Optimalisasi Pra-pengolahan sp-ICP-MS: Mengungkap Distribusi Nanopartikel Perak dalam Jaringan Biologis

Abstrak

Proliferasi cepat nanopartikel rekayasa (ENP) telah meningkatkan paparan manusia, namun alat analitik saat ini tidak dapat secara simultan mengkuantifikasi dan mengkarakterisasi ENP dalam matriks biologis. Spektrometri massa plasma terintegrasi tunggal partikel (sp-ICP-MS) menawarkan pengukuran simultan dan penilaian properti fisik, namun aplikasinya pada jaringan terbatas oleh protokol pra-pengolahan yang tidak memadai yang dapat mengubah integritas partikel atau mengurangi pemulihan. Dalam studi ini, kami secara sistematik mengevaluasi lima agen pelarut—natrium hidroksida (NaOH), tetrametilamoni hidroksida (TMAH), asam nitrat (HNO₃), asam klorida (HCl), dan proteinase K—menggunakan nanopartikel perak (nAg) sebagai sistem model. Perlakuan NaOH mencapai pelarutan jaringan >90 % sambil mempertahankan ukuran partikel dan meminimalkan ionisasi, unggul dibandingkan reagen lain. Perpanjangan protokol NaOH pada homogenisasi jantung, paru, limpa, dan ginjal mengonfirmasi kepadannya luas. Terakhir, kami menerapkan pra-pengolahan yang dioptimalkan untuk menilai nasib nAg yang diberikan secara intravenus versus Ag⁺ dalam darah dan hati tikus. sp-ICP-MS mengungkapkan bahwa nAg sebagian besar tetap dalam bentuk partikel (~80 %) dalam hati tetapi terionisasi (~95 %) dalam aliran darah, sedangkan Ag⁺ tetap ionik dalam kedua kompartemen. Temuan ini menunjukkan bahwa pra-pengolahan NaOH memungkinkan analisis sp-ICP-MS yang akurat dari ENP in vivo dan menekankan pentingnya konversi partikel-ke-ion dalam menentukan distribusi dan kinetika biologis.

Pendahuluan

Kemajuan nanoteknologi telah mempercepat produksi nanopartikel rekayasa (ENP) lebih kecil dari 100 nm, menawarkan keuntungan unik seperti penetrasi jaringan yang ditingkatkan dan permukaan reaktif. Nanopartikel perak (nAg) banyak digunakan dalam barang konsumen dan farmasi, dihargai karena pelepasan Ag⁺ yang berkelanjutan dan properti konduktifnya. Namun, atribut skala nano yang sama yang memberikan fungsionalitas juga dapat menimbulkan risiko kesehatan, termasuk gangguan baris darah-otak dan respons inflamasi. Dengan keberadaan ENP yang umum, penilaian yang ketat terhadap bahaya dan paparan—yang secara kolektif mendefinisikan risiko ENP—tetap sangat penting.

Sementara penelitian luas telah berfokus pada toksisitas ENP, lebih sedikit studi yang mengkuantifikasi skenario paparan aktual. Karya terbaru telah menunjukkan distribusi selular yang berbeda untuk nAg versus Ag⁺ dalam sel yang dibudayakan, menekankan kebutuhan untuk membedakan partikel dari ion dalam jaringan. ICP-MS konvensional mengukur total kandungan logam tetapi tidak dapat membedakan spesies partikel versus ion, sedangkan TEM memberikan informasi ukuran tetapi tidak memiliki kemampuan kuantitatif. Oleh karena itu, metode yang menggabungkan pengukuran yang presisi dengan analisis properti fisik sangat penting untuk mengungkap biotransformasi ENP.

sp-ICP-MS dapat mendeteksi partikel individu, memberikan estimasi ukuran dari intensitas puncak dan konsentrasi dari frekuensi puncak, sambil membedakan ion melalui analisis sinyal latar belakang. Studi sebelumnya telah menerapkan sp-ICP-MS pada sampel lingkungan dan komersial, namun penggunaannya dalam jaringan biologis terbatas, sebagian besar karena pra-pengolahan yang tidak memadai yang dapat merusak atau mengubah ENP. Berbagai reagen pelarut bervariasi dalam kemampuan mereka untuk meluluskannya, memulihkan ENP, dan mempertahankan integritas partikel. Studi ini oleh karena itu mengevaluasi dan mengoptimalkan strategi pra-pengolahan untuk analisis sp-ICP-MS nAg dalam jaringan tikus, bertujuan untuk menentukan alur kerja yang andal untuk pengukuran simultan dan penilaian properti fisik ENP in vivo.

Bahan dan Metode

ENP

Biopure nAg berukuran 30, 70, dan 100 nm (nAg30, nAg70, nAg100) diperoleh dari nanoComposix (San Diego, CA, AS). RM8013, standar untuk kalibrasi efisiensi transfer, diperoleh dari National Institute of Standards and Technology (Gaithersburg, MD, AS). Semua suspensi ENP di-sonikasi selama 10 menit sebelum penggunaan.

Reagen

Larutan 0,1 mol L⁻¹ NaOH, 25 % TMAH, 30 % HCl, dan proteinase K dibeli dari Wako (Osaka, Jepang). Larutan 70 % HNO₃ diperoleh dari Kanto Kagaku (Tokyo, Jepang).

Hewan Coba

Tikus BALB/c betina (6 minggu) diperoleh dari Japan SLC (Shizuoka, Jepang). Tikus dipelihara dalam siklus cahaya/gelap 12 jam dengan akses bebas ke makanan dan air. Semua prosedur mematuhi pedoman etika Universitas Osaka, Jepang.

Pengukuran Distribusi Ukuran Partikel dengan Pencaharan Cahaya Dinamis

nAg diencerkan dalam air MilliQ hingga 10 µg mL⁻¹ Ag. Alih-alih 1 mL ditempatkan dalam sel kapiler zeta (Malvern Instruments) dan dianalisis pada Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments) untuk menentukan diameter rata-rata dan potensial zeta.

Pengukuran Massa Kasar Ag

Konsentrasi total Ag diukur pada Agilent 7700x ICP-MS (Agilent Technologies). Kondisi operasinya adalah daya RF 1550 W, aliran Ar 1,05 L menit⁻¹, waktu tinggal 100 ms. Rodium berfungsi sebagai standar internal. Pengukuran dilakukan tiga kali.

Analisis sp-ICP-MS dan Perhitungannya

Analisis sp-ICP-MS menggunakan instrumen yang sama dengan daya RF 1550 W, aliran Ar 1,05 L menit⁻¹, waktu tinggal 10 ms, dan waktu total pelaksanaan 30 s. Perhitungan ukuran partikel menggunakan alat partikel tunggal yang dikembangkan oleh RIKILT.

Konsentrasi Partikel Kritis untuk sp-ICP-MS

Larutan stok nAg (1,0 mg mL⁻¹) diencerkan secara berurutan untuk menghasilkan larutan 2000, 800, 700, dan 600 pg mL⁻¹, yang kemudian diencerkan sepuluh kali untuk menghasilkan 40 konsentasi yang berbeda untuk evaluasi sp-ICP-MS.

Optimalisasi Metode Pra-pengolahan untuk Hati Tikus

Homogenisasi hati disiapkan dengan mencampur jaringan dengan pelarut fosfat (PBS, b/v = 1:10) dan homogenisasi. Setiap homogenisasi ditambahkan 100 ng mL⁻¹ nAg kemudian diperlakukan dengan salah satu reagen berikut pada rasio 1:1 v/v: 0,1 mol L⁻¹ NaOH, 25 % TMAH, 30 % HCl, atau proteinase K (10 U mL⁻¹ dalam 0,01 M Tris-HCl, 0,01 M EDTA, 0,5 % SDS). Sampel diinkubasi selama 3 jam pada 37 °C, sisa dikumpulkan, ditimbang, dan supernatants diencerkan 500 kali untuk sp-ICP-MS.

Evaluasi Kepadatan Pra-pengolahan NaOH pada Berbagai Organ

Jaringan jantung, paru, limpa, dan ginjal dihomogenisasi dalam PBS (b/v = 1:10) dan ditambahkan 100 ng mL⁻¹ nAg. Larutan NaOH 1 mol L⁻¹ ditambahkan pada rasio 1:1 v/v, dan sampel diinkubasi selama 3 jam pada 37 °C. Sisa ditimbang, dan supernatants diencerkan 500 kali untuk sp-ICP-MS.

Evaluasi Kuantitas dan Properti Fisik nAg₁₀₀ dan Ag⁺ dalam Tikus Setelah Administrasi Intravenus Tunggal

nAg₁₀₀ dan AgNO₃ diencerkan hingga 0,25 mg mL⁻¹ (Ag⁺) dalam glukosa 5 %. Tikus menerima suntikan intravenus nAg₁₀₀ (1,5 atau 0,75 mg kg⁻¹), AgNO₃ (1,5 atau 0,75 mg kg⁻¹ sebagai Ag⁺), atau glukosa 5 % (kontrol). Dua puluh empat jam setelah suntikan, sampel darah dan hati dikumpulkan. Homogenisasi hati disiapkan dalam PBS (b/v = 1:10) kemudian diperlakukan dengan TMAH atau NaOH (1:1 v/v) untuk analisis ICP-MS dan sp-ICP-MS.

Hasil dan Pembahasan

Optimalisasi Deteksi Partikel oleh sp-ICP-MS

sp-ICP-MS yang akurat memerlukan tidak lebih dari satu partikel memasuki plasma selama setiap waktu tinggal; jika tidak, beberapa partikel akan secara kesalahan dijumlahkan sebagai satu peristiwa, mengangkat estimasi ukuran. Kami melakukan deret pengenceran nAg₁₀₀ dan memplot jumlah partikel yang terdeteksi versus teoretis. Meskipun konsentrasi rendah menghasilkan hubungan linier, konsentrasi lebih tinggi menghasilkan lebih sedikit peristiwa yang terdeteksi dari yang diharapkan, yang mengindikasikan interferensi multi-partikel (Gambar 1a). Mengurangi jumlah terdeteksi dari jumlah teoretis menunjukkan bahwa penyimpangan menjadi signifikan ketika peristiwa yang terdeteksi melebihi 500, yang menetapkan ambang praktis untuk analisis yang andal (Gambar 1b).

Validasi dengan nAg berbagai diameter mengonfirmasi bahwa pengaturan sp-ICP-MS menghasilkan estimasi ukuran yang akurat: diameter yang diukur sebesar 30,0 ± 1,2 nm, 65,1 ± 0,6 nm, dan 97,4 ± 0,6 nm untuk nAg30, nAg70, dan nAg100, masing-masing. Pengukuran pencaharan cahaya dinamis (DLS) (36,4 ± 1,6 nm, 70,6 ± 1,7 nm, 101 ± 1,0 nm) cocok dengan hasil sp-ICP-MS, memvalidasi protokol analitik.

Optimalisasi Metode Pra-pengolahan untuk Mendeteksi nAg dalam Jaringan Hati Tikus

Pra-pengolahan yang efektif harus meluluhkan jaringan, memulihkan ENP tanpa mengubah status fisik atau kimiawi, dan menghindari ionisasi atau agregasi. Kami membandingkan lima agen pelarut—NaOH, TMAH, HNO₃, HCl, dan proteinase K—menggunakan homogenisasi hati yang ditambahkan 100 ng mL⁻¹ nAg.

Analisis sisa menunjukkan bahwa NaOH, TMAH, dan proteinase K melarutkan >90 % matriks hati, sedangkan HNO₃ dan HCl melarutkan hanya sekitar 75 % (Gambar 2a). Karena sekitar 80 % jaringan adalah air, pelarutan yang lebih rendah oleh reagen asam mengindikasikan penghapusan matriks yang tidak sempurna.

Data pemulihan sp-ICP-MS menunjukkan bahwa perlakuan asam sepenuhnya mengionisasi nAg, sedangkan proteinase K sebagian mengionisasinya. Sebaliknya, NaOH dan TMAH mempertahankan nAg sebagai partikel utuh dengan deteksi ion yang tidak dapat diabaikan (Gambar 2b). Analisis distribusi ukuran menunjukkan bahwa perlakuan TMAH menyebabkan pergeseran dari 100 nm ke 120 nm dan memperluas distribusi (Gambar 2c-d), yang mengindikasikan agregasi. Perlakuan NaOH mempertahankan ukuran asli 100 nm (Gambar 2c-d), mengonfirmasi kesesuaiannya.

Kecenderungan TMAH untuk meningkatkan konstanta dielektrik melalui dekomposisi menjadi trimetilamina dan metanol dapat mengurangi potensial zeta nAg, mempromosikan agregasi. Namun, paparan TMAH waktu singkat (1 menit) mempertahankan ukuran partikel (~100 nm), mengonfirmasi bahwa perlakuan yang panjang yang bertanggung jawab atas agregasi.

Evaluasi Kepadatan Pra-pengolahan NaOH pada Berbagai Organ

Untuk mengonfirmasi kepadatan luas NaOH, kami menerapkan protokol pada homogenisasi jantung, paru, limpa, dan ginjal yang ditambahkan nAg. Analisis sisa menunjukkan pelarutan >95 % (Gambar 3a). sp-ICP-MS mendeteksi Ag yang ditambahkan sebagai partikel dalam semua jaringan, dengan tingkat pemulihan dalam rentang 80–120 % yang diterima oleh standar FDA (Gambar 3b). Diameter partikel tetap dekat 100 nm di seluruh organ (Gambar 3c-d), menekankan konsistensi metode.

Data secara kolektif mengonfirmasi bahwa pra-pengolahan NaOH menyediakan platform yang kuat dan dapat direproduksi untuk mengkuantifikasi dan mengkarakterisasi nAg dalam berbagai jaringan hewan melalui sp-ICP-MS.

Evaluasi sp-ICP-MS untuk Analisis Kuantitatif dan Properti Fisik nAg dan Ag⁺ dalam Jaringan Biologis

Untuk menunjukkan relevansi praktis, kami membandingkan nasib nAg₁₀₀ versus Ag⁺ yang diberikan secara intravenus dalam darah dan hati tikus. ICP-MS mengonfirmasi kehadiran Ag dalam kedua kompartemen untuk kedua perlakuan (Gambar 4a,b). Namun, sp-ICP-MS mengungkapkan spesiasi yang berbeda: dalam darah, Ag sebagian besar ada sebagai ion (>95 %) terlepas dari bentuk yang diberikan, sementara dalam hati, sekitar 80 % Ag dari nAg₁₀₀ tetap sebagai partikel, dengan kehadiran partikel yang minimal setelah administrasi Ag⁺ (Gambar 4c,d). Analisis ukuran partikel hati nAg₁₀₀ menunjukkan diameter rata-rata sekitar 80 nm, lebih kecil dari 100 nm yang diberikan, yang mencerminkan ionisasi parsial dan transformasi yang mungkin dalam jaringan hati (Gambar 4e).

Kesimpulan

Kami telah menetapkan protokol pra-pengolahan NaOH yang dioptimalkan yang memungkinkan analisis sp-ICP-MS yang akurat dari nanopartikel perak dalam jaringan tikus, menyediakan pengukuran simultan dan karakterisasi ukuran partikel. Penerapan alur kerja ini pada nAg₁₀₀ dan Ag⁺ yang diberikan secara intravenus mengungkapkan bahwa nAg terionisasi parsial in vivo, dengan sekitar 80 % tetap dalam bentuk partikel dalam hati dan sekitar 95 % terionisasi dalam aliran darah. Temuan ini menekankan pentingnya memperhitungkan konversi partikel-ke-ion saat menilai distribusi dan kinetika ENP. Metode ini dapat diterapkan pada berbagai jaringan dan dapat digunakan dalam studi penilaian risiko untuk mengungkap dinamika paparan ENP dan respons biologis.

Ketersediaan Data dan Bahan

Berbagi data tidak berlaku untuk artikel ini karena tidak ada dataset yang dihasilkan atau dianalisis selama studi saat ini.

Singkatan

Ag:

Perak

Ag⁺:

Ion perak

DLS:

Pencaharan cahaya dinamis

ENPs:

Nanopartikel rekayasa

HCl:

Asam klorida

HNO₃:

Asam nitrat

ICP-MS:

Spektrometri massa plasma terintegrasi

nAg:

Nanopartikel perak

nAg₁₀₀:

nAg 100 nm

nAg₃₀:

nAg 30 nm

nAg₇₀:

nAg 70 nm

NaOH:

Natrium hidroksida

PBS:

Pelarut fosfat

sp-ICP-MS:

sp-ICP-MS partikel tunggal

TEM:

Mikroskop transmisi elektron

TMAH:

Tetrametilamoni hidroksida