Optimasi Liposom Asam Gliseretinik melalui Solusi Monofase Liofilisasi: Praformulasi, Desain, dan Evaluasi In-Vitro

Abstrak

Dalam studi ini, liposom asam gliseretinik (GA) berhasil diformulasikan menggunakan metode solusi monofase liofilisasi. Praformulasi memeriksa kelebihan larut fosfatidilkolin kedelai (SPC), kolesterol, dan GA dalam pelarut bersama alkohol tersier-butil/air (TBA/air). Kami menyelidiki bagaimana persentase volume TBA mempengaruhi laju sublimasi, dan mengkarakterisasi GA yang telah diobati oleh DSC, XRD, dan FTIR. XRD menunjukkan keadaan amorf untuk GA, sementara FTIR mengonfirmasi bahwa tidak ada perubahan kimia yang terjadi. Uji kelebihan larut mengungkapkan peningkatan yang signifikan dalam kelebihan larut GA dalam air. Menggunakan desain Box-Benhnken dan seleksi lioprotektor, kami mengidentifikasi formulasi optimal—508 mg SPC, 151 mg kolesterol, 55 % TBA, dan rasio bobot trehalosa/SPC 4:1. Dalam kondisi ini, liposom yang direkonstitusi mencapai efisiensi kapsulasi 74,87 % dan diameter rata-rata 191 nm. Studi peluncuran in vitro menunjukkan peluncuran berkelanjutan dalam dua media, dan uji penyerapan seluler menunjukkan penyerapan yang bergantung pada waktu oleh sel Hep G2.

Latar Belakang

Asam gliseretinik (GA), saponin triterpen yang diekstrak dari akar Glycyrrhiza, menunjukkan aktivitas antimikroba, antiviral, dan antikanker dan digunakan secara klinis untuk hepatitis kronis dan kanker hati. Menurut Sistem Klasifikasi Biofarmasutika, GA adalah obat kelas II; kelebihan larutnya yang rendah, hidrofobisitas tinggi, dan larut air yang buruk membatasi biodisponibilitas oral dan dapat menyebabkan retensi natrium dan kehilangan kalium yang bergantung pada dosis, yang mengarah pada hipertensi. Meningkatkan penyerapan dan mempertahankan konsentrasi terapeutik melalui formulasi yang ditargetkan sangat penting.

Liposom banyak dikenal karena kompatibilitas biologis, kemampuan untuk menargetkan nodus limfa dan situs tumor melalui efek permeabilitas dan retensi yang ditingkatkan, dan kemampuan untuk membawa obat hidrofobik dan hidrofilik. Namun, suspensi liposom konvensional tidak stabil, rentan terhadap kebocoran, fusesi, dan hidrolisis fosfolipid, yang menghambat penyimpanan jangka panjang. Proliposom—bubur kering cair yang merekonstitusi menjadi liposom saat dihidrasi—menawarkan solusi. Produksi proliposom konvensional oleh spray-drying atau freeze-drying memiliki kelemahan: spray-drying dapat merusak obat yang sensitif suhu, dan freeze-drying memakan waktu dan mahal karena penghapusan air yang berkepanjangan.

Inovasi terbaru, metode solusi monofase liofilisasi, melarutkan lipid, obat, dan lioprotektor yang larut air dalam pelarut bersama alkohol tersier-butil/air, kemudian freeze-drying menghasilkan bubur kering yang secara spontan membentuk liposom saat air ditambahkan. Keuntungan termasuk sublimasi yang cepat, pemrosesan satu langkah yang cocok untuk produksi skala besar, risiko pelarut sisa yang rendah (TBA adalah kelas 3), output bubur steril, dan kompatibilitas dengan obat yang tidak larut air atau tidak stabil.

Meski memiliki manfaat ini, masih terdapat kesenjangan pengetahuan: dampak konsentrasi TBA/air terhadap laju sublimasi, perubahan keadaan padat obat setelah liofilisasi, dan proses hidrasi-penggabungan bubur. Studi ini menggunakan GA sebagai model untuk menjawab pertanyaan ini, mengoptimalkan variabel formulasi dan proses melalui desain Box-Benhnken, mengevaluasi efek lioprotektor, dan menilai peluncuran in vitro dan penyerapan seluler.

Metode / Eksperimental

Bahan

Asam gliseretinik (kemurnian ≥ 98 %) diperoleh dari Dalian Meilun Biology Technology Co., Ltd. Fosfatidilkolin kedelai (Lipoid S100) dan kolesterol diperoleh dari Lipoid GmbH dan J&K Scientific Ltd., masing-masing. FITC-PEG-DSPE (MW 2000) dari Shanghai Ponsure Biotech, Inc. Alkohol tersier-butil (≥ 98 %) dan semua reagen lainnya dibeli dari Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Air deion dihasilkan oleh sistem Milli-Q.

Studi Kelebihan Larut

Larutan jenuh GA, SPC, dan kolesterol disiapkan dalam campuran TBA/air pada suhu yang bervariasi dari 25 °C hingga 45 °C. Kelebihan larut GA dikuantifikasi oleh HPLC menggunakan kolom C18 (4,6 × 250 mm, 5 µm) dan fase seluler metanol/air (90:10 v/v) pada 1,0 ml min⁻¹, mendeteksi pada 250 nm. Kelebihan larut SPC dan kolesterol diperkirakan melalui metode turbiditas, memantau absorbansi pada 655 nm.

Persiapan Solusi Monofase Liofilisasi

GA, SPC, dan kolesterol dilarutkan dalam TBA pada 45 °C; lioprotektor yang dipilih (mannitol, laktosa, sukrosa, atau trehalosa) dilarutkan dalam air pada 45 °C. Kedua larutan dicampur untuk menghasilkan solusi monofase isotropis (60 ml). Setelah difilter (0,22 µm), aliquot 2,0 ml ditempatkan dalam botol freeze-drying 10 ml, di-pre-freeze pada −40 °C selama 12 jam, dan diobati liofil pada −50 °C selama 24 jam (tekanan kamar 1–20 Pa).

Ukuran Partikel dan Efisiensi Kapsulasi

Liposom yang direkonstitusi disiapkan dengan mendispersekan 5 mg bubur proliposom dalam 5 ml air teruji, di-vortex selama 1 menit, mengulangi setelah 15 menit. Ukuran diukur oleh pencaran cahaya dinamis (Nano ZS90, Malvern). Efisiensi kapsulasi (EE) ditentukan oleh ultra-filtrasi-sentrifugasi: 1 ml dispersi difilter melalui filter MWCO 50 kDa, filtrat dikuantifikasi oleh HPLC, dan EE dihitung melalui EE = (1 − W_free/W_total) × 100 %.

Laju Sublimasi dan Tekanan Uap

Campuran TBA/air dengan berbagai persentase volume TBA (10–90 %) di-pre-freeze dan diobati liofil; waktu hingga sublimasi lengkap dicatat untuk menghitung laju (µl min⁻¹). Tekanan uap diukur menggunakan ebuliometer statis dan persamaan Antoine.

Karakterisasi Fisikokimia

DSC (HSC-1, 25–350 °C, 10 °C min⁻¹, atmosfer N₂) menilai transisi termal. XRD (D8 Focus, Cu-Kα, 5°–60°, 5° min⁻¹) mengevaluasi kristalinitas. FTIR (Nicolet 6700, 4000–400 cm⁻¹, resolusi 4 cm⁻¹) memverifikasi integritas kimia.

Stabilitas

Bubur proliposom disimpan pada 25 °C, terisi nitrogen, dalam kegelapan. Setelah 6 bulan, EE dan ukuran partikel liposom yang direkonstitusi dievaluasi ulang.

Peluncuran In-Vitro

Peluncuran dikaji oleh dialisis (MWCO 8000–14000 Da) dalam PBS (pH 7,4) atau larutan Tween 80 0,1 % pada 37 °C, mengaduk pada 300 rpm. Sampel diambil hingga 12 jam, diganti dengan media segar, dan GA dikuantifikasi oleh HPLC.

Penyerapan Seluler

Liposom GA berlabel FITC diinkubasi dengan sel HepG2 (1 × 10⁴ sel mL⁻¹) selama 0,5, 1, 2, dan 4 jam. Setelah dicuci dan di-quench dengan trypan blue, sel dilysis dengan Triton X-100. Fluoresensi (eksitasi 495 nm, emisi 520 nm) diukur dan dinormalisasi terhadap konten protein (uji BCA).

Hasil dan Pembahasan

Kelebihan Larut dan Sublimasi

Kelebihan larut GA dalam TBA/air meningkat secara progresif baik dengan persentase volume TBA maupun suhu; kelebihan larut melebihi 0,5 mg mL⁻¹ ketika TBA > 40 %. SPC dan kolesterol memerlukan volume TBA yang menurun seiring dengan peningkatan suhu di atas 35 °C, yang mengonfirmasi efek pelarut yang menguntungkan TBA.

Laju sublimasi meningkat dari 4 µl min⁻¹ pada 10 % TBA menjadi lebih dari 10 µl min⁻¹ di atas 60 % TBA, yang disebabkan oleh tekanan uap jenuh yang lebih tinggi dan kristal es berbentuk jarum yang lebih halus yang diamati dalam mikroskopi optik.

Perubahan Fisikokimia Pasca-Liofilisasi

DSC menunjukkan pergeseran puncak meleleh GA ke suhu yang lebih rendah seiring dengan penurunan konten TBA, sementara XRD mengonfirmasi kehilangan lengkap puncak kristal, menunjukkan keadaan amorf. Spektrum FTIR tetap tidak berubah, membuktikan stabilitas kimia. Amorfisasi meningkatkan kelebihan larut air dari 6,36 µg mL⁻¹ (bahan mentah) menjadi 19–64 µg mL⁻¹ tergantung pada rasio TBA.

Saringan Faktor Tunggal

SPC optimal (480 mg), kolesterol (120 mg), dan TBA (50 %) diidentifikasi berdasarkan skor gabungan tertinggi dari EE dan diameter rata-rata.

Optimasi Box-Benhnken

Menggunakan SPC, kolesterol, dan TBA sebagai variabel independen, model memprediksi kondisi optimal: 508 mg SPC, 151 mg kolesterol, 55 % TBA, menghasilkan EE = 68,55 % dan diameter rata-rata = 220 nm. Plot interaksi mengonfirmasi efek sinergis.

Seleksi Lioprotektor

Trehalosa lebih unggul daripada laktosa, sukrosa, dan mannitol. Rasio trehalosa/SPC 4:1 memaksimalkan EE (74,87 %) dan meminimalkan ukuran partikel (191 nm), dengan perlindungan yang lebih baik selama siklus freeze-thaw.

Mikroskop Transmisi Elektron

Citra menunjukkan hidrasi awal dengan fragmen GA dan lipid yang terdisperse, berevolusi menjadi liposom sferis seragam ~200 nm dengan amplang bilayer dan obat yang terperangkap.

Stabilitas

Setelah 6 bulan pada 25 °C, EE tetap 72,82 % dan diameter 198 nm, yang menunjukkan stabilitas fisik yang kuat.

Peluncuran In-Vitro

Kedua media PBS dan larutan garam menunjukkan peluncuran berkelanjutan: 65,25 % dan 69,46 % GA dirilis dalam 12 jam, dengan fase awal yang cepat diikuti oleh plat, yang mengonfirmasi perilaku peluncuran berkelanjutan.

Penyerapan Seluler

Penyerapan HepG2 meningkat dari 1.480 ng mL⁻¹ protein pada 30 menit menjadi 2.030 ng mL⁻¹ pada 240 menit, dengan mikroskopi fluoresensi yang mengesahkan internalisasi yang bergantung pada waktu.

Kesimpulan

Karya ini mendemonstrasikan bahwa metode solusi monofase liofilisasi, dikombinasikan dengan desain Box-Benhnken dan lioprotektor trehalosa, menghasilkan liposom termuat GA dengan efisiensi kapsulasi yang tinggi (74,87 %), ukuran partikel kecil (191 nm), dan peluncuran berkelanjutan selama 12 jam. Metode ini menghasilkan bubur kering yang stabil yang cocok untuk produksi skala besar dan menawarkan platform yang menjanjikan untuk pengiriman terapeutik hidrofobik.

Singkatan

BBD

Desain Box-Benhnken

DSC

Kalsimetri selang differing

EE

Efisiensi kapsulasi

FTIR

Spektroskopi inframerah transformasi Fourier

GA

Asam gliseretinik

MD

Diameter rata-rata

SPC

Fosfatidilkolin kedelai

TBA

Alkohol tersier-butil

TEM

Mikroskop transmisi elektron

XRD

Difraksi X-ray