Sintesis Terinspirasi Biomineralisasi dari Nanopartikel Karbon yang Didoping Cerium untuk Aktivitas Pemulungan Radikal Hidroksil Tinggi
Abstrak
Nanopartikel Cerium oksida baru-baru ini telah menerima perhatian luas dalam aplikasi biomedis karena kinerja anti-oksidasi yang sangat baik. Dalam penelitian ini, pendekatan sederhana, ringan, dan hijau dikembangkan untuk mensintesis nanopartikel karbon yang didoping-cerium (Ce-doped CNPs) menggunakan bio-mineralisasi bull serum albumin (BSA) sebagai prekursor. CNP yang didoping-C yang dihasilkan menunjukkan morfologi yang seragam dan sangat kecil dengan ukuran rata-rata 14,7 nm. Hasil XPS dan FTIR mengungkapkan adanya gugus hidrofilik pada permukaan CNP yang didoping Ce, yang menghasilkan dispersi yang sangat baik dalam air. Uji CCK-8 menunjukkan bahwa CNP yang didoping-ce memiliki biokompatibilitas yang baik dan sitotoksisitas yang dapat diabaikan. Menggunakan H2 O2 spesies oksigen reaktif (ROS) yang diinduksi sebagai model, CNP yang didoping-ce menunjukkan kemampuan pemulung radikal hidroksil yang sangat tinggi. Selanjutnya, hasil sitometri aliran dan pewarnaan hidup-mati menunjukkan bahwa CNP yang didoping-ce melindungi sel dari H2 O2 kerusakan yang diinduksi dalam efek tergantung dosis, yang memberikan bukti langsung untuk kinerja anti-oksidatif. Temuan ini menunjukkan bahwa CNP yang didoping-ce sebagai pemulung ROS baru dapat memberikan prospek terapi potensial dalam mengobati penyakit yang terkait dengan stres oksidatif.
Latar Belakang
Peradangan terus menerus dan deregulasi dianggap sebagai langkah umum dari berbagai proses patologis [1]. Stres oksidatif telah ditemukan di banyak penyakit klinis di mana ROS memiliki ekspresi yang jauh lebih tinggi daripada eliminasi enzim antioksidan [2,3,4], yang akhirnya didefinisikan sebagai ketidakseimbangan antara kinerja oksidatif dan anti-oksidatif. ROS yang sangat reaktif memiliki kecenderungan untuk menghasilkan radikal bebas (termasuk superoksida (O2
−
), HO2ˋ dan hidroksil (ˋ OH)) yang menyebabkan kerusakan makromolekul dalam organisme, seperti protein dan asam nukleat, sedangkan kelebihan produksi ROS membuat perbedaan penting dalam kerusakan oksidatif berkelanjutan, yang menyebabkan kerusakan signifikan pada struktur dan fungsi seluler, seperti infiltrat inflamasi [5,6 ,7], kerusakan membran sel dan DNA [8,9], bahkan meningkatkan kematian sel. Dengan demikian, stres oksidatif memainkan peran kunci dalam patogenesis penyakit pembuluh darah makro [10,11,12], kanker, dan beberapa penyakit sistem saraf lainnya [13]. Akibatnya, merupakan masalah penting dan mendesak untuk mengontrol konsentrasi radikal bebas oksigen reaktif dalam organisme hidup dan menjaga mereka dalam kisaran yang sesuai, yang juga merupakan dasar untuk mengurangi serangkaian kelainan oksidatif.
Baru-baru ini, nanopartikel serium oksida (CeO2 NP) telah menarik perhatian besar karena sifat redoksnya yang unik yang diterapkan secara luas dalam bidang energi, katalisis, dan biomedis [14,15,16]. Terutama, CeO2 nanopartikel dipamerkan potensi besar sebagai antioksidan ideal untuk mengobati penyakit terkait ROS dalam aplikasi biomedis [17, 18]. Aktivitas antioksidan ceria nanopartikel berasal dari kemampuannya dalam menangkap radikal bebas, seperti superoksida (•O
2−
) dan radikal hidroksil (•OH), dan mempertahankan efek antioksidan sebagai enzim untuk jangka waktu yang berkelanjutan [19]. Ada semakin banyak bukti bahwa CeO2 nanopartikel biasanya memiliki struktur kristal tipe fluorit, dan ion serium memiliki kemampuan konversi reversibel antara tervalensi (3+) dan quadrivalensi (4+) [20]. Sakelar Ce
3+
ke Ce
4+
bilangan oksidasi dapat menghilangkan O2
−
melalui superoksida dismutase (SOD)-mimetik, dan •OH melalui reaksi redoks, sedangkan Ce
4+
ke Ce
3+
alihkan hapus H2 O2 melalui katalase (CAT)-mimetik [21]. Namun, sifat fisik dan kimia CeO2 NP dapat mempengaruhi perilaku biologis, termasuk bio-distribusi, farmakokinetik, toksisitas, pembubaran, dan eliminasi [22]. Mengingat hipotesis bahwa itu mapan pada kimia superfisial CNP yang didoping-ce, pemanfaatan biologis CNP yang didoping-ce sebagai pendekatan terapeutik masih perlu dieksplorasi secara luas [23, 24].
Studi ini berkonsentrasi pada pengembangan nanopartikel baru berbasis cerium (dinamai sebagai CNP yang didoping-ce) dengan biokompatibilitas yang sangat baik menggunakan rute sintetis sederhana dan hijau dan selanjutnya mengeksplorasi kelayakannya sebagai agen antioksidan untuk aplikasi biomedis. Serangkaian metode digunakan untuk mengkarakterisasi sifat fisik dan kimia dari CNP yang didoping-ce. Didorong oleh kinerja yang menguntungkan, kami selanjutnya memverifikasi biokompatibilitas CNP yang didoping-ce yang disiapkan dan menggunakannya sebagai reagen antioksidan untuk menghilangkan radikal bebas oksigen menggunakan H2 O2 model yang diinduksi. Akhirnya, mekanisme antioksidan CNP yang didoping-ce terungkap dari jalur apoptosis sel menggunakan pewarnaan fluorescent hidup-mati dan flow cytometry. Studi ini akan memberikan pemulung ROS yang baru dan efisien untuk mengurangi kerusakan stres oksidatif dalam kondisi patologis.
Bagian Eksperimental
Bahan dan Reagen
Bull serum albumin (BSA), fluorescein diacetate (FDA), dan propidium iodide (PI) dibeli dari Sigma (New York, NY, USA). Fetal bovine serum (FBS) dan Dulbecco’s Minimum Essential Medium (DMEM) diperoleh dari Invitrogen China Limited (Shanghai, Republik Rakyat Tiongkok). Ce (TIDAK3 )3 ·6H2 O, metil violet (MV), dan ferrous sulfate heptahydrate (FeSO4
.
7H2 O) dibeli dari Aladdin Reagent Corporation (Shanghai, Republik Rakyat Tiongkok), dan hidrogen peroksida (30%) diperoleh dari Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Beijing, Republik Rakyat Tiongkok). Semua bahan kimia adalah reagen analitis dan digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut. Air de-ionisasi digunakan dalam percobaan.
Sintesis Nanopartikel Cerium Oksida
CNP ce-doped disiapkan dengan menerapkan sedikit modifikasi metode bio-mineralisasi berbasis album seperti yang dijelaskan dalam dokumen [24]. Proses sintesis diilustrasikan sebagai berikut:1,25 g BSA dilarutkan dalam 50,0 mL air deionisasi dan terus diaduk untuk membentuk larutan transparan. Kemudian, larutan prekursor logam 300 mM Ce (NO3 )3 ·6H2 O ditambahkan perlahan-lahan di bawah pengadukan yang kuat, masing-masing. Secara bersamaan, 2,0 M NaOH dilarutkan dalam 50 mL air deionisasi, yang digunakan untuk mengatur nilai pH campuran. Larutan termasuk NaOH yang harus ditambahkan perlahan-lahan patut diperhatikan. CNP yang didoping-ce dapat dibentuk setelah diaduk dengan energik pada PH 12 pada 55 °C. Waktu reaksi yang cukup untuk pembentukan CNP yang didoping-ce adalah sekitar 8 jam; sistem adalah senyawa coklat, pendinginan ke suhu kamar secara alami. Suspensi tambahan disaring dengan membran 0,22 m (poli-eter sulfon) untuk menghilangkan aglomerasi skala besar tersebut. Solusi sebelumnya akhirnya didialisis terhadap air selama 3 hari dalam kantong dialisis dengan berat molekul 14 kDa cutoff. Larutan dialisis yang terkumpul dikeringkan dengan menggunakan pengering beku vakum. Serbuk CNP yang didoping-C akhirnya diperoleh dan disimpan untuk karakterisasi lebih lanjut.
Instrumen dan Karakterisasi Nanopartikel Cerium Oksida
Morfologi CNP yang didoping-C diperiksa dengan mikroskop elektron transmisi (TEM) pada mikroskop JEM-2100 (JEOL, Tokyo, Jepang) di bawah tegangan akselerasi 200 kV. Distribusi ukuran dipelajari oleh perangkat lunak ImagingJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Struktur kimia CNP yang didoping-ce dianalisis menggunakan spektrometer Fourier transform infrared (FT-IR) (Nicolet Nexus 470, GMI, dan Ramsey, MN, USA). Komposisi unsur ditentukan oleh analisis unsur yang dilakukan melalui spektroskopi fotoelektron sinar-X (XPS). Analisis difraksi sinar-X (XRD) dilakukan pada difraktometer Rigaku D/MAX-2000 (Jepang) yang dioperasikan pada 40 kV dan 100 mA, dengan celah 0,5° dan kecepatan pemindaian 7° menit
−1
, dilengkapi dengan sumber radiasi Cu Kα (λ = 0.15418 nm). Spektrum absorbansi UV–Vis direkam menggunakan Spektrofotometer UV-2550 UV–Vis (Shimadzu, Kyoto, Jepang).
Eksperimen Fotometrik UV-vis
Kinerja antioksidan CNP yang didoping-ce dan aktivitas pembersihan radikal bebas dinilai dengan eksperimen fotometrik UV-vis. Solusi MV disiapkan dalam air deionisasi pada konsentrasi 3,0 × 10
−4
M. Dan 0,15 mM FeSO4
.
7H2 O dilarutkan sebagai alternatif. Larutan tersuspensi CNP yang didoping-C dicadangkan untuk digunakan pada konsentrasi 10 μM dengan mendispersikannya dalam buffer Tris-HCl 0,1 M pada pH 5,0. Secara tepat, pemrosesan ultrasonik dapat meningkatkan kelarutan CNP yang didoping-ce. Solusi reaksi untuk fotometrik mencakup 3.0 × 10
−5
M MV, 0,15 mM FeSO4
.
7H2 O, 1,0 J J2 O2 , 0,1 M buffer Tris-HCl (pH 5,0), dan 0,17 mM CNP yang didoping Ce untuk mencapai volume 10 mL yang diperlukan (larutan campuran MV/FeSO4
.
7H2 O/H2 O2 /CeO2 ) di akhir. Absorbansi larutan reaksi dapat diukur setelah diinkubasi selama 5 menit pada suhu kamar.
Sitotoksisitas Nanopartikel Cerium Oksida
Viabilitas sel CNP yang didoping-C dievaluasi pada sel VSMC dan 7721 dengan uji CCK-8 (Dojindo, Kumamoto, Jepang) berdasarkan cincin tetrazolium yang terbelah dan penurunan garam tetrazolium yang larut dalam air dari jumlah pewarna formazan oleh dehidrogenase dalam sel hidup. Secara singkat, VSMC dan 7721 sel (1,5 × 10
4
sel per sumur) diunggulkan ke dalam pelat 96-sumur dengan lima ulangan untuk setiap kelompok. Setelah menetas selama 24 jam pada 37°C dan 5% CO2 dan kepadatan sel telah mencapai pertemuan 80%, media pertumbuhan diganti dengan DMEM segar yang mengandung konsentrasi berbeda (0, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 g/ml) larutan CNP yang didoping-ce dan diinkubasi selama 24 jam. Kemudian, sel dicuci dengan PBS dan 10 L larutan CCK-8 ditambahkan ke masing-masing sumur. Selanjutnya, pelat 96-sumur diinkubasi lagi selama 4 jam pada 37°C dan 5% CO2 untuk memungkinkan pertumbuhan sel eksponensial. Terakhir, absorbansi masing-masing sumur dideteksi pada panjang gelombang emisi 490 nm menggunakan Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader (Bio-Tek, Winooski, VT, USA). Sel (dalam DMEM) tanpa pengobatan digunakan sebagai kontrol, dan viabilitas sel relatif (rata-rata ± kesalahan standar rata-rata) dihitung menggunakan sampel Abs/kontrol Abs × 100%.
Model Hidrogen Peroksida pada Uji Viabilitas Sel In Vitro
Sebagai jenis oksigen aktif oksidatif yang kuat, hidrogen peroksida (H2 O2 ) mudah melewati membran sel dan bereaksi dengan ion besi intraseluler untuk membentuk radikal bebas yang sangat reaktif menurut teori Fenton, yang mengarah ke rantai perubahan. Pada saat yang sama, jenis stres oksidatif sel yang diinduksi oleh H2 O2 terlibat langsung dalam proses apoptosis. Oleh karena itu, 30% H2 O2 dipilih untuk mensimulasikan apoptosis sel dalam penelitian ini, yang juga dapat digunakan sebagai IC50 model untuk menyelidiki lebih lanjut efek perlindungan CNP yang didoping-ce pada kerusakan oksidatif. Berdasarkan pembahasan di atas, VSMC dan 7721 sel awalnya diunggulkan dengan kepadatan 1,5 × 10
4
sel/sumur ke dalam pelat 96-sumur. Setelah sel melekat, mereka terus dikultur selama 24 jam ekstra. Dan persiapan segar 30% H2 O2 ditambahkan ke setiap sumur dengan konsentrasi yang berbeda (50, 100, 200, 400, 800 umol/ml) untuk merangsang pertumbuhan sel. Setelah penetasan 4 jam dan pencucian berikutnya dengan PBS, 10 μL larutan CCK-8 ditambahkan ke setiap sumur selama 4 jam pada 37 °C dalam 5% CO2 inkubator. Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader (Bio-Tek, Winooski, VT, USA) digunakan untuk menentukan nilai penyerap setiap sumur pada 490 nm. Persentase aktivitas sel dianggap sebagai indeks efek pada viabilitas sel, yang bergantung pada pengukuran tingkat kelangsungan hidup sel relatif terhadap kontrol.
Induksi Apoptosis dan Uji Viabilitas Sel In Vitro
Dengan cara yang sama, sel VSMC dan 7721 diunggulkan di pelat 96-sumur dan dikultur. Hari berikutnya, sel-sel diberi perlakuan awal dengan konsentrasi berbeda dari CNP yang didoping-C (0, 12,5, 25, 50, 100, 200, dan 400 μg/ml) sekitar 24 jam dan diekspos ke preparasi segar 30% H2 O2 dengan konsentrasi yang sesuai untuk masing-masing sumur. Di sisi lain, itu harus disetel grup kosong tanpa 30% H2 O2 dan CNP dan kelompok kontrol yang didoping-C hanya dengan H2 O2 solusi. Setiap kelompok dibentuk enam paralel. Setelah perawatan selama 4 jam dan pencucian berikutnya dengan PBS, uji CCK-8 digunakan untuk mengukur kondisi apoptosis sel setiap lubang pada kerapatan optik 490 nm seperti yang dijelaskan di atas.
Pengujian Pewarnaan Hidup-Mati dan Sitometri Aliran
Untuk menilai potensi efek antioksidan CNP yang didoping-ce, 7721 sel ditumbuhkan pada pelat enam lubang dengan 4,0 × 10
4
sel dalam 100 ul media per sumur dan dibiarkan berkembang selama 24 jam. Kemudian, enam kelompok ditetapkan menjadi kontras simultan; itu termasuk kontrol, H2 O2 kelompok, 50μg/mL CNP yang didoping-C + H2 O2 , 100μg/mL CNP yang didoping-C + H2 O2 , 200μg/mL CNP yang didoping-ce + H2 O2 , dan 400μg/mL CNP yang didoping-C + H2 O2 . Sementara sel telah tumbuh hingga 80% di setiap kelompok, kelompok pertama terpapar kondisi pertumbuhan normal tanpa H2 O2 dan CNP yang didoping-ce; kelompok kedua baru saja diinkubasi dengan H2 selected yang dipilih O2 tanpa CNP yang didoping-C selama 4 jam, yaitu tanpa pengobatan; kelompok ketiga hingga kelompok keenam mengandung konsentrasi yang berbeda dari CNP yang didoping-C (50, 100, 200, dan 400μg/mL) dan menunjukkan H2 O2 inkubasi selama 4 jam, masing-masing. Setelah itu, buffer kerja FDA dan PI digunakan untuk pewarnaan sel (Calcein AM/Ethidium Homodimer, Invitrogen). Fluoresensi sel yang diwarnai diamati di bawah mikroskop fluoresensi; sel hidup berwarna hijau, dan sel mati berwarna merah.
Lebih lanjut, kit Apoptosis Annexin V-FITC/propidium iodide (PI) digunakan untuk mengukur laju apoptosis sel dengan pewarnaan fluoresensi ganda. Secara singkat, 7721 sel dikultur sebelumnya dalam pelat kultur enam sumur sesuai dengan langkah-langkah di atas selama 24 jam, hingga 7721 sel tumbuh. Setelah itu, sel-sel dengan takaran perlakuan yang berbeda dipanen dan dicuci tiga kali dengan PBS pada suhu 4°C pada masing-masing kelompok. Diperhatikan bahwa sel-sel harus dicerna dengan hati-hati, dikumpulkan, dan disentrifugasi diikuti oleh 2000 rpm selama 5 menit. Setelah itu, sel disuspensi kembali dengan 500 μl binding buffer dan disesuaikan dengan konsentrasi 1 × 10
6
sel/ml. Kemudian suspensi sel dimasukkan ke dalam flow tube dengan masing-masing 5 l Annexin V-FITC dan 5 l 20 g/ml larutan PI. Sebelum campuran diinkubasi pada suhu kamar selama 15 menit, 500 μl PBS harus ditambahkan ke tabung reaksi. Akhirnya, hasil eksperimen dideteksi menggunakan metode Annexin-V pada sistem flow cytometer Beckman Coulter Epics XL MCL (BD Accuri C6), dan persentase sel apoptosis diklarifikasi dengan analisis perangkat lunak (Flowjo 7.6.2).
Analisis Statistik
Semua data eksperimen dinyatakan sebagai mean ± standard error mean. Untuk perbandingan kelompok yang berbeda digunakan teknik statistik ANOVA dengan uji beda nyata terkecil (LSD) post hoc untuk menganalisis data yang diperoleh. P nilai kurang dari 0,05 (P < 0.05) dianggap signifikan secara statistik.
Hasil dan Diskusi
Persiapan dan Karakterisasi Nanopartikel Cerium Oksida
Dalam penelitian ini, dispersi berair dari CNP yang didoping Ce diperoleh dengan menggunakan Ce (NO3 )3
.
6H2 O dan BSA sebagai prekursor dengan metode sintetik yang terinspirasi oleh biomineralisasi. Selama persiapan, BSA yang digunakan sebagai bahan sumber karbon utama dapat mengintegrasikan ion logam ke nanopartikel logam karena struktur spasialnya yang unik dan fleksibilitas rantai molekulnya. Dengan kata lain, nanopartikel logam-doped terutama terdiri dari kerangka karbon dan elemen logam dimuat, yang mungkin berbeda dari nanopartikel serium anorganik konvensional [25]. Pemeriksaan morfologi ditandai dengan mikroskop elektron transmisi (TEM), dan ukuran partikel yang dihasilkan dianalisis dengan perangkat lunak ImagingJ. Gbr. 1a menunjukkan gambar TEM karakteristik dari CNP yang didoping-ce yang dihasilkan. Imajinasi ini mencerminkan bahwa CNP yang didoping-ce memiliki struktur poligonal, dispersi seragam, dan bentuk diskrit tanpa agregasi yang jelas. Analisis statistik menunjukkan CNP yang didoping-ce memiliki distribusi ukuran yang sempit dengan diameter rata-rata 14,7 ± 0,8 nm (Gbr. 1b), yang konsisten dengan gambar TEM. Ketika CNP yang didoping-C berada di dalam air selama beberapa hari, dapat ditemukan bahwa tidak ada pengendapan dan masih mempertahankan pernyataan larutan homogen, yang menunjukkan stabilitas jangka panjangnya dalam larutan berair, yang dapat bermanfaat untuk aplikasi biomedis berikut .
a Gambar TEM untuk CNP yang didoping Ce. Inset menunjukkan gambar TEM resolusi tinggi. b Distribusi diameter CNP yang didoping-ce
Ilustrasi skema desain CNP yang didoping-ce
Struktur Kimia dan Komposisi Permukaan CNP Ce-Doped
Gugus fungsi permukaan dan komposisi CNP yang didoping-ce diselidiki menggunakan pola spektroskopi fotoelektron sinar-X (XPS) dan spektrum inframerah transformasi Fourier (FT-IR). XPS digunakan untuk mengkarakterisasi keadaan oksidasi ion serium pada permukaan sampel. Spektrum XPS survei (Gbr. 2a) menunjukkan tiga puncak dominan pada 902,0, 285,0, dan 531,8 eV, yang menunjukkan keberadaan elemen serium, karbon, dan oksigen dari CNP yang didoping-C. Sinyal belerang(S 2p) pada 164.0 eV menunjukkan bahwa BSA berhasil terkonjugasi ke CNP yang didoping-ce. Koeksistensi Ce(III) dan Ce(IV) dalam katalis CNP yang didoping-C dapat dibuktikan dengan spektrum Gambar 2b. Spektrum resolusi tinggi Ce3d (Gbr. 2b) dapat dibagi menjadi Ce3d3 dan Ce3d5 (dihasilkan dari pemisahan spin-orbit 32 eV), menunjukkan adanya puncak terindeks dan kuat, masing-masing terletak di 882.0, 884.0, dan 902.0 eV. Sinyal Ce3d terutama dibagi menjadi O2 , 3d5/2 , dan 3d3/2 , puncak antara 875 dan 895 eV milik Ce3d3/2 tingkat, yang hampir bertepatan dengan spektrum yang diterbitkan sebelumnya [26]. Selain itu, spektrum XPS juga menyiratkan 15,99% dari Ce3d. Pengamatan ini sesuai dengan hasil dalam literatur untuk CeO2 nanopartikel [25]. Spektrum C1 seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2c dijelaskan oleh tiga puncak utama pada 285.0, 287,8, dan 288,9 eV, yang masing-masing menyiratkan bahwa CeO2 nanopartikel difungsikan dengan tingkat energi 1s, C=O, C−F, dan COOR dari C. Kehadiran spektrum O1s seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2d didominasi oleh dua puncak utama pada 530,5 dan 531,8 eV, yang sesuai dengan ikatan antara O2
−
dan Ce
3+
.
a Spektrum XPS dari CNP yang didoping-ce. Spektrum survei. b spektrum Ce3d. c spektrum C1s. d Spektrum O1s
Analisis FTIR selanjutnya dilakukan untuk memverifikasi pembentukan CNP yang didoping-ce dalam proses reaksi. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3A, untuk CNP yang didoping-C, puncak yang intens dan lebar muncul pada 3400 cm
−1
, yang disebabkan oleh vibrasi regangan O–H dan dapat ditentukan oleh vibrasi lentur dari air yang diserap. Puncak karakteristik pada 1510 cm
−1
dapat dideskripsikan pada regangan antisimetris –O–C–O, sedangkan puncaknya pada 1450 cm
−1
dapat ditugaskan untuk getaran peregangan simetris –O–C–O, yang keduanya menunjukkan adanya gugus nitrat. Selain itu, pita serapan dalam 451 cm
−1
ditugaskan ke peregangan asimetris Ce-O, menunjukkan pembentukan CNP yang didoping-C. Hasil ini menunjukkan bahwa gugus fungsi CNP yang didoping-C terutama mengandung OH dan –COO
−
tertentu. grup.
Spektrum FTIR dari BSA dan CNP yang didoping Ce. Pola B XRD dari CNP yang didoping-C. C Spektrum serapan UV-Vis dari CNP yang didoping-C. D Spektrum serapan UV-Vis dari Methyl violet (MV) setelah berbagai perlakuan. a Video klip, b MV diperlakukan dengan H2 O2 dan CNP yang didoping-ce, c MV diobati dengan FeSO4 dan H2 O2 , dan d MV diobati dengan FeSO4 , H2 O2 , dan solusi CNP yang didoping-ce pada waktu inkubasi 5 mnt
Menurut analisis difraksi sinar-X (XRD), struktur kristal CNP yang didoping-ce diselidiki. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 3B, ada empat puncak difraksi utama pada 24,4°, 30,3°, 35,23°, dan 43,2°. Salah satu puncak ini pada 24,4 ° dapat dianggap berasal dari struktur karbon anorganik yang dihasilkan, yang mirip dengan titik-titik kuantum karbon yang dilaporkan dan puncak karakteristik grafit [27,28,29]. Dibandingkan dengan struktur kristal grafit yang teratur (bidang 002, 2θ = 26,5°), puncak difraksi CNP yang didoping-C sekitar 24,4° dengan pergeseran yang lebih rendah menjadi lemah, yang mungkin disebabkan oleh karbon yang sangat tidak teratur dan peningkatan sp
2
(C-C) jarak lapisan dalam proses karbonisasi [30]. Puncak difraksi pada sudut 30,3°, 35,23°, dan 47,42° sebagian besar cocok dengan (111), (200), dan (220) bidang, masing-masing, dari nanopartikel ceria konvensional. Selanjutnya, puncak lainnya pada sudut 56,30 °, 69.00 °, 75.57 °, dan 78.99 ° sesuai dengan (311), (400), (331), dan (402) dari serium oksida yang direferensikan (JCPDS 2004 36-1253). Spasi yang sesuai \( \left(\mathrm{Fm}3\overline{\mathrm{m}}\right) \) dihitung menurut hukum Bragg (panjang gelombang hukum Cu-Kα adalah 0,154 nm). Hasil ini sebelumnya dapat mengkonfirmasi CNP yang didoping-ce dengan struktur kristal hibrida.
Sudah diketahui bahwa Fe
2+
dapat secara bergantian mengkatalisis dismutasi hidrogen peroksida (H2 O2 ) menjadi radikal hidroksil reaktif lainnya menurut reaksi Fenton [31]. Sebagai reagen kromogenik, larutan metil violet terutama menunjukkan warna ungu. Ditargetkan dengan –C=C–, radikal hidroksil dapat bereaksi dengan metil violet, menghasilkan MV menjadi warna yang dangkal bahkan tidak berwarna, dan absorbansi UV-Vis maksimumnya pada 582 nm menurun [32]. Menurut desain kami, CNP yang didoping-ce pasti dapat menghilangkan radikal hidroksil, yang akhirnya meningkatkan absorbansi MV pada 582 nm.
Untuk mengkonfirmasi kemampuan pemulung radikal bebas yang mendasari untuk CNP yang didoping Ce, spektrum penyerapan UV-Vis dari MV digunakan untuk memberikan beberapa wawasan. Tidak ada absorbansi yang signifikan dari 500 hingga 700 nm dalam larutan berair CNP yang didoping-C pada Gambar 3C. Namun, kami dapat mengamati absorbansi maksimum metil violet pada sekitar 582 nm dan absorbansi dihambat pada H2 O2 pengobatan (Gbr. 3D). Ketika menambahkan CNP yang didoping-ce ke dalam larutan campuran, absorbansinya jelas pulih, yang membuktikan bahwa CNP yang didoping-ce memiliki kemampuan untuk membersihkan radikal hidroksil dan melindungi MV dari serangan pada kondisi eksperimental ini. Hasil ini akan memiliki aplikasi biomedis lebih lanjut dalam mengobati penyakit yang disebabkan oleh radikal bebas.
Uji Sitotoksisitas Nanopartikel Cerium Oksida In Vitro
Sebelum menerapkan CNP yang didoping-C yang disintesis untuk mengobati penyakit yang terkait dengan stres oksidatif, penting untuk mengevaluasi biokompatibilitasnya. Dalam penelitian ini, efek CNP yang didoping-ce pada viabilitas sel dievaluasi melalui inkubasi VSMC dan 7721 sel dengan CNP yang didoping-ce menggunakan uji viabilitas sel dari uji CCK-8. Dapat dilihat bahwa viabilitas sel tidak menunjukkan perubahan yang signifikan setelah konsentrasi berbeda dari perlakuan CNP yang didoping-C selama waktu pemaparan 24 jam (Gbr. 4a). Bahkan pada dosis tertinggi 400 g/ml, viabilitas sel pada semua kelompok perlakuan adalah sekitar 90%, menunjukkan bahwa CNP yang didoping-ce memiliki sitotoksisitas yang sangat kecil pada sel. Temuan ini menyoroti kompatibilitas sito yang menguntungkan dari CNP yang didoping-ce dan memungkinkannya cocok untuk aplikasi biomedis.
a Pengaruh berbagai konsentrasi CNP yang didoping-C pada viabilitas sel VSMC dan 7721 sel oleh CCK-8. Sel diberi CNP yang didoping-C sebelumnya pada konsentrasi yang berbeda selama 24 jam dan kemudian diadministrasikan oleh H2 O2 pada dosis yang berbeda. b Viabilitas sel VSMC dan c 7721 sel dikultur dengan konsentrasi berbeda dari CNP yang didoping-C di bawah 560 μM H2 O2 -stres oksidatif yang diinduksi oleh uji CCK-8
Sifat Antioksidan dan Aktivitas Pemulungan Radikal Bebas CNP Ce-Doped In Vitro
Sifat enzim mimetik dari bahan nano serium oksida kondusif untuk aplikasi terapeutik potensial mereka. Apakah CNP yang didoping Ce dalam larutan akan cukup melindungi VSMC dan 7721 sel terhadap radikal bebas diperiksa. Untuk studi ini, H2 O2 digunakan untuk menginduksi generasi spesies oksigen reaktif (ROS), yang menyebabkan kerusakan sel atau kematian. Pertama, IC50 nilai viabilitas sel ditentukan untuk mengeksplorasi efek perlindungan CNP yang didoping-ce. Viabilitas sel VSMC dan 7721 menunjukkan nilai yang rendah setelah penambahan H2 O2 . Tren peningkatan aktivitas apoptosis untuk VSMC dan 7721 sel diamati dengan peningkatan H2 O2 konsentrasi dalam larutan (Gbr. 4b). Dengan kata lain, peningkatan ROS bergantung pada dosis, yang juga mengungkapkan median dosis mematikan (LD50 ) dari VSMC dan 7721 sel masing-masing sekitar 549 dan 556 umol/ml. Akibatnya, LD50 H2 O2 melalui stres oksidatif adalah 560 μM, yang mendekati hasil literatur [33].
Selanjutnya, efek antioksidan CNP yang didoping-C di bawah LD50 dari H2 O2 diuji menggunakan alat penghitungan sel-6 (CCK-8). Karena sifat elektroniknya yang unik, CNP yang didoping-ce memiliki kecenderungan yang melekat untuk ada dalam keadaan oksidasi ganda (Ce
3+
dan Ce
4+
) dan diberikan aktivitas antioksidan melalui perilaku oksidasi-reduksi. Saat ROS ada, Ce
4+
dapat terus dialihkan ke Ce
3+
bersama dengan aktivitas pemulungan radikal bebas yang persisten [34, 35]. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4c, hasil ini menyiratkan bahwa viabilitas sel VSMC dan 7721 sel telah ditingkatkan secara bertahap dengan peningkatan konsentrasi CNP yang didoping-C di bawah tekanan oksidatif yang sama. Khususnya, viabilitas sel dipulihkan sekitar 88,0% pada konsentrasi CNP yang didoping-ce 400 μg/ml. Akibatnya, CNP yang didoping-C menunjukkan efek antioksidan yang luar biasa dengan cara yang bergantung pada dosis melalui kemampuan pembersihan radikal bebas yang efisien.
Pewarnaan hidup-mati dan uji aliran sitometri digunakan untuk mengungkap lebih lanjut efek sito-antioksidatif dari CNP yang didoping-ce. Seperti yang digambarkan pada Gambar. 5, fluoresensi hijau intensif tanpa merah diamati pada 7721 sel yang diobati dengan CNP tunggal yang didoping-C, tetapi banyak fluoresensi merah dapat dilihat di H2 O2 pengobatan 556 uM, yang menunjukkan H2 O2 dapat menginduksi apoptosis sel secara dramatis. Tapi H2 O2 Apoptosis yang diinduksi telah dikurangi secara bertahap dengan peningkatan konsentrasi CNP yang didoping-ce. Khususnya, hanya sejumlah kecil fluoresensi merah yang dapat terlihat setelah perlakuan CNP yang didoping-ce sebesar 400 μg/ml di bawah H2 O2 -diinduksi stres oksidatif yang menunjukkan viabilitas sel yang lebih tinggi. Uji aliran cytometry lebih lanjut dilakukan untuk menyelidiki efek antioksidan dari CNP yang didoping-ce. Dalam plot pencar dari sitometri aliran variabel ganda, sinyal emisi Annexin-V-FITC diplot pada x -sumbu, sementara sinyal emisi PI diplot pada y -sumbu. Beberapa wilayah sel didefinisikan sebagai berikut:Annexin V-/PI––dianggap sebagai sel hidup, Annexin V+/PI––singkatan dari sel apoptosis awal, dan Annexin V+/PI+––mewakili sel apoptosis/nekrosis akhir. Seperti yang ditampilkan pada Gambar. 6, kelompok kontrol menunjukkan fraksi kecil dan normal dari apoptosis akhir sel sebesar 1,45%, tetapi H2 O2 pengobatan menunjukkan tingkat apoptosis akhir sel yang sangat tinggi sebesar 46,4%. Seperti yang kami harapkan, proporsi sel apoptosis yang diobati dengan konsentrasi berbeda dari CNP yang didoping-C memiliki tren penurunan bertahap. Dibandingkan dengan 46,4% sel apoptosis akhir di bawah H2 O2 pengobatan, persentase apoptosis menurun tajam menjadi 24,2, 20,0, 15,1, dan 11,2% setelah pengobatan CNP yang didoping-ce sebesar 50, 100, 200, dan 400 g/ml. Basing on the results of the live-dead staining and flow cytometry, it revealed that Ce-doped CNPs exerted favorable antioxidative effects against oxidative stress-induced apoptosis in a dose-dependent manner.
Fluorescent images of 7721 cells incubated with different concentrations of Ce-doped CNPs under H2 O2 -induced oxidative stress for 24 h by live-dead staining (scale bars = 50 μm)
Flow cytometry profiles of 7721 cells were examined to determine the percentages of early apoptosis and late apoptosis cells with different treatments
Conclusions
In summary, we reported a novel Ce-doped CNPs with the capability of scavenging free radicals. The preparation method is simple by using one-step synthesis in the bio-mineralization manner. Different from the former surface modification (such as PVP), the as-prepared Ce-doped CNPs exhibited the improvement in biocompatibility and dispersibility in aqueous solution. Furthermore, in vitro studies showed albumin-based bio-mineralization Ce-doped CNPs not only own superoxide dismutase feature but also alleviate the oxidative damage caused by H2 O2 , which have a protective effect on cells in this periods of study. Furthermore, the concentration of Ce-doped CNPs plays important roles in the recovery of apoptotic cells. Herein, the novel Ce-doped CNPs have promising biomedical applications in diseases prevention and treatment of oxidative stress-mediated.
