Kanker tiroid anaplastik (ATC) terdiri dari sekitar 2% dari semua kanker tiroid, dan tingkat kelangsungan hidup rata-ratanya tetap buruk karena resistensinya terhadap terapi konvensional. Vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR)-target terapis-loaded silika nanopartikel mesopori mewakili kemajuan besar untuk pencitraan angiogenesis dan penghambatan pada kanker mematikan. Dalam penelitian ini, kami bertujuan untuk menilai apakah
131
Nanopartikel silika mesopori berlabel anti-VEGFR2 yang ditargetkan akan memiliki kemanjuran antitumor dalam model tikus telanjang yang mengandung tumor ATC. Menggunakan studi in vitro dan in vivo, kami menyelidiki peningkatan kemampuan penargetan dan waktu retensi pada kelompok target anti-VEGFR2 menggunakan mikroskop confocal dan penghitung . Radioaktivitas jaringan tumor dari kelompok target anti-VEGFR2 pada 24 dan 72 jam setelah injeksi intratumoral secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok non-target (semua P < 0,05). Selain itu, kami menemukan bahwa akumulasi radioaktif terlihat jelas bahkan pada 3 minggu setelah injeksi pada kelompok target anti-VEGFR2 melalui computed tomography/computed tomography emisi foton tunggal, yang tidak terlihat pada 3 hari setelah injeksi di Na
131
saya kelompok. Sementara itu, dibandingkan dengan kelompok yang tidak ditargetkan, pertumbuhan tumor pada kelompok yang ditargetkan secara signifikan dihambat, tanpa menimbulkan efek toksik sistemik yang nyata. Selain itu, waktu kelangsungan hidup rata-rata pada kelompok yang ditargetkan (41 hari) diperpanjang secara signifikan dibandingkan dengan kelompok yang tidak ditargetkan (34 hari) atau Na
131
I (25 hari) kelompok (keduanya P < 0,01). Data kami mendukung pandangan bahwa
131
. yang dikembangkan Nanopartikel silika mesopori berlabel anti-VEGFR2 yang ditargetkan menunjukkan hasil yang menjanjikan dalam model tikus pembawa tumor ATC dan pendekatan semacam itu mungkin mewakili pilihan terapi baru untuk ATC.
Latar Belakang
Kanker tiroid anaplastik (ATC) hanya menyumbang sekitar 2% dari semua kanker tiroid; namun, ini adalah jenis tumor agresif lokal yang memiliki tingkat metastasis jauh yang tinggi. Umumnya, kelangsungan hidup rata-rata pasien dengan ATC adalah sekitar 6 bulan, dengan hanya 20% pasien yang bertahan hidup 1 tahun setelah diagnosis karena bencana vaskular dan kolaps saluran napas yang disebabkan oleh penyakit regional agresif yang menyerang jaringan leher dan kelenjar getah bening dan/atau metastasis paru [1 , 2]. Radioiodine-131 (
131
I) memainkan peran penting dalam diagnosis dan pengobatan metastasis kanker tiroid (DTC) yang berbeda [3,4,5]. Namun,
131
conventional konvensional Modalitas pengobatan I tidak sesuai untuk ATC karena karakteristiknya yang tidak berkonsentrasi yodium [6].
Angiogenesis merupakan faktor utama yang berkontribusi terhadap kelangsungan hidup, pertumbuhan, migrasi, dan metastasis sel kanker. Faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGF) adalah sitokin pengatur penting dalam angiogenesis, dan memainkan peran penting dalam pengembangan ATC. Peran VEGF yang mapan dalam angiogenesis berarti bahwa ligan berlabel radio, seperti bevacizumab, yang menargetkan reseptor VEGF (VEGFR), telah berhasil dikembangkan untuk deteksi dini dan deteksi lesi yang sensitif menggunakan positron emission tomography (PET) dan single-photon emission computed tomography ( SPECT) teknik pencitraan. VEGFR-2 memberikan sebagian besar fungsi VEGF dalam sel endotel pembuluh darah, dan bertanggung jawab untuk proliferasi melalui aktivasi jalur protein kinase yang diaktifkan mitogen, migrasi pembuluh endotel, dan promosi angiogenesis dan pertumbuhan vaskular [7, 8 ]. Ekspresi VEGF diregulasi dalam sel ATC dari asal epitel dibandingkan dengan di jaringan tiroid normal [9,10,11]. Strategi anti-VEGF telah dikembangkan untuk menghambat pertumbuhan pembuluh darah baru dan membuat tumor kelaparan akan oksigen dan nutrisi yang diperlukan. Beberapa studi praklinis telah mengembangkan obat yang menargetkan VEGFR2 di ATC dengan tingkat keberhasilan yang berbeda [12,13,14,15]. Namun, salah satu tantangan utama yang terkait dengan obat antikanker ini adalah ketersediaan hayati yang rendah dan pengiriman yang tidak efisien ke situs target. Banyak obat antikanker bersifat hidrofobik dan membutuhkan sistem penghantaran obat yang biokompatibel untuk meningkatkan bioavailabilitasnya dan memfasilitasi pemberian intravena yang lebih mudah.
Nanopartikel, termasuk nanopartikel berbasis logam, polimer, dan lipid, dapat digunakan untuk menggabungkan agen terapeutik dengan agen pencitraan. Ligan/bagian penargetan, seperti peptida, antibodi, radionuklida, atau fragmen antibodi, dapat dilekatkan pada nanopartikel untuk meningkatkan kemanjuran terapeutiknya. Untuk pengobatan kanker, nanopartikel dapat terakumulasi di area tumor melalui peningkatan permeabilitas dan efek retensi, dengan kemampuan untuk memberikan agen terapeutik dengan cara yang lebih terlokalisasi. Selama bertahun-tahun, dalam ilmu material dan teknik, silika telah dianggap sebagai bahan yang serbaguna dan relatif aman karena berbagai modifikasi fisik dan kimia yang ditawarkannya, serta biokompatibilitasnya yang baik [16]. Food and Drug Administration (FDA) AS mengakui silika sebagai "Umumnya Aman" [17, 18]. Di antara berbagai bahan berbasis silika, nanopartikel silika mesopori (MSNs) menonjol sebagai kelas bahan nano dengan banyak keunggulan khas, seperti sifatnya yang tidak beracun, permeabilitas permukaan yang baik, luas permukaan yang tinggi, struktur pori yang dapat disesuaikan, stabilitas fisikokimia yang sangat baik, dan permukaan yang dapat dimodifikasi secara kimia, yang semuanya menjadikannya inang potensial untuk berbagai bahan kimia dan/atau obat terapeutik [19]. Demikian pula, nanomaterial karbon mesopori telah terbukti menjadi pembawa nano yang sangat baik dalam pengiriman obat [20,21,22]. Dalam beberapa tahun terakhir, upaya di bidang MSN telah difokuskan pada menggabungkan kemampuan terapeutik dan pencitraan. Memberi label nanopartikel dengan probe pencitraan adalah alat yang berharga untuk memungkinkan pelacakan in vitro dan in vivo mereka. Saat ini, modalitas pengobatan yang ditargetkan mewakili strategi yang mendorong untuk pengobatan ATC [23, 24].
Terinspirasi oleh peran penting terapi bertarget dan pencitraan molekuler terhadap VEGFR dalam penelitian kanker dan keuntungan yang ditawarkan oleh MSN, dalam penelitian ini, kami mengembangkan anti-VEGFR2 yang menargetkan nanoplatform berpotensi theranostik berdasarkan rekayasa permukaan MSN untuk pencitraan SPECT noninvasif simultan dan in vivo ditingkatkan
131
Saya efek terapeutik. Kami bertujuan untuk menentukan apakah
131
MSN bertarget anti-VEGFR2 berlabel I akan memiliki kemanjuran antitumor dalam model tikus telanjang pembawa tumor ATC, diikuti oleh studi ekstensif in vivo, in vitro, dan ex vivo.
Bahan dan Metode
Materi
Medium Eagle (DMEM) Dulbecco yang dimodifikasi, Trypsin-EDTA 0,25%, dan serum janin sapi (FBS) dibeli dari Gibco (CA, USA). Antibiotik (penisilin G, streptomisin, dan nistatin) dibeli dari Dingguo Biotechnology Co. Ltd. (Beijing, China). Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB), tetraethyl orthosilicate (TEOS), 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES), dimethyl sulfoxide (DMSO), 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC), N -hydroxysuccinimide (NHS), dan fluorescein isothiocyanate (FITC) dibeli dari Sigma-Aldrich (Jerman). Tidak
131
Saya dibeli dari Atomic Hitech (Beijing, China). Antibodi anti-VEGFR2 dibeli dari Abcam Co. Ltd. (UK).
Karakterisasi
Nanopartikel didispersikan dalam etanol, membentuk suspensi, diendapkan pada kisi tembaga berlapis karbon, dan dikeringkan setidaknya selama 24 jam. Morfologi nanopartikel ditentukan menggunakan mikroskop elektron transmisi (TEM) (JEOL-100CXII, Jepang) pada tegangan akselerasi 200 kV. Potensi zeta dan diameter hidrodinamik sampel diukur menggunakan hamburan cahaya dinamis (DLS) menggunakan Zetasizer (Nano ZS90, UK). Distribusi ukuran pori dan luas permukaan MSN dicirikan oleh analisis Brunauer–Emmett–Teller (BET) dan Barrett–Joyner–Halenda (BJH) (ASAP2020M, USA).
Budaya Sel
Garis sel ATC manusia FRO [25] (dibeli dari Cell Resource Center, Institute of Basic Medical Sciences, Peking Union Beijing Medical College di Beijing, Republik Rakyat Cina) dikultur pada suhu 37°C dalam inkubator yang dilembabkan dengan campuran 5% CO2 dan 95% udara dan dilengkapi dengan 10% FBS dan 1% penisilin-streptomisin. Media diganti setiap hari, dan sel-sel dilewatkan oleh tripsin setelah pertemuan tercapai. Sel-sel dikulturkan sampai kira-kira 80% pertemuan tercapai sebelum setiap percobaan.
Preparasi dan Modifikasi Permukaan Nanopartikel Silika
Sintesis MSN dan Aminasi
MSN disintesis seperti yang dilaporkan sebelumnya [26]. Secara singkat, 50 mg CTAB ditambahkan ke dalam campuran 25 mL air, 5 mL etanol, dan 100 μL 2 M larutan NaOH dalam labu alas bulat dengan pengadukan terus menerus pada 70 °C. Kemudian, 200 L TEOS ditambahkan ke dalam campuran dan direaksikan selama 1 jam. Larutan reaksi kemudian disentrifugasi dan dicuci dengan etanol lima kali pada 10.000 rpm. Selanjutnya, produk disuspensikan kembali dalam 10 mL etanol. Setelah menghilangkan template CTAB, produk kemudian disuspensikan kembali dalam 5 mL DMSO dan 100 μL APTES, yang ditambahkan setetes demi setetes ke dalam campuran yang dihasilkan untuk memodifikasi permukaan silika dengan aminasi. Setelah semalaman diaduk, endapan dipisahkan dengan sentrifugasi, dicuci dengan etanol sebanyak lima kali, kemudian MSNs-NH2 diperoleh.
Sintesis BSA-MSNs-Anti-VEGFR2
Lima miligram bovine serum albumin (BSA) dan 50 μL antibodi anti-VEGFR2 ditambahkan ke dalam produk di atas (MSNs-NH2 , 50 mg) dan direaksikan dengan pengadukan selama 2 jam. Campuran dicuci dengan air lima kali, setelah itu 1,1 mg NHS dan 1,6 mg EDC ditambahkan ke dalam campuran dan diaduk semalaman pada suhu kamar dalam 5 mL air. Endapan dipisahkan dengan sentrifugasi, dicuci dengan air sebanyak lima kali, yang berhasil memperoleh BSA-MSNs-anti-VEGFR2.
131
I Radiolabeling Nanopartikel
Nanopartikel yang dihasilkan diberi radiolabel dengan
131
Saya menggunakan metode Chloramine-T (dilambangkan sebagai
131
I-BSA-MSN dan
131
I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2, masing-masing) [27]. Secara singkat, sekitar 100 μg BSA-MSNs atau BSA-MSNs-anti-VEGFR2 diencerkan dengan 100 μL buffer fosfat (PB), dan 74 MBq
131
saya ditambahkan. Kemudian Kloramin-T (100 μL; 5 mg/mL dalam PB) ditambahkan ke dalam campuran. Setelah 60 detik pengocokan dan inkubasi, reaksi dihentikan dengan menambahkan 100 μL natrium metabisulfit (5 mg/mL dalam PB). Tabung sentrifus digunakan untuk memisahkan berlabel BSA-MSNs dan BSA-MSNs-anti-VEGFR2 dari senyawa berat molekul rendah. Laju pelabelan dan kemurnian radiokimia
131
Nanopartikel berlabel ditentukan menggunakan kromatografi lapis tipis.
Serapan Seluler In Vitro:Studi Mikroskop Confocal
Pertama, MSNs-anti-VEGFR2 dan MSNs diberi label dengan FITC [28]. Secara singkat, MSNs-NH2 (100 mg) ditambahkan ke dalam 1 mL larutan alkohol FITC (1 mg/mL), dengan didiamkan selama 4 jam sambil diaduk. MSN berlabel FITC (FITC-MSNs) diperoleh dengan sentrifugasi dan dikeringkan dalam ruang hampa. FITC-MSNs-anti-VEGFR2 juga dapat diperoleh dengan menggunakan metode yang sama.
Sel FRO diunggulkan di piring 6-sumur semalaman dan kemudian 5 × 10
5
sel per sumur diinkubasi dengan FITC-MSNs dan FITC-MSNs-anti-VEGFR2 masing-masing selama 1 dan 6 jam pada suhu 37°C. Sel dicuci tiga kali dengan phosphate buffer saline (PBS) dan kemudian difiksasi dengan etanol 70% selama 20 menit. Selanjutnya, sel dicuci tiga kali dengan PBS dan inti diwarnai dengan 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) selama 45 menit dan kemudian difiksasi dengan paraformaldehyde (4% dalam PBS). Gambar mikroskop confocal diperoleh menggunakan confocal laser scanning microscopy (CLSM) (Zeiss LSM 510, USA).
Serapan Seluler Bergantung Waktu
Untuk mengukur serapan yodium-131 seluler yang bergantung pada waktu dari nanopartikel, 1 × 10
5
sel per sumur dikultur dengan 3,7 MBq/mL Na
131
Saya,
131
I-BSA-MSN, atau
131
I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2, masing-masing. Sel kemudian dicuci secepat mungkin dengan 1 mL larutan buffer Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS), dipisahkan dengan tripsin, dan disuspensikan kembali dalam 1 mL HBSS selama 1, 2, 3, 5, 7, dan 9 jam. Radioaktivitas diukur menggunakan pencacah (LKB gamma 1261, Australia). Semua percobaan dilakukan tiga kali untuk mendapatkan data yang tepat.
Model Hewan
Tikus telanjang Balb/c (betina, berusia sekitar 4 minggu, dengan berat 15-20 g) dibeli dari Pusat Penelitian Hewan Eksperimental Beijing di Peking Union Medical College dan dipelihara dalam kondisi bebas patogen tertentu, dengan kelembaban relatif (30–70 %) dan lingkungan yang dikontrol suhu (20–24 °C) di Laboratory Animal Center, Tianjin Medical University, China. Semua prosedur penanganan hewan sesuai dengan protokol yang disetujui oleh Komite Etik Rumah Sakit Umum Universitas Kedokteran Tianjin. Xenograft tumor FRO diinduksi dengan injeksi subkutan 5 × 10
6
Sel FRO dalam 50 μL PBS ke bahu kanan tikus.
Pencitraan Di Vivo
Ketika tikus telanjang yang mengandung tumor diberi makan selama 1-2 minggu dan volume tumor telah mencapai diameter sekitar 10 mm, tikus secara acak dibagi menjadi tiga kelompok (Na
131
Saya,
131
I-BSA-MSN, dan
131
I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2). Setiap grup menerima 7,4 MBq
131
I melalui injeksi intratumoral untuk menilai lokalisasi organ
131
nanopartikel berlabel I. Pencitraan skintigrafi dilakukan pada 1, 2, 3, 7, 14, dan 21 hari setelah masing-masing injeksi obat. Tikus telanjang dibius dengan 4% chloral hydrate (150 L) sebelum setiap pemindaian, ditempatkan dalam posisi tengkurap, dan kemudian dicitrakan menggunakan pemindai SPECT/CT (Discovery NM/CT 670, USA). Untuk menghindari paparan jaringan tiroid terhadap radiasi dan pencitraan yang tidak diinginkan, natrium perklorat (0,05 mg/mL) ditambahkan ke air minum untuk semua tikus 1 hari sebelum eksperimen dan dipertahankan selama 1 minggu.
Distribusi Jaringan
Pada 24 dan 72 jam setelah injeksi intratumoral sebesar 7,4 MBq
131
nanopartikel berlabel I, tikus di setiap kelompok (n = 3/kelompok) dikorbankan dengan dislokasi serviks, dan jaringan jantung, limpa, ginjal, hati, usus, paru-paru, dan tumor diangkat dan ditimbang. Radioaktivitas di berbagai organ diukur menggunakan penghitung (LKB gamma 1261, Australia), dan radioaktivitas dinyatakan sebagai persentase dosis yang disuntikkan per gram jaringan (%ID/g).
Di Vivo
131
Saya Terapi
Mirip dengan pencitraan in vivo, tikus dari ketiga kelompok disuntik secara intratumor dengan dosis 74 MBq (50 μL)
131
I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2,
131
I-BSA-MSN, dan Na
131
I, masing-masing, ketika volume tumor telah mencapai diameter sekitar 10 mm. Volume normal saline yang sama diberikan sebagai kelompok kontrol. Volume tumor diperkirakan menggunakan rumus berikut:volume = 4π/3 (1/2 panjang × 1/2 lebar × 1/2 tinggi) [15, 29]. Volume tumor dan berat badan hewan diukur setiap 3 hari. Tikus di-eutanasia jika berat badannya turun lebih dari 20% atau hampir mati.
Pemeriksaan Histologi
Ketika percobaan selesai, tikus dikorbankan dan tumor dan jaringan normal dari empat kelompok, termasuk jantung, hati, limpa, ginjal, dan paru-paru, diisolasi untuk mempelajari histopatologinya. Secara singkat, bagian parafin setebal 5 mm di-dewax menggunakan dua inkubasi xilena (masing-masing selama 30 menit pada 56 °C) dan kemudian direhidrasi dalam etanol. Bagian kemudian direndam semalam dalam sukrosa 10% dalam air suling. Setelah itu, bagian dicuci dalam 0,1 M PBS, pH 7,4, diinkubasi dalam 1,2% hidrogen peroksida dalam metanol selama 30 menit, dan dibilas dalam 0,1 M PBS, pH 7,4 selama 15 menit. Slide tumor kemudian diinkubasi dalam ruang lembab semalaman, pada suhu kamar, dengan pengenceran antibodi anti-VEGFR2 1:100. Setelah dicuci tiga kali dengan PBS, slide diinkubasi dengan sistem deteksi DAKO-REALTM En-Vision™ selama 60 menit, kemudian divisualisasikan menggunakan diaminobenzidine dan diwarnai dengan hematoxylin Mayer. Semua gambar diperoleh menggunakan mikroskop Olympus.
Analisis Statistik
Semua data disajikan sebagai mean ± standar deviasi (SD), dan analisis statistik dilakukan dengan menggunakan SPSS (Paket Statistik untuk Ilmu Sosial) 12.0 for windows (SPSS, Chicago, IL, USA). Analisis data dilakukan dengan menggunakan kurva Kaplan-Meier dan uji log-rank. Semua uji statistik adalah dua sisi, dan P nilai < 0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Hasil
Karakteristik Nanopartikel
Karakteristik nanopartikel dianalisis dan ditentukan oleh TEM dan DLS (Gbr. 1a-c). Gambar TEM menunjukkan bahwa MSN memiliki morfologi sferis yang seragam, dan gambar DLS menunjukkan bahwa MSN seragam dengan ukuran 108 ± 5.9 nm. Modifikasi BSA dan/atau penargetan anti-VEGFR2 tidak mengubah morfologi nanopartikel dan hanya menghasilkan sedikit kecenderungan untuk beragregasi dalam larutan dibandingkan dengan MSN yang tidak dimodifikasi, yang mungkin disebabkan oleh peningkatan luas permukaan nanokompleks. Diameter BSA-MSNs-anti-VEGFR2 sedikit meningkat menjadi 163 ± 4,6 nm, dan potensi zeta rata-rata MSN adalah 23,91 mV, yang berubah menjadi 28,45 mV untuk BSA-MSNs-anti-VEGFR2. Perubahan potensial zeta dan peningkatan ukuran setelah modifikasi permukaan menunjukkan keberhasilan penambahan BSA dan anti-VEGFR2 pada permukaan MSN pada setiap langkah (Tabel 1). Karakterisasi tekstur MSN lebih lanjut dikonfirmasi oleh isoterm adsorpsi-desorpsi nitrogen. MSN memiliki struktur mesopori yang terdefinisi dengan baik dengan luas permukaan 630,2 m
2
/g, dan diameter pori rata-rata 2,8 nm (Gbr. 1d). Stabilitas nanopartikel BSA-MSNs-anti-VEGFR2 dipantau selama beberapa minggu, dan tidak ada agregasi yang jelas diamati. Proporsi
131
Saya memberi label sekitar 50–75%.
Karakteristik nanopartikel. Karakterisasi MSN (a ), BSA-MSN (b ), BSA-MSNs-anti-VEGFR2 (c ), dan isoterm adsorpsi-desorpsi nitrogen dan kurva distribusi ukuran pori Barrett–Joyner–Halenda (BJH) dari MSN (d ). Gambar mikroskop elektron transmisi menunjukkan bahwa semuanya memiliki morfologi yang teratur (bulat seragam). Gambar hamburan cahaya dinamis menunjukkan bahwa semuanya seragam, dengan ukuran rata-rata masing-masing 108 nm, 139 nm, dan 163 nm. Analisis BET dan BJH menunjukkan isoterm tipe IV yang khas, konsisten dengan struktur mesopori
Penerapan Partikel Nano Buatan
Pengikatan BSA-MSNs dan BSA-MSNs-anti-VEGFR2 untuk menargetkan sel FRO garis sel ATC manusia diuji menggunakan mikroskop confocal (Gbr. 2). Imunofluoresensi menunjukkan bahwa MSN yang ditargetkan dan tidak ditargetkan dapat secara efisien mengikat ke sel FRO. Setelah 1 jam inkubasi dengan BSA-MSNs atau BSA-MSNs-anti-VEGFR2, fluoresensi terlihat hadir dalam sel, dan yang dipertahankan dan diperkuat setelah 6 jam inkubasi. Dibandingkan dengan BSA-MSNs-anti-VEGFR2, BSA-MSNs juga dapat mengikat sel, tetapi kami menemukan bahwa retensi sel tumor minimal dan sinyal fluoresensi hijau lemah. Hasil ini menunjukkan bahwa kemampuan penargetan nanopartikel ditingkatkan melalui modifikasi dengan antibodi anti-VEGFR2.
Penyerapan nanopartikel dibangun. Gambar mikroskop pemindaian laser confocal menunjukkan internalisasi seluler dari berbagai formulasi pada 1 dan 6 jam untuk BSA-MSNs dan BSA-MSNs-anti-VEGFR2. Sinyal florescent pada 1 jam meningkat pada 6 jam untuk kedua kelompok. Selain itu, fluoresensi hijau yang mengikat pada kelompok bertarget anti-VEGFR2 lebih kuat daripada kelompok yang tidak bertarget pada kedua titik waktu
Serapan Seluler Bergantung Waktu
Untuk menentukan serapan radioiodin Na
131
Saya,
131
I-BSA-MSN, dan
131
I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 seiring berjalannya waktu,
131
Pengukuran aktivitas waktu-I diperoleh dalam sel FRO. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3a,
131
Penyerapan saya dalam garis sel ini mencapai tingkat maksimal setelah 3 jam inkubasi dengan
131
I-BSA-MSN dan setelah 5 jam dengan
131
I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2. Selain itu, serapan radioiodine
131
I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 lebih tinggi dari
131
I-BSA-MSN.
Penyerapan seluler dan distribusi jaringan tergantung waktu. a Data tentang serapan seluler yang bergantung pada waktu disajikan sebagai mean ± SD dari tiga kelompok. b Perbandingan data biodistribusi
131
I pada tumor dan organ utama tikus pembawa tumor ATC pada 24 dan 72 jam setelah injeksi Na
131
intratumoral Saya,
131
I-BSA-MSN, dan
131
I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2. Radioaktivitas jaringan tumor kelompok target anti-VEGFR2 pada 24 dan 72 jam setelah injeksi intratumoral (masing-masing 32,2 ± 2,8% ID/g dan 23,0 ± 1,8% ID/g) secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok non-target (26,1 ± 2,5% ID/g dan 12,3 ± 1,2% ID/g, masing-masing) (semua P < 0,05). Data juga disajikan sebagai mean ± SD untuk ketiga kelompok
Distribusi Jaringan
Distribusi jaringan
131
I pada tikus telanjang diukur menggunakan γ counter pada 24 dan 72 jam setelah injeksi intratumoral dengan masing-masing obat (Gbr. 3b). Hasilnya mengungkapkan bahwa ketiga kelompok memiliki akumulasi radiasi yang serupa di jaringan normal pada 24 dan 72 jam. Radioaktivitas untuk semua kelompok secara bertahap menurun seiring waktu dan sebagian besar terakumulasi dalam tumor. Selain itu, akumulasi dalam jaringan tumor pada 24 dan 72 jam setelah injeksi pada kedua kelompok dengan
131
Nanopartikel berlabel I jauh lebih tinggi daripada di Na
131
kelompok I, yaitu 11,6 ± 0,9% ID/g pada 24 jam dan menurun drastis menjadi 2,1 ± 0,08% ID/g pada 72 jam. Namun, konsentrasi tumor kelompok target anti-VEGFR2 pada 24 dan 72 jam pasca injeksi adalah masing-masing 32,2 ± 2,8% ID/g dan 23,0 ± 1,8% ID/g, yang secara signifikan lebih tinggi daripada non- kelompok sasaran (masing-masing 26,1 ± 2,5% ID/g dan 12,3 ± 1,2% ID/g, semua P < 0.05).
In Vivo Imaging
Untuk menentukan
131
Saya mengambil dan mendistribusikan nanopartikel dan mengamati waktu tinggal
131
I dalam jaringan tumor in vivo, gambar SPECT/CT representatif dari tikus yang mengandung tumor FRO diperoleh pada titik waktu yang berbeda setelah injeksi intratumoral dengan masing-masing obat (Gbr. 4a). Hasil penelitian menunjukkan bahwa akumulasi radioaktif di Na
131
Kelompok I diekskresikan dengan cepat dari tumor pada 2 hari setelah injeksi, dan tidak terlihat pada 3 hari setelah injeksi. Sebaliknya, dua grup dengan
131
Nanopartikel berlabel I memiliki pembersihan darah yang lebih lambat dan akumulasi yang lebih tinggi di jaringan tumor bahkan pada 2 minggu setelah injeksi, terutama pada kelompok target anti-VEGFR2. Khususnya, pada 3 minggu setelah injeksi, radioaktivitas pada kelompok yang ditargetkan jelas lebih kuat daripada kelompok yang tidak disuntik.
Pencitraan in vivo, in vivo
131
I terapi, dan analisis kelangsungan hidup. a SPECT / CT leburan dan gambar tiga dimensi dari tikus yang mengandung tumor ATC diperoleh pada titik waktu yang berbeda setelah injeksi intratumoral dengan obat masing-masing. Akumulasi radioaktif di Na
131
Kelompok I tidak terlihat pada 3 hari setelah injeksi, tetapi terlihat jelas bahkan pada 3 minggu setelah injeksi pada kelompok target anti-VEGFR2. Volume tumor (b ), berat badan (c ) berubah, dan kurva kelangsungan hidup Kaplan–Meier (d ) dalam model xenograft FRO ATC (n = 6/grup). Pertumbuhan tumor dan penurunan berat badan pada kelompok yang ditargetkan secara signifikan dihambat dibandingkan dengan yang tidak ditargetkan, Na
131
I, atau kelompok salin, masing-masing. Data disajikan sebagai mean ± SD dari tiga kelompok dan semuanya P < 0,05. Selain itu, waktu kelangsungan hidup rata-rata pada kelompok yang ditargetkan (41 hari) diperpanjang secara signifikan dibandingkan dengan kelompok yang tidak ditargetkan (34 hari) atau Na
131
Grup I (25 hari) (semua P < 0,01)
Di Vivo
131
Saya Terapi
Gambar 4b menunjukkan volume tumor rata-rata dari waktu ke waktu dalam empat kelompok. Volume tumor sebelum injeksi digunakan sebagai referensi awal. Kecuali di
131
Kelompok I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2, tumor berangsur-angsur tumbuh pada semua kelompok terutama pada kelompok Na
131
I dan kelompok salin. Pada hari ke 24, rata-rata volume tumor di Na
131
I dan kelompok salin masing-masing adalah 296,6 ± 24,2% dan 278,3 ± 19,3%, dibandingkan dengan 198,7 ± 13,2% di
131
Kelompok I-BSA-MSNs pada hari ke 30. Menariknya, kami mengamati bahwa volume pada kelompok sasaran anti-VEGFR2 berkurang secara perlahan setelah hari ke-9 pasca injeksi dan hampir menurun ke referensi awal pada akhir pengamatan.
Gambar 4c menunjukkan perubahan bobot badan keempat kelompok. Berat badan secara bertahap menurun di Na
131
I dan kelompok salin selama periode pengamatan. Namun, dua kelompok lainnya kehilangan berat badan hanya pada minggu pertama, yang diperoleh kembali di kemudian hari, terutama untuk kelompok sasaran anti-VEGFR2.
Analisis Kelangsungan Hidup
Dalam penelitian ini, kami menggunakan probabilitas kelangsungan hidup sebagai metrik lain untuk mengevaluasi efek terapeutik
131
nanopartikel berlabel I. Gambar 4d menunjukkan kurva kelangsungan hidup Kaplan–Meier setelah perawatan dengan saline, Na
131
Saya,
131
I-BSA-MSN, atau
131
I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 dalam model tikus telanjang pembawa tumor ATC. Tumor berkembang pesat di salin dan Na
131
kelompok I, dan waktu kelangsungan hidup rata-rata adalah 27 dan 25 hari, masing-masing. Analisis dengan uji log-rank mengungkapkan bahwa median waktu bertahan hidup di
131
Kelompok I-BSA-MSN (34 hari) memanjang secara signifikan dibandingkan dengan kelompok Na
131
Saya mengelompokkan (P < 0,001). Selain itu, kami menemukan bahwa pengobatan pada kelompok sasaran anti-VEGFR2 (waktu kelangsungan hidup rata-rata, 41 hari) menghasilkan hasil kelangsungan hidup yang lebih baik secara signifikan daripada kelompok yang tidak ditargetkan (P < 0.01).
Analisis Histopatologi
Untuk mengevaluasi efek antitumor
131
Nanopartikel berlabel I dan menguji potensi toksisitas MSN pada tikus, organ utama dan tumor dikumpulkan untuk pewarnaan hematoxylin dan eosin setelah radioterapi. Tidak ada perubahan patologis yang signifikan pada organ vital yang diamati pada tikus yang mengandung tumor setelah pengobatan dengan
131
nanopartikel berlabel I (Gbr. 5a). Ini menunjukkan bahwa tidak ada toksisitas sistemik yang jelas terjadi dalam periode pengamatan. Selain itu, tumor yang diobati dengan
131
I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 menunjukkan degenerasi dan nekrosis masif sel tumor, yang lebih jelas daripada
131
Grup I-BSA-MSN. Namun, tumor yang diobati dengan Na
131
I atau kelompok salin dikemas dengan sel tumor yang layak. Analisis imunohistokimia tumor mengungkapkan ekspresi VEGFR yang terlihat (Gbr. 5b).
Analisis histopatologi. a Analisis histopatologi organ utama tikus pembawa tumor FRO ATC setelah pengobatan dengan
131
nanopartikel berlabel I. Tidak ada perubahan patologis yang signifikan pada jantung, hati, paru-paru, dan ginjal yang diamati. b Pemeriksaan patologis (pewarnaan H&E) dan analisis imunohistokimia tumor pada mencit. Fragmen besar dari degenerasi dan nekrosis sel tumor pada kelompok target anti-VEGFR2 dan potongan kecil nekrosis densitas rendah di
131
Grup I-BSA-MSNs ditampilkan. Sebaliknya, hanya sel tumor yang hidup yang diamati di Na
131
I dan kelompok salin. Fotomikrograf dari analisis imunohistokimia menunjukkan ekspresi VEGFR yang terlihat. Bar = 200 μm
Diskusi
Prognosis ATC tetap buruk dan sejauh ini tidak ada pilihan pengobatan yang efektif [1, 2, 6]. Terapi molekuler yang ditargetkan, sebagai terapi baru, telah meningkatkan morbiditas dan mortalitas banyak kanker [23, 24]. VEGFR is crucial to microvascular formation, which facilitates the growth of most malignancies, and allows continued tumor expansion [9, 10]. In this study, we evaluated the efficacies of Na
131
I,
131
I-BSA-MSNs, and
131
I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 for the treatment of ATC in tumor-bearing nude mouse models. The results demonstrated that both anti-VEGFR2 targeted and non-targeted nanoparticles labeled with
131
I were effective in delaying the tumor growth of ATC and that the
131
I-labeling anti-VEGFR2 targeted MSNs was the most effective agent to inhibit the tumor growth in nude mice and prolonging median survival. This treatment modality might represent a novel therapeutic option for ATC.
VEGFR targeting with nanoparticles is rarely reported in the literature. Goel S et al. [19] confirmed that VEGFR targeting using VEGF121 conjugated, anti-VEGFR therapeutics-loaded MSNs represented a major advance for angiogenesis imaging and inhibition in human glioblastoma. A study performed by Gule indicated that inhibition of epidermal growth factor receptor (EGFR) and VEGFR2 in ATC using vandetanib causes significant tumor growth inhibition in vivo in an orthotopic xenograft model [15]. In the present study, using confocal microscopy, we found that both targeted and non-targeted nanoparticles could efficiently bind to the cytoplasm and cytoplast of FRO cells, and further confirmed that the targeting ability of the nanoparticles was enhanced via modification with the anti-VEGFR2 antibody, which result was consistent with that of the time-dependent cellular uptake experiment. Additionally, after intratumoral injection with the respective drugs, we compared data on the tissue distribution of
131
I in the tumor-bearing nude mice at 24 and 72 h for the different groups. The radioactivity for all groups was mostly accumulated in the tumor and gradually decreased with time. Moreover, we found that the radioactivity in anti-VEGFR2 targeted group could be retained for longer time in the tumor in comparison with non-targeted group, which was also consistent with the results observed by confocal microscopy.
SPECT/CT is a powerful tool to provide both structural and functional imaging information for diseases, and can monitor the metabolism of radioactive drugs at different times post injection [30,31,32]. In the present study, we compared data on the tissue distribution of
131
I using SPECT/CT. The results showed that radioactive accumulation in the Na
131
I group was not seen at 3 day post-injection. However, higher accumulation in the tumor tissue was observed at 2 weeks post-injection for the two groups with
131
I-labeled nanoparticles, and at 3 weeks the radioactive signal in the anti-VEGFR2 targeted group was apparently stronger than that in the non-targeted group. We hypothesized that the passive tumor targeting of MSNs, which relies on unpredictable tumor extravasation and enhanced permeability retention effect, and positive targeting linked with anti-VEGFR-2, associated with VEGFR2 overexpression in ATC, played a key role in enhancing the retention of the nanoparticles in the tumors. This finding revealed that anti-VEGFR2 modification prolonged the retention time of
131
I in the tumor tissue compared with that of free Na
131
I and
131
I-BSA-MSN, which was also similar to the tissue biodistribution of
131
I measured by γ counter.
In the present study, we monitored the body weight change of nude mice after intratumoral injection with a single dose of 2 mCi
131
I, which showed that the body weight in the
131
I-labeled nanoparticle groups gradually increased at 1 week post-injection, especially for the anti-VEGFR2 targeted group. Similarly, we also observed the changes in tumor volume and found that the tumors in the Na
131
I or saline group grew rapidly, while the volume in
131
I-BSA-MSNs group increased slowly. Interestingly, the tumors in anti-VEGFR2 targeted group gradually decreased after 1 week post-injection, which was contrary to the body weight change. These results indicated that the anti-VEGFR2 modification could effectively inhibit the increase in tumor volume and thereby enhanced the efficiency of
131
I therapy. We considered that the tumor necrosis was caused by the beta rays emitted from
131
I, which resulted in tumor shrinkage and indirectly led to an increase in body weight. This effect, we speculated, began to appear mainly 1 week after injection of
131
saya.
Our findings indicated that the treatment mediated by intratumorally injected
131
I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 resulted in significant tumor growth delay, which was confirmed increased structural damage and massive necrosis in tumor tissue compared with that in the
131
I-BSA-MSNs group. Significantly, this higher antitumor activity was achieved without causing apparent systemic toxic effects, as indicated by the lack of significant pathological changes in the vital organs observed in tumor-bearing nude mice. Although further studies are needed to document both the acute and chronic toxicological effects,
131
I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 exhibited several properties that made them a promising candidate for minimally invasive therapy for ATC.
In our pre-experiment, injection into the tail vein was performed and the results showed that the radioactivity was mainly distributed in the phagocytosis system. Intratumoral injection was used in some studies [29, 33, 34], and the operation is more convenient. Therefore, we used intratumoral injection as the injection method and also achieved better results. MSNs offer a promising approach to overcome the insolubility issue and deliver large payloads of hydrophobic small molecule drugs. Currently, we are investigating the potential for loading targeted anti-cancer drugs using MSNs. We will provide the results in the future publication.
Conclusions
In the present study, we successfully synthesized BSA-MSNs-anti-VEGFR2, with uniform spherical morphology, and which were radiolabeled with
131
I using the Chloramine-T method. The results showed that both targeted and non-targeted MSNs could efficiently bind to the cytoplasm and cytoplast of FRO cells. The radioactivity in ATC tumor-bearing nude mouse model was mostly accumulated in the tumor and could be retained a longer time in the
131
I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 group. Additionally, the tissue distribution of
131
I could be also imaged and validated using SPECT/CT. Moreover, tumor growth in the ATC tumor-bearing nude mouse model was significantly inhibited by the anti-VEGFR2 targeted MSNs compared with that achieved using non-targeted MSNs and the
131
I treatment with anti-VEGFR2 targeting MSNs significantly prolonged the survival of ATC tumor-bearing mice. Our data supported the view that such an approach may represent a more effective means to treat ATC.
