Optimasi dan Evaluasi Metode Pretreatment sp-ICP-MS untuk Mengungkap Distribusi Nanopartikel Perak dalam Tubuh

Hasil dan Diskusi

Optimasi Deteksi Partikel oleh sp-ICP-MS

Dalam analisis sp-ICP-MS, penting untuk memasukkan satu atau tidak ada partikel ke dalam detektor per waktu tinggal. Jika beberapa partikel dimasukkan ke dalam detektor selama waktu tinggal, massa kotor beberapa partikel dianggap sebagai massa satu partikel [13]. Oleh karena itu, sampel harus cukup diencerkan untuk analisis sp-ICP-MS. Sebaliknya, analisis sp-ICP-MS dari sampel dengan konsentrasi ENP yang sangat rendah menyebabkan distribusi partikel dan data ukuran yang tidak akurat.

Untuk menentukan hubungan antara konsentrasi nAg100 dan jumlah partikel yang terdeteksi, kami secara serial mengencerkan larutan stok nAg100 untuk evaluasi dengan sp-ICP-MS. Hasil penelitian menunjukkan bahwa jumlah partikel yang terdeteksi meningkat secara teoritis dan linier pada daerah konsentrasi Ag yang relatif lebih rendah. Sebaliknya, pada konsentrasi Ag yang relatif lebih tinggi, jumlah partikel yang terdeteksi lebih rendah dari nilai teoritis (Gbr. 1a). Data ini menunjukkan bahwa pada konsentrasi Ag yang lebih tinggi, beberapa partikel cenderung dimasukkan ke dalam detektor selama setiap waktu diam, yang menghasilkan perkiraan ukuran partikel yang terlalu tinggi. Dengan demikian, perlu untuk menentukan jumlah partikel terdeteksi terbesar yang tidak berbeda dari nilai teoritis untuk menilai ukuran partikel secara akurat. Selanjutnya, kami mengurangi jumlah partikel yang terdeteksi dari nilai teoretis dan memplot perbedaannya sebagai sumbu vertikal. Hasilnya menunjukkan bahwa perbedaan dalam estimasi ukuran terjadi ketika jumlah partikel yang terdeteksi> 500. Hal ini menunjukkan bahwa perlu untuk mendeteksi partikel 500 selama waktu analisis (Gbr. 1b). Meskipun data ini diperoleh dalam satu percobaan, pengulangan percobaan menunjukkan hasil yang sama (data tidak ditampilkan).

Penentuan jumlah partikel optimal per waktu tinggal untuk analisis sp-ICP-MS yang akurat. Serangkaian larutan nAg (600 fg/mL hingga 2.500 pg/mL) dianalisis dengan sp-ICP-MS. a Untuk menentukan hubungan antara konsentrasi nAg100 dan jumlah partikel yang terdeteksi, kurva untuk partikel yang terdeteksi (garis padat) nilai teoritis (garis putus-putus) diplot. b Jumlah partikel yang terdeteksi dikurangi dari nilai teoritis diplot dalam sumbu vertikal untuk menentukan jumlah partikel yang optimal. Setiap poin adalah hasil dari satu percobaan (n = 1)

Untuk memvalidasi kondisi analisis, kami mengencerkan nAg dengan berbagai diameter (nAg30, nAg70, nAg100) untuk mendeteksi < 500 partikel per waktu analisis dan mengevaluasi diameternya. Analisis sp-ICP-MS menunjukkan bahwa diameter primer nAg30, nAg70, dan nAg100 berturut-turut adalah 30.0 ± 1.2, 65.1 ± 0.6, dan 97,4 ± 0.6. Selain itu, diameter hidrodinamik yang ditentukan oleh hamburan cahaya dinamis (DLS) masing-masing adalah 36,4 ± 1,6, 70,6 ± 1,7, dan 101 ± 1,0, nilai-nilai ini mirip dengan yang diperkirakan oleh sp-ICP-MS. Temuan ini menunjukkan bahwa kondisi sp-ICP-MS sesuai untuk mengukur diameter nanopartikel dari berbagai ukuran.

Optimasi Metode Perawatan Awal untuk Mendeteksi nAg di Jaringan Hati Tikus

Untuk mengukur dan menentukan sifat fisik ENP dalam tubuh, jaringan perlu dilisiskan sepenuhnya. Selain itu, penting untuk secara efisien memulihkan partikel dan ion yang didistribusikan di dalam tubuh tanpa menyebabkan perubahan fisik atau kimia dalam partikel. Kami menguji lima reagen pelarut, NaOH, TMAH, HNO₃ , HCl, atau proteinase K, dan dianalisis kuantitas dan sifat fisiknya dengan sp-ICP-MS untuk mengoptimalkan strategi pretreatment menggunakan hati sebagai model [14,15,16,17,18].

Homogenat hati dicampur dengan nAg100 untuk mendapatkan konsentrasi Ag akhir 100 ng/mL diikuti dengan perlakuan dengan masing-masing reagen pelarut pada 37 °C. Pertama, kami mengevaluasi jumlah residu jaringan sebagai indikator kelarutan jaringan. Lebih dari 90% jaringan dilarutkan dengan perlakuan NaOH, TMAH, dan proteinase K, sedangkan hanya 75% jaringan yang dilarutkan dengan HNO₃ dan perlakuan HCl (Gbr. 2a). Mengingat hampir 80% jaringan terdiri dari air [19], HNO₃ Perlakuan , HCl, dan PBS tidak efisien untuk melarutkan matriks jaringan yang tidak larut. Sebaliknya, pengobatan dengan NaOH, TMAH, dan proteinase K secara efisien melarutkan matriks jaringan yang tidak larut, menunjukkan kesesuaiannya untuk secara akurat mengukur nAg dalam jaringan. Selanjutnya, kami menganalisis tingkat pemulihan setiap partikel dan ion untuk mengevaluasi perubahan sifat fisik dengan setiap perlakuan. Analisis Sp-ICP-MS menunjukkan bahwa nAg100 hampir sepenuhnya terionisasi dengan perlakuan dengan reagen asam (HNO₃ dan HCl) dan sebagian terionisasi ketika diperlakukan dengan proteinase K. Hal ini menunjukkan bahwa reagen asam dan proteinase K melarutkan partikel dan mengubahnya menjadi ion. Sebaliknya, 100 ng/mL Ag, sesuai dengan jumlah awalnya ditambahkan, terdeteksi sebagai partikel ketika jaringan diperlakukan dengan reagen alkali (NaOH dan TMAH). Hampir tidak ada ion yang terdeteksi setelah perlakuan basa (Gbr. 2b), yang menunjukkan bahwa NaOH dan TMAH mempertahankan sifat fisik nAg. Akhirnya, kami mengevaluasi distribusi diameter partikel dalam jaringan yang diperlakukan dengan reagen yang berbeda, untuk menganalisis sifat fisik secara rinci. Diameter partikel rata-rata berubah menjadi 120 dari 100 nm setelah perlakuan TMAH (Gbr. 2c). Selanjutnya, partikel menjadi lebih luas setelah perlakuan TMAH (Gbr. 2d), menunjukkan agregasi partikel. Sebaliknya, ketika jaringan diperlakukan dengan NaOH, diameter partikel rata-rata mendekati 100 nm, sesuai dengan ukuran partikel awal. Hal ini menunjukkan bahwa perlakuan awal dengan NaOH adalah kondisi optimal untuk mendeteksi nAg100 di jaringan hati tikus.

Pretreatment NaOH adalah metode yang optimal untuk mendeteksi nAg100 di hati tikus. Lima reagen pelarut disaring sebagai pelarut pretreatment untuk melisiskan jaringan (NaOH, TMAH, HNO₃ , HCl, dan proteinase K). Homogenat hati dicampur dengan larutan nAg100 untuk mendapatkan konsentrasi Ag akhir 100 ng/mL dan diperlakukan dengan masing-masing reagen pelarut pada 37 °C. Setelah 3 h, a tingkat residu di setiap kelompok sebagai indikator kelarutan jaringan, b tingkat pemulihan (batang hitam dan putih mewakili tingkat perak yang terdeteksi sebagai partikel dan sebagai ion, masing-masing), c diameter partikel rata-rata yang ditampilkan dalam diagram batang, dan d distribusi ukuran partikel yang ditunjukkan dalam bagan hangat lebah dianalisis dengan analisis sp-ICP-MS. Hasilnya dinyatakan sebagai mean ± SD (n = 3)

Pretreatment TMAH telah banyak digunakan untuk analisis sp-ICP-MS dalam berbagai penelitian. TMAH dapat menginduksi agregasi nAg100 berdasarkan berbagai sifat fisik seperti viskositas dan pH. Selanjutnya, konstanta dielektrik mungkin terkait dengan agregasi. Perlakuan TMAH selama 3 h dapat meningkatkan konstanta dielektrik yang disebabkan oleh dekomposisi TMAH menjadi trimetilamina (TMA) dan metanol [20]. Peningkatan konstanta dielektrik membawa potensi zeta nAg100 yang berbanding terbalik dengan konstanta dielektrik, menjadi hampir nol, mengakibatkan hilangnya tolakan elektrostatik antara nAg dan induksi agregasi. Perlakuan nAg100 dengan TMAH untuk waktu yang singkat (1 min) menghasilkan ukuran partikel rata-rata sekitar 100 nm (data tidak ditampilkan).

Evaluasi Keserbagunaan Pretreatment NaOH di Berbagai Organ

Untuk mengevaluasi keserbagunaan pretreatment NaOH untuk mendeteksi nAg, kami memperlakukan berbagai organ tikus (jantung, paru-paru, ginjal, dan limpa) dengan NaOH dan melakukan sp-ICP-MS untuk deteksi partikel. Pertama, kami mengevaluasi jumlah residu jaringan sebagai indikator kelarutan jaringan. Lebih dari 95% solubilisasi jaringan dicapai dengan perlakuan NaOH (Gbr. 3a). Selain itu, Ag yang sesuai dengan jumlah aditif terdeteksi sebagai partikel (Gbr. 3b). Meskipun beberapa tingkat pemulihan melebihi 100%, kriteria US Food and Drug Administration menyatakan bahwa tingkat pemulihan 80-120% cukup dapat diandalkan [21]. Oleh karena itu, analisis kami dapat diandalkan. Selain itu, diameter partikel rata-rata nAg yang terdeteksi di organ mana pun mendekati 100 nm, sesuai dengan ukuran partikel nAg yang ditambahkan (Gbr. 3c, d). Studi ini menunjukkan bahwa pretreatment NaOH sangat ideal untuk mendeteksi nAg tidak hanya di hati tikus tetapi juga di jantung tikus, paru-paru, ginjal, dan limpa.

Pretreatment NaOH adalah metode yang optimal untuk mendeteksi nAg100 di berbagai organ. Seperti pada Gambar. 2, homogenat jantung, ginjal, paru-paru dan limpa dicampur dengan nAg100 dan diinkubasi dengan larutan NaOH. Setelah 3 h, a tingkat residu (batang hitam dan putih mewakili tingkat residu dalam perlakuan NaOH- atau PBS, masing-masing), b tingkat pemulihan (batang hitam dan putih mewakili tingkat Ag yang terdeteksi sebagai partikel dan sebagai ion, masing-masing), c diameter partikel rata-rata ditunjukkan dalam bagan hangat lebah, dan d distribusi ukuran partikel yang ditunjukkan dalam bagan hangat lebah dianalisis dengan analisis sp-ICP-MS di setiap sampel jaringan. Hasilnya dinyatakan sebagai mean ± SD (n = 3)

Secara keseluruhan, hasil kami menunjukkan bahwa pretreatment NaOH adalah strategi pretreatment yang optimal untuk kuantifikasi dan analisis sifat fisik nAg dalam jaringan hewan dengan sp-ICP-MS.

Evaluasi sp-ICP-MS untuk Analisis Sifat Kuantitatif dan Fisik nAg dan Ag ⁺ dalam Jaringan Biologis

nAg terionisasi dalam tubuh atau Ag ⁺ partikulat dalam jaringan tikus, meskipun rincian proses ini tidak jelas. Oleh karena itu, kami mengevaluasi aplikasi praktis sp-ICP-MS dengan menganalisis kuantitas dan sifat fisik Ag dalam darah dan hati tikus setelah pemberian tunggal nAg100 atau Ag secara intravena ⁺ . Analisis ICP-MS menunjukkan bahwa Ag terdeteksi dalam darah kedua Ag ⁺ - dan tikus yang diberi nAg100 (Gbr. 4a). Selain itu, Ag terdeteksi di hati kedua kelompok (Gbr. 4b). Selanjutnya, kami menganalisis sifat fisik Ag di setiap sampel. Karena sejumlah kecil nAg terdeteksi dalam darah kedua Ag ⁺ - dan tikus yang diberi nAg100, sebagian besar Ag yang terdeteksi berada dalam bentuk ion (Gbr. 4c). Dalam sampel hati, sekitar 80% Ag terdeteksi sebagai partikel pada tikus yang diberi nAg100, sementara sejumlah kecil nAg terdeteksi pada Ag ⁺ -tikus yang dirawat (Gbr. 4d). Terakhir, kami mengevaluasi ukuran partikel dalam hati tikus yang diberi nAg100 oleh sp-ICP-MS, yang menunjukkan bahwa ukuran partikel kira-kira 80 nm (Gbr. 4e). Data ini menunjukkan bahwa Ag ⁺ diberikan ke dalam darah hampir tidak berubah menjadi partikel, dan sifat fisik Ag ⁺ dalam darah dan hati tidak berubah. Sebaliknya, nAg100 yang diberikan ke dalam darah sebagian terionisasi; 20% Ag dalam hati dan sebagian besar Ag dalam darah dalam bentuk ion. Sebagai hasil dari ionisasi parsial, diameter rata-rata nAg dalam jaringan hati lebih kecil daripada partikel yang diberikan pada awalnya (80 vs 100 nm). Akibatnya, sampel biologis kami yang menerapkan strategi sp-ICP-MS mengungkapkan bahwa nAg100 yang diberikan ke dalam darah didistribusikan sebagai partikel (sekitar 80%) di hati dan sebagai ion (sekitar 95%) dalam darah, sedangkan metode ICP-MS bisa hanya mengevaluasi jumlah Ag dan bukan perubahan fisik atau kimia dalam partikel.

Kuantifikasi simultan dan analisis sifat fisik dari nAg100 dan Ag yang diberikan secara intravena ⁺ . nAg100 dan Ag ⁺ diberikan secara intravena pada tikus (0,75 atau 1,5 mg/kg). Setelah 24 jam, hati dan darah mereka dikumpulkan. Semua sampel diberi perlakuan awal dengan larutan NaOH. Konsentrasi Ag dalam a darah dan b hati diukur dengan ICP-MS. nAg di c darah dan d hati diukur dengan sp-ICP-MS. Diameter rata-rata partikel yang terdeteksi di hati ditunjukkan dalam e . Hasilnya dinyatakan sebagai mean ± SE (n = 3)