Preparasi Liposom Asam Glycyrrhetinic Menggunakan Lyophilization Monophase Solution Method:Preformulation, Optimization, and In Vitro Evaluation
Abstrak
Dalam penelitian ini, liposom asam glisirrhetinat (GA) berhasil dibuat menggunakan metode larutan monofase liofilisasi. Studi preformulasi terdiri evaluasi kelarutan fosfatidilkolin kedelai (SPC), kolesterol, dan GA dalam tert-butil alkohol (TBA)/air co-pelarut. Pengaruh persentase volume TBA pada tingkat sublimasi diselidiki. GA setelah liofilisasi menggunakan TBA/water co-solvent dengan persentase volume yang berbeda dikarakterisasi secara fisikokimia dengan DSC, XRD, dan FTIR. Pola XRD GA menunjukkan sifat amorf yang nyata. Hasil spektroskopi FTIR menunjukkan bahwa tidak terjadi perubahan struktur kimia. Studi kelarutan menunjukkan kelarutan air GA ditingkatkan. Formulasi optimum dan variabel pengolahan dari 508 mg SPC, 151 mg kolesterol, 55% persentase volume TBA, 4:1 trehalosa/rasio berat SPC diperoleh setelah menyelidiki melalui desain Box-Benhnken dan percobaan seleksi lyoprotectant. Di bawah kondisi optimum, diperoleh efisiensi enkapsulasi yang memuaskan (74,87%) dan diameter rata-rata (191 nm) dari liposom yang dilarutkan. Studi pelepasan obat in vitro menunjukkan bahwa liposom yang dilarutkan memiliki sifat pelepasan berkelanjutan dalam dua jenis media pelepasan. Selanjutnya, studi serapan sel in vitro mengungkapkan bahwa proses penyerapan liposom yang mengandung obat oleh sel Hep G2 bergantung pada waktu.
Latar Belakang
Glycyrrhetinic acid (GA), salah satu jenis saponin triterpen, terutama diekstraksi dari akar glycyrrhiza obat tradisional Cina [1]. Penelitian telah menunjukkan bahwa GA memiliki efek antimikroba, antivirus, dan antikanker yang jelas dan umumnya digunakan untuk pengobatan klinis hepatitis kronis dan kanker hati [2,3,4]. Menurut Sistem Klasifikasi Biofarmasi, GA adalah obat tipe II. Karena polaritas yang rendah, hidrofobisitas yang tinggi, dan kelarutan yang buruk dari molekul GA, bioavailabilitas oralnya relatif rendah [5]. Selain itu, GA dapat menyebabkan retensi natrium dan kehilangan kalium [6], yang berhubungan dengan hipertensi, sedangkan efek samping GA tampaknya tergantung pada dosis. Oleh karena itu, menggunakan strategi formulasi yang tepat untuk meningkatkan penyerapan dan mempertahankan konsentrasi efektif GA akan meningkatkan ketersediaan hayati dan keamanannya secara signifikan.
Keunggulan liposom sebagai pembawa obat telah diakui secara luas [7,8,9]. Keunggulan fungsionalnya terutama ditunjukkan melalui aspek-aspek berikut:(1) liposom memiliki biokompatibilitas dan keamanan yang baik; (2) liposom meningkatkan pengiriman obat yang ditargetkan ke kelenjar getah bening dan mengurangi efek penghambatan atau kerusakan yang dimiliki obat antikanker pada sel dan jaringan normal; (3) liposom pembawa obat berukuran tepat telah meningkatkan permeabilitas dan efek retensi di lokasi tumor padat, infeksi, dan peradangan di mana permeabilitas pembuluh darah kapiler meningkat, menunjukkan kemampuan penargetan pasif; (4) liposom dapat membawa obat hidrofobik dan larut dalam air; dan (5) permukaan liposom dapat dimodifikasi dan dihubungkan dengan gugus fungsi. Sebagai hasil dari karakteristik yang menguntungkan ini, banyak obat liposom telah disetujui.
Produk yang diperoleh dengan metode preparasi liposom konvensional adalah suspensi liposom berair. Namun, suspensi liposom berair relatif tidak stabil dan dapat bocor, melebur, dan mengalami hidrolisis fosfolipid selama penyimpanan, mengakibatkan kemampuan penyimpanan jangka panjang yang terbatas [10]. Saat ini, cara yang efektif untuk mengatasi masalah tersebut adalah dengan menyiapkan proliposom [11]. Proliposom adalah bedak dengan fluiditas yang baik yang terbuat dari komponen dan eksipien liposom yang mengalami dehidrasi. Liposom dapat direkonstruksi dengan mendispersikan proliposom dalam air sebelum aplikasi. Pengeringan semprot dan pengeringan beku adalah dua metode yang paling umum untuk preparasi proliposom [12], tetapi mereka memiliki beberapa keterbatasan dalam aplikasinya. Misalnya, pengeringan semprot tidak cocok untuk obat termosensitif, dan seringkali dapat menyebabkan masalah seperti kepatuhan dinding karena efisiensi termal peralatan yang rendah. Penataan ulang struktural dari lapisan ganda liposomal dapat terjadi selama proses pengeringan semprot [13]. Metode pengeringan beku yang umum digunakan adalah sistem suspensi air, tetapi pengeringan beku air membutuhkan waktu yang lama sehingga metode ini sangat mahal dan memakan waktu.
Metode persiapan proliposom baru (metode larutan monofase liofilisasi) telah dikembangkan dalam beberapa tahun terakhir [14, 15]. Metode ini melibatkan pelarutan lipid, obat, dan lyoprotectants yang larut dalam air dalam sistem tert-butil alkohol (TBA)/air co-pelarut, kemudian memperoleh proliposom dengan pengeringan beku, berikut penambahan air, membentuk suspensi liposom homogen. Metode ini memiliki beberapa keuntungan:(1) penambahan TBA dapat secara signifikan meningkatkan laju sublimasi es, menghasilkan liofilisasi yang cepat dan menyeluruh yang menguntungkan secara ekonomi. Pada saat yang sama, sublimasi cepat bermanfaat untuk mencegah gumpalan runtuh [16]. (2) Teknik larutan monofase liofilisasi adalah proses satu langkah, yang merupakan metode yang sangat efektif untuk preparasi liposom skala besar. (3) Meskipun tidak tercantum dalam Pedoman ICH untuk Pelarut Residual, TBA kemungkinan termasuk dalam kategori pelarut toksisitas rendah kelas 3 berdasarkan kesamaan LD50 data toksisitas untuk pelarut kelas 3 lainnya [17]. (4) Bubuk steril dapat diperoleh dengan metode ini. (5) Sangat cocok untuk obat dengan kelarutan air yang buruk atau stabilitas air yang buruk [18].
Ada beberapa laporan tentang penggunaan TBA/sistem liofilisasi air untuk preparasi liposom. Namun, penelitian tentang sistem ini tidak memadai dan masih banyak pertanyaan. Misalnya, variasi laju sublimasi sistem TBA/air dengan konsentrasi berbeda, perubahan sifat zat padat dari obat tertentu setelah liofilisasi oleh sistem TBA/air dengan konsentrasi berbeda, dan proses hidrasi dan perakitan serbuk terliofilisasi adalah masih belum jelas. Di sisi lain, kelarutan obat hidrofobik tertentu dalam co-pelarut TBA/air dengan proporsi dan suhu yang berbeda sangat spesifik. Informasi di atas sangat penting untuk formulasi dan desain teknologi liposom pembawa obat. Oleh karena itu, dalam penelitian ini, kami menggunakan GA sebagai obat model untuk melakukan penyelidikan praformulasi seperti dijelaskan di atas. Selanjutnya, menggunakan diameter rata-rata dan efisiensi penjeratan sebagai ukuran evaluasi utama, kami mengoptimalkan formulasi dan variabel pemrosesan GA-liposom yang disiapkan dengan metode larutan monofase liofilisasi menggunakan desain Box-Benhnken. Efek dari jenis pelindung liofilisasi pada kualitas liposom dievaluasi, seperti pelepasan liposom in vitro dan penyerapannya oleh sel hepatoma.
Metode/Eksperimental
Materi
Glycyrrhetinic acid (> 98% murni) diperoleh dari Dalian Meilun Biology Technology Co., Ltd. (Dalian, China). Fosfatidilkolin kedelai (Lipoid S100) dibeli dari Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Jerman). Kolesterol dibeli dari J&K Scientific Ltd. (Beijing, China). Senyawa referensi GA dibeli dari National Institutes for Food and Drug Control (Beijing, China). FITC-PEG-DSPE (berat molekul 2000) dibeli dari Shanghai Ponsure Biotech, Inc. (Shanghai, China). Tert-butil alkohol (> 98%) dan semua reagen lainnya, jika tidak ditentukan lain, dibeli dari Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Beijing, China). Air deionisasi disiapkan oleh sistem pemurnian air Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA).
Studi Kelarutan GA, SPC, dan Kolesterol dalam Sistem Co-solvent TBA/Air
Larutan TBA-air jenuh (30 ml) GA dengan persentase volume TBA yang berbeda disiapkan dengan mengaduk kelebihan obat dalam pembawa yang sesuai pada 25 °C, 30 °C, 35 °C, 40 °C, dan 45 °C selama 72 jam. Setelah sentrifugasi (15 menit pada 3000 rpm), supernatan dilewatkan melalui filter mikropori 0,45 m. Kelarutan saturasi GA diukur dengan HPLC setelah pengenceran yang memadai. Tiga ulangan dilakukan di setiap ko-pelarut TBA/air. Analisis HPLC dilakukan pada sistem HPLC LabAlliance (model Seri III) (Lab Alliance, Tianjin, Cina) yang dilengkapi dengan pompa kuaterner, autosampler, dan kompartemen kolom, yang digabungkan dengan detektor UV. Pemisahan dilakukan pada kolom C18 (4,6 mm × 250 mm; 5 μm; Dikma Technologies, Beijing, China); metanol dan air (90:10 V /V ) digunakan sebagai fase gerak pada laju alir 1,0 ml/menit. Analit dideteksi oleh detektor UV pada 250 nm.
Kelarutan fosfatidilkolin kedelai (SPC) (atau kolesterol) dalam sistem ko-pelarut TBA/air diperkirakan menggunakan metode turbidimetri [19, 20]. Secara singkat, 10 mg SPC (atau kolesterol) dilarutkan dalam TBA pada 25 °C, 30 °C, 35 °C, 40 °C, dan 45 °C untuk mendapatkan larutan yang jernih; suhu dipertahankan selama percobaan. Peningkatan jumlah air murni pada suhu yang sama ditambahkan ke larutan TBA SPC (atau kolesterol) pada 25 °C sampai kekeruhan pertama kali terjadi, dan nilai volume air kritis dicatat. Kekeruhan dapat diidentifikasi dengan mendeteksi nilai penyerapan pada 655 nm (> 0,04) terhadap larutan blanko (air murni) pada spektrofotometer UV-Vis model T6 (Purkinje General Instrument Co., Ltd., Beijing).
Preparasi Liposom Menggunakan Metode Solusi Monofase Liofilisasi
GA, SPC, dan kolesterol dilarutkan dalam TBA pada 45 °C, dan lyoprotectant yang larut dalam air seperti manitol, laktosa, sukrosa, dan trehalosa dilarutkan dalam air 45 °C. Kemudian kedua larutan ini dicampur dalam perbandingan yang sesuai untuk mendapatkan larutan monofase isotropik bening ketiga (volume total 60 ml). Setelah larutan monofase disterilkan dengan penyaringan melalui pori-pori 0,22 m, larutan tersebut diisikan ke dalam vial pengering beku 10 ml dengan volume pengisian 2,0 ml. Setelah dibekukan selama 12 jam pada 40 °C, pengeringan beku dilakukan pada suhu rak 50 °C selama 24 jam dengan tekanan ruang 1–20 Pa dalam lyophilizer (SJIA-10N, Ningbo Shuangjia Science Technology Development Co., Ltd., Cina).
Pengukuran Ukuran Partikel dan Efisiensi Enkapsulasi Liposom
Suspensi liposom dibuat dengan menambahkan 5 mg bubuk proliposom ke dalam 5 ml air murni dan vortex agitasi berikutnya selama 1 menit dua kali dengan interval 15 menit untuk hidrasi lengkap. Analisis ukuran liposom dicirikan dengan menggunakan penganalisis ukuran partikel laser (Nano ZS90 Malvern Instruments, UK).
Efisiensi enkapsulasi GA dalam liposom ditentukan dengan teknik ultrafiltrasi-sentrifugasi. Secara singkat, pipet 1 ml dispersi liposom (500 μg proliposom dalam 5 ml air murni) ke dalam labu ukur 10 ml, diikuti dengan menambahkan 5 ml air murni, 2 ml aseton, dan encerkan hingga 10 ml dengan air murni. Pindahkan 0,5 ml suspensi ini ke dalam ruang atas filter sentrifus (Amicon Ultra-0,5, Millipore, Cdduounty Cork, Irlandia) dengan potongan berat molekul 50 kDa, yang disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 30 menit pada 15 °C menggunakan sebuah ultrasentrifugasi (CP70MX, Hitachi Koki Co., Ltd., Jepang). Kemudian, 20 l ultrafiltrat disuntikkan ke dalam sistem HPLC pada panjang gelombang serapan UV 250 nm, dan kandungan GA disebut kandungan obat bebas. Efisiensi enkapsulasi (EE) dihitung menurut persamaan berikut
dimana Agratis adalah jumlah obat gratis dan Ajumlah adalah jumlah obat total.
Penentuan Laju Sublimasi Campuran TBA/Air
Satu mililiter campuran TBA/air dengan persentase volume TBA yang berbeda (10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, dan 90%) dimasukkan ke dalam botol pengering beku 10 ml , masing-masing. Campuran TBA/air dibekukan terlebih dahulu pada 40 °C selama 12 jam dan kemudian diliofilisasi dengan liofilisasi (SJIA-10N, Ningbo Shuangjia Science Technology Development Co., Ltd., China) pada 50 °C. Waktu dicatat ketika campuran TBA/air benar-benar hilang dari botol pengering beku, dan laju sublimasi dihitung dengan membagi volume (μl) dengan waktu (menit).
Penentuan Tekanan Uap Jenuh dari TBA/Campuran Air
Rincian peralatan eksperimental dan prosedur operasi dijelaskan di tempat lain [21, 22]. Tekanan uap sistem TBA/air (10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, dan 90%) diukur dengan metode statis. Peralatan terdiri dari ebulliometer kerja yang diisi dengan campuran TBA/air, ebulliometer referensi yang diisi dengan air murni, bejana penyangga, dua kondensor, dua pengukuran suhu, dan sistem kontrol tekanan. Tekanan kesetimbangan sistem ditentukan oleh suhu didih air murni dalam ebulliometer referensi dalam hubungan suhu-tekanan yang diwakili oleh persamaan Antoine [23].
Penentuan Kelarutan GA
Kelarutan dalam air GA bebas ditentukan dengan menambahkan kelebihan GA (10 mg) ke 10 ml air murni di bawah pengadukan magnetik (300 rpm) dalam penangas air yang dikontrol secara termostatik (DF-101S, Henan Yuhua instrument Co., Ltd., Cina) pada 25 °C hingga keseimbangan tercapai (48 jam). Sampel disaring melalui filter membran 0,45 m, yang diencerkan dengan metanol, dan dianalisis dengan HPLC [24]. Eksperimen dilakukan dalam rangkap tiga.
Pengamatan Morfologi Permukaan Campuran TBA/Air Pra-beku
Lima mililiter campuran air/tert-butanol dituangkan ke dalam Cawan Petri 90 mm, kemudian dibekukan dalam perangkap dingin (− 40 °C); sampel beku diamati menggunakan mikroskop optik XSP-4C (Shanghai Changfang Optical Instrument Co. Ltd., Shanghai, China).
Mikroskop Transmisi Elektron
Penampilan liposom diamati dengan mikroskop elektron transmisi (TEM) Hitachi HT7700 (Hitachi, Jepang) pada tegangan percepatan 100 kV. Suspensi liposom diperoleh dengan menambahkan 5 mg bubuk proliposom ke dalam 5 ml air murni pada suhu kamar, dicampur dengan vortex selama 10 detik, kemudian didiamkan selama 30 detik. Setetes ditarik dengan mikropipet kemudian ditempatkan pada kisi tembaga berlapis karbon. Kelebihan suspensi dihilangkan dengan blotting grid dengan kertas saring. Pewarnaan negatif menggunakan larutan asam fosfotungstat 1% (w /dengan , pH 7,1) langsung dibuat pada deposit. Kelebihannya dihilangkan dengan kertas saring dan endapan dibiarkan kering sebelum dianalisis.
Spektroskopi Inframerah Transformasi Empat
Spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR) sampel diperoleh pada spektrofotometer FTIR Nicolet 6700 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Setiap sampel dan kalium bromida dicampur dengan mortar batu akik dan dikompres menjadi piringan tipis. Rentang pemindaian adalah 4000–400 cm
−1
dan resolusinya adalah 4 cm
−1
.
Kalorimetri Pemindaian Diferensial
Pengukuran kalorimetri pemindaian diferensial (DSC) dilakukan pada kalorimeter pemindaian HSC-1 DSC (Hengjiu Instrument, Ltd., Beijing, China). Sampel 15 mg ditempatkan dalam panci aluminium dan disegel dalam cetakan sampel. Probe dipanaskan dari 25 hingga 350 °C dengan kecepatan 10 °C/menit di bawah atmosfer nitrogen.
Difraksi sinar-X
Sifat struktural sampel diperoleh dengan menggunakan difraktometer sinar-X Fokus D8 (Bruker, Jerman) dengan radiasi Cu-Kα. Pengukuran dilakukan pada tegangan 40 kV dan 40 mA. Sampel dipindai dari 5 ° hingga 60 °, dan kecepatan pemindaian adalah 5 °/menit.
Stabilitas Proliposom GA
Serbuk proliposom GA dipindahkan ke dalam botol kaca, diisi dengan nitrogen, disegel, dan disimpan jauh dari cahaya pada suhu kamar. Pengujian stabilitas dilakukan selama 6 bulan dengan menggunakan indeks efisiensi penjeratan dan ukuran partikel liposom yang dilarutkan.
Pelepasan Obat In Vitro
Pelepasan GA dari liposom diamati menggunakan metode dialisis pada suhu 37 ± 0,5 °C. Setelah menyusun kembali liposom dalam PBS (pH 7,4) atau normal saline untuk membuat 0,5 mg/ml GA, alikuot dari setiap dispersi liposom (5 ml) ditempatkan dalam kantong dialisis (pembatasan berat molekul 8000-14,000 Da) dan tertutup rapat. Kemudian, tabung direndam dalam 150 ml media pelepas, PBS (pH 7,4), atau normal saline yang mengandung 0,1% (v /v ) Tween 80 untuk menjaga kondisi sink [25, 26]. Sambil mengaduk media pelepasan menggunakan pengaduk magnet pada 300 rpm, sampel (1,5 ml) diambil pada interval waktu yang telah ditentukan dari media pelepasan selama 12 jam, yang diisi ulang dengan volume media segar yang sama. Konsentrasi GA ditentukan dengan HPLC setelah pengenceran yang sesuai dengan metanol.
Serapan Seluler In Vitro
Liposom fluoresensi dibuat dengan metode larutan monofase liofilisasi. Secara singkat, campuran 30 mg GA, 254 mg SPC, 75,5 mg kolesterol, dan 21,2 mg FITC-PEG-DSPE dilarutkan dalam TBA. Selanjutnya, 1016 mg trehalosa dilarutkan dalam air. Kemudian kedua larutan tersebut dicampur untuk mendapatkan larutan monofase yang jernih (volume total 30 ml). Setelah larutan monofase disterilkan dengan penyaringan melalui pori-pori 0,22 m, larutan tersebut diisikan ke dalam vial pengering beku 10 ml dengan volume pengisian 2,0 ml, kemudian diliofilisasi selama 24 jam dan ditambahkan air untuk menyusun kembali liposom sampai digunakan.
Sel-sel HepG2 (Wanleibio, Co., Ltd., Shenyang, China) dikultur dalam DMEM dengan 10% FBS (serum janin sapi). Sel-sel disepuh sampai 90% pertemuan dicapai di piring 6-sumur, dan sel-sel dikultur dalam inkubator yang dilembabkan pada 37,0 °C dengan 5,0% CO2 . Setelah inkubasi 24 jam, 200 μl suspensi liposom FITC-GA ditambahkan ke 1 ml suspensi sel HepG2 (1 × 10
4
sel per sumur). Setelah inkubasi selama 0,5 jam, 1 jam, 2 jam, dan 4 jam, sel dicuci tiga kali dengan pH 7,4 PBS, dan fluoresensi ekstraseluler dipadamkan dengan 0,4% (w /v ) larutan trypan blue. Sel dilisiskan dengan 1% (w /v ) Triton X100. Intensitas fluoresensi lisat seluler pada eksitasi 495 nm dan emisi 520 nm diukur menggunakan spektrofotometer fluoresensi RF5301 (Shimadzu, Tokyo, Jepang). Nilai fluoresensi relatif diubah menjadi konsentrasi fosfolipid berdasarkan kurva standar konsentrasi fosfolipid versus intensitas fluoresensi FITC yang diukur dalam buffer lisis sel. Konsentrasi protein ditentukan menggunakan alat uji protein BCA (Pierce, Rockford, IL, USA). Serapan dinyatakan sebagai jumlah fosfolipid versus per miligram protein seluler [27].
Hasil dan Diskusi
Studi Preformulasi
Studi Kelarutan
Karena liposom dibuat menggunakan metode larutan monofase liofilisasi, studi kelarutan dilakukan untuk memastikan bahwa obat dan bahan pembawa dapat larut dalam larutan TBA/air sebelum liofilisasi.
Gambar 1 menunjukkan perubahan kelarutan jenuh GA dalam sistem co-solvent TBA/air dengan persentase volume yang berbeda. Dalam 25 °C hingga 45 °C, kelarutan jenuh GA terus meningkat dengan meningkatnya persentase volume TBA dari 10 menjadi 60%, dan kelarutan jenuh GA adalah> 0,5 mg/ml ketika persentase volume TBA> 40%. Di sisi lain, kelarutan jenuh GA meningkat dengan meningkatnya suhu larutan TBA/air, bila dipertahankan pada persentase volume yang sama. Perbedaan kelarutan pada suhu yang berbeda menjadi semakin nyata ketika persentase volume TBA mencapai 30%. Kelarutan fosfolipid kedelai dan kolesterol dalam sistem ko-pelarut TBA/air ditunjukkan pada grafik kolom bertumpuk (Gbr. 2). Gambar 2a, b menunjukkan volume campuran TBA/air yang dibutuhkan untuk satu unit (1 mg) fosfolipid dan kolesterol untuk mencapai kelarutan jenuh pada suhu yang berbeda, masing-masing. Area abu-abu mewakili volume air dan area hitam mewakili volume TBA. Saat suhu meningkat secara bertahap dari 25 menjadi 45 °C, total volume TBA/pelarut air dan persentase volume TBA (label pada kolom) yang diperlukan untuk melarutkan 1 mg fosfolipid menurun secara bertahap (Gbr. 2a). Karena suhu meningkat melebihi 35 °C, volume TBA yang dibutuhkan berkurang secara signifikan dan berada di bawah 0,15 ml. Demikian pula, ketika suhu meningkat secara bertahap dari 25 menjadi 45 °C, terjadi pengurangan volume TBA yang diperlukan untuk melarutkan 1 mg kolesterol, sedangkan persentase volume TBA menunjukkan kecenderungan penurunan secara bertahap. Hasil di atas menunjukkan bahwa suhu dan persentase volume TBA sangat mempengaruhi kelarutan fosfolipid, kolesterol, dan GA.
Kelarutan jenuh GA dalam co-solvent TBA/air dengan persentase volume yang berbeda (rata-rata ± SD, n = 3)
Kelarutan SPC (a ) dan kolesterol (b ) dalam co-solvent TBA/air dengan persentase volume yang berbeda
Perbandingan Laju Sublimasi Sistem Co-solvent TBA/Air dengan Persentase Volume Berbeda
Tingkat sublimasi secara langsung mempengaruhi efisiensi produksi bubuk lyophilized. Laju sublimasi yang lebih cepat lebih ekonomis dan dapat mencegah keruntuhan material [16]. Dalam studi ini, kami menguji tingkat sublimasi dari berbagai konsentrasi TBA/sistem air. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3, tingkat sublimasi pelarut campuran secara bertahap meningkat seiring dengan peningkatan persentase volume TBA dari 10 menjadi 90%. Selanjutnya, tingkat sublimasi mencapai di atas 10 μl/menit karena persentase volume melebihi 60%.
Laju sublimasi TBA/air co-solvent dengan persentase volume yang berbeda (rata-rata ± SD, n = 3)
Untuk mengetahui penyebab perbedaan laju sublimasi TBA dengan persentase volume yang berbeda, terlebih dahulu dilakukan pemeriksaan morfologi permukaan sampel beku. Gambar 4 berisi gambar mikroskopis optik dari TBA/larutan air dengan persentase volume 40% hingga 80% (TBA dengan persentase volume < 30% tidak dapat diperiksa karena cepat meleleh di bawah mikroskop optik). Dibandingkan dengan TBA dengan persentase volume 40%, TBA dengan volume> 50% memiliki struktur berbentuk jarum yang jelas dan tersebar. Kami berspekulasi bahwa dengan meningkatnya persentase volume TBA, diameter kristal berbentuk jarum menjadi lebih kecil, menghasilkan peningkatan luas permukaan spesifik dan oleh karena itu meningkatkan laju sublimasi.
Morfologi permukaan TBA/air co-pelarut persentase volume TBA yang berbeda dengan mikroskop optik (pembesaran × 100). a 40%. b 50%. c 60%. d 70%. e 80%
Selain itu, kami juga mengukur tekanan uap jenuh sistem ko-pelarut TBA/air dengan persentase volume yang berbeda pada 25 °C. Gambar 5 adalah grafik batang perubahan tekanan uap jenuh sistem ko-pelarut TBA/air dengan persentase volume TBA yang berbeda. Seperti yang ditunjukkan pada gambar, tekanan uap jenuh dari pelarut campuran cenderung meningkat secara bertahap dengan meningkatnya persentase volume TBA. Karena suhu berkorelasi positif dengan tekanan uap jenuh, sesuai dengan persamaan Antoine (Persamaan 2), kita dapat menyimpulkan bahwa tekanan uap jenuh sistem ko-pelarut di bawah suhu liofilisasi (− 50 °C) akan meningkat seiring dengan persentase volume TBA meningkat, dan ini mungkin salah satu alasan peningkatan bertahap dalam tingkat sublimasi.
$$ {\log}_{10}p=A-\frac{B}{T} $$ (2)
dimana p adalah tekanan uap, T adalah suhu, A dan B adalah konstanta khusus komponen.
Tekanan uap jenuh TBA/air co-solvent dengan persentase volume yang berbeda (rata-rata ± SD, n = 3)
Pengaruh Liofilisasi Terhadap Sifat Fisik dan Kimia GA Dalam Sistem Co-solvent TBA/Air dengan Persentase Volume Berbeda
Untuk mengetahui pengaruh liofilisasi terhadap sifat fisikokimia GA dalam sistem ko-pelarut TBA/air, dilakukan percobaan sebagai berikut. Sepuluh miligram GA dilarutkan dalam 8 ml TBA/pelarut air dengan persentase volume TBA yang berbeda (40%, 50%, 60%, 70%, dan 80%). Setelah larutan monofase disterilkan dengan penyaringan melalui pori-pori 0,22 m, larutan tersebut diisikan ke dalam vial pengering beku 10 ml dengan volume pengisian 2,0 ml. Pengeringan beku dilakukan pada 50 °C selama 24 jam dengan lyophilizer.
Spektrum DSC dari bubuk lyophilized setelah melarutkan GA dalam sistem co-solvent TBA/air dengan persentase volume TBA yang berbeda ditunjukkan pada Gambar. 6a. Kurva DSC obat mentah menunjukkan puncak endotermik yang jelas pada 301 °C, yang merupakan titik leleh GA. Liofilisasi dalam sistem co-solvent TBA/air dengan persentase volume TBA yang berbeda menyebabkan pergeseran ke depan dari puncak leleh GA. Besarnya pergeseran puncak leleh meningkat seiring dengan penurunan persentase volume TBA.
DSC (a ), XRD (b ), dan FTIR (c ) GA setelah liofilisasi dalam co-solvent TBA/air dengan persentase volume yang berbeda; (a) GA, (b) 40% TBA, (c ) 50% TBA, (d) 60% TBA, (e) 70% TBA, dan (f) 80% TBA
Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa konsentrasi TBA dapat sangat mempengaruhi pembentukan campuran kompleks fase kristal, amorf, atau metastabil [28]. Dalam beberapa kasus, penggunaan TBA dapat mengakibatkan penurunan kristalinitas, dan kasus lain sebaliknya [29].
Spektrum difraksi sinar-X (XRD) dari bubuk terliofilisasi setelah melarutkan GA dalam sistem ko-pelarut TBA/air dengan persentase volume TBA yang berbeda ditunjukkan pada Gambar 6b. Spektrum XRD dari obat mentah menunjukkan beberapa puncak difraksi kristal yang berbeda antara 5° dan 20°. Liofilisasi dalam sistem ko-pelarut TBA/air dengan persentase volume TBA yang berbeda menyebabkan hilangnya puncak difraksi pada 5° hingga 20° dalam spektrum XRD sampel. Ini menunjukkan bahwa kristal obat asli telah menjadi amorf.
Spektrum FTIR dari bubuk lyophilized setelah melarutkan GA dalam sistem co-pelarut TBA/air dengan persentase volume TBA yang berbeda ditunjukkan pada Gambar. 6c. Bentuk spektrum FTIR obat mentah konsisten dengan bentuk bubuk lyophilized dalam sistem ko-pelarut TBA/air dengan persentase volume TBA yang berbeda dalam 4000–400 cm
−1
jangkauan. Tidak munculnya puncak karakteristik untuk gugus fungsi baru, menunjukkan bahwa struktur kimia GA tetap sama setelah liofilisasi di TBA dengan persentase volume yang berbeda.
Perubahan dari kristal ke bentuk amorf dapat mengubah kelarutan obat sehingga mempengaruhi enkapsulasi proliposom selama rekonstruksi terhidrasi. Dalam penelitian ini, kami mengukur kelarutan air dari bubuk GA terliofilisasi pada 25 °C. Kami menemukan bahwa kelarutan jenuh dari GA terliofilisasi dalam air menurun secara bertahap dari 64,10 menjadi 19,27 g/ml karena persentase volume TBA meningkat dari 40 menjadi 80%. Namun, itu masih jauh lebih tinggi daripada kelarutan dalam air obat mentah (6,36 μg/ml) yang menunjukkan bahwa perubahan dari struktur kristal ke amorf selama liofilisasi memang mempengaruhi kelarutan obat mentah (Gbr. 7).
Kelarutan dalam air dari liofilisasi GA dalam pelarut bersama TBA/air dengan persentase volume yang berbeda (rata-rata ± SD, n = 3)
Eksperimen Faktor Tunggal
Ada banyak faktor yang dapat mempengaruhi kualitas liposom. Telah diketahui dengan baik bahwa rasio fosfolipid/obat memiliki efek pada kualitas enkapsulasi obat [30]. Kolesterol dalam jumlah sedang dapat meningkatkan keteraturan dan stabilitas membran lipid. However, high content of cholesterol in the liposome can decrease the flexibility of membrane and thereby hinder the penetration of drug into the lipid bilayer [31]. In this study, we selected three factors that impact on liposome quality and performed a single-factor study to determine the appropriate values for subsequent optimization tests, including quantity of SPC, quantity of cholesterol, and volume percentage of TBA in the co-solvent. The quality of liposomes was evaluated in terms of encapsulation efficiency and mean diameter. Each experiment was performed in triplicate with all other parameters set to constant value, GA 60 mg, pre-freeze temperature − 40 °C, pre-freeze time 12 h. In this study, we compared the results via a scoring system, giving equal weight to both encapsulation rate and mean diameter. Scoring was conducted as follows:
where EE is encapsulation efficiency, MEE is maximum encapsulation efficiency of the group, MD is mean diameter, and MMD is maximum mean diameter of the group.
The experimental design and result are shown in Table 1. As can be seen in the table, within the range tested in this experiment, the highest score can be obtained separately when the amount of SPC is 480 mg (drug-SPC ratio of 1:8, w /dengan ), the amount of cholesterol is120 mg (cholesterol-SPC ratio of 1:4, w /dengan ), and volume percentage of TBA in the co-solvent is 50%. Therefore, these parameters were chosen as the center level of response surface optimization design, respectively.
Parameter Optimization by Box-Benhnken Design
To further study the interactions between the various factors, parameter optimization was performed by Box-Benhnken design. Based on the results of single-factor experiments, we investigated and optimized the interactions between the parameters, including quantity of SPC (X1 ), quantity of cholesterol (X2 ), volume percentage of TBA (X3 ) by Box-Benhnken design (BBD). Encapsulation efficiency (Y1 ) and mean diameter (Y2 ) were selected as responses. Optimization process was undertaken with desirability function to optimize the two responses simultaneously. We suppose that Y1 and Y2 have the same weightiness (importance). Y1 had to be maximized, while Y2 had to be minimized. The desirable ranges are from 0 to 1 (least to most desirable). Experimental design and results are shown in Table 2. To find the most important effects and interactions, analysis of variance (ANOVA) was calculated by statistical software, Design Expert trial version 8.03 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, USA). Two quadratic models were selected as suitable statistical model for optimization for two responses encapsulation efficiency and mean diameter. The results of ANOVA relating encapsulation efficiency as response were shown in Table 3, indicating that the model was significant for all factors investigated with F value of 12.81 (P < 0,05). In this case, X1 , X2 , X1X2 , X1X1 , X2X2 were significant model terms (P < 0.05), demonstrating that the influences of the factors (X1 and X2 ) on encapsulation efficiency were not simply linear. The interaction terms were notably significant, indicating good interactions between the factors. On the contrary, the ANOVA results relating mean diameter as response (Table 3) indicated that the model was not significant for all factors investigated with F value of 1.9 (P > 0.05). In this case, X3 were significant model terms (P < 0.05), demonstrating that volume percentage of TBA have significant influence on mean diameter, while quantity of SPC (X1 ) and quantity of cholesterol (X2 ) do not have a significant effect (P > 0.05). Moreover, there were no significant interactions between the three variables.
In order to provide a better visualization of the effect of the independent variables on the two responses and desirability value, three-dimensional profiles of multiple non-linear regression models are depicted in Fig. 8. Figure 8a–f presented the interaction of X1 , X2 , and X3 under encapsulation efficiency and mean diameter as response respectively. The three-dimensional profiles demonstrated how three pairs of parameters affect the encapsulation efficiency and mean diameter of reconstituted liposomes. For encapsulation efficiency, all the three surfaces are upper convex (Fig. 8a–c), with a maximum point in the center of the experimental domain, which demonstrated that there are good interactions between the three variables. For mean diameter, the shape of Fig. 8d is similar to flat surface, indicating that X1 and X2 have less effect on mean diameter. The surface contours of Fig. 8e, f both showed a slope; the mean diameter was decreased by increasing the volume percentage of TBA, indicating that factor X3 had an obvious effect on mean diameter but there was no obvious interaction between X3 and the other two factors.
Three dimensional plots of the effect of X X (a ), X X (b ) and X X (c ) on encapsulation efficiency and the effect of X X (d), X X (e) and X X (f) on mean diameter
Based on the quadratic model, the optimal conditions for liposomes preparation calculated by software were as follows:508 mg phospholipid quantity, 151 mg cholesterol quantity, and 55% volume percentage of TBA. Under these conditions, the encapsulation efficiency and mean diameter were found to be 68.55% and 220 nm, respectively.
Selection of the Type and Dosage of Lyoprotectant
Competition for liquid water between the growing ice crystals and the hydrophilic substances (including the hydrophilic portion of the lipid membrane) during freezing leads to adhesion of ice crystals to the phospholipid groups. This can result in damage to the lipid membrane. Lipid membrane fusion following rehydration causes an increase in particle size and leakage of encapsulated drug. Lyoprotectant can reduce liposomal damage during the freeze-thaw process [32]. In this study, we investigated the effect of various types (lactose, sucrose, trehalose, mannitol) and dosage (lyoprotectant to SPC ratio was 1:2, 1:1, 2:1, 4:1, and 6:1 w /dengan ) of lyoprotectant on scores of reconstituted liposome. Single-factor experiments were performed while maintaining all other variables constant:GA amount of 60 mg, SPC amount of 508 mg, cholesterol amount of 151 mg, volume percentage of TBA in the co-solvent of 55%, pre-freeze temperature of − 40 °C, pre-freeze time of 12 h. Experimental results are shown in Fig. 9. The encapsulation efficiency increases firstly and then decreases by decreasing lyoprotectant/SPC weight ratio from 1:2 to 1:6, wherein lactose, sucrose, and mannitol are respectively used as lyoprotectant. However, the encapsulation efficiency of the trehalose group increases constantly with decreasing lyoprotectant/SPC weight ratio (Fig. 9a). In terms of the mean diameter (Fig. 9b), it was found that the mean diameter was greater than 218 nm for lactose, sucrose, and mannitol group in the range from 1:2 to1:6. Nevertheless, the mean diameter of trehalose group can be reduced to less than 190 nm when lyoprotectant/SPC weight ratio is more than 4:1; obviously, the protective effect of trehalose is better than other lyoprotectants tested. Trehalose has a good protection ability for membrane, perhaps because of the formation of hydrogen bonds with the polar head groups of lipids, and disruption of the tetrahedral hydrogen bond network of water [33]. According to scores (Fig. 9c), the highest score (0.24) was obtained when trehalose/SPC weight ratio is 4:1 and 6:1. Finally, we choose trehalose and 4:1 (trehalose/SPC weight ratio) for following experiments from the perspective of cost and increasing drug loading.
The effect of mass ratio between cryoprotectant and SPC on encapsulation efficiency (a ), mean diameter (b ) and scores (c ) of reconstituted liposomes (mean ± SD, n =3)
Through the above Box-Benhnken design and lyoprotectant screening experiment, the experimental conditions were determinated:GA amount of 60 mg, SPC amount of 508 mg, cholesterol amount of 151 mg, volume percentage of TBA in the co-solvent of 55%, weight ratio of trehalose to SPC was 4:1. Under these conditions, the encapsulation efficiency and mean diameter were 74.87% and 191 nm, respectively.
Transmission Electron Microscopy
In this study, TEM of liposomes suspension was taken at the same time point (same hydration time). We have observed different states in the sample, which could explain the self-assembly behavior of the liposomes. Figure 10a shows the initial state of hydration; it can be seen that a large amount of GA (black dots) is wrapped in dispersed phospholipids (translucent material), and spontaneous aggregation of the phospholipid fragments occurs. Figure 10b shows the morphology of fully assembled liposomes (average diameter of about 200 nm), which were nearly spherical with a phospholipid bilayer structure (the light-gray portion). Moreover, the drug particles (dark gray dots) were entrapped in the lipid bilayer.
Transmission electron micrographs of reconstituted liposomes, (a ) initial state of hydration of proliposomes, (b ) fully assembled liposomes
Stability of GA Proliposome
After 6 months, the proliposome powders have a good mobility and an unaltered appearance. The liposome suspension formed automatically when in contact with purified water. The entrapment efficiency and particle size of the reconstituted liposome were 72.82% and 198 nm. There is no significant difference from the data of the reconstituted liposome 6 months before. Therefore, the GA proliposome could be considered stable at 25 °C for over 6 months.
In Vitro Drug Release Studies
Evaluation of in vitro drug release from encapsulated liposome was done by dialysis method. The in vitro release profiles of GA from GA-loaded liposomes at 37 °C in PBS (pH 7.4) and physiological saline solution are shown in Fig. 11. The release profile of both group showed a fast release (the larger slope) within 1 h, then curve slope becomes smaller after 1 h, the release rate begins to slow down. The drug-release curve shapes of physiological saline solution group are similar to PBS group. The in vitro release of GA from the GA-loaded liposomes was 65.25 ± 4.82% and 69.46 ± 4.32% from PBS and physiological saline solution in 12 h. No significant difference (P = 0.088, paired t test, SPSS software17.0) was found for the release of GA at different release medium over the entire study period, which demonstrated that the reconstituted liposomes have both sustained-release performance in two kinds of release medium.
In vitro dissolution profiles of GA from GA-loaded liposomes in a PBS and b physiological saline solution (mean ± SD, n = 3)
In Vitro Cell Uptake
Figure 12a showed that the uptake process of GA-liposomes by Hep G2 cells is time-dependent under the experimental concentrations. After incubation for 30 min, the uptake amounts of drug-loaded liposomes (unit mass protein) by Hep G2 cells were 1480 ng. In the range from 30 to 240 min, the uptake amounts of drug-loaded liposomes (unit mass protein) were gradually increased from 1480 to 2030 ng. Figure 12b–e showed fluorescence microscopy images of Hep G2 cells at 30, 60, 120, and 240 min after ingestion of drug-loaded liposomes, and it is observed that the fluorescence intensity is also gradually increased over time. This result indicates that the reconstituted liposomes prepared by monophase solution method can be effectively uptaken by the hepatoma cells.
In vitro cellular uptake of GA-loaded liposomes by Hep G2 cells. a The uptake amount versus incubation time. b –e Fluorescence microscopy images at 30, 60, 120, and 240 min
Conclusions
In the present work, preformulation investigation, formulation design along with in vitro characterization of GA-loaded liposomes by lyophilization monophase solution method have been done. After carrying out a preformulation study, we found that solubility of GA, cholesterol, and SPC in TBA/water co-solvent was substantially increased when temperature was over 40 °C. Sublimation rate of co-solvent gradually increased with increasing TBA volume percentage, which perhaps relate to surface morphology of the frozen co-solvent and saturated vapor pressure. After lyophilization using TBA/water co-solvent system, GA became amorphous structure; moreover, water solubility increased. This may have an effect on proliposome encapsulation during hydrated reconstruction. After optimization by Box-Benhnken design and screening of lyoprotectant, the optimum conditions (508 mg SPC, 151 mg cholesterol, 55% volume percentage of TBA, 4:1 trehalose/SPC weight ratio) for lyophilization monophase solution process were achieved. Under the optimum conditions, satisfactory encapsulation efficiency (74.87%) and mean diameter (191 nm) of reconstituted liposomes were obtained. The reconstituted liposomes resulted in initial assemble and final spherical shape, as confirmed by TEM analysis. The in vitro release profile of the produced GA-loaded liposome was investigated in the two media and it both showed prolonged release during 12 h. Cellular uptake studies showed that the uptake process of reconstituted liposomes by Hep G2 cells is time-dependent.
