Pengaruh Rekayasa Nanopartikel pada Pelepasan Zat Eksopolimer dari Fitoplankton Laut
Abstrak
Nanopartikel yang direkayasa (ENP), produk dari teknologi nano modern, berpotensi dapat berdampak pada lingkungan laut dan menimbulkan ancaman serius bagi ekosistem laut. Namun, respons seluler fitoplankton laut terhadap ENP masih belum diketahui dengan baik. Di sini, kami menyelidiki empat spesies diatom yang berbeda (Odontella mobiliensis , Skeletonema grethae , Phaeodactylum tricornutum , Thalassiosira pseudonana ) dan satu ganggang hijau (Dunaliella tertiolecta ) untuk pelepasan zat polimer ekstraseluler (EPS) di bawah model perawatan ENP:titanium dioksida 25 nm (TiO2 ), 10–20 nm silikon dioksida (SiO2 ), dan serium dioksida 15–30 nm (CeO2 ). Kami menemukan SiO2 ENP dapat secara signifikan merangsang pelepasan EPS dari alga ini (200–800%), sementara TiO2 Paparan ENP menginduksi pelepasan terendah. Selanjutnya, peningkatan Ca
2+
intra intraseluler konsentrasi dapat dipicu oleh ENP, menunjukkan bahwa proses pelepasan EPS dimediasi melalui Ca
2+
jalur sinyal. Dengan pemahaman yang lebih baik tentang mekanisme seluler yang dimediasi pelepasan EPS yang diinduksi ENP, tindakan pencegahan dan keamanan potensial dapat dikembangkan untuk mengurangi dampak negatif pada ekosistem laut.
Latar Belakang
Nanopartikel yang direkayasa (ENP), yang ukurannya berkisar antara 1 dan 100 nm (setidaknya dalam satu dimensi), digunakan dalam fabrikasi berbagai barang konsumsi, termasuk tinta dan cat printer, deterjen, bakterisida, pelapis, kosmetik, losion tabir surya, ban, konstruksi komputer, dan pengiriman obat. Mengingat penerapan ENP yang menjanjikan, pendanaan untuk Inisiatif Nanoteknologi Nasional (NNI) di AS saja mendekati $1,4 miliar pada tahun 2017 [1,2,3]. Membangun pengetahuan dasar pada skala nano adalah fokus utama dari komunitas riset nanoteknologi pada fase pertama. Pada 2009, pengetahuan baru ini mendukung sekitar seperempat triliun dolar pasar di seluruh dunia, di mana sekitar $91 miliar berada di produk AS yang menggabungkan komponen skala nano [4]. Dengan pesatnya perkembangan nanoteknologi, tidak dapat dihindari bahwa ENP pada akhirnya akan menemukan jalannya ke sistem perairan. Perhatian utama ENP dalam hal potensi toksisitasnya (misalnya, potensi untuk menghasilkan spesies oksigen reaktif, ROS) di lingkungan terkait dengan reaktivitas permukaannya yang besar dan unik. Namun, dampak sebenarnya pada ekosistem laut sebagian besar masih belum diketahui karena faktor lingkungan dan biologis yang kompleks dari perairan alami dan berbagai ENP [1, 5, 6]. Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa ENPs dapat menyebabkan kerusakan signifikan pada ekosistem laut berbasis alga [7, 8]. Organisme laut (terutama fitoplankton) telah terbukti berinteraksi dengan ENP yang mengarah ke dampak negatif [9,10,11]. Dengan potensi peningkatan pemanfaatan nanoteknologi di berbagai bidang, semakin banyak ENP dapat memasuki lingkungan perairan, sehingga respons seluler fitoplankton laut terhadap ENP memerlukan perhatian lebih lanjut [12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21].
Sebagian besar mikroba laut, baik auto- atau heterotrofik, umumnya mampu menghasilkan zat eksopolimer (EPS), yang memiliki peran fungsional dan sifat fisik yang beragam dalam ekosistem laut yang bertindak sebagai penghambat pertumbuhan, pemacu pertumbuhan, racun, pemulung logam, atau sebagai substrat untuk siklus heterotrofik [22,23,24,25,26]. EPS yang dilepaskan dari fitoplankton dan bakteri di laut adalah biopolimer koloid anionik kaya polisakarida yang sangat penting untuk pembentukan gel laut, salju laut, dan biofilm, serta untuk pemulungan koloid dan elemen jejak dan untuk memberikan perlindungan terhadap berbagai ancaman lingkungan, termasuk ENP [7, 15, 19, 20, 25, 27]. Selain itu, pelepasan EPS diyakini sebagai respons alami ketika fitoplankton mengalami berbagai stres [8].
Ca
2+
adalah utusan kedua yang umum terlibat dalam banyak jalur sinyal intraseluler. Telah dibuktikan bahwa Ca
2+
diperlukan untuk kemotaksis, motilitas, dan adhesi di diatom Amphora coffeaeformis [28]. Ca
2+
gratis intraseluler yang disempurnakan tingkat diketahui menyebabkan aktivasi protein kinase C, yang terlibat dalam banyak jalur sinyal intraseluler [29]. Karena pelepasan EPS terkait erat dengan motilitas dan adhesi diatom, diusulkan bahwa Ca
2+
-proses sekresi yang dimediasi mengontrol pelepasan EPS dari diatom [30], dan bukti langsung memverifikasi Ca
2+
pensinyalan, eksositosis, dan korelasi Ca
2+
pensinyalan dengan eksositosis telah dilaporkan dalam penelitian kami sebelumnya [31]. Studi sebelumnya juga menunjukkan bahwa interaksi dengan ENP dapat mengubah Ca
2+
intraseluler jalur, yang penting untuk pensinyalan sel [29, 32,33,34]. Ca intraseluler spesifik
2+
perubahan konsentrasi penting dalam proses pensinyalan dan sekresi sel; namun, tidak ada laporan tentang titanium dioksida (TiO2 ), silikon dioksida (SiO2 ), atau serium dioksida (CeO2 ) untuk mengubah Ca
2+
intra intraseluler tingkat fitoplankton.
Pada tahun 2013, Quigg dkk. [8] merangkum efek toksik langsung dan tidak langsung dari ENPs pada alga. Dalam percobaan kami sebelumnya, ENP ditunjukkan untuk memfasilitasi agregasi EPS [35]. Dalam hal ini, EPS dapat memperburuk atau mengurangi toksisitas langsung yang diinduksi ENP terhadap organisme akuatik [7, 15, 36]. Namun, pengukuran langsung untuk pelepasan EPS dari fitoplankton di bawah tekanan ENP tidak pernah dilaporkan. Dalam penelitian ini, bertujuan untuk mempelajari pelepasan EPS dari empat spesies diatom yang berbeda (Odontella mobiliensis , Skeletonema grethae , Phaeodactylum tricornutum , Thalassiosira pseudonana ) dan satu ganggang hijau (Dunaliella tertiolecta ) di bawah perawatan ENP. Dengan memahami mekanisme yang mendasari pelepasan EPS yang diinduksi ENP pada fitoplankton, penerapan tindakan pencegahan dan keamanan dapat mengurangi efek yang berpotensi merugikan terhadap organisme laut.
Hasil dan Diskusi
Karakterisasi ENP
Hamburan laser dinamis (DLS) digunakan untuk mengkarakterisasi metrik ukuran ENP berikut yang tersuspensi dalam air murni:TiO2 , SiO2 , dan CeO2 . Distribusi ukuran partikel berkisar antara 7 hingga 66 nm dalam TiO2 , 9 hingga 66 nm dalam SiO2 , dan 12 hingga 70 nm di CeO2 . Beberapa ukuran yang lebih besar dapat disebabkan oleh agregasi atau aglomerasi sedangkan ukuran yang dominan untuk TiO2 adalah 25 nm, SiO2 adalah 10 hingga 20 nm, dan CeO2 adalah 15 hingga 30 nm, yang konsisten dengan informasi pabrikan (Gbr. 1).
Karakterisasi ENP dengan penilaian DLS a TiO2 , b SiO2 , dan c CeO2 dalam media L1 setelah sonikasi menunjukkan distribusi ukurannya. Konsentrasi akhir ENP dalam sampel DLS adalah 1 μg/ml, waktu pengukuran adalah 3 menit setelah sonikasi
ENP Menginduksi Ca Intraseluler
2+
Konsentrasi di Fitoplankton
Untuk menyelidiki apakah ENP dapat menginduksi peningkatan Ca
2+
intra intraseluler konsentrasi, sel fitoplankton (OD 600 = 0.8) dimuat dengan pewarna Fluo-4AM dan terkena 1 mg/ml 25 nm TiO2 , 10–20 nm SiO2 , dan 15–30 nm CeO2 ENP masing-masing. Perubahan Ca
2+
intra intraseluler konsentrasi, sebagaimana diwakili oleh intensitas fluoresensi dalam sel fitoplankton, dipantau selama 150 detik. Gambar 2a–e menunjukkan bahwa 1 mg/ml dari tiga ENP masing-masing meningkatkan Ca
2+
konsentrasi dalam SiO2 sekitar 50–300%, TiO2 sekitar 40%, dan CeO2 sekitar 150-200%, sedangkan kondisi kontrol (media L1) tetap tidak berubah. Hasilnya menunjukkan ENP dapat menginduksi Ca
2+
intra intraseluler yang signifikan tanggapan dalam fitoplankton dan menyarankan agar fitoplankton menanggapi ENP yang berbeda melalui Ca
2+
jalur sinyal. Data kami hanya menunjukkan perubahan kecil pada Ca
2+
intra intraseluler level ketika TiO2 hadir, berpotensi dikaitkan dengan kematian sel fitoplankton substansial dari TiO2 toksisitas yang diinduksi [37, 38]. Dalam penelitian kami sebelumnya, TiO2 mendorong peningkatan Ca
2+
intra intraseluler konsentrasi [34] di samping apoptosis sel yang signifikan [39]. Namun, SiO2 secara mengejutkan menunjukkan Ca
2+
intra intraseluler yang paling jelas peningkatan untuk semua spesies fitoplankton, sedangkan CeO2 hanya dapat memicu Ca intraseluler perantara
2+
konsentrasi meningkat. Penelitian sebelumnya menyarankan potensi CeO tinggi2 konsentrasi (> 50 mg/ml) untuk menginduksi stres oksidatif intraseluler dan peningkatan Ca
2+
intraseluler tingkat, meskipun efeknya kecil, dan mendukung temuan kami [40]. Kami juga mengukur potensi zeta masing-masing ENP dalam air laut buatan untuk mengatasi efek potensial yang mungkin ditimbulkan oleh muatan permukaan; namun, nilainya rendah. Pengukuran menunjukkan ENP dianggap kurang lebih netral [41] (File tambahan 1:Data tambahan). Ini berfungsi sebagai laporan pertama di mana ENP yang berbeda ditemukan menginduksi Ca
2+
intraseluler perubahan konsentrasi fitoplankton tertentu, yang pada akhirnya membuka jalan baru untuk penelitian masa depan.
Pengukuran Ca
2+
intra intraseluler konsentrasi setelah stimulasi oleh ENP yang berbeda. Sel fitoplankton yang berbeda aDunaliella tertiolecta , bThalassiosira pseudonana , cSkeletonema grathae , dPhaeodactylum tricornutum , dan eOdontella mobiliensis diobati dengan TiO2 25 nm (hijau), SiO2 10–20 nm (merah), CeO2 15–30 nm (ungu) dengan konsentrasi 1 mg/ml dan kontrol (biru). Panah hitam menunjukkan titik waktu saat EPN diterapkan (30 dtk). Pengukuran menunjukkan data representatif dari rata-rata 20 sel individu
Rilis EPS yang Diinduksi EPS di Fitoplankton
Enzyme-linked lectin assay (ELLA) digunakan untuk menilai jumlah pelepasan EPS dari sel fitoplankton ketika distimulasi dengan TiO2 , SiO2 , dan CeO2 ENP, rentang konsentrasi dari 1 μg/ml hingga 5 mg/ml berdasarkan penelitian sebelumnya untuk TiO2 [42, 43] dan CeO2 [44,45,46]. Sekresi EPS dinormalisasi ke jumlah DNA fitoplankton total (File tambahan 1:Data tambahan) agar memiliki dasar yang sama untuk perbandingan. Dibandingkan dengan kontrol, kami menemukan bahwa 10–20 nm SiO2 mampu meningkatkan pelepasan EPS hingga 550% di Dunaliella , 500% di Thalassiosira , 1000% dalam Kerangka , 400% di Odontella , dan 900% di Phaeodactylum (Gbr. 3). Ketika spesies fitoplankton terpapar TiO2 , tidak ada efek kuat pada sekresi EPS, karena hanya Skeletonema dan Phaeodactylum menunjukkan perubahan yang signifikan. Dengan demikian, data rilis EPS konsisten dengan Ca
2+
intraseluler kami hasil konsentrasi. TiO2 tidak memberikan dampak yang signifikan pada produksi EPS, mirip dengan fakta bahwa Ca
+2
intraseluler konsentrasi menunjukkan perubahan yang sangat terbatas karena toksisitas TiO2 menjadi fitoplankton. Produksi dan residu ROS dapat menyebabkan banyak komplikasi seperti apoptosis pada fitoplankton [47,48,49]. Di CeO2 pengobatan, hasil menunjukkan efek kecil di Dunaliella , Kerangka tengkorak , Odontella , dan Phaeodactylum . Namun, SiO2 menunjukkan induksi EPS paling signifikan pada Thalassiosira pseudonana (sekitar 600%) dan Skeletonema grethae (sekitar 1000–1500%). Data ini menunjukkan bahwa ENP yang berbeda dapat menginduksi pelepasan EPS spesifik dari fitoplankton, dan Ca
2+
intraseluler. perubahan juga sesuai dengan hasil rilis EPS. Dengan menilai perubahan Ca
2+
intra intraseluler konsentrasi, terbukti ada hubungan langsung di Ca
2+
jalur seluler di mana ENP membangkitkan sekresi EPS dari fitoplankton. Pengamatan di sini sesuai dengan penelitian kami sebelumnya berdasarkan Phaeocystis Rilis EPS [31]. Hasilnya memberikan bukti langsung bahwa fitoplankton dapat mendeteksi dan membedakan ENP yang merespons dengan pelepasan EPS berbeda yang diatur oleh Ca
2+
jalur seluler.
Penggunaan ELLA memungkinkan kami untuk menentukan pelepasan EPS melalui interaksi fitoplankton dengan ENP. Hasil kami menunjukkan bahwa sekresi EPS meningkat secara signifikan saat fitoplankton berinteraksi dengan SiO2 untuk Dunaliella tertiolecta , Thalassiosira pseudonana , dan Skeletonema grethae . Tampaknya diatom ini siap untuk mengenali SiO2 partikel. Namun, di Phaeodactylum tricornutum , sekresi EPS yang kuat tidak ditemukan. Perbedaan ini menunjukkan pelepasan EPS yang dipicu oleh ketergantungan ENP pada spesies fitoplankton dan konsentrasi ENP (Gbr. 3). Dalam studi sebelumnya, tumpahan minyak menyebabkan pelepasan EPS mikroba laut besar yang diusulkan untuk melawan konsekuensi negatif dari tumpahan minyak [50]. Selain itu, Boglaienko, dan Tansel menemukan bahwa SiO2 partikel mampu menghilangkan agregat minyak secara efisien [51]. Temuan kami memberikan mekanisme potensial baru di mana toksisitas rendah SiO2 partikel dapat menginduksi pelepasan EPS dari fitoplankton tertentu, berpotensi memfasilitasi penghapusan tumpahan minyak dengan mempromosikan agregasi EPS. Cerium dioksida tidak pernah dilaporkan mengganggu ekosistem laut berbasis fitoplankton. Hasil di sini menunjukkan CeO2 ENP dapat berdampak pada semua fitoplankton di sini kecuali Thalassiosira pseudonana. CeO2 ENP mungkin, seperti SiO2, memiliki kemampuan untuk meningkatkan pelepasan EPS dari fitoplankton tertentu untuk aplikasi mitigasi minyak.
Kesimpulan
Interaksi lingkungan laut ENP menjadi semakin kritis karena pelepasan bahan nano saat ini dan di masa depan. Di sini, kami mendemonstrasikan peningkatan sekresi EPS sebagai salah satu efek utama ENP terhadap fitoplankton. Kami juga memberikan bukti bahwa fitoplankton yang berbeda dapat merespon secara berbeda terhadap berbagai tekanan ENP dengan mengatur Ca
2+
jalur. Namun, penilaian lengkap ENP terhadap ekosistem laut akan membutuhkan penyelidikan lebih lanjut untuk memberikan pengetahuan dan pemahaman terperinci tentang interaksi antara bahan nano dan organisme laut.
Rilis EPS dipicu oleh berbagai ENP. Sel fitoplankton yang berbeda aDunaliella tertiolecta , bThalassiosira pseudonana , cSkeletonema grathae , dPhaeodactylum tricornutum , dan eOdontella mobiliensis diobati dengan TiO2 (lingkaran), SiO2 (segitiga), CeO2 (persegi), masing-masing, dengan konsentrasi 5 mg/ml dan 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,1 mg/ml, 10 μg/ml, 1 μg/ml (n = 3)
Metode
Budaya Fitoplankton
Kultur kelompok Odontella mobiliensis (CCMP597), Dunaliella tertiolecta (UTEX999), Skeletonema grethae (CCMP775), Phaeodactylum tricornutum (UTEX646), Thalassiosira pseudonana (Provasoli - Koleksi kultur fitoplankton laut Guillard, West Boothbay Harbor, MN, USA) ditanam di media laut L1 (Sigma, MO, USA) pada siklus 14:10 (terang:gelap) pada 100 μmol m
−2
s
−1
dan 24 °C dalam kondisi axenic. Fase pertumbuhan kultur ditentukan dengan penghitungan sel dengan hemositometer.
Nanopartikel dan Karakterisasi
Semua ENP, TiO2 , SiO2 , CeO2 (Sigma-Aldrich, MO, USA), disonikasi dalam air murni sebelum digunakan. ENP dilarutkan dengan media L1 yang disaring (Sigma, MO, USA) sebelum diuji. Ukuran ENP dikonfirmasi secara independen menggunakan hamburan laser dinamis homodyne (DLS). Secara singkat, sampel air laut disaring ulang melalui membran Millipore 0,22 m (dicuci sebelumnya dengan HCl 0,1 N) dan dituangkan langsung ke dalam lima sel hamburan 10 ml yang kemudian ditempatkan dalam goniometer dari spektrometer laser Brookhaven BI-200SM (Brookhaven Instruments, NY, AS). Fungsi autokorelasi dari fluktuasi intensitas hamburan yang terdeteksi pada sudut 45° diproses secara online oleh autokorelator Brookhaven BI 9000AT, dan distribusi ukuran partikel dihitung dengan metode CONTIN (Provencher, 1982). Hasil dari setiap sampel dikumpulkan dalam rangkap tiga tepat setelah sonikasi. Kalibrasi spektrometer DLS dilakukan menggunakan suspensi standar mikrosfer lateks monodispersi (Polysciences, PA, USA).
Perawatan ENP
Sel-sel fitoplankton dikultur dalam piring 96-sumur dengan media L1 selama 24 jam. Sel diperlakukan dengan stok ENP:5 mg/ml dan 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,1 mg/ml, 10 μg/ml, 1 μg/ml TiO2 , SiO2 , dan CeO2 (Sigma-Aldrich, MO, USA) atau media L1 (kontrol) selama 48 jam. Supernatan yang mengandung EPS yang disekresikan dikumpulkan dan disentrifugasi sebentar pada 4000 rpm untuk menghilangkan sisa ENP. Protokol ini diadaptasi dari publikasi kami sebelumnya [34]. Rentang konsentrasi yang digunakan di sini tidak dimaksudkan untuk mewakili atau meniru tingkat ENP saat ini di lingkungan tetapi bertujuan untuk menilai dampak potensial penuh ENP pada fitoplankton laut dan menyelidiki mekanisme seluler yang terkait. Sebagai bahan nano baru yang menjanjikan, ENPs belum mencapai kapasitas komersial penuhnya. Penilaian mendetail tentang dampak ekologis lengkapnya sangat dibutuhkan sebelum ENP memasuki pasar produk komersial dan rumah tangga untuk memperkenalkan lebih banyak ENP ke laut.
Enzyme-Linked Lectin Assay (ELLA)
Supernatan yang mengandung polisakarida yang disekresi dikumpulkan dan disentrifugasi sebentar pada 1700 rcf (Megafuge 1.0R) untuk menghilangkan sisa ENP. Supernatan kemudian diinkubasi dalam plat 96 sumur (Nunc MaxiSorp, VWR, CA, USA) semalaman pada suhu 4°C. Kemudian plat 96-sumur dicuci dengan PBST (PBS + 0,05% Tween-20) dan PBS kemudian diblok dengan BSA 1%. Pelat 96-sumur dicuci lagi dengan PBST dan PBS dan diinkubasi dengan lektin (Concanavalin A, ConA) (Sigma-Aldrich, MO, USA), terkonjugasi ke horseradish peroxidase (HRP; 5 mg/ml) (Sigma-Aldrich, MO , AS), pada 37 °C selama 1 jam. Substrat, 3,39,5,59-tetramethylbenzidine (TMB; Sigma-Aldrich, MO, USA), ditambahkan ke setiap sumur pada suhu kamar diikuti oleh H2 SO4 (Sigma-Aldrich, MO, USA) untuk menghentikan reaksi. Kepadatan optik diukur pada 450 nm oleh PerkinElmer VICTOR3 (MA, USA). Protokol ini diadaptasi dari publikasi kami sebelumnya [34, 52].
Penentuan DNA
Pelet yang mengandung fitoplankton dikumpulkan dan diperoleh kit ZR-96 Quick-gDNA (ZYMO Research, CA, USA). Singkatnya, buffer lisis 4x digunakan untuk memecah sel fitoplankton dan mengalir melalui kolom pengikatan DNA, dielusi oleh buffer elusi pada akhirnya. Konsentrasi DNA diukur dengan NanoDrop ND-1000 (Thermo, CA, USA). Protokol diadaptasi dari protokol kit yang diproduksi.
Pengukuran Ca Intraseluler
2+
Konsentrasi yang Diinduksi oleh ENP
Sel fitoplankton kemudian diisi dengan pewarna Fluo-4AM (1 mM) (Kd = 335 nM, Ex = 494 nm, dan Em = 506 nm, ThermoFisher, CA, USA) selama 60 mnt [31]. Setelah pewarna dimuat, sel fitoplankton dibilas, diinkubasi dengan media L1, dan diperlakukan dengan 1 mg/ml TiO2 , SiO2 , dan CeO2 masing-masing. Semua percobaan pensinyalan kalsium dilakukan pada mikroskop Nikon (Nikon Eclipse TE2000-U, Tokyo, Jepang). Protokol dan ketentuan diadaptasi dari publikasi sebelumnya [31, 34].
Potensi Zeta Pengukuran ENP
Untuk mengukur muatan permukaan ENP, potensi zeta (ζ) ENP diukur dengan Zetasizer Nano ZS, Malvern, dengan adanya air laut buatan pada 25 °C. Setelah data dikumpulkan dari setiap sampel, nilai yang tercatat dirata-ratakan.
Analisis Statistik
Data dilaporkan sebagai rata-rata ± SD. Setiap percobaan dilakukan secara independen setidaknya tiga kali. Histogram dibuat dengan GraphPad Prism 6.0. (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA).
