Dual integrin vβ 3 dan Liposom Paramagnetik Penargetan NRP-1 untuk Deteksi Dini Tumor pada Pencitraan Resonansi Magnetik
Abstrak
Peningkatan MRI (magnetic resonance imaging) memainkan peran penting dalam deteksi dini tumor tetapi dengan spesifisitas rendah. Pencitraan molekuler angiogenesis dapat secara efisien mengirimkan agen kontras ke lokasi tumor oleh pembawa target tertentu. Kami merancang dan mensintesis liposom paramagnetik bertarget ganda yang difungsikan dengan dua ligan penargetan angiogenesis, Vβ3 integrin-specific RGD (Arg-Gly-Asp) dan neuropilin-1 (NRP-1) reseptor-spesifik ATWLPPR (Ala-Thr-Trp -Leu-Pro-Pro-Arg) (A7R). Liposom ini terbukti berada dalam kisaran nanopartikel dan ditunjukkan untuk secara efektif merangkum agen kontras paramagnetik MRI Gd-DTPA (asam gadolinium-diethylenetriamine pentaacetic). Relaksivitas T1 dari berbagai formulasi liposom lebih rendah dari Gd-DTPA murni tetapi tanpa perbedaan yang signifikan secara statistik. Serapan seluler in vitro dan uji penghambatan kompetitif menunjukkan afinitas pengikatan liposom bertarget ganda yang lebih tinggi ke HUVECs (sel endotel vena umbilikalis manusia) dan sel A549 dibandingkan dengan Gd-DTPA murni, non-target, dan liposom bertarget tunggal, yang terbukti dimediasi oleh pengikatan RGD/ανβ3-integrin dan A7R/NRP1. Untuk pencitraan MR tikus yang membawa sel A549 in vivo, liposom bertarget ganda mencapai nilai SER (tingkat peningkatan sinyal) tertinggi dengan perbedaan yang signifikan di semua titik waktu eksperimental. Itu meningkat sekitar tiga kali lipat dibandingkan dengan Gd-DTPA murni dan liposom non-target dan 1,5 kali lipat liposom bertarget tunggal pada 2 jam pasca injeksi. SER diturunkan secara bertahap dan hanya turun 40% dari nilai puncak dalam 6 jam. Liposom bertarget ganda cenderung memberikan efek sinergis dan spesifisitas pengiriman Gd-DTPA ke lokasi tumor. Oleh karena itu, liposom paramagnetik penargetan dual-ανβ3-integrin-NRP1 dengan peptida heterodimerik RGD-ATWLPPR mungkin merupakan sistem yang kuat untuk pencitraan molekuler tumor.
Pengantar
Magnetic resonance imaging (MRI) memainkan peran penting dalam mendeteksi tumor padat pada tahap awal karena memberikan resolusi spasial yang lebih baik daripada computed tomography (CT) dan positron emission tomography (PET) [1]. Selain itu, penerapan agen kontras paramagnetik seperti asam gadolinium-diethylenetriamine pentaacetic (Gd-DTPA) lebih meningkatkan rasio signal-to-noise (S/N) [2, 3]. Namun, spesifisitas MRI yang rendah dalam diagnosis dini tumor masih menjadi masalah.
Liposom dapat membawa "kargo" hidrofilik di lingkungan berair dengan agen amfifilik atau hidrofilik terintegrasi dalam lapisan ganda lipidnya. Liposom melindungi isinya dari interaksi dengan komponen dalam plasma, mencapai waktu paruh biologis "kargo" hidrofilik yang berkepanjangan; karenanya, liposom lebih sering digunakan sebagai pembawa agen kontras di MRI [4,5,6]. Selanjutnya, dengan mengkonjugasikan peptida, antibodi, aptamers, atau molekul kecil ke lipid bilayer [7,8,9], sifat permukaan liposom dapat dimodifikasi untuk meningkatkan aktivitasnya dalam pengiriman "kargo" atau menargetkan ke sel dan jaringan tertentu [10] , 11]. Untuk tumor penargetan, peptida biasanya digunakan untuk menempel pada protein seperti 3-integrin, reseptor faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGF-R), dan galektin-1 yang diekspresikan secara berlebihan di kedua sel endotel dan segudang sel tumor [12,13 ,14]. Dengan menargetkan dan mengganggu protein ini, proses angiogenesis pada tumor padat diharapkan dapat diblokir, selanjutnya menghambat pertumbuhan sel tumor dan metastasis [15,16,17,18]. Protein yang diekspresikan berlebihan ini juga merupakan kandidat yang menarik untuk pencitraan molekuler untuk mengidentifikasi lokalisasi tumor pada tahap awal [19,20,21].
Namun demikian, ekspresi heterogen dari berbagai reseptor untuk angiogenesis tumor dapat mengganggu kemampuan penargetan probe bertarget tunggal [22]. Untuk memecahkan masalah, penargetan simultan dari reseptor ganda dapat memperluas populasi sel yang dikenali dan memberikan afinitas pengikatan yang diperkuat melalui konjugasi dua ligan berbeda ke reseptor pada permukaan sel yang sama. Secara teoritis, pembawa bertarget ganda dapat secara efisien mengirimkan lebih banyak agen kontras ke lokasi tumor untuk pencitraan molekuler [23,24,25,26].
Dalam penelitian kami sebelumnya, liposom paramagnetik dengan Arg-Gly-Asp (RGD)-lipopeptida terkonjugasi dapat secara efektif memberikan agen kontras dalam jumlah yang cukup ke dalam tumor [27]. Dengan demikian, kami berhipotesis bahwa dengan menargetkan dua molekul secara bersamaan dalam angiogenesis tumor, misalnya, 3-integrin dan neuropilin-1, dapat meningkatkan sinyal pencitraan MR tumor berbasis liposom paramagnetik. Dua ligan afinitas tinggi RGD untuk 3-integrin dan Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg (ATWLPPR, A7R) untuk neuropilin-1 (NRP1, ko-reseptor VEGF-R) difungsikan ke liposom dengan konjugasi dengan asam 6-aminohexanoic (C6)-asam palmitat (Pal). Liposom terenkapsulasi Gd-DTPA bertarget ganda ini dievaluasi dengan perbandingan dengan liposom Gd-DTPA murni, non-target, dan bertarget tunggal dengan menggunakan uji in vitro dan in vivo.
Bahan dan Metode
Bahan kimia
Fosfatidilkolin telur (C40H82NO9P, PC telur, MW 775 Da) dan N-(carbonyl-methoxypolyethylene glycol-2000)-1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (mPEG2000-DSPE, MW 2788 Da) diperoleh dari Avanti Lipid Polar (Alabaster, AL, USA), dan kolesterol (C27H46O, MW 386 Da) diperoleh dari Bio Basic (Ontario, Kanada). Injeksi garam dimeglumine asam gadopentetic (Gd-DPTA, Magnevist) dibeli dari Bayer Schering Pharma (Berlin, Jerman). Peptida dan konjugatnya disintesis oleh Yishengyuan (Shanghai, Cina).
Peptida dan Konjugat
Tiga peptida termasuk peptida P1 bertarget ganda (GARYCRGD CFDATWLPPR , MW 2435 Da), peptida P2 bertarget tunggal (GARYCRGD CFDG, MW 1670 Da), dan peptida P3 bertarget tunggal (ATWLPPR, MW 1191 Da). Peptida terkonjugasi dengan asam 6-aminohexanoic (C6)-asam palmitat (Pal), dan peptida penargetan Pal-C6-P1, Pal-C6-P2, dan Pal-C6-P3 semuanya disintesis menggunakan fluorenylmethoxy carbonyl (FMOC) kimia sintesis fase padat. Kemurnian peptida dikonfirmasi> 90% oleh HPLC.
Persiapan Liposom
Liposom dibuat dengan menggunakan metode hidrasi film tipis. Komposisi liposom adalah PC telur/kolesterol/mPEG2000-DSPE dengan perbandingan molar 1,85/1/0,15. Tiga komponen dicampur dan dilarutkan dalam kloroform, pelarut diuapkan pada suhu 37 °C, dan lapisan tipis terbentuk di dasar labu bundar. Film tipis dikeringkan semalaman pada suhu kamar. Untuk persiapan liposom yang ditargetkan, peptida dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO) dan kemudian diencerkan dalam kloroform (konsentrasi DMSO akhir menjadi 1%). Liposom P1-Gd-LP, P2-Gd-LP, P3-Gd-LP, dan P2/P3-Gd-LP menambahkan Pal-C6-P1 menjadi 4,5 μg/μmol peptida/rasio lipid total, Pal-C6 -P2 dengan rasio 3 μg/μmol peptida/lipid total, Pal-C6-P3 dengan rasio 2,5 μg/μmol peptida/lipid total, Pal-C6-P2, dan Pal-C6-P3 dengan 3 dan 2,5 μg/μmol peptida / rasio lipid total, masing-masing. Dalam pembuatan liposom paramagnetik, film tipis dihidrasi dengan larutan berair Gd-DTPA, kemudian suspensi diekstrusi sepuluh kali secara berurutan melalui membran polikarbonat 0,4 μm, 0,2 μm, 0,1 μm dengan ekstruder mini (Avanti Polar Lipid, USA). Gd-DTPA yang tidak dienkapsulasi dihilangkan dengan sentrifugasi pada 10.000×g pada 4 °C (Avanti J-E, Beckman Coulter, CA, USA) melalui tabung sentrifus ultrafiltrasi 100.000 MWCO, Amicon Ultra-15 (Millipore, MA, USA). Suspensi akhir termasuk liposom non-target (Gd-LP), liposom bertarget ganda (P1-Gd-LP), liposom bertarget tunggal (P2-Gd-LP atau P3-Gd-LP), dan bertarget tunggal campuran. liposom (P2/P3-Gd-LP) disimpan pada suhu 4 °C di bawah nitrogen.
Karakterisasi Liposom
Distribusi ukuran liposom yang disiapkan ditentukan dengan menggunakan penganalisis ukuran partikel submikron (Zetaplus, Brookhaven Instruments, USA). Morfologi liposom diamati dengan mikroskop elektron transmisi (TEM, JEM-1230, JEOL, Tokyo, Jepang) pada pewarnaan uranil asetat. Konsentrasi gadolinium ditentukan oleh spektrometer emisi optik plasma yang digabungkan secara induktif (ICP-OES, Optima 7000DV, PerkinElmer, USA).
Pengukuran Relaksitas T1
Gambar berbobot T1 dari suspensi liposom diperoleh dengan menggunakan penganalisis resonansi magnetik nuklir 3.0 Tesla (Philips, GE, USA). Larutan murni Gd-DTPA, Gd-LP, P1-Gd-LP, P2-Gd-LP, dan P3-Gd-LP diencerkan masing-masing dengan phosphate buffered saline (PBS) hingga konsentrasi gadolinium 1 × 10
− 3
mM hingga 1 × 10 mM Gd/L. Untuk mengukur relaksasi longitudinal T1 (s), urutan inversion recovery spin-echo (STIR) digunakan dengan sepuluh waktu inversi (TI) yang berbeda mulai dari 200~9000 md, dan parameter pemindaian lainnya adalah sebagai berikut:waktu pengulangan (TR) 10000 md, waktu gema (TE) 7,6 md, bidang pandang (FOV) 2 × 2 cm
2
, ukuran matriks 320 × 320 dan ketebalan irisan 5,0 mm. Relaksivitas T1 (s
−1
mM
−1
) dapat diperoleh melalui rumus berikut:r1 = (R1obs-R1m)/C. R1obs dan R1m adalah tingkat relaksasi R1 (s
−1
) dari preparat dan matriks yang sesuai, dan C adalah konsentrasi gadolinium (mM).
Garis dan Kultur Sel
Sel A549 (sel adenokarsinoma manusia) dan HUVECs (sel endotel vena umbilikalis manusia), keduanya mengekspresikan keluarga reseptor 3-integrin dan reseptor neuropilin-1, disediakan oleh Institut Kanker Fakultas Kedokteran Universitas Tongji (Shanghai, Cina). Sel dikultur dalam Media Elang Modifikasi Dulbecco (DMEM, Invitrogen, USA) yang dilengkapi dengan 10% serum neonatus sapi dan 100 U mL
−1
penisilin dan 100 μg mL
−1
streptomisin pada 37 °C, 5% CO2. Sel dikultur dalam pelat 6-sumur hingga pertemuan 80-90% dalam pengujian.
Serapan Seluler dan Pengikatan Kompetitif
Lima liposom paramagnetik termasuk Gd-LP, P1-Gd-LP, P2-Gd-LP, P3-Gd-LP, dan P2/P3-Gd-LP dengan konsentrasi gadolinium 10 mM diberikan ke sel HUVEC dan A549 pada 37 ° C selama 4 jam. Setelah dua kali pembilasan PBS, asam nitrat ditambahkan dan kemudian, sel-sel dalam media dinitrasi pada 65 °C semalaman. Dalam uji pengikatan kompetitif, peptida bebas yang sesuai secara bersamaan diinkubasi dengan liposom dan sel terkonjugasi. Konsentrasi gadolinium akhir ditentukan oleh ICP-OES.
Kemampuan MRI Mendeteksi Di Vivo
Semua prosedur hewan sesuai dengan Panduan Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium. Tikus telanjang BalB/C betina berumur 4 minggu (SLAC, Shanghai, China) disuntik secara subkutan dengan sel A549 (1 × 10
−4
sel per tikus) di sisi kanan. Saat ukuran tumor mencapai 50–100 mm
3
, tikus pembawa tumor secara acak dibagi menjadi lima kelompok (masing-masing n = 5). Untuk pencitraan MR, tikus dibius dengan injeksi peritoneal 10% urethane (m/v) dan dipindai pada penganalisis resonansi magnetik nuklir 1,5 Tesla (Philips, GE, USA). Pertama, gambar berbobot T2 diperoleh untuk melokalisasi tumor menggunakan prosedur sebagai berikut:TR = 7.3 ms, TE = 2.7 ms, FOV = 12.0 × 12.0 cm
2
, ketebalan irisan = 2 mm, ukuran matriks = 256 × 128. Sebelum injeksi intravena agen kontras, gambar berbobot T1 diperoleh untuk pemindaian polos dengan urutan spin-echo:TR = 420 ms, TE = 14.8 ms, FOV = 12.0 × 12.0 cm
2
, ketebalan irisan = 2.0 mm, matriks = 256 × 128, kemudian enam irisan berturut-turut diamati. Setelah injeksi agen kontras paramagnetik, gambar dengan bobot T1 diperoleh pada titik waktu 0,5, 1, 2, 4, dan 6 jam. Daerah yang menarik (ROI) dari tumor dan daerah otot tungkai belakang dalam gambar MR dibatasi, dan intensitas sinyal rata-rata (SI) dalam ROI sebelum dan sesudah injeksi kontras digunakan untuk memperkirakan SER seperti yang dijelaskan dalam penelitian kami sebelumnya [27 ].
Analisis Statistik
Data dinyatakan sebagai mean ± SD, dan beberapa perbandingan antara mean dianalisis dengan ANOVA satu arah dengan perangkat lunak SPSS 22.0. P . dua sisi nilai kurang dari 0,05 dianggap signifikan.
Hasil
Karakterisasi Liposom
Semua agen memuat liposom dengan peptida non-, tunggal, dan bertarget ganda ditunjukkan dalam bentuk bulat atau oval dengan ukuran yang sama mengelilingi struktur lipoid bening di bawah TEM. Nanopartikel ini berdiameter kurang dari 100 nm, dan potensi zeta berkisar dari 15 mv hingga 60 mv yang diukur dengan potensiometer zeta. Ukuran rata-rata Gd-LP, P1-Gd-LP, P2-Gd-LP, dan P3-Gd-LP masing-masing adalah 87,75 ± 0,87 nm, 103,50 ± 1,21 nm, 89,91 ± 1,46 nm, dan 89,90 ± 1,18 nm.
Relaksivitas T1 Liposom Target Ganda
Gd-DTPA murni memiliki nilai relaksivitas tertinggi pada lima kelompok tetapi tidak berbeda dengan keempat jenis liposom lainnya (P> 0,05) (Gbr. 1), menunjukkan bahwa penambahan komposisi lipid dan peptida membuat sedikit efek pada relaksivitas Gd-DTPA yang dienkapsulasi. Dengan demikian, disarankan bahwa liposom non-, tunggal, dan bertarget ganda yang dienkapsulasi dengan Gd-DTPA diharapkan memiliki kemampuan yang cukup untuk pencitraan molekuler.
Relaksasi T1 (s
−1
mM
−1
) larutan murni Gd-DTPA, Gd-LP, P1-Gd-LP, P2-Gd-LP, dan P3-Gd-LP diukur dalam konsentrasi gadolinium (mM) yang berbeda. Data mewakili mean ± standar deviasi (n = 3), (P> 0,05)
Serapan Seluler dan Pengikatan Kompetitif
Konsentrasi gadolinium dalam kelompok liposom bertarget ganda lebih tinggi daripada formula lain dalam studi serapan seluler. Dibandingkan dengan liposom yang tidak bertarget, konsentrasi gadolinium dari kelompok bertarget ganda meningkat sebesar 50% (Gbr. 2a). Itu hingga 20% peningkatan konsentrasi gadolinium dari kelompok liposom bertarget tunggal. Selain itu, konsentrasi gadolinium dari liposom bertarget tunggal campuran (P2/P3-Gd-LP) secara signifikan lebih rendah daripada liposom bertarget ganda.
a Eksperimen serapan seluler Gd-LP, P1-Gd-LP, P2-Gd-LP, P3-Gd-LP, dan P2/P3-Gd-LP dalam sel A549 dan HUVEC. b -d Studi kompetisi seluler P1-Gd-LP, P2-Gd-LP, dan P3-Gd-LP, dengan masing-masing P1, P2, dan P3 ditambahkan untuk menghambat reseptor dalam kelompok kompetisi. *P < 0,05, vs grup lain
Konsentrasi gadolinium dalam kelompok liposom yang ditargetkan secara signifikan menurun dalam pengikatan kompetitif dengan ligan P1, P2, atau P3 ke 3-integrin dan/atau reseptor neuropilin-1. Serapan seluler dalam kelompok kompetitif mendekati liposom yang tidak ditargetkan (Gbr. 2b-d dan Tabel 1). Data ini menunjukkan bahwa liposom bertarget ganda memiliki kemampuan penargetan tumor terbaik di antara kelompok-kelompok ini yang dimediasi oleh pengikatan RGD/ανβ3-integrin dan A7R/NRP1.
Analisis Gambar MR
Liposom konvensional dan liposom dengan agen kontras gadolinium yang dienkapsulasi disuntikkan ke tikus yang mengandung tumor untuk mengevaluasi efek pada peningkatan sinyal tumor di MRI (Gbr. 3). Dalam hal SER, efek pencitraan grup liposom Gd-DTPA murni dan non-target serupa (Gbr. 4). SER memuncak dalam 1 jam pasca injeksi dan turun tajam dalam 6 jam berikutnya, sedangkan liposom bertarget tunggal dan ganda menunjukkan pola peningkatan yang berbeda dengan dua kelompok di atas. SER mencapai puncaknya pada 1 jam tetapi turun perlahan dari titik waktu 2 hingga 6 jam. Di antara mereka, liposom bertarget ganda mencapai nilai SER tertinggi dengan statistik signifikan di semua titik waktu. Itu meningkat sekitar tiga kali lipat dibandingkan dengan Gd-DTPA murni dan liposom non-target dan 1,5 kali lipat liposom bertarget tunggal pada 2 jam setelah injeksi. SER diturunkan secara bertahap dan hanya turun 40% dari nilai puncak dalam 6 jam.
Gambar MR dari tikus yang mengandung tumor sebelum dan sesudah injeksi dengan agen kontras yang berbeda pada titik waktu yang berbeda. a Gd-DTPA murni. b Gd-LP. c P1-Gd-LP. d P2-Gd-LP. e P3-Gd-LP
Penentuan SER pada titik waktu yang berbeda dengan injeksi murni Gd-DTPA, Gd-LP, P1-Gd-LP, P2-Gd-LP, dan P3-Gd-LP. T = 3, dan *P < 0,05 P1-Gd-LP vs empat grup lainnya
Diskusi
Partikel liposom kecil terutama yang berdiameter kurang dari 100 nm cenderung memperpanjang waktu paruh biologis dengan peningkatan permeabilitas ke dalam tumor padat dan akibatnya terakumulasi dalam jaringan tumor lokal [4]. Kami berhasil membuat liposom yang dimodifikasi non-, tunggal, dan ganda-peptida dengan diameter dalam kisaran nanopartikel dan menunjukkan liposom ini dapat secara efektif merangkum agen kontras MRI paramagnetik Gd-DTPA. Relaksivitas T1 dari berbagai formulasi liposom lebih rendah dari Gd-DTPA murni tetapi tanpa perbedaan yang signifikan secara statistik (P> 0,05). Salah satu alasan yang mungkin adalah bahwa lapisan ganda lipid secara efektif mengenkapsulasi ion gadolinium dan mencegah pertukarannya dengan air [28]. Selain itu, modifikasi peptida pada permukaan liposom tidak mengubah integritas liposom [29]. Alasan lain mungkin kekerasan liposom disebabkan komponen kolesterol dan fosfolipid jenuh yang memiliki koefisien permeabilitas rendah untuk air [30]. Dalam hal ini, komponen liposom hanya memiliki sedikit pengaruh pada kemampuan pencitraan agen kontras Gd-DTPA.
Angiogenesis, pembentukan pembuluh darah baru dari pembuluh darah yang ada, merupakan peristiwa penting dalam banyak kemajuan patologis, terutama dalam invasi pertumbuhan dan metastasis tumor [15, 16]. Sejumlah besar molekul terlibat dalam perkembangan angiogenesis tumor, misalnya, VEGF dan faktor lain untuk vaskularisasi tumor padat, yang melibatkan interaksi dengan reseptor membran. [17, 31]. Salah satu reseptor tersebut adalah neuropilin-1 (NRP1), ko-reseptor untuk VEGFR-2, meningkatkan aktivitas pengikatan dan biologis VEGF165, yang memiliki distribusi jaringan luas yang mencakup beberapa sel turunan tumor dan sel endotel [32]. Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg (ATWLPPR), sebuah heptapeptide, telah terbukti secara khusus mengikat NRP1 dan berhasil digunakan untuk mendeteksi tumor positif NRP-1 [12, 17]. Namun, afinitas yang relatif rendah dari monomer A7R menunjukkan perbaikan lebih lanjut untuk memberikan pencitraan yang sukses [33]. Integrin, salah satu reseptor adhesi sel, juga memainkan peran penting dalam angiogenesis tumor dan metastasis, terutama integrin vβ3, yang sangat diekspresikan pada sel tumor dan sel endotel vaskular yang diaktifkan [34]. Urutan asam amino Arg-Gly-Asp (RGD), yang berikatan secara khusus dengan integrinαvβ3 telah digunakan secara luas untuk pencitraan tumor noninvasif [7, 21, 27, 35].
Selama dekade terakhir, penargetan simultan dari beberapa reseptor semakin banyak dipelajari di bidang pencitraan [23, 25, 26, 36]. Sistem pengiriman TF LP atau RGD LP, vβ3, dan galectin-1 dengan paramagnetik Anx/RGD-liposom telah digunakan untuk pencitraan tumor [37, 38]. Efek sinergis dari motif bertarget ganda dapat terjadi melalui berbagai cara. Pertama, ketersediaan situs pengikatan adalah elemen kunci dari konjugasi dengan ligan peptida. Menargetkan dua reseptor secara bersamaan dapat meningkatkan situs pengikatan pada sel yang sama. Kedua, peptida penargetan ganda dapat mengikat dua reseptor berbeda untuk meningkatkan kemungkinan agen pengiriman ke wilayah yang tertarik. Selain itu, tautan ke dua famili reseptor yang berbeda meningkatkan kemungkinan pengikatan ke sel tumor heterogen.
Dalam penelitian kami sebelumnya, liposom paclitaxel jebakan bertarget ganda baru berhasil dibangun dengan menghubungkan urutan yang mengandung RGD dan motif ATWLPPR dengan konjugat dengan spacer lys-gly-gly (KGG) dan jangkar asam palmitat (Pal) dan kemudian terkonjugasi ke permukaan liposom [39]. Ini mengungkapkan bahwa dibandingkan dengan dua peptida bertarget tunggal, peptida bertarget ganda memiliki aktivitas pengikatan yang lebih tinggi. Liposom bertarget ganda ini juga mempertahankan sifat pengikatan yang lebih baik daripada formulasi bertarget tunggal.
Dalam penelitian ini, alih-alih obat terapi, kami merangkum agen kontras MRI Gd-DTPA dalam liposom untuk pencitraan molekuler. Serapan seluler dari liposom paramagnetik penargetan meningkat, dan liposom bertarget ganda menunjukkan afinitas pengikatan yang lebih tinggi daripada liposom bertarget tunggal, dan, terlebih lagi, liposom bertarget tunggal campuran. Saat ini, ada dua strategi yang umum digunakan untuk penargetan ganda, satu adalah campuran dua ligan tunggal [25, 38] dan yang lainnya adalah menggabungkan dua ligan dalam satu molekul [39, 40]. Dibandingkan dengan pemanfaatan campuran peptida individu, kami berhipotesis bahwa penerapan satu konjugasi yang digabungkan dengan dua target dapat mencangkokkan sejumlah besar peptida per permukaan liposom. Dalam uji pengikatan kompetitif, ini memberikan bukti penting bahwa penargetan efektif liposom ke sel tumor dimediasi oleh pengikatan spesifik ligan dan reseptor 3-integrin dan neuropilin-1. Data ini menegaskan sekali lagi bahwa liposom bertarget ganda kombinasi RGD-ATWLPPR memfasilitasi pengiriman dan akumulasi obat dalam tumor.
Dalam percobaan pencitraan MR, Gd-DTPA murni dan liposom non-target dimetabolisme dengan cepat karena molekulnya yang kecil, kelarutan dalam air, dan peningkatan permeabilitas dan efek retensi (efek EPR) [41, 42]. Sebaliknya, periode sirkulasi yang berkepanjangan dan akumulasi secara bertahap dalam jaringan tumor dari liposom bertarget ganda telah menunjukkan kemampuan mengikat secara khusus pada reseptor pada sel tumor. Pkhususnya , liposom bertarget ganda lebih efektif daripada liposom bertarget tunggal. Liposom bertarget ganda cenderung memberikan efek sinergis dan spesifisitas pengiriman Gd-DTPA ke lokasi tumor.
Dalam beberapa tahun terakhir, sejumlah besar nanopartikel bertarget ganda telah berhasil dirancang dan disintesis untuk pencitraan tumor karena afinitas dan spesifisitas pengikatannya yang lebih baik. Misalnya, Wu et al. juga menggunakan motif RGD dan ATWLPPR untuk merancang peptida heterodimerik bertarget vβ3 dan NRP-1 ganda untuk mendeteksi glioma ganas dengan pencitraan positron emission tomography (PET) [43]. Dalam penelitian mereka, peptida c (RGDyK) dihubungkan dengan ATWLPPR melalui penghubung glutamat dan kemudian diberi label dengan fluor-18 (F-18) untuk pencitraan radionuklida. Uji pengikatan reseptor in vitro menunjukkan peningkatan penyerapan sel dan afinitas pengikatan dari probe bertarget ganda. Selain itu, serapan tumor in vivo dari dual-RGD-ATWLPPR berlabel F-18 secara signifikan lebih tinggi daripada molekul bertarget tunggal, dan peptida heterodimerik ini juga memiliki rasio tumor-ke-organ tertinggi. Dibandingkan dengan probe peptida berlabel radio, liposom paramagnetik bertarget ganda non-radioaktif kami dapat memberikan agen kontras secara lebih efektif ke lokasi tumor karena kapasitas beban yang lebih besar. Dalam studi lain, Zhang et al. berhasil membangun 68Ga-BBN (Bombesin)-RGD, pelacak PET heterodimerik yang menargetkan GRPR (reseptor peptida pelepas gastrin) dan integrin vβ3, dan data klinis menunjukkan keamanan dan efisiensi radiotracer PET penargetan ganda dalam diagnosis dan stadium kanker prostat [44]. Namun, radiotracer PET bertarget ganda ini hanya dapat digunakan untuk pencitraan noninvasif kanker prostat karena GRPR adalah biomarker penting untuk kanker prostat. Tidak seperti probe peptida BBN-RGD, peptida RGD-ATWLPPR dapat mengikat sebagian besar tumor dengan ekspresi berlebihan VEGFR dan/atau integrin dalam neovaskularisasi tumor padat. Oleh karena itu, liposom paramagnetik penargetan dual-ανβ3-integrin-NRP1 ini diharapkan dapat digunakan untuk deteksi dini berbagai tumor.
Kesimpulan
Dalam penelitian kami, liposom paramagnetik bertarget ganda disiapkan dengan mengkonjugasikan dua ligan untuk reseptor 3-integrin dan neuropilin-1 di permukaan dan memuat agen kontras MRI Gd-DTPA di inti liposom. Modifikasi ini tidak secara signifikan mengganggu properti Gd-DTPA. Liposom bertarget ganda memfasilitasi serapan seluler spesifik in vitro yang menunjukkan bahwa afinitas dan pengikatan ligan bertarget ganda tampaknya meningkat secara sinergis. Selain itu, pencitraan in vivo menunjukkan bahwa liposom yang dimodifikasi peptida ganda dapat tetap beredar untuk porsi yang lebih besar dan periode yang lebih lama daripada rekan yang tidak bertarget atau bertarget tunggal dan kemudian menunjukkan selektivitas dan spesifisitas yang unggul. Singkatnya, kami berhasil membangun liposom paramagnetik penargetan angiogenesis baru dengan peptida heterodimerik bertarget ganda yang dapat secara efisien mengikat ke jaringan tumor, dan kami berharap liposom paramagnetik bertarget ganda ini memiliki potensi untuk meningkatkan efek agen kontras MRI untuk pencitraan spesifik tumor pada tahap awal.
Singkatan
ATWLPPR:
Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg
BBN:
Bombesin
C6:
Asam 6-Aminohexanoic
CT:
Computed tomography
DMEM:
Media Elang Modifikasi Dulbecco
DMSO:
Dimetil sulfoksida
FMOC:
fluorenilmetoksi karbonil
FOV:
Bidang pandang
Gd-DTPA:
Gadolinium-diethylenetriamine asam pentaacetic
HPLC:
Kromatografi cair kinerja tinggi
HUVEC:
Sel endotel vena umbilikalis manusia
ICP-OES:
Spektrometer emisi optik plasma yang digabungkan secara induktif
