Optimisasi Liposom Beredar Lama Memuat Daidzein: Bioavailability Oral yang Ditingkatkan dan Rilis Terpantau

Abstrak

Kami mengembangkan formulasi liposom beredar lama memuat daidzein (DLCL) dengan menggabungkan ultrasonikasi dengan teknik hidrasi film lipid. Desain ortogonal mengidentifikasi parameter optimal: rasio mol fosfatidilkolin kedelai (SPC) terhadap kolesterol 55:40, rasio massa obat terhadap lipid 1:10, 5 % DSPE-mPEG2000, hidrasi 50 °C, dan sonikasi 24 menit. Dalam kondisi ini, DLCL mencapai efisiensi enkapsulasi 85,3 ± 3,6 % dan pemuatan obat 8,2 ± 1,4 %. Studi rilis menunjukkan bahwa DLCL memperpanjang waktu kumulatif rilis empat kali lipat pada pH 1,2 dan dua kali lipat pada pH 6,9 relatif terhadap daidzein bebas. Pada tikus Sprague-Dawley, satu dosis oral 30 mg kg⁻¹ DLCL menghasilkan waktu tinggal rata-rata (MRT) dan waktu paruh (t½) yang masing-masing 1,6- dan 1,8-kali lipat lebih lama, serta peningkatan 2,5-kali lipat AUC₀–t. Temuan ini mengonfirmasi bahwa DLCL mengurangi metabolisme first-pass, meningkatkan penyerapan oral, dan memberikan rilis berkelanjutan daidzein.

Latar Belakang

Daidzein adalah isoflavon yang hanya muncul dalam kedelai dan legum related. Profil terapeutiknya melindungi jantung, mengurangi gejala menopauza, mencegah osteoporosis, mengurangi risiko kanker terkait hormon, dan aktivitas anti-inflamasi. Namun, sifatnya yang tidak baik baik hidrofilik maupun lipofilik, coupled dengan glukuronidasi dan sulfasi yang cepat di usus, membatasi bioavailability oralnya. Strategi terbaru—kompleks fosfolipid, mikel terorganisasi sendiri, dan nanopartikel PLGA—telah mencoba mengatasi keterbatasan ini, namun masing-masing memiliki kelemahan dalam stabilitas atau pemuatan obat.

Liposom, sebagai pembawa obat serbaguna, mengenkapsulasi agen hidrofilik dan hidrofobik, meningkatkan permeabilitas usus, melindungi dari degradasi enzimatik, dan mengurangi toksisitas off-target. Liposom konvensional, namun, dengan cepat dibersihkan oleh sistem fagosit mononuklear (MPS). Modifikasi permukaan dengan polimer hidrofilik seperti polietilena glikol (PEG) menghasilkan liposom beredar lama yang menahan opsonisasi dan memperpanjang sirkulasi sistemik, sehingga meningkatkan bioavailability. Studi ini menyelidiki pembuatan liposom yang dimodifikasi PEG memuat daidzein, properti fisikokimia, kinetika rilis in-vitro, dan farmakokinetik in-vivo pada tikus, memberikan dasar untuk translasi klinis.

Metode

Bahan

SPC (Lipoid GmbH, Jerman), kolesterol dan DSPE-mPEG2000 (AVT Pharmaceutical Co., Shanghai), daidzein (≥ 98 % kemurnian, Yuanye Biotechnology, Shanghai), apigenin (standar internal, Delge Pharmaceutical Technology, Nanjing), metanol dan asetonitril kelas HPLC (TEDIA, AS), kloroform dan metanol (Sinopharm, Shanghai), air Milli-Q, dan reagen lainnya digunakan sebagaimana adanya. Semua pelarut kelas analitik.

Hewan Uji

Sepuluh tikus Sprague-Dawley jantan (200–210 g) diperoleh dari Pusat Hewan Provinsi Hubei (lisensi SCXK (E) 2017–0012) dan dipelihara dalam kondisi laboratorium standar. Protokol studi mendapat persetujuan dari Komite Etika Universitas Hubei dan mematuhi Panduan NIH untuk Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium.

Persiapan Nanoliposom Beredar Lama Memuat Daidzein (DLCL)

Desain ortogonal (empat faktor, tiga tingkat) mengevaluasi dampak rasio SPC-kolesterol (A), rasio obat-lipid (B), suhu hidrasi (C), dan waktu ultrasonik (D) sambil mempertahankan 5 % DSPE-mPEG2000. Parameter optimal adalah SPC : kolesterol = 55 : 40 (mol), obat-lipid = 1 : 10 (w/w), hidrasi pada 50 °C, dan sonikasi 24 menit. Liposom terbentuk dengan melarutkan SPC, kolesterol, DSPE-mPEG2000, dan daidzein dalam campuran kloroform-metanol 1:4 (v/v), menguap di bawah vakum pada 40 °C hingga terbentuk film tipis, hidrasi dengan 20 mL air ultra murni dalam kolam es sambil di sonikasi pada 80 W, dan ekstrusi secara berurutan melalui membran 0,45 µm dan 0,22 µm. Suspensi akhir disimpan pada 4 °C; untuk liofilisasi, 3 % sukrosa ditambahkan sebagai krioprotektor.

Penentuan Daidzein dalam DLCL dengan HPLC

Kolom Phenomenex ODS (150 × 4,6 mm, 5 µm) pada 40 °C digunakan dengan gradasi asetat amonium 10 mM (A) dan metanol (B). Laju aliran: 1 mL min⁻¹; deteksi pada 240 nm; volume injeksi 10 µL. Rentang linier: 0,313–50 µg mL⁻¹ (R² = 0,9999). Waktu retensi: 4,30 menit. Validasi metode mengonfirmasi akurasi, presisi, dan stabilitas (Tabel 1).

Ukuran Partikel dan Morfologi

Ukuran dan potensi zeta DLCL diukur dengan pencitraan cahaya dinamis (Zetasizer Nano90). Pencitraan TEM (JEM-2100) mengonfirmasi struktur bilayer bola yang seragam. Diameter rata-rata 156,1 ± 3,0 nm dengan indeks polidispersi (PDI) 0,294 ± 0,012 dan potensi zeta –49 ± 0,6 mV.

Efisiensi Enkapsulasi dan Pemuatan Obat

EE dan pemuatan obat diukur melalui dialisis: 500 µL DLCL ditempatkan dalam kantong dialisis MWCO 8–14 kDa, dialisis terhadap 20 mL air selama 12 jam, dan konsentrasi obat bebas (C₁) diukur. Total obat (C₀) diperoleh oleh ekstraksi metanol. EE (%) = (C₀ – C₁)/C₀ × 100; pemuatan obat (%) = C₀ × V₀ × EE/W₀ × 100. DLCL optimal menghasilkan EE = 85,3 ± 3,6 % dan pemuatan = 8,2 ± 1,4 %.

Rilis Obat In-Vitro

Rilis dinilai dalam cairan lambung simulasi (pH 1,2, HCl 0,1 M, Tween-80 0,5 %) dan cairan usus simulasi (pH 6,9, PBS 25 mM, Tween-80 0,5 %) menggunakan kantong dialisis (8–14 kDa). Sampel diambil pada 0–144 jam, diisi ulang, dan daidzein diukur dengan HPLC. DLCL memperpanjang rilis kumulatif hingga 48 jam pada kedua tingkat pH, sedangkan obat bebas mencapai rilis lengkap dalam 12–24 jam.

Farmakokinetik pada Tikus

Tikus diupas selama malam hari dan diberi dosis oral daidzein bebas (30 mg kg⁻¹) atau DLCL (30 mg kg⁻¹). Darah diambil pada 0,5–36 jam, diproses menjadi plasma, dan dianalisis dengan LC-MS/MS (kolom GL Inertsustain C18, 40 °C, 0,2 mL min⁻¹). Analisis memantau transisi m/z 253,0 → 224,15 untuk daidzein dan 269,0 → 117,05 untuk apigenin (standar internal). Analisis non-kompartemen (DAS3.0) menghasilkan nilai MRT, t½, dan AUC₀–t.

Hasil dan Pembahasan

Karakteristik Nanoliposom Optimal

Array ortogonal mengidentifikasi rasio obat-lipid dan rasio SPC-kolesterol sebagai determinan utama ukuran, dengan efek minimal pada EE. Formulasi akhir menghasilkan distribusi ukuran sempit, enkapsulasi yang baik, dan muatan permukaan negatif yang kuat, yang menunjukkan perilakoid koloidal yang stabil. Gambar TEM membenarkan bilayer yang terbentuk dengan baik, dan inklusi daidzein tidak mengganggu arsitektur liposom.

Profil Rilis In-Vitro

Daidzein yang dirilis dari DLCL menunjukkan profil berkelanjutan: 18 % pada 1 jam dan 100 % pada 48 jam dalam cairan lambung; 3 % pada 1 jam dan 100 % pada 48 jam dalam cairan usus. Sebaliknya, daidzein bebas merilis 85 % dan 73 % pada 1 jam dalam media lambung dan usus, masing-masing, mencapai rilis lengkap dalam 12–24 jam. Rilis yang lebih lambat pada pH rendah disebabkan oleh destabilisasi bilayer lipid yang diinduksi asam.

Farmakokinetik In-Vivo

Pemberian DLCL menghasilkan kurva konsentrasi plasma yang jauh lebih tinggi dibandingkan obat bebas. Parameter farmakokinetik kunci: AUC₀–t = 1515,5 ± 532,4 µg L⁻¹ h (peningkatan 2,5 kali lipat), MRT = 1,6 kali lipat, dan t½ = 1,8 kali lipat relatif terhadap daidzein bebas. MRT dan t½ yang diperpanjang mencerminkan metabolisme first-pass yang dikurangi dan paparan sistemik yang panjang, mengonfirmasi keunggulan terapeutik dari pengiriman liposomal yang dimodifikasi PEG.

Kesimpulan

DLCL, disiapkan dengan efisiensi enkapsulasi 85,3 % dan pemuatan obat 8,2 %, menunjukkan kinetika rilis in-vitro yang unggul dan secara signifikan meningkatkan bioavailability oral pada tikus. Formulasi ini mencapai peningkatan AUC sebesar 2,5 kali lipat dan memperpanjang paparan sistemik 1,6 hingga 1,8 kali lipat, menyoroti potensinya sebagai sistem pengiriman oral yang layak klinis untuk daidzein.

Ketersediaan Data dan Bahan

Semua data, bahan, dan protokol tersedia bagi peneliti yang berkelayakan tanpa keterbatasan yang berlebihan.

Singkatan

AUC

Luas di bawah kurva waktu-konsentrasi;

DLCL

Liposom beredar lama daidzein;

DSPE-mPEG2000

Distearoyl fosfoetanolamina-PEG2000;

EE

Efisiensi enkapsulasi;

HPLC

Kromatografi cairan berkinerja tinggi;

LC-MS/MS

Kromatografi cairan-spektrometri massa berganda;

MRT

Waktu tinggal rata-rata;

t½

Waktu paruh eliminasi;