Nanopartikel Komposit Berbasis Polidopamine dengan Cangkang Polimer Labil Redoks untuk Pelepasan Obat Terkendali dan Terapi Kemo-Fototermal yang Ditingkatkan
Abstrak
Terapi fototermal (PTT) yang menggunakan agen konversi phSUPPotothermal (PTC) untuk mengikis tumor di bawah iradiasi cahaya NIR telah menarik perhatian yang meningkat karena kemanjuran terapeutiknya yang sangat baik dan selektivitas target yang ditingkatkan. Di sini, nanopartikel kulit-inti baru yang didasarkan pada poli (asam metakrilat) (PMAA) lapisan polidopamin (PDA) terlapis-silang disulfida telah berhasil disintesis dengan polimerisasi presipitasi. Untuk nanopartikel komposit PDA@PMAA ini, inti PDA menunjukkan kemanjuran fototermal yang tinggi, sementara itu, cangkang PMAA redoks-labil berfungsi sebagai pembawa untuk merangkum obat antikanker dan melepaskannya secara selektif. Karena karakteristik ikatan disulfida, cangkang PMAA terjadi pada degradasi selektif serta pelepasan obat yang terkontrol saat memasuki sel kanker. Selain itu, nanopartikel PDA@PMAA yang memuat DOX menunjukkan efek sinergis, yang menunjukkan peningkatan efek penghambatan yang signifikan terhadap sel kanker dengan kombinasi terapi fototermal dan kemoterapi tradisional dengan dosis obat rendah dan penyinaran laser pendek dalam in vitro belajar.
Pengantar
Terapi fototermal (PTT), pengobatan kanker lokal non-invasif, telah menarik perhatian besar dalam terapi kanker karena selektivitasnya yang tinggi dan efek samping yang minimal [1]. Di PTT, paparan laser inframerah-dekat (NIR) yang diberikan, diserap oleh agen konversi fototermal (PTC) dan diubah menjadi hipertermia lokal yang mengarah ke ablasi tumor [2,3,4]. Berbagai nanomaterial telah mengungkapkan efek PTC, seperti struktur nano emas [5,6,7], nanomaterial berbasis karbon [8,9,10,11,12], Fe3 O4 nanocluster [13,14,15], nanocrystals CuS [16], dan melanin alami [17], yang semuanya menunjukkan absorbansi optik yang kuat di jendela optik jaringan NIR. Di antara agen PTC ini, polidopamin (PDA), meniru protein perekat yang ditemukan dalam kerang menunjukkan penyerapan NIR yang kuat, efisiensi PTC yang tinggi (40%), biokompatibilitas yang sangat baik, dan biodegradabilitas, yang telah banyak dieksplorasi dalam aplikasi PTT. 18, 19]. Namun, penggunaan tunggal PTT menunjukkan kemanjuran klinis yang terbatas karena pengiriman panas yang tidak mencukupi di wilayah target tanpa merusak jaringan normal di sekitarnya [20]. Untuk mengatasi masalah ini, terapi kemo-fototermal dengan kombinasi hipertermia dan agen kemoterapi telah dimanfaatkan oleh banyak peneliti untuk efek sinergisnya yang dihasilkan dari penghantaran obat yang dipromosikan ke tumor dan peningkatan toksisitas obat oleh hipertermia [21, 22].
Untuk mencapai efek pengobatan yang dioptimalkan, pekerjaan saat ini dikhususkan untuk mengembangkan nanopartikel terapeutik baru dengan konversi fototermal kinerja tinggi, kemampuan memuat obat yang sangat baik, dan perilaku pelepasan obat yang terkontrol. Lapisan polimer "pintar" diperkenalkan di sistem kami, yang dihubungkan silang oleh penghubung yang dapat dibelah, untuk memungkinkan penguraian dan pelepasan obat pembawa yang terkontrol dengan cara yang dipicu. Ikatan disulfida yang dapat dibelah oleh tiol bebas merupakan kandidat yang menjanjikan sebagai cleavable linker karena sensitif terhadap keadaan redoks, stabilitas tinggi dalam sirkulasi darah, dan biokompatibilitas yang baik [23]. Pembawa obat yang menggabungkan ikatan disulfida dapat mengalami degradasi selektif saat memasuki sel tumor, di mana konsentrasi glutathione (GSH) pereduksi (ca. 2-10 mM) jauh lebih tinggi daripada konsentrasi di cairan ekstraseluler [24,25,26]. Di sini, jenis baru nanopartikel komposit yang terdiri dari bola PDA sebagai inti dan ikatan silang poli(asam metakrilat) (PMAA) ikatan disulfida sebagai cangkang disiapkan, dilambangkan sebagai PDA@PMAA, yang mempertahankan kemanjuran PTC dari inti PDA dan sifat redoks-labil dari cangkang polimer. Struktur, sifat, dan perilaku pelepasan obat dari nanopartikel komposit PDA@PMAA dipelajari, dan efek terapi kemo-fototermal ditunjukkan lebih lanjut melalui uji MTT.
Metode/Eksperimental
Materi
Dopamin hidroklorida (DA-HCl) dan methacryloyl chloride dan glutathione (GSH) diperoleh dari Aladdin Reagent Corporation, Shanghai, PR China. Asam metakrilat (MAA) dan N,N' -bis(acryloyl)cystamine (BAC) dibeli dari Sigma-Aldrich. 2,2-azobisisobutyronitrile (AIBN) diperoleh dari Sinopharm Chemical Reagent Company dan direkristalisasi dari etanol. Larutan berair amonia (NH3 •H2 O, 30%), asetonitril, dan etanol anhidrat dibeli dari Perusahaan Reagen Kimia Lingfeng Shanghai. Doksorubisin (DOX) dalam bentuk garam hidroklorida diperoleh dari Beijing Huafeng United Technology Company. Uji MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) dan reagen biologis lainnya dibeli dari Invitrogen Corp. Calcein-AM dibeli dari Bojin Biotech, Inc. (Xi'an) . Semua reagen kimia memiliki tingkat analitik atau lebih baik dan digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut kecuali seperti yang disebutkan di atas.
Karakterisasi
Gambar mikroskop elektron transmisi (TEM) diamati pada mikroskop elektron transmisi Tecnai G2 20 TWIN (FEI, USA). Diameter hidrodinamik dan potensi zeta partikel dilakukan oleh penganalisis ukuran partikel hamburan cahaya dinamis (DLS) (Malvern Nano-ZS90) pada sudut hamburan 90°. Spektrum UV-vis dilakukan oleh spektrofotometer Perkin-Elmer Lambda 750 pada suhu kamar. Spektrum Fourier-transform infrared (FT-IR) direkam menggunakan pelat KBr pada spektroskopi FTIR Nicolet 6700. Efek pemanasan NIR dari nanopartikel PDA dan PDA@PMAA dikarakterisasi menggunakan laser NIR gelombang kontinu 808-nm (Teknologi Optoelektronik Industri Baru Changchun, Changchun, Cina; ukuran titik:6 mm × 7 mm) dengan iradiasi laser pada daya kepadatan 5 W cm
−2
selama 300 detik. Suhu sebelum dan sesudah iluminasi diukur dengan termokopel dengan akurasi 0,1
°
C. Gambar seluler diperoleh dengan mikroskop pemindaian laser confocal (CLSM, Leica TCS SP8 STED 3X).
PDA@PMAA Komposit Nanopartikel
Sintesis bola PDA dilakukan dalam larutan campuran air deionisasi (90 mL), etanol (40 mL), dan NH3 •H2 O (3 mL), ditambahkan dengan 0,5 g dopamin hidroklorida. Larutan diaduk pada suhu 30
°
C selama 24 jam, dan produk disentrifugasi dan dicuci. Cangkang PMAA disintesis dengan polimerisasi distilasi-presipitasi yang merujuk pada pekerjaan kami sebelumnya. MAA (100 mg), BAC (10 mg), dan AIBN (3 mg) dilarutkan dalam 25 mL asetonitril, diikuti dengan menambahkan 50 mg bola PDA yang telah disiapkan. Kemudian, campuran dipanaskan sampai 100
°
C diaduk selama 2 jam, dan produk disentrifugasi dan dicuci. Rasio massa PDA dan MAA divariasikan dari 0,5 hingga 6 untuk menyesuaikan ketebalan cangkang PMAA, dan rincian resepnya tercantum pada Tabel 1.
Efek Fototermal PDA@PMAA
Dispersi berair PDA@PMAA (50 g mL
−1
) ditempatkan di pelat sel 96-sumur (100 L per sumur) disinari oleh laser NIR 808-nm (5 W cm
−2
), dan suhu sebelum dan sesudah iluminasi diukur.
Pemuatan dan Pelepasan Obat
DOX dipilih sebagai obat model untuk menyelidiki pemuatan obat dan kinerja pelepasan terkontrol dari nanopartikel PDA atau PDA@PMAA. Langkah-langkah spesifik mengacu pada pekerjaan kami sebelumnya [27, 28]. Secara singkat, 10 mg nanopartikel PDA atau PDA@PMAA-1 didispersikan ke dalam 1 mL larutan berair DOX (1 mg mL
−1
), yang sebelumnya disesuaikan dengan pH8.0. Setelah pengadukan lembut selama 24 jam pada suhu kamar, dispersi disentrifugasi untuk mengumpulkan nanopartikel PDA@PMAA bermuatan DOX (12.000 rpm, 10 menit) dan kemudian dicuci dengan air deionisasi dua kali untuk menghilangkan DOX yang tidak dimuat. Spektrum absorbansi UV supernatan diukur, dan intensitas pada 480 nm digunakan untuk menganalisis pemuatan dan pelepasan DOX. Konten pemuatan obat (LC) dan efisiensi enkapsulasi (EE) dinyatakan sesuai dengan rumus berikut:LC (%) =(berat obat yang dimuat)/(berat total nanopartikel); EE (%) =(berat obat yang dimuat)/(berat obat yang ditambahkan pertama kali).
Studi pelepasan in vitro dilakukan pada 37 °C dalam buffer fosfat (pH7.4 dan 5.5) dengan atau tanpa GSH. Biasanya, nanopartikel PDA@PMAA DOX yang terdispersi dalam buffer yang sesuai ditempatkan ke dalam tas dialisis (berat molekul cut-off 14.000 Da) dan kemudian direndam dalam 100 mL media pelepas. Sampel disimpan pada suhu 37
°
C di bawah pengocokan terus menerus. Pada titik waktu yang berbeda, 2 mL buffer eksternal diambil untuk analisis spektrum UV-vis dan diisi ulang dengan volume media segar yang sama. Semua data pelepasan DOX dirata-ratakan selama tiga pengukuran, dan konten pelepasan dihitung dengan rumus:Konten pelepasan (%) =(jumlah obat dalam media pelepasan)/(jumlah obat yang dimuat ke dalam nanopartikel) × 100. Pelepasan obat perilaku nanopartikel PDA@PMAA DOX-loaded dengan iradiasi laser dalam buffer fosfat pH7,4 dilakukan mengikuti prosedur yang sama. Cahaya NIR diterapkan selama 5 menit per jam.
Pengujian Sel In Vitro
Sel HEK-293T (sel ginjal embrionik manusia, sel normal) dan sel A549 (sel epitel adenokarsinoma paru manusia, sel kanker) dikultur dalam medium Eagle's (DMEM) yang dimodifikasi Dulbecco yang dilengkapi dengan 10% FBS (serum sapi janin), penisilin (100 U mL
−1
) dan streptomisin (100 mg mL
−1
) dalam atmosfer yang dilembabkan dengan 5% CO2 pada 37 °C.
Untuk mengamati penyerapan seluler, sel A549 (1 × 10
4
sel per sumur) diunggulkan ke dalam piring 6-sumur dalam 1,5 mL medium. Media digantikan oleh media yang mengandung nanopartikel PDA@PMAA bermuatan DOX setelah 24 jam. Setelah 1 jam atau 4 jam, DMEM dan PBS segar ditambahkan untuk membersihkan nanopartikel bebas yang tidak diinternalisasi oleh sel sebelum pengamatan fluoresensi. Distribusi intraseluler nanopartikel diamati oleh CLSM. Fluoresensi dicitrakan di λEX (488 nm) untuk DOX, dan warna palsu secara artifisial ditetapkan sebagai merah.
Sitotoksisitas nanopartikel PDA@PMAA yang dimuat DOX dan kosong terhadap sel A549 dinilai dengan uji MTT standar. Sel (dengan kepadatan 10
4
sel per sumur) diinkubasi dalam pelat 96-sumur selama 24 jam untuk memungkinkan perlekatan sel. Kemudian, nanopartikel PDA @ PMAA yang dimuat DOX dan kosong, dan DOX bebas pada berbagai konsentrasi ditambahkan ke sel, masing-masing. Untuk grup laser NIR, laser (λ =808 nm) diterapkan untuk menyinari sel pada kepadatan daya 5 W cm
−2
selama 300 detik setelah inkubasi 1 jam. Kemudian, setelah waktu inkubasi 24 jam pada 37
°
C, 20 L larutan MTT (5 mg mL
−1
dalam buffer fosfat) diganti dengan DMEM segar yang mengandung MTT (5 mg mL
−1
), dan sel-sel diinkubasi selama 4 jam lagi. Selanjutnya, supernatan dihilangkan, dan 150 L dimetil sulfoksida (DMSO) ditambahkan ke setiap sumur untuk melarutkan formazan. Absorbansi dipantau pada 570 nm menggunakan spektrofotometer setelah 10 menit inkubasi. Setiap titik data dikumpulkan dengan rata-rata lima sumur, dan sel yang tidak diberi perlakuan digunakan sebagai kontrol. Persentase viabilitas sel dihitung dengan membandingkan absorbansi sel kontrol dengan sel yang diberi perlakuan. Proses sitotoksisitas yang sama dari nanopartikel komposit kosong terhadap sel HEK-293T dilakukan seperti yang disebutkan di atas.
Untuk memvisualisasikan efek antitumor dari nanopartikel PDA@PMAA dan nanopartikel PDA@PMAA DOX dengan atau tanpa iradiasi laser NIR, sel diunggulkan dalam pelat 6-sumur dengan kepadatan 3 × 10
4
sel per sumur. Sel-sel diekspos ke nanopartikel PDA@PMAA-1, nanopartikel PDA@PMAA-1 bermuatan DOX, atau DOX bebas selama 24 jam pada konsentrasi nanopartikel 100 g mL
−1
atau konsentrasi DOX setara 5 g mL
−1
. Untuk grup laser NIR, laser (λ =808 nm) diterapkan untuk menyinari sel pada kepadatan daya 5 W cm
−2
selama 300 detik setelah inkubasi 1 jam. Selanjutnya, sel diinkubasi dengan Calcein-AM selama 30 menit, dicuci tiga kali menggunakan PBS, dan diamati menggunakan CLSM pada λEX (490nm).
Hasil dan Diskusi
Preparasi dan Karakterisasi Nanopartikel PDA@PMAA
Bola PDA disiapkan dalam kondisi dasar melalui metode oksidasi larutan. Pelapisan kimia bola PDA dengan lapisan polimer ikatan silang disulfida dicapai melalui metode polimerisasi distilasi-presipitasi yang masing-masing menggunakan MAA dan BAC sebagai monomer dan pengikat silang (Gbr. 1). Nanopartikel komposit multifungsi ini memberikan banyak keunggulan dibandingkan nanopartikel terapeutik lainnya dalam tiga aspek. Pertama, inti PDA menunjukkan kinerja fototermal yang luar biasa di bawah iradiasi NIR. Kedua, penggabungan ikatan disulfida menawarkan degradasi selektif cangkang polimer serta pelepasan obat yang terkontrol saat memasuki sel kanker. Ketiga, cangkang PMAA menyediakan nanopartikel dengan stabilitas koloid yang sangat baik. Ketebalan lapisan PMAA dapat dikontrol dengan mengatur rasio massa bola MAA dan PDA. Gambar 2 menunjukkan gambar TEM dari bola PDA dan nanopartikel PDA@PMAA yang diperoleh. Jelas bahwa nanopartikel PDA dan PDA@PMAA adalah mono-dispersi dan berbentuk bola. Bola PDA memiliki diameter rata-rata ~ 100 nm, dan ukuran nanopartikel hibrida PDA@PMAA berkisar antara 120 ± 5 hingga 200 ± 10 nm dengan rasio massa PDA terhadap MAA berkisar antara 0,5 hingga 6. Ukuran hidrodinamik (D h ) dan distribusi ukuran nanopartikel PDA dan PDA@PMAA juga dicirikan oleh hamburan cahaya dinamis (DLS), seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2. Nanopartikel PDA@PMAA memiliki distribusi ukuran yang sempit, biasanya dengan nilai PI 0,09–0,14. Dh deret nanopartikel PDA@PMAA berkisar antara 176 hingga 349 nm dengan memvariasikan rasio massa PDA terhadap MAA, yang sesuai dengan tren pertumbuhan ukuran dari pengamatan TEM. Khususnya, Dh nanopartikel komposit lebih besar dari ukuran yang ditentukan oleh TEM, menunjukkan bahwa nanopartikel komposit sangat bengkak dalam media berair [29]. Potensi nanopartikel PDA adalah 26,8 mV karena adanya gugus katekol pada permukaan PDA. Perubahan potensial nanopartikel PDA@PMAA dari 30.2 menjadi 33,2 menunjukkan adanya gugus karboksil yang berasal dari cangkang PMAA.
Ilustrasi skema sintesis, efek fototermal, pemuatan obat, dan pelepasan obat yang responsif terhadap rangsangan dari nanopartikel PDA@PMAA
Gambar TEM nanopartikel PDA@PMAA (bilah skala, 200 nm). a PDA. b[email protected]. c PDA@PMAA-1. d PDA@PMAA-2. e PDA@PMAA-4. f PDA@PMAA-6
Karena MAA responsif terhadap pH, dapat disimpulkan bahwa nanosfer PDA@PMAA juga memiliki sensitivitas pH. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3, nanopartikel PDA@PMAA-1 diambil sebagai contoh untuk menyelidiki ketergantungan pH dari ukuran hidrodinamik nanopartikel berlapis PMAA. Dapat dilihat bahwa dalam buffer fosfat pH8.5, nanopartikel PDA@PMAA-1 memiliki diameter hidrodinamik sekitar 240 nm; sementara di lingkungan asam pH 3,0, ukuran hidrodinamiknya sangat menyusut menjadi ca. 150nm. Karena rantai polimer PMAA sangat terionisasi pada pH tinggi, dan tolakan elektrostatik yang kuat antara rantai polimer mengakibatkan pembesaran ukuran hidrodinamik, sedangkan pada pH rendah, derajat ionisasi rendah rantai PMAA menyebabkan ukuran menyusut [30]. Nanopartikel PDA@PMAA yang responsif terhadap pH menunjukkan potensi besar dalam pelepasan obat terkontrol dalam sel tumor (pH lebih rendah dari 6,5) karena runtuhnya lapisan polimer seperti spons dapat memfasilitasi pelepasan obat. Struktur kimia nanopartikel PDA@PMAA dikarakterisasi dengan spektroskopi Fourier-transform infrared (FTIR) (Gbr. 4). Dalam spektrum nanopartikel BAC dan PDA@PMAA, pita muncul pada 1650 dan 1550 cm
−1
, yang dikaitkan dengan pita amida I dan II khas BAC, menunjukkan bahwa pengikat silang BAC telah berhasil dimasukkan ke dalam nanopartikel komposit [25]. Puncaknya pada 1706 cm
−1
, yang termasuk dalam vibrasi regangan gugus C=O dalam PMAA, dapat dilihat dengan jelas pada nanopartikel PDA@PMAA selain nanopartikel PDA, menunjukkan keberhasilan pelapisan lapisan PMAA.
Diameter hidrodinamik nanopartikel PDA@PMAA-1 dalam buffer fosfat pada berbagai pH
Spektrum FTIR pengikat silang BAC, nanopartikel PDA, dan nanopartikel PDA@PMAA (dari atas ke bawah)
Efek Fototermal Nanopartikel PDA@PMAA
Intensitas absorbansi pada daerah NIR merupakan faktor utama yang menentukan kapabilitas PTC suatu agen PTC. Untuk mengeksplorasi kemampuan penyerapan cahaya nanopartikel PDA@PMAA, spektrum UV-vis mereka diringkas pada Gambar. 5a. Dapat dilihat bahwa setiap sampel memiliki serapan yang jelas di wilayah NIR dari 600 hingga 1000 nm. Dibandingkan dengan PDA@PMAA, PDA menyajikan penyerapan tertinggi pada 808 nm pada konsentrasi massa yang setara. Absorbansi nanopartikel PDA@PMAA meningkat seiring dengan penurunan ketebalan cangkang PMAA (dari PDA@PMAA-6 menjadi [email protected]). Penyerapan optik yang kuat di wilayah NIR mendorong kami untuk menyelidiki lebih lanjut efek fototermal PDA@PMAA. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 5b, efek fototermal dari PDA dan dispersi berair PDA@PMAA diukur pada konsentrasi 100 g mL
−1
disinari dengan laser 808 nm pada 5 W cm
−2
selama 300 detik. Air murni digunakan sebagai kontrol negatif. Suhu dispersi PDA meningkat 41
°
C dan lebih tinggi dari semua sampel PDA@PMAA, yang konsisten dengan penyerapan maksimumnya pada 808 nm. Peningkatan suhu dengan dispersi PDA@PMAA bisa mencapai 17-33
°
C dengan penurunan ketebalan cangkang PMAA (dari PDA@PMAA-6 menjadi PDA@PMAA-0,5), jauh lebih tinggi daripada yang disebabkan oleh kontrol air murni (hanya mencapai 3,5
°
C). Studi sebelumnya menyarankan bahwa terapi termal dengan suhu di atas 55
°
C menunjukkan keuntungan besar dalam ablasi termal tumor padat [31]. Membandingkan kenaikan suhu maksimum dari serangkaian nanopartikel PDA@PMAA, hanya PDA@PMAA-0,5 (58
°
C) dan PDA@PMAA-1 (56
°
C) dapat mencapai hingga 55
°
C. Mengingat cangkang PMAA harus memiliki ketebalan tertentu untuk memastikan kapasitas pemuatan obatnya, PDA@PMAA-1 dipilih sebagai perwakilan dalam eksperimen berikut.
a Spektrum UV-vis dispersi berair PDA dan PDA@PMAA pada konsentrasi 100 g mL
−1
. b Efek fototermal dari dispersi berair PDA dan PDA@PMAA pada konsentrasi 100 g mL
−1
diukur dengan penyinaran laser (λ =808 nm, 5 W cm
−2
)
Pelepasan Obat In Vitro
Doxorubicin (DOX) dipilih sebagai obat model untuk mengkonfirmasi kemampuan potensial nanopartikel komposit PDA@PMAA-1 untuk melepaskan obat yang dienkapsulasi dalam kondisi reduktif. Pemuatan DOX ke dalam nanopartikel komposit dilakukan pada kandungan muatan obat teoritis sebesar 9,1% berat dan konsentrasi polimer 10 mg mL
−1
, dan konten pemuatan obat akhir dan efisiensi enkapsulasi masing-masing adalah 5,1% dan 53,7%. Hal ini menunjukkan bahwa DOX dapat dimuat secara efisien ke dalam jaringan polimer. Nanopartikel PDA yang dimuat DOX juga disiapkan untuk perbandingan, konten yang memuat DOX adalah 3,7%. Kapasitas pemuatan obat yang lebih tinggi dari nanopartikel PDA@PMAA-1 dapat dikaitkan dengan interaksi elektrostatik yang kuat antara gugus amino dari molekul DOX dan gugus karboksil dari rantai PMAA [25]. Mengingat hal itu, cangkang PMAA mengandung ikatan disulfida yang dapat dibelah redoks, obat yang dimuat sebelumnya akan dipicu untuk melepaskan obat yang dimuat sebelumnya secara efisien dalam kondisi reduksi. Dengan memperhitungkan lingkungan mikro tumor yang sedikit asam dan perbedaan besar dalam konsentrasi GSH antara intraseluler (1–10 mM) dan plasma (20–40 M), eksperimen pelepasan obat in vitro dirancang dan dilakukan dengan menggunakan buffer fosfat pH7,4 dan 5,5 dengan atau tanpa 10 mM GSH untuk meniru sel tumor dan lingkungan aliran darah [23, 32, 33]. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6, jumlah pelepasan obat hanya 10,8% selama periode waktu 24 jam, menunjukkan bahwa DOX ditahan secara stabil dalam nanopartikel PDA@PMAA-1 ketika mereka didispersikan dalam kondisi fisiologis. Di hadapan 10 mM GSH, pelepasan obat yang sangat cepat terdeteksi, di mana pelepasan kumulatif DOX adalah sekitar 72,8% dalam 24 jam, karena degradasi cangkang PMAA yang terikat disulfida di lingkungan pereduksi. Namun, struktur inti PDA mempertahankan integritas setelah degradasi responsif redoks (File tambahan 1:Gambar S2). Selain itu, pelepasan meledak (ca. 87% dalam 24 jam) DOX diamati dalam buffer fosfat pH5,5 dengan 10 mM GSH, karena gugus karboksil di PMAA terprotonasi dalam kondisi asam, yang selanjutnya menyebabkan runtuhnya polimer jaringan. Profil pelepasan ini menyiratkan fitur nanopartikel PDA @ PMAA yang menjanjikan untuk pelepasan obat terkontrol karena nanopartikel menunjukkan kebocoran obat yang rendah dalam plasma, namun, melepaskan obat dengan cepat ketika memasuki sel tumor. Selanjutnya, pelepasan obat yang lambat (sekitar 13% dalam 24 jam) untuk nanopartikel PDA@PMAA bermuatan DOX dengan iradiasi NIR dalam buffer fosfat pH7.4 terdeteksi, menunjukkan nanopartikel PDA@PMAA mempertahankan integritas struktural saat iradiasi. Perilaku pelepasan nanopartikel PDA dengan adanya 10 mM GSH menunjukkan pelepasan obat yang luar biasa rendah (sekitar 30% dalam 24 jam) dibandingkan dengan nanopartikel PDA@PMAA-1 (File tambahan 1:Gambar S1). Perbedaan besar dalam perilaku pelepasan nanopartikel PDA dan PDA@PMAA menunjukkan bahwa pengenalan kulit polimer yang dapat terdegradasi yang diikat silang oleh ikatan disulfida memunculkan pelepasan obat efektif yang dipicu oleh Redoks.
Profil pelepasan DOX dari nanopartikel PDA@PMAA-1 pada 37
°
C dalam 7,4 buffer fosfat (○), dalam 7,4 buffer fosfat dengan penyinaran laser NIR (□, dalam 7,4 buffer fosfat dengan 10 mM GSH (lingkaran merah), atau dalam 5,5 buffer fosfat dengan 10 mM GSH (lingkaran hijau)
Pengujian Sel
Investigasi serapan seluler dan pelepasan obat intraseluler dari nanopartikel PDA@PMAA yang dimuat DOX lebih lanjut dilakukan terhadap garis sel A549. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 7, fluoresensi merah untuk DOX dapat diamati dalam sitoplasma sel setelah inkubasi 1 jam, menunjukkan internalisasi nanopartikel yang cepat terhadap sel tumor. Setelah inkubasi 4 jam, fluoresensi merah yang kuat diamati di seluruh sitoplasma sel dan nukleus. Ini menunjukkan bahwa lebih banyak nanopartikel diendositosis oleh sel dan melepaskan DOX secara efisien melalui degradasi cangkang polimer di lingkungan pereduksi sel tumor.
Gambar CLSM dari sel A549 yang dibudidayakan dengan nanopartikel PDA@PMAA bermuatan DOX untuk (a ) 1 jam dan (b ) 4 jam. Di setiap baris, gambar mikroskop kontras interferensi diferensial, gambar fluoresensi, dan gambar overlay ditampilkan dari kiri ke kanan, masing-masing. (bilah skala, 50 m)
Untuk mengevaluasi biokompatibilitas PDA@PMAA, sel normal yang khas (sel HEK-293T) dipilih untuk uji viabilitas sel dengan uji MTT. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 8, tidak ada sitotoksisitas yang jelas dari nanopartikel PDA@PMAA-1 kosong yang terdeteksi pada rentang konsentrasi yang luas 0,1–100 g mL
−1
, menunjukkan biokompatibilitas yang baik dari nanopartikel PDA@PMAA-1 yang memastikan aplikasinya di bidang biomedis. Selanjutnya, viabilitas sel terhadap sel A549 (sel tumor) sebagai fungsi konsentrasi inkubasi nanopartikel PDA@PMAA-1 kosong atau bermuatan DOX diukur, dan setiap kelompok dibagi lagi menjadi kelompok dengan atau tanpa paparan laser NIR (Gbr. 9 ). Hampir tidak ada efek pada viabilitas sel yang diamati untuk kelompok kosong PDA@PMAA-1 tanpa laser, menunjukkan bahwa nanopartikel komposit kosong tidak memiliki sitotoksisitas. Setelah 5 W cm
−2
Iradiasi laser NIR selama 300 detik, viabilitas sel untuk kelompok kosong PDA@PMAA-1 jelas menurun, dan ~ 54,3% sel terbunuh pada konsentrasi 100 g mL
−1
. Hasilnya menyiratkan bahwa nanopartikel PDA@PMAA-1 ini bersifat sitotoksik terhadap sel A549 dengan iradiasi NIR yang menginduksi hipertermia. Adapun kelompok bermuatan DOX, nanopartikel PDA@PMAA-1 bermuatan DOX menunjukkan penurunan viabilitas sel dengan cara yang responsif terhadap dosis, yang memiliki kemanjuran yang mirip dengan DOX bebas, yang menunjukkan pelepasan obat secara lengkap dari PMAA ikatan silang disulfida. kerang. Untuk sel yang diobati dengan nanopartikel PDA@PMAA-1 bermuatan DOX dengan paparan laser NIR, viabilitas sel menunjukkan penurunan yang lebih dalam dibandingkan dengan kelompok non-iradiasi, terutama pada dosis obat tinggi. Misalnya, ketika sel diperlakukan dengan 100 g mL
−1
PDA@PMAA-1 yang mengandung DOX (mengandung 5 g mL
−1
DOX), viabilitas sel berkurang menjadi sekitar 15,7%, yang jauh lebih rendah daripada pengobatan fototermal (~ 54,3%) atau kemoterapi (~ 38,1%) saja di bawah dosis nanopartikel yang sama. Khususnya, penghambatan sel 50% (IC50 ) nilai PDA@PMAA-1 bermuatan DOX dengan paparan laser NIR jangka pendek ditentukan hingga 2 g mL
−1
, yang jauh lebih rendah daripada DOX gratis (6,3 g mL
−1
). Ini menunjukkan bahwa terapi kemo-fototermal nanopartikel PDA@PMAA yang memuat DOX menunjukkan efek sinergis, yang mungkin dikaitkan dengan peningkatan sitotoksisitas DOX pada suhu yang lebih tinggi [34, 35]. Sebaliknya, kelompok laser DOX bebas dengan NIR tidak menunjukkan efek sinergis yang sama karena tidak ada hipertermia lokal yang disebabkan oleh penyinaran laser NIR. Gambar fluoresensi sel yang diwarnai Calcein-AM (sel hijau, sel hidup) setelah perawatan menunjukkan bahwa jumlah sel hidup yang dirawat oleh nanopartikel PDA@PMAA yang dimuat DOX pada iradiasi laser NIR secara signifikan lebih sedikit daripada kelompok lain, yang selanjutnya mengkonfirmasi antitumor sinergis efek nanopartikel PDA@PMAA bermuatan DOX dengan penyinaran cahaya NIR (Gbr. 10). Manfaat dari efek sinergis positif dari pengobatan kombinasi kemo-fototermal, memungkinkan dosis obat sitotoksik yang lebih rendah untuk mencapai efek membunuh tumor yang sama, sehingga menghindari efek samping yang parah pada jaringan normal pada dosis obat tinggi. Secara keseluruhan, data di atas menunjukkan bahwa nanopartikel PDA@PMAA ini dapat secara efisien melepaskan obat di bawah kondisi reduksi intraseluler dan menampilkan efek pembunuhan sel tumor yang sinergis untuk terapi kombinasi kemo-fototermal, yang menunjukkan potensi besar mereka untuk pengobatan kanker.
Viabilitas sel dari sel HEK-293 yang terpapar nanopartikel PDA@PMAA-1 kosong selama 24 jam
Viabilitas sel sel A549 yang diobati dengan nanopartikel DOX, PDA@PMAA-1 gratis, dan nanopartikel PDA@PMAA-1 bermuatan DOX pada berbagai konsentrasi tanpa atau dengan iradiasi laser NIR (λ =808 nm, 5 W cm
−2
) selama 300 detik
Gambar fluoresensi confocal dari sel A549 hidup yang dirawat dengan PBS, nanopartikel PDA@PMAA-1, nanopartikel PDA@PMAA-1 yang memuat DOX, dan DOX gratis dengan atau tanpa iradiasi laser NIR (λ =808 nm, 5 W cm
−2
) selama 300 detik. Sel hidup diwarnai dengan Calcein-AM (hijau). Bilah skala adalah 50 m
Kesimpulan
Multifungsi inti-shell PDA@PMAA komposit nanopartikel disintesis dengan melapisi lapisan PMAA disulfida-crosslinked pada nanopartikel PDA melalui polimerisasi distilasi-presipitasi. Nanopartikel komposit menunjukkan efek konversi fototermal yang sangat baik dan degradasi lapisan PMAA yang labil redoks. Untuk sampel khas PDA@PDA@PMAA-1, suhu dispersi PDA@PMAA meningkat sebesar 31
°
C at the concentration of 100 μg mL
−1
irradiated with an 808 nm laser at 5 W cm
−2
for 300 s. The DOX-loaded PDA@PMAA-1 nanoparticles were stable under the physiological environment with low leakage of DOX (10.8% in 24 h), while a rapid and full release of DOX was triggered in the reducing and weakening acidic condition (pH5.5 + 10 mM GSH). The cell viability of A549 cells treated with PDA@PMAA-1 nanoparticles under NIR irradiation was reduced significantly to about 15.7% at relatively low equivalent drug concentration (5 μg mL
−1
), which was much lower than photothermal (~ 54.3%) or chemotherapy (~ 38.1%) treatment alone under the same dose of nanoparticles and drugs. So the DOX-loaded composite nanoparticles realized a synergistic inhibition effect against cancer cells by the combination of photothermal therapy and traditional chemotherapy. This work demonstrated the feasibility of such composite nanoparticles to be a powerful platform for controlled drug delivery and could be exploited as combined chemo-photothermal therapy with improved therapeutic efficacy.
Ketersediaan Data dan Materi
The datasets generated during and/or analyzed during the current study are available from the corresponding author on request.
