara DNA dan HL serta di dalam HL itu sendiri tidak signifikan (Tabel 1).
Kami telah melakukan analisis komparatif parameter energi pengikatan HL dengan alur DNA minor dan mayor atau interkalasinya ke dalam alur DNA minor. Nilai benjolan ditunjukkan menjadi 6,2 kJ/mol dalam kasus interkalasi HL ke dalam DNA dan 2,5 kJ/mol dalam kasus pengikatannya dengan alur DNA minor dan mayor (Tabel 1). Nilai Int adalah 8,7 kJ/mol dalam kasus interkalasi HL ke dalam DNA, 6,3 kJ/mol dalam kasus pengikatannya dengan alur DNA utama, dan 3,6 kJ/mol dalam kasus pengikatannya dengan alur DNA minor. Data ini menunjukkan bahwa pengikatan HL dengan alur kecil DNA adalah yang paling stabil.
Interaksi Gabungan HL dan C60 Fullerene dengan DNA
Sebelumnya dengan menggunakan simulasi komputer, kami telah menunjukkan bahwa C60 molekul dapat berinteraksi dengan DNA dan membentuk C60 stable yang stabil +DNA kompleks saat berikatan dengan DNA minor groove [15]. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4, C60 fullerene juga dapat membentuk ikatan ion-π dengan CCl3 kelompok molekul HL.
Interaksi gabungan difenil-N-(trikloroasetil)-amidofosfat (HL) dan C60 fullerene dengan DNA (HL+C60 atau C60 Versi +HL):a , b mengikat dengan alur kecil dan besar, c , d interkalasi menjadi alur minor dan mayor. Struktur DNA database PDB yang digunakan:a , b —2M2C, c —1XRW, dan d —2MIW
Kami telah menggunakan dua versi pemodelan molekul HL, C60 interaksi fullerene dan DNA, yang diusulkan pada [16] dan terbukti berguna untuk interpretasi hasil simulasi MD. Kami telah menggunakan struktur 1XRW PDB molekul DNA dalam versi, ketika awalnya HL dan kemudian C60 interkalasi molekul menjadi DNA (HL+C60 ) dan struktur molekul DNA 2MIW PDB - dalam versi, ketika awalnya C60 molekul dan kemudian HL interkalasi menjadi DNA (C60 +HL).
Pengikatan dengan alur DNA minor dalam kasus HL+C60 versi terjadi melalui nukleotida GCTA-GCAT (Gbr. 4a). Gugus fenil mengisi alur kecil dan memasuki interaksi susun:satu gugus dengan C60 fullerene dan yang lainnya dengan basa nitrogen nukleotida G. Interaksi elektrostatik muncul antara CCl3 kelompok HL dan basa nitrogen dari nukleotida G dan C60 penuh.
Menurut hasil simulasi MD, heliks ganda DNA dalam hal ini dicirikan oleh mobilitas yang cukup besar (nilai RMSD adalah 3,08 Å), nilai RMSD untuk HL adalah 2,04 Å, sedangkan C60 fullerene tetap hampir tak tergoyahkan. Akibatnya, lingkungan nukleotida HL+C60 struktur diubah oleh TGC-GCATG. Selain itu, ikatan hidrogen antara gugus amino HL dan DNA dan interaksi susun antara nukleotida basa nitrogen GC dan C60 fullerene muncul.
Pengikatan HL+C60 dengan alur DNA utama terjadi melalui nukleotida C-ATCC (Gbr. 4b). Ikatan hidrogen terbentuk antara gugus HL CO dan basa nitrogen dari nukleotida A. Gugus fenil mengisi alur DNA utama dan memasuki interaksi susun dengan C60 penuh.
Menurut hasil simulasi MD, lingkungan nukleotida HL+C60 struktur tidak berubah:nilai RMSD untuk DNA dan HL masing-masing adalah 3,14 dan 2,24 Å, C60 fullerene tetap hampir tak tergoyahkan. Dalam hal ini, semua interaksi antara HL dan C60 fullerene menghilang dan HL hanya berinteraksi secara sterik dengan DNA. Seharusnya sebagai hasilnya C60 fullerene serta HL akan terdorong keluar dari alur DNA utama.
Saat HL+C60 diselingi ke dalam alur DNA kecil (Gbr. 4c), terjadi pengikatan dengan nukleotida CGT-GAG. C60 fullerene terjadi untuk dibangun ke dalam alur DNA kecil dan berinteraksi dengannya secara sterik. Gugus fenil HL membentuk interaksi susun dengan basa nitrogen nukleotida CG-CG. Menurut simulasi MD, nilai RMSD untuk DNA dan HL masing-masing adalah 2,29 dan 2,13 Å, C60 fullerene tetap tidak tergoyahkan, dan CC13 kelompok HL memasuki interaksi elektrostatik dengan basa nitrogen dari nukleotida G.
Dalam kasus C60 Versi +HL, pengikatan dengan alur DNA minor (Gbr. 4d) terjadi melalui nukleotida CGC-GCC. Salah satu gugus fenil HL membentuk susunan dengan C60 fullerene dan yang lainnya dengan nukleotida G. CC13 gugus HL tampak membentuk ikatan elektrostatik dengan basa nitrogen nukleotida C. Menurut analisis MD, nilai RMSD untuk DNA dan HL dalam kasus ini masing-masing adalah 2,35 dan 2,75 Å, C60 fullerene tetap tidak bergerak, dan lingkungan nukleotida C60 Struktur +HL diubah oleh CGCT-GC. Selain itu, C60 molekul menembus lebih dalam ke dalam DNA dan membentuk interaksi susun dengan basa nitrogen nukleotida C.
Menurut parameter energi yang dihitung, kompleks yang terbentuk dalam kasus C60 Interkalasi +HL ke dalam alur DNA minor adalah yang paling kaku (nilai Bump 20,0 kJ/mol) (Tabel 1). Sebaliknya dalam kasus HL+C60 interaksi dengan DNA, parameter ini hanya 6,2 kJ/mol saat HL+C60 disisipkan ke dalam alur DNA minor, 7,8 kJ/mol ketika diikat dengan alur DNA minor, dan 8,8 kJ/mol saat diikat dengan alur DNA utama. Selain itu, parameter energi menunjukkan bahwa pembentukan ikatan hidrogen yang kuat di dalam HL+C60 Kompleks +DNA hanya mungkin dalam kasus pengikatan dengan alur utama DNA, ketika nilai Hbnd adalah 2,3 kJ/mol, pada jenis interaksi lain sama dengan nol atau 1,0 kJ/mol (Tabel 1). Apalagi menurut hasil MD dalam hal ini keduanya C60 fullerene dan HL tampaknya tergeser dari alur DNA utama.
Oleh karena itu, C60 Pengikatan +HL dengan alur DNA kecil disarankan sebagai versi yang paling mungkin dari C60 interaksi gabungan fullerene, HL, dan DNA.
Studi In vitro tentang Efek Biologis HL
Viabilitas Sel CCRF-CЕM
Dalam percobaan in vitro, pengaruh jangka panjang difenil-N(trikloroasetil)-amidofosfat (HL) dalam kisaran 2,5–10 μM pada kelangsungan hidup sel CCRF-CЕM leukemia manusia diperkirakan dengan uji MTT. Sel diinkubasi selama 24, 48, dan 72 jam dalam media RPMI 1640 dengan 16 μM C60 fullerene atau HL saja atau kombinasinya. Viabilitas sel yang diinkubasi tanpa C60 atau HL dianggap 100%.
Pada inkubasi 24 jam, tidak ada efek HL pada viabilitas sel CCRF-CЕM yang diamati (Gbr. 5). Masih pada inkubasi yang lebih lama, aktivitas sitotoksik HL dalam konsentrasi 5 dan 10 μM menjadi jelas, viabilitas sel pada 48 jam dihambat masing-masing sebesar 25 dan 33%, dan terus menurun pada 72 jam.
Viabilitas sel CCRF-CEM yang diinkubasi dengan difenil-N-(trikloroasetil)-amidofosfat (HL) dalam konsentrasi yang berbeda. (M ± m, n = 8); *p < 0,05 dibandingkan dengan sel kontrol
Perlu dicatat bahwa 50% penurunan viabilitas sel CCRF-CЕM (IC50 ) terdeteksi pada 72 jam di bawah aksi HL dalam konsentrasi 10 M (Gbr. 5). Baru-baru ini, kami telah menunjukkan bahwa perwakilan CAPh lain dimorfolido-N-trichloracetylphosphorylamid menyebabkan 50% penurunan viabilitas sel CCRF-CЕM pada 72 jam dalam konsentrasi 1 mM [16]. Analisis komparatif dari data ini menunjukkan bahwa pengenalan kelompok fenoksi dan bukan morfolido ke dalam struktur turunan CAPh memungkinkan penurunan dua urutan konsentrasi toksik efektifnya terhadap sel leukemia. Kami berasumsi bahwa fleksibilitas konformasi –P(O)(OC6 H5 ) inti memastikan interaksi yang lebih efektif dari senyawa ini dengan DNA.
Tidak ada pengaruh C60 fullerene yang digunakan sendiri pada viabilitas sel selama masa inkubasi terdeteksi (data tidak disajikan). Pada saat yang sama, hasil yang ditunjukkan pada Gambar. 6 menunjukkan bahwa C60 fullerene mengintensifkan aktivitas sitotoksik HL terhadap sel CCRF-CЕM. Di bawah aksi gabungan C60 fullerene dan HL, 50% penurunan viabilitas sel diamati pada konsentrasi HL yang lebih rendah (5 M) dan pada periode inkubasi sebelumnya (48 jam) daripada di bawah aksi HL itu sendiri. Terlebih lagi pada 72 jam aksi gabungan C60 fullerene dan HL, efek sitotoksik HL terdeteksi dalam konsentrasi rendah 2,5 M di mana HL itu sendiri tidak berpengaruh pada viabilitas sel (Gbr. 6).
Viabilitas sel CCRF-CEM yang diinkubasi dengan difenil-N-(trikloroasetil)-amidofosfat (HL) saja atau dalam kombinasi dengan 16 μM C60 fullerene. (M ± m, n = 8); *p <0,05 dibandingkan dengan sel kontrol;
#p < 0,05 dibandingkan dengan HL
Jadi, C60 fullerene terbukti mempotensiasi efek sitotoksik HL dan meningkatkan sensitivitas sel leukemia secara signifikan terhadap aksinya dalam konsentrasi rendah. Mempertimbangkan bahwa C60 fullerene mampu terakumulasi di dalam sel leukemia lebih dari 24 jam [28] dan terlokalisasi di kompartemen intraseluler [29,30,31], khususnya di nukleus [32, 33], interaksinya dengan DNA inti sel kanker yang berproliferasi aktif seharusnya tidak dikecualikan.
Sehingga data yang diperoleh secara in vitro sesuai dengan hasil studi in silico dan menunjukkan bahwa pengikatan awal C60 molekul dan kemudian HL dengan alur DNA kecil dengan pembentukan kompleks yang stabil bisa menjadi salah satu kemungkinan alasan penghambatan sinergis mereka terhadap proliferasi sel CCRF-CЕM.
Resistensi Eritrosit terhadap Hemolisis
Estimasi potensi antikanker HL dan C60 kombinasi fullerene, penting untuk memperhitungkan kemungkinan efeknya pada sel nonmalignant, khususnya pada sel darah.
Studi resistensi eritrosit terhadap hemolisis asam memungkinkan untuk menjelaskan pengaruh agen farmakologis pada tingkat membran. Dinamika hemolisis mencerminkan dinamika gangguan membran plasma eritrosit dan karenanya stabilitas organisasi strukturalnya. Pada Gambar 7, ketergantungan persentase eritrosit hemolisis diinkubasi selama 1 jam dalam larutan NaCl tanpa penambahan (kontrol) dan dengan HL atau C60 fullerene sendiri atau dalam kombinasi. Tidak ada pengaruh 16 μM C60 fullerene pada eritrosit hemolisis terdeteksi (tidak ditampilkan). HL dalam konsentrasi 2,5 μM sendiri atau dalam kombinasi dengan C60 mempengaruhi resistensi eritrosit terhadap hemolisis (Gbr. 7). Sementara itu, di bawah aksi HL di 10 M konsentrasi percepatan hemolisis terdeteksi maksimum pada 20 s. Tindakan gabungan 10 μM HL dan C60 fullerene diikuti oleh intensifikasi hemolisis lebih lanjut dengan 60% eritrosit hemolisis pada 20 detik.
Resistensi eritrosit terhadap hemolisis dengan adanya difenil-N-(trikloroasetil)-amidofosfat (HL) secara terpisah dan dalam kombinasi dengan 16 μM C60 fullerene. (M ± m, n = 8)
Data yang diperoleh menunjukkan bahwa aplikasi C60 fullerene dalam kombinasi dengan 2.5 M HL tidak memiliki efek berbahaya pada stabilitas struktural membran eritrosit darah dan pada saat yang sama memungkinkan untuk meningkatkan aktivitas sitotoksik HL secara signifikan dalam konsentrasi rendah terhadap sel leukemia. Meskipun efek sitotoksik sinergis dari C60 fullerene dan HL dalam konsentrasi 10 M terhadap sel leukemia, penerapan kombinasi mereka tampaknya dibatasi oleh intensifikasi efek hemolitik.
Akhirnya, dalam konteks studi in vitro di atas, penting untuk menekankan bahwa antarmuka air/padat memiliki air terbatas yang juga dapat mempengaruhi transportasi, sifat termodinamika struktur nano [34, 35], dan interaksinya dengan membran sel. [36].
Ada data literatur tentang lokalisasi intraseluler turunan karbasilamidofosfat, khususnya, penetrasi fosforamidat ke dalam sel. Dengan demikian, turunan fosforamidat dapat menembus membran sel MDA-231 kanker payudara dan kanker paru-paru (H460, H383, dan H2009) [37]. Nitrobenzyl phosphoramide mustard terbukti menembus membran sel dan terlokalisasi di mitokondria NTR
+
sel mamalia [10]. Tidak dikecualikan bahwa C60 fullerene, yang mampu menembus membran sel kanker karena difusi pasif atau endositosis [28, 30, 32] dengan akumulasi di nukleus dan mitokondria [30, 32, 33], bisa menjadi pengangkut molekul antitumor kecil [ 38,39,40].
Kesimpulan
Sebuah perwakilan baru dari turunan karbasilamidofosfat yang memiliki dua substituen fenoksi dekat gugus fosforil difenil-N-(trikloroasetil)-amidofosfat (HL) disintesis dan diuji sebagai agen sitotoksik itu sendiri dan dalam kombinasi dengan C60 fullerene. Menurut hasil simulasi molekuler, ketika C60 fullerene dan kemudian HL diikat dengan alur DNA minor, kompleks kaku terbentuk distabilkan dengan menumpuk interaksi gugus fenil HL dengan C60 fullerene dan nukleotida DNA G, serta interaksi HL CCl3 dikelompokkan berdasarkan ikatan ion-π dengan C60 molekul dan dengan ikatan elektrostatik dengan nukleotida DNA G.
Dengan menggunakan uji MTT, kami telah menunjukkan aktivitas sitotoksik HL terhadap sel CCRF-CM leukemia manusia dengan IC50 value detected at 10 μM concentration at 72 h of cells treatment. The cytotoxic effect of HL was facilitated by C60 fullerene. Under combined action of 16 μM C60 fullerene and HL, the value of IC50 was detected at lower 5 μM HL concentration and at earlier 48 h period of incubation and besides the cytotoxic effect of HL was observed at a low 2.5 μM concentration at which HL by itself had no influence on cell viability.
Previously, we have shown a significant toxic effect of dimorfolido-N-trichloroacetylphosphoramide against human leukemic cells of different origin, but its effective concentration was high and no enhancement of toxicity after combined action with C60 fullerene was observed [16]. We assume that introduction of flexible of –P(O)(OC6 H5 ) groups instead of morfolido groups into CAPh derivative contributed to lowering of its toxic concentration against human leukemic cells ensuring its effective interaction with C60 molecule and DNA. Binding of C60 fullerene and HL with minor DNA groove with formation of a stable complex is assumed to be one of the possible reasons of their synergistic inhibition of CCRF-CЕM cells proliferation.
We have revealed that application of C60 fullerene in combination with 2.5 μM HL had no harmful effect on structural stability of blood erythrocytes membrane, while combination of C60 fullerene with 10 μM HL appeared to be limited by intensification of hemolytic effect.
Thus, C60 fullerene was shown to potentiate cytotoxic effect of HL and to increase significantly human leukemic cells sensitivity to its action in a low concentration. A combination of C60 fullerene with HL in a low concentration 2.5 μM may be promising for further biomedical studies.
