Nanopartikel emas bentuk bulat:pengaruh ukuran partikel dan konsentrasi pada pertumbuhan akar Arabidopsis thaliana
Abstrak
Saat ini, karena berbagai aplikasi nanopartikel (NP) di banyak area industri, akumulasi entitas tersebut di lingkungan menimbulkan risiko besar. Karena kelembamannya, NP logam mulia dapat tetap berada di tanah yang terkontaminasi hampir tidak berubah untuk waktu yang lama. Dalam konteks ini, penyerapan partikel yang bergantung pada ukuran, bentuk, dan konsentrasi oleh tanaman termasuk dalam area yang belum dijelajahi. Dalam karya ini, kami menyajikan solusi air dari AuNP bulat yang disintesis secara biologis ramah dengan distribusi ukuran yang cukup sempit dalam kisaran ukuran dari 10 hingga 18 nm. Karakterisasi menyeluruh mereka dengan spektroskopi serapan atom, plasma berpasangan induktif yang dilengkapi spektroskopi massa, hamburan cahaya dinamis (DLS), dan metode TEM diikuti oleh studi pengaruhnya terhadap pertumbuhan Arabidopsis thaliana (akar primer dan lateral), dalam ukuran partikel dan cara yang bergantung pada konsentrasi. Karena bentuk AuNP yang benar-benar bulat dan tidak adanya aglomerasi partikel, ukuran dan distribusi ukuran yang diturunkan dari DLS sesuai dengan yang diperoleh dari TEM. Panjang dan jumlah A. thaliana akar lateral dipengaruhi secara signifikan oleh semua jenis AuNPs. AuNPs terkecil pada konsentrasi tertinggi menghambat panjang akar primer dan, sebaliknya, meningkatkan pertumbuhan akar rambut.
Latar Belakang
Saat ini, kimia dan teknik modern menghasilkan sejumlah besar objek nano untuk meningkatkan sifat utilitas materi tidak hanya dalam aplikasi khusus tetapi semakin meningkat dalam produk konsumsi sehari-hari. Bahan berstrukturnano, yaitu, nanopartikel [1, 2], nanorod [3], nanotube [4], nanotekstil nonwoven [5], karena mereka berdiri atau melekat pada berbagai jenis dukungan, secara signifikan meningkatkan hasil di hampir semua bidang aplikasi industri mulai dari dari kosmetik [6] dan perawatan kesehatan [7], lebih dari bioteknologi [8, 9], hingga aplikasi konversi energi [10], dan katalis [3]. Sementara penyertaan bahan nano dalam produk ini dapat meningkatkan kinerjanya, kerusakannya pada akhir masa pakainya memberikan beberapa titik masuk utama untuk NP sintetis ke lingkungan. Khususnya NP yang direkayasa, yang telah banyak digunakan dalam katalis, penstabil pewarna pelindung UV, agen antimikroba dalam industri tekstil, atau produk perawatan kesehatan dan kosmetik (khususnya yang memiliki inertitas kimia tinggi seperti Au, Ag, Pt, dan Pd) harus diberikan perhatian khusus, karena mereka dapat terakumulasi di lingkungan hampir tidak berubah selama bertahun-tahun, memicu proses yang sejauh ini tidak diketahui pada serapan tanaman mereka. Mengenai nanopartikel logam mulia (NMNPs), beberapa karya perintis telah diterbitkan tentang efek nanopartikel perak (AgNPs) pada bibit selada thale (Arabidopsis thaliana ), menunjukkan bahwa konsentrasi AgNP yang sangat rendah (< 1 ppm) dapat menjadi racun bagi bibit [11]. AgNP dari 20 hingga 80 nm jelas menghambat pertumbuhan, dan fitotoksisitasnya bergantung pada konsentrasi dan ukuran partikel. Ujung akar (topi dan columella) diamati berubah menjadi coklat muda ketika akar primer terkena AgNPs. Ujung coklat dikaitkan dengan adsorpsi AgNP baik itu sendiri atau dalam hubungannya dengan bahan dinding sel atau metabolit sekunder yang dihasilkan oleh ujung akar. Namun, mekanisme pastinya belum dijelaskan.
Meskipun ada beberapa penelitian yang membahas peran NP di lingkungan [12], yang menargetkan pada nanopartikel emas (AuNPs) masih jarang [13]. Jika tersedia, sebagian besar data yang dipublikasikan tentang nanotoksikologi berfokus pada sitotoksisitas mamalia [14,15,16] atau dampak pada hewan dan bakteri [17,18,19,20], dan hanya beberapa penelitian yang mempertimbangkan toksisitas produk rekayasa. NP untuk tanaman. Selain itu, interaksi NMNPs dengan tanaman dan organisme lain yang memiliki kesamaan dengan sel tanaman, seperti alga, telah dipelajari dengan buruk sejauh ini, menyiratkan bahwa konsekuensi umum dari paparan NMNPs untuk sel tanaman masih belum jelas [11]. Kurangnya data ini mengarah pada pemahaman yang salah tentang bagaimana NMNP ditransfer dan terakumulasi di berbagai tingkat rantai makanan.
Dalam karya ini, kami melaporkan efek nanopartikel emas pada pertumbuhan tanaman, khususnya pada perkembangan akar primer dan lateral A. thaliana di hadapan partikel ukuran yang berbeda. AuNPs disintesis dengan metode basah di bawah protokol ramah biologis tanpa menggunakan stabilizer, menghasilkan nanopartikel bulat dengan kontrol yang tepat atas ukuran dan distribusi ukurannya. Sebelum perawatan tanaman, AuNPs dicirikan secara menyeluruh oleh spektrum metode analisis yang luas (AAS, ICP-MS, DLS, dan TEM).
Eksperimental
Bahan, peralatan, dan prosedur
Nanopartikel emas disintesis dengan prosedur yang sedikit diadaptasi yang diterbitkan oleh Batús et al. [20]. Secara singkat, 149 mL air dipanaskan dalam labu alas bulat 250 mL leher dua sampai mulai refluks. Kemudian ditambahkan 1 mL natrium sitrat 0,33 M dan 0,945 mL 10 mg/mL kalium tetrakloroaurat(III) dalam air. Setelah 30 menit, pemanasan dihentikan dan campuran reaksi dibiarkan menjadi dingin. Dalam semua eksperimen persiapan, air Milli-Q (18,2 MΩ pada 25 °C) digunakan.
Untuk pengujian akar A. thaliana , AuNP yang disintesis dari tiga ukuran berbeda (10, 14, dan 18 nm) disentrifugasi pada 5000g selama 1 jam untuk meningkatkan konsentrasi partikel hingga nilai batas 2000 mg/L.
A. thaliana Benih Columbia (Col-0) (diperoleh dari benih Lehle, AS) disterilisasi permukaannya dengan 30% (v /v ) larutan pemutih selama 10 menit dan dibilas lima kali dengan air steril. Benih steril ditaburkan pada cawan agar yang mengandung media Murashige-Skoog (MS) dan agar tanaman 1% (pH 5,8). Untuk menyinkronkan perkecambahan biji, cawan agar disimpan pada suhu 4 °C selama 2 hari. A. thaliana tanaman ditanam selama 5 hari di pelat berorientasi vertikal di ruang pertumbuhan pada 22 °C dengan 100 μmol m
− 2
s
− 1
intensitas cahaya dalam kondisi hari yang panjang (siklus terang/gelap 16 j/8 j).
Bibit berumur lima hari dengan ukuran yang sama dipindahkan ke cawan agar (20 tanaman per cawan) yang berisi media 1/16 MS, konsentrasi AuNP yang berbeda (0, 1, 10, dan 100 mg/L) dan agar tumbuhan 1% ( pH 5,8). AuNP ditambahkan ke media setelah autoklaf. Sebagai kontrol, efek buffer natrium sitrat juga diselidiki. Panjang akar ditandai, dan bibit ditanam selama 5 hari berikutnya. Keduanya, pertambahan panjang akar primer dan akar lateral diukur menggunakan software JMicroVision 1.2.7.
Metode analitik
Larutan AuNPs yang telah disiapkan dicirikan oleh Spektroskopi Serapan Atom (AAS), plasma induktif berpasangan yang dilengkapi spektroskopi massa (ICP-MS), hamburan cahaya dinamis (DLS), dan mikroskop elektron transmisi (TEM).
Konsentrasi NP yang disiapkan ditentukan dengan menggunakan AAS oleh perangkat VarianAA880 (Varian Inc., USA) menggunakan alat penyemprot api pada panjang gelombang 242,8 nm. Ketidakpastian konsentrasi yang ditentukan oleh metode ini adalah kurang dari 3%.
Plasma yang digabungkan secara induktif dengan detektor spektroskopi massa (ICP-MS) digunakan untuk menentukan konsentrasi ion Au yang berasal dari bahan kimia sumber Au yang tidak bereaksi, menggunakan spektrometer triple-quadrupole Agilent 8800 (Agilent Technologies, Jepang) yang terhubung ke auto-sampler. Larutan koloid AuNPs dipipet ke dalam tabung mikro hidrofobik 1,5 mL dan disentrifugasi pada 30000g pada sentrifus Eppendorf 5430 selama 1 jam. Setelah sentrifugasi, 0,3 mL supernatan dibuang dengan hati-hati menggunakan pipet dan dianalisis dengan ICP-MS. Nebulisasi sampel dilakukan menggunakan perangkat MicroMist yang dilengkapi dengan pompa peristaltik. Larutan buffer murni (2,2 mM natrium sitrat) digunakan sebagai sampel kosong. Ketidakpastian pengukuran kurang dari 3%.
Gambar TEM diukur menggunakan JEOL JEM-1010 (JEOL Ltd., Jepang) yang dioperasikan pada 400 kV. Setetes larutan koloid ditempatkan pada kisi tembaga yang dilapisi dengan lapisan tipis karbon amorf pada kertas saring. Kelebihan pelarut dihilangkan. Sampel dikeringkan di udara dan disimpan di bawah vakum dalam desikator sebelum ditempatkan pada pemegang spesimen. Ukuran partikel diukur dari mikrograf TEM dan dihitung dengan memperhitungkan setidaknya 500 partikel.
Distribusi ukuran partikel ditentukan oleh Zetasizer ZS90 (Malvern Instruments Ltd., Inggris) dalam rezim DLS untuk distribusi ukuran partikel, dilengkapi dengan fotodioda longsoran untuk deteksi sinyal. Laser keadaan padat yang dipompa dioda (50 mW, 532 nm) digunakan sebagai sumber cahaya. Pengukuran dilakukan dalam kuvet polistiren pada suhu kamar.
Hasil dan diskusi
Karakterisasi nanopartikel
Ukuran dan distribusi ukuran AuNP ditentukan oleh analisis TEM dan DLS. Hasilnya dirangkum dalam Tabel 1, bersama dengan konsentrasi AuNP yang ditentukan oleh AAS segera setelah sintesis NP dan konsentrasi ion Au sisa yang ditentukan oleh ICP-MS. Dari data ini, terbukti bahwa protokol sintesis kami menyediakan nanopartikel Au yang terkontrol dengan baik dengan distribusi ukuran yang cukup sempit. Di sini, kami menggunakan metode modifikasi yang diterbitkan oleh Batús et al. [20] untuk sintesis AuNP yang distabilkan sitrat dengan ukuran dan bentuk terkontrol. Protokol yang dikembangkan memungkinkan perluasan ukuran yang ditargetkan berdasarkan pembesaran AuNP yang telah disintesis sebelumnya melalui pengurangan Au
3+
yang dikatalisasi permukaan bersama-sama dengan penghambatan simultan yang efektif dari nukleasi sekunder.
Wang dkk. [21] menemukan bahwa selama 3 hari pemaparan hidroponik A. thaliana ke Ag
+
dan AgNPs (5 nm) pada konsentrasi yang sama, konsentrasi Ag menurun lebih cepat pada Ag
+
-diperlakukan solusi daripada di AgNP satu, menunjukkan penyerapan lebih cepat dari Ag
+
ion. Oleh karena itu, kami memberikan perhatian khusus untuk meminimalkan kemungkinan efek ion Au dalam distorsi hasil. AuNP yang disintesis sebagai disentrifugasi hingga konsentrasi batas 2000 mg/L dan diencerkan dengan media MS hingga konsentrasi yang diperlukan (1, 10, dan 100 mg/L). Setelah prosedur ini, konsentrasi ion Au sisa dalam larutan yang mengandung 100 mg/L AuNP ditentukan oleh ICP-MS (lihat Tabel 1). Rupanya, sentrifugasi memiliki efek positif pada keberadaan ion Au sisa yang konsentrasinya berkurang dua kali lipat dibandingkan dengan larutan yang disintesis (Tabel 1, AAS) dan kandungan buffer sitrat itu sendiri.
Untuk mengukur polidispersitas NP, kami melakukan pengukuran DLS, yang sangat sensitif terhadap keberadaan konglomerat partikel yang akhirnya terbentuk (Gbr. 1). Dalam pengukuran ini, bahkan sejumlah kecil NP yang diaglomerasi menyebabkan dominasi puncak yang sesuai pada diameter yang jauh lebih tinggi, terutama dalam distribusi ukuran berbobot intensitas (lihat inset pada Gambar. 1). Untungnya, tidak ada aglomerasi partikel yang terdeteksi, dan dengan demikian, kredibilitas evaluasi ukuran mungkin hanya dipengaruhi oleh pendekatan bola [22]. Meskipun kerugian ini, pengukuran DLS memberikan gambaran keseluruhan yang lebih signifikan secara statistik dari distribusi ukuran partikel dibandingkan dengan TEM, karena mengevaluasi seluruh volume sampel sekaligus. Karena sebagian besar NP yang disiapkan berbentuk bulat (lihat Gambar 2), ukuran yang diturunkan dari DLS sesuai dengan yang diperoleh dengan TEM (Tabel 1). Aglomerat partikel yang tampak, terlihat pada gambar TEM (Gbr. 2, 10 nm), lebih mungkin disebabkan oleh kebutuhan penghilangan pelarut dalam pengukuran TEM, daripada interkoneksi partikel individu dalam larutan koloid itu sendiri.
Analisis hamburan cahaya dinamis (distribusi ukuran tertimbang nomor) dari larutan berair AuNPs dengan ukuran berbeda. Inset menunjukkan data pembobotan intensitas "mentah". Angka mengacu pada diameter partikel rata-rata dalam nm
Gambar TEM dari set AuNP yang disiapkan. Harap diperhatikan bahwa perbesaran gambar berbeda untuk ukuran NP tertentu
Adaptasi larutan nanopartikel untuk memenuhi kondisi biologi tanaman
Karena kecenderungan agregasi yang kuat dari AuNPs dalam media pertumbuhan tanaman (media MS), yang biasa digunakan untuk pertumbuhan tanaman in vitro [23], kami harus mengoptimalkan rasio timbal balik dari kedua komponen ini untuk menghindari agregasi NP sambil mempertahankan kondisi yang dapat diterima untuk pertumbuhan tanaman. Pengenceran MS yang berbeda diuji. Agregasi AuNPs mudah terlihat dengan perubahan warna (transisi dari merah ke ungu). Karena konsentrasi awal AuNP yang disintesis sebagai rendah (sekitar 30 mg/L, lihat Tabel 1), tidak cukup untuk eksperimen biologis, konsentrasi NP perlu ditingkatkan dengan sentrifugasi. Dengan prosedur ini, kami meningkatkan konsentrasi partikel hingga nilai batas 2000 mg/L. Solusi NP tersebut kemudian diencerkan hingga konsentrasi akhir, yang juga menurunkan konsentrasi buffer sitrat dalam percobaan kami. Untuk eksperimen yang berkembang dari A. thaliana , kami mengencerkan AuNPs dalam media 1/16 MS. Agregasi NP minimal dapat dideteksi dalam media ini dan NP jauh lebih stabil dibandingkan dengan 1/2 MS, 1/4 MS, dan 1/8 MS dengan pertumbuhan tanaman yang hampir tidak berubah. Konsentrasi AuNPs dalam solusi akhir ditentukan oleh AAS. Karena percobaan pertumbuhan tanaman dilakukan secara in vitro (dalam kondisi steril), efek prosedur sterilisasi pada NP juga dipelajari. Autoklaf yang umum digunakan (121 °C, 20 menit) dari media pertumbuhan yang disiapkan menyebabkan agregasi lengkap dari NP yang diselidiki. Oleh karena itu, prosedur ini tidak cocok untuk eksperimen kami. Penambahan NP ke dalam media agar yang diautoklaf sekitar 60 °C akhirnya digunakan sebagai prosedur alternatif di mana tidak ada agregasi NP yang terdeteksi dan proses sterilisasi masih efektif.
Pengaruh NP terhadap pertumbuhan akar Arabidopsis thaliana in vitro
Tanaman model seperti dikotil A. thaliana memiliki potensi untuk membantu memahami faktor stres yang mengurangi hasil tanaman global dengan tujuan mengidentifikasi gen yang dapat meningkatkan kelangsungan hidup dalam kondisi stres [24]. Semua bentuk AuNP yang diuji memiliki efek signifikan pada akar lateral (LR). Baik panjang (Gbr. 3a) dan jumlah (Gbr. 3b) LR berkurang pada tanaman yang diberi perlakuan AuNP. Konsentrasi tertinggi AuNPs (100 mg/L) dari semua ukuran partikel yang diselidiki menyebabkan penurunan panjang LR hingga sekitar 50%. Jumlah LR berkurang menjadi sekitar 70% dalam kasus AuNP 18 nm dan konsentrasi tertinggi (100 mg/L). Pengurangan jumlah LR yang sedikit lebih kecil diamati ketika konsentrasi tertinggi AuNP yang lebih kecil (14 dan 10 nm) digunakan (Gbr. 3b). Panjang akar primer juga berkurang setelah perlakuan AuNP (Gbr. 3c). Efek negatif dari 10-nm AuNP cukup besar terutama pada konsentrasi partikel yang lebih tinggi. Efek partikel yang lebih besar (14, 18 nm) jauh lebih kecil dan mirip dengan efek buffer natrium sitrat yang digunakan sebagai kontrol. Sebagian besar penelitian yang diterbitkan dengan NP yang direkayasa menunjukkan tingkat fitotoksisitas tertentu, terutama pada konsentrasi NP yang tinggi. Misalnya, AgNP berlapis sitrat menghambat A. thaliana pemanjangan akar semai dengan respons dosis linier dari 67 hingga 535 μg/L setelah 2 minggu [25]. Beberapa penelitian lain yang menggunakan uji pemanjangan akar dan perkecambahan biji telah menunjukkan bahwa fitotoksisitas dipengaruhi oleh ukuran NP. Banyak penelitian telah menyimpulkan bahwa semakin kecil NP semakin fitotoksiknya. Namun, generalisasi tentang toksisitas tergantung ukuran bahan nano yang direkayasa ini tidak selalu benar untuk semua kombinasi jenis tanaman dan NP [21, 25]. Berlawanan dengan itu, nanotube karbon berdinding tunggal secara positif mempengaruhi pemanjangan akar tomat, kubis, wortel, dan selada dalam 24 hingga 48 jam [26]. Efek positif dari 24 nm AuNPs pada tingkat perkecambahan biji dan pertumbuhan vegetatif dilaporkan oleh Kumar et al. [13].
Pengaruh AuNP pada a panjang dan b jumlah akar lateral dan c pemanjangan akar utama A. thaliana bibit. Tanaman terkena konsentrasi yang berbeda (0,1, 10, dan 100 mg/L) dari 10, 14, dan 18 nm AuNPs. Data adalah mean + SD dari 19–20 tanaman. *P < 0,05, **P < 0.01, ***P < 0,001; t tes
Efek positif substansial dari 10 nm AuNPs pada pertumbuhan rambut akar diamati selama percobaan pertumbuhan akar (Gbr. 4). Efek ini menunjukkan ketergantungan konsentrasi yang kuat. Peningkatan konsentrasi NP menginduksi pertumbuhan rambut akar yang lebih jelas (Gbr. 4e). Perilaku ini telah sering diamati pada akar yang tumbuh di tanah yang miskin fosfor [27]. Efek serupa tidak diamati dalam kasus AuNP 14 dan 18 nm. Bertentangan dengan itu, García-Sánchez et al. [28] diamati, selama A. thaliana pengobatan dengan AgNP yang tersedia secara komersial, penghambatan pada sejumlah rambut akar yang berhubungan dengan 1 cm akar tanaman. Penurunan akar rambut diamati dalam kasus semua partikel yang diuji, terlepas dari ukuran spesifiknya (10, 20, 40, dan 80 nm), menggunakan konsentrasi larutan perlakuan yang seragam 200 mg/L. Rambut akar secara substansial meningkatkan luas permukaan akar yang bersentuhan dengan tanah, dan sebagian besar air dan nutrisi yang masuk ke tanaman diserap melaluinya. Dengan demikian, perkembangan mereka secara signifikan dipengaruhi oleh rangsangan lingkungan dan sinyal stres [29].
Pengaruh konsentrasi yang berbeda dari 10 nm AuNPs pada pertumbuhan rambut akar di A. thaliana bibit. a Kontrol, b –d bibit yang diberi perlakuan masing-masing dengan 1, 10, dan 100 mg/L AuNP, dan e detail pertumbuhan rambut akar yang diinduksi pada tanaman yang terpapar 100 mg/L AuNPs. Bilah skala sesuai dengan 1 cm
Kesimpulan
Kami telah berhasil menyiapkan nanopartikel emas dengan pengurangan dua komponen (natrium sitrat-kalium tetrakloroaurat) yang lembut di lingkungan air yang menyediakan partikel berbentuk bulat, terdistribusi sempit dengan kontrol yang sangat baik atas ukuran yang dihasilkan. Sentrifugasi pasca-sintesis memungkinkan untuk mencapai konsentrasi NP yang diinginkan dan menghilangkan pengaruh ion dan buffer sitrat pada distorsi hasil dalam percobaan tanaman. Pengaruh AuNP dari berbagai ukuran (diameter 10, 14, dan 18 nm) dan konsentrasi (1, 10, dan 100 mg/L) pada pertumbuhan akar A. thaliana diselidiki. Jumlah dan panjang akar lateral berkurang secara signifikan setelah perawatan dengan larutan NP dengan konsentrasi partikel yang lebih tinggi, terlepas dari ukuran spesifiknya. Efek negatif pada pertumbuhan akar primer diamati dalam kasus AuNP 10 nm. Anehnya, AuNP terkecil (10 nm) jelas menginduksi pertumbuhan rambut akar. Secara keseluruhan, penelitian ini menunjukkan bahwa paparan langsung tanaman terhadap AuNP secara signifikan berkontribusi terhadap fitotoksisitas dan menggarisbawahi perlunya pembuangan limbah dan lumpur yang mengandung nanopartikel Au yang bertanggung jawab secara lingkungan.
Singkatan
AAS:
Spektroskopi serapan atom
AgNP:
Nanopartikel perak
AuNP:
Nanopartikel emas
DLS:
Hamburan cahaya dinamis
ICP-MS:
Spektroskopi massa dilengkapi plasma yang digabungkan secara induktif
