Komplementasi ELISA dan Permukaan Elektroda Interdigitasi dalam Fungsionalisasi Nanopartikel Emas untuk Deteksi Cacat Pembekuan Darah Manusia yang Efektif
Abstrak
Mengembangkan diagnosis yang disempurnakan menggunakan biosensor penting untuk perawatan pasien sebelum komplikasi penyakit muncul. Meningkatkan biosensor akan memungkinkan deteksi berbagai biomarker penyakit dengan kelimpahan rendah. Imobilisasi yang efisien dari probe/reseptor pada permukaan penginderaan adalah salah satu cara yang efisien untuk meningkatkan deteksi. Di sini, kami memperkenalkan permukaan penginderaan pra-basa dengan fungsionalisasi amina untuk menangkap nanopartikel emas (GNP) yang terkonjugasi dengan faktor pembekuan darah manusia IX (FIX), dan kami menunjukkan kinerja strategi yang sangat baik. Kami telah memilih enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) dan elektroda interdigitated (IDE), yang banyak digunakan, untuk mendemonstrasikan metode kami. Jumlah optimal untuk silanisasi telah ditemukan menjadi 2,5%, dan GNP berukuran 15-nm ideal dan dicirikan. Batas deteksi FIX dicapai dengan ELISA pada 100 pM dengan GNP dan FIX yang sudah dicampur sebelumnya, yang menunjukkan peningkatan sensitivitas 60 kali lipat tanpa biofouling, dibandingkan dengan ELISA konvensional. Selanjutnya, FIX terdeteksi dengan spesifisitas yang lebih tinggi dalam serum manusia pada pengenceran 1:1280, yang setara dengan 120 pM FIX. Hasil ini dilengkapi dengan analisis pada IDE, di mana peningkatan deteksi pada 25 pM dicapai, dan FIX terdeteksi dalam serum manusia pada pengenceran 1:640. Permukaan yang dioptimalkan ini berguna untuk meningkatkan deteksi berbagai penyakit pada berbagai permukaan penginderaan.
Pengantar
Peningkatan segala aspek di garda terdepan kedokteran adalah wajib untuk menjaga kesehatan manusia dan memperpanjang umur. Mendiagnosis penyakit adalah salah satu bidang utama di bidang medis, yang harus ditingkatkan lebih lanjut untuk memudahkan identifikasi penyakit dan perawatan. Di sisi lain, penyakit epidemik seperti influenza dan demam berdarah harus dideteksi pada tahap awal untuk menghindari penyebaran [1,2,3]. Ada berbagai diagnostik yang telah terbukti mampu mendeteksi secara asli melalui berbagai biomarker [4, 5]. Di antara sistem diagnosis yang dihasilkan sebelumnya, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) secara luas dianggap sebagai "standar emas" untuk mengidentifikasi penyakit virus dan bakteri utama dan spesies molekuler [6, 7]. Strategi yang berbeda telah dikembangkan dengan ELISA dengan karakteristik yang menarik seperti kemudahan penggunaan, presisi, dan batas deteksi yang lebih rendah. Selain itu, deteksi simultan dari berbagai penyakit dan penggunaan untuk menyaring penyakit utama adalah umum dalam praktik [8,9,10]. ELISA adalah immunoassay yang digunakan untuk mendeteksi target yang diinginkan menggunakan antibodi yang sesuai pada pelat 96-sumur polistiren (PS). Sensitivitas dan selektivitas molekul target sangat bergantung pada berbagai faktor dalam ELISA, seperti afinitas pengikatan target dan antibodi, interaksi antibodi primer dan sekunder, dan imobilisasi target yang efisien pada permukaan ELISA. Secara khusus, imobilisasi target pada pelat PS memainkan peran penting dalam membatasi deteksi. Antibodi atau protein dapat secara fisik teradsorpsi ke permukaan PS melalui interaksi gugus hidrofobik dengan antibodi [11]. Ada beberapa kemungkinan, misalnya, melibatkan ikatan yang lemah dari antibodi (atau protein) atau ketidakstabilan antibodi pada pelat PS dan distribusi antibodi (atau protein) yang tidak seragam yang menyebabkan cacat dalam pendeteksian. Telah terbukti bahwa orientasi antibodi yang tepat pada pelat yang diimobilisasi meningkatkan deteksi lebih dari 64 kali lipat dibandingkan dengan molekul yang diimobilisasi secara acak [12, 13]. Menemukan prosedur yang cocok untuk imobilisasi protein atau antibodi yang efisien pada pelat PS dengan keseragaman dengan demikian merupakan kebutuhan yang sangat penting. Peneliti yang berbeda memanfaatkan imobilisasi protein pada pelat PS ELISA dengan proses kimia atau fisika, seperti reaksi fotokimia yang dibantu oleh polivinil benzil laktononilamida dan imobilisasi protein dengan adanya deterjen [14,15,16]. Dixit dkk. [8] telah melumpuhkan antibodi pada pelat PS yang dimodifikasi amina untuk meningkatkan batas deteksi, dan mereka menunjukkan bahwa campuran (3-aminopropil)triethoxysilane (APTES) dan antibodi sebelum langkah imobilisasi meningkatkan sensitivitas 54 kali dibandingkan dengan ELISA konvensional dan mencapai batas deteksi 10 pM [8, 17].
Dalam karya ini, kami memperkenalkan metode baru imobilisasi protein pada pelat PS ELISA yang dibantu oleh nanopartikel emas (GNPs). GNP adalah salah satu alat yang paling kuat di bidang pengembangan sensor. Mereka menawarkan sifat positif, seperti kemudahan dispersi dalam air, inertness biologis, dan kompatibilitas yang baik dengan fungsionalisasi permukaan, dan mereka dapat disesuaikan dengan ukuran nano yang seragam [18,19,20,21,22,23]. Telah terbukti bahwa antibodi terkonjugasi GNP meningkatkan batas deteksi dengan virus influenza dan FIX pada sensor mode pandu gelombang [21,22,23]. GNP digunakan di semua jenis sensor, termasuk sensor mode pandu gelombang, resonansi plasmon permukaan, dan spektroskopi Raman untuk deteksi kinerja tinggi. Selain itu, GNP juga telah digunakan dalam uji kolorimetri, di mana konjugasi aptamer atau antibodi pada permukaan GNP diikuti untuk mendeteksi analit dengan mata telanjang. Para peneliti juga berfokus pada penggunaan GNP dalam metode ELISA untuk meningkatkan deteksi [24]. Sebelumnya, anti-tikus-IgG-HRP terkonjugasi GNP meningkatkan deteksi Pb(II) dan mencapai batas deteksi 9 pg/mL [25]. Laksmipriya dkk. telah menemukan bahwa konjugasi antibodi primer dan sekunder pada GNP meningkatkan deteksi protein ESAT-6, yang terlibat dalam menyebabkan tuberkulosis [9, 26]. Di sini, kami menggunakan GNP untuk melumpuhkan protein pada permukaan PS ELISA dengan modifikasi kimia yang dibantu oleh APTES. Pendekatan ini melibatkan dua langkah:fungsionalisasi permukaan PS dengan gugus amina menggunakan APTES diikuti dengan imobilisasi protein terkonjugasi GNP pada pelat PS yang dimodifikasi amina. Gugus amina dari APTES dapat berikatan dengan gugus COOH pada permukaan PS ELISA. Di sisi lain, protein terkonjugasi GNP yang distabilkan dengan ion sitrat anionik dapat berikatan dengan APTES kationik melalui interaksi elektrostatik [11, 27, 28]. Gugus amino-terminal di APTES menggantikan gugus sitrat pada GNP dan secara kimiawi difiksasi ke pelat PS [29]. Gugus amina bermuatan positif di APTES juga menarik GNP yang bermuatan negatif. Selain itu, perlakuan APTES mengubah substrat PS menjadi lebih hidrofobik [30].
Pelat ELISA yang dimodifikasi secara kimia dan konjugasi GNP digunakan untuk mendeteksi faktor IX (FIX) dari kaskade pembekuan darah manusia. FIX adalah protein penting dalam sistem pembekuan darah, dan konsentrasi FIX yang lebih rendah dalam aliran darah menyebabkan defisiensi pembekuan. Peningkatan imobilisasi FIX pada pelat ELISA melalui GNP memungkinkan jalur potensial untuk mendeteksi level FIX yang lebih rendah. Pelat ELISA yang dimodifikasi GNP menunjukkan peningkatan drastis dalam deteksi FIX. Selanjutnya, kami juga mendemonstrasikan deteksi FIX dalam serum manusia, dan strategi saat ini dapat digunakan dengan ELISA untuk mendeteksi biomarker lainnya. Untuk melengkapi penelitian di atas dengan substrat ELISA, kami juga menerapkan strategi di atas pada permukaan elektroda interdigitasi (IDE) lain yang banyak digunakan dalam sensor dielektrik elektrokimia untuk mendeteksi FIX dan FIX murni dalam sampel serum yang diencerkan manusia (Gbr. 1a, b) .
a Representasi skematis dari ELISA yang dibantu GNP. GNP dicampur dengan protein dan diimobilisasi pada permukaan ELISA yang dimodifikasi APTES. Antibodi kemudian ditambahkan. Akhirnya, substrat untuk HRP digunakan untuk mendeteksi target. b Representasi skema IDE yang dibantu GNP
Bahan dan Metode
Reagen dan Biomolekul
(3-Aminopropil)triethoxysilane (APTES) dan serum manusia dibeli dari Sigma-Aldrich (AS). Protein FIX dan antibodi anti-FIX berasal dari Abcam (Malaysia). Peroksidase lobak terkonjugasi anti-mouse-IgG (anti-mouse immunoglobulin HRP) dibeli dari Thermo-Scientific (USA). Plat ELISA dibeli dari Becton Dickinson (Prancis). Lapisan buffer ELISA 5x diperoleh dari BioLegend (UK). Albumin serum sapi (BSA) dan substrat HRP diperoleh dari Promega (AS). Nanopartikel emas (GNPs) (10, 15, dan 80 nm) diperoleh dari Nanocs (AS). Pembaca ELISA analitis berasal dari Fisher Scientific (Malaysia).
Optimasi dengan Reagen Silane dan GNP
Untuk mengoptimalkan konsentrasi APTES dan GNP yang sesuai, kami melakukan proses imobilisasi dengan berbagai kombinasi APTES dan GNP pada pelat ELISA. Awalnya, pelat ELISA dihidroksilasi dengan 1% KOH selama 1 h. Kemudian, 1,25, 2,5, dan 5% APTES dihubungkan pada sumur terpisah dari pelat ELISA pada suhu kamar (RT) selama 5 h. Setelah itu, GNP yang diencerkan (dalam air suling) dengan konsentrasi 25, 50, dan 100% diimobilisasi pada permukaan yang dimodifikasi APTES. FIX, pada 200 nM, kemudian diizinkan untuk mengikat ke permukaan GNP. Situs pengikatan yang tersisa kemudian diblokir menggunakan 2% BSA, kemudian pengenceran 1:1000 antibodi FIX diperkenalkan, diikuti dengan penambahan pengenceran 1:1000 anti-tikus-IgG-HRP. Akhirnya, substrat ditambahkan untuk mendeteksi interaksi FIX. Sumur dicuci 5 kali di antara setiap langkah menggunakan buffer pencuci (buffer PBS mengandung 0,05% Tween 20, pH 7.4). Terakhir, optical density (OD) diukur dengan ELISA reader pada 405 nm. GNP berukuran 15 nm digunakan dalam eksperimen ini.
Menentukan Ukuran GNP yang Diperlukan
Setelah menentukan konsentrasi pengenceran APTES dan GNP yang sesuai pada kondisi optimal, GNP 10, 15, dan 80 nm dicoba untuk imobilisasi FIX untuk menentukan ukuran yang paling sesuai. Kondisi percobaan yang sama digunakan seperti yang dinyatakan di atas. APTES pada 2,5% dan pengenceran GNP 50% digunakan untuk imobilisasi FIX.
Deteksi FIX Spesifik dan Selektif
Kami juga mengkonfirmasi pengikatan spesifik protein dan antibodi pada pelat ELISA. Untuk itu, kami menggunakan tiga jenis eksperimen kontrol yang berbeda. Kami melumpuhkan urutan biomolekul berikut pada pelat ELISA untuk berfungsi sebagai kontrol dan kondisi spesifik:kontrol 1 (C1), FIX-BSA-anti-tikus IgG-substrat; kontrol 2 (C2), substrat antibodi FIX-BSA-FIX; control 3 (C3), BSA-FIX antibodi-anti-tikus IgG-substrat, spesifik (S), FIX-BSA-FIX antibodi-anti-tikus IgG-substrat.
Deteksi FIX Terkonjugasi GNP pada Pelat ELISA vs. ELISA Konvensional
FIX dideteksi menggunakan pelat ELISA yang dimodifikasi GNP dengan dua metode yang berbeda, seperti APTES-GNP-FIX dan APTES-GNP yang telah dicampur sebelumnya, dan metode ini dibandingkan dengan ELISA konvensional. Langkah-langkah berikut merupakan prosedur. ELISA konvensional:(i) protein FIX diencerkan dalam buffer pelapis 1× dengan konsentrasi dari 0 hingga 200 nM, (ii) diblokir dengan 2% BSA, (iii) pengenceran 1:1000 antibodi FIX ditambahkan, (iv) 1:1000 pengenceran anti-IgG-HRP anti-tikus ditambahkan, (v) substrat untuk HRP ditambahkan dan diukur pada 405 nm.
APTES-GNP-FIX (metode 1):(i) pelat PS diaktifkan oleh 1% KOH, (ii) 2,5% APTES ditambahkan ke pelat ELISA di RT selama 5 h, (iii) 25% dari 15 nm yang diterima GNP ditambahkan dan disimpan pada 4 °C semalaman, (iv) FIX dengan konsentrasi dari 0 hingga 200 nM diizinkan untuk mengikat secara independen ke permukaan GNP, (v) permukaan yang tersisa diblokir oleh 2% BSA, (vi) 1:1000 pengenceran antibodi FIX ditambahkan, (vii) 1:1000 pengenceran anti-IgG-HRP anti-tikus ditambahkan, (vii) substrat untuk HRP ditambahkan dan diukur pada 405 nm.
APTES-GNP premixed FIX (metode 2):(i) pelat PS diaktifkan oleh 1% KOH, (ii) 2,5% APTES ditambahkan pada RT selama 5 h, (iii) premix 25% larutan GNP 15 nm dengan konsentrasi berbeda dari FIX (diinkubasi pada RT selama 30 min; 0 hingga 200 nM) diimobilisasi pada permukaan yang dimodifikasi APTES, (iv) permukaan yang tersisa diblokir oleh 2% BSA, (v) 1:1000 pengenceran antibodi FIX ditambahkan, (vi) pengenceran 1:1000 anti-IgG-HRP ditambahkan, (vii) substrat untuk HRP ditambahkan dan diukur pada 405 nm.
Deteksi FIX dalam Serum Manusia dan Setelah Spiking FIX
Untuk mendeteksi FIX dalam serum manusia, kami mencampur serum dengan GNP alih-alih FIX di sini. Pengenceran serum dari 20 hingga 1280 dititrasi dan dicampur dengan GNP untuk mengevaluasi deteksi FIX. Kondisi dan konsentrasi eksperimen lain digunakan, mirip dengan eksperimen sebelumnya.
Eksperimen spiking dilakukan dengan memasukkan konsentrasi FIX (0 hingga 8 nM) yang berbeda ke dalam pengenceran serum manusia yang dioptimalkan dan dicampur dengan GNP sebelum imobilisasi pada pelat ELISA. Kondisi dan konsentrasi eksperimental lainnya digunakan seperti pada eksperimen sebelumnya.
Fabrikasi Permukaan Elektroda Interdigitasi
Proses fabrikasi permukaan elektroda interdigitasi (IDE) meliputi pembersihan wafer, pertumbuhan lapisan oksida, pelapisan spin photoresist negatif, pola photoresist, pengendapan logam aluminium, penghilangan photoresist, dan pemotongan wafer. Proses dimulai pada wafer buffered oxide etchant yang dibersihkan diikuti dengan oksidasi pada silikon wafer (310 nm) pada suhu tinggi (1000 °C), kemudian dilakukan proses etching menggunakan aluminium. Fotoresist negatif diendapkan oleh spin coater dengan kecepatan putaran 2000 rpm. Resistansi dikembangkan oleh RD-6 setelah terpapar sinar UV (240 s). Kemudian, aluminium 240 nm diendapkan oleh evaporator termal (Edwards Auto 306) pada 3.0E−5 Torr. Photoresist dilucuti menggunakan aseton sampai muncul IDE padat, kemudian dipotong-potong untuk membuat IDE tunggal. Akhirnya, lapisan seng oksida dilapiskan di atas untuk imobilisasi biomolekuler terakhir [31]. Sebelum melanjutkan dengan pemasangan seng oksida, permukaan penginderaan awalnya dicuci dengan 1 M kalium hidroksida (pH 9.0).
Deteksi FIX pada Permukaan yang Dimodifikasi GNP
Setelah pengoptimalan dan konfirmasi efisiensi deteksi FIX dengan substrat ELISA yang dimodifikasi GNP, modifikasi permukaan yang sama dilakukan pada permukaan IDE untuk melengkapi deteksi di atas. Awalnya, permukaan seng oksida IDE dimodifikasi dengan amina dengan menambahkan 2,5% APTES yang diencerkan dalam etanol selama 3 jam di RT. Setelah itu, permukaan dicuci dengan etanol lima kali, dan ditambahkan premix GNPs (25%) dan FIX. Kemudian, permukaan yang tersisa diblokir oleh etanolamin, dan antibodi FIX ditambahkan berikutnya untuk mendeteksi FIX. Perubahan seiring dalam sinyal saat ini diperhatikan. Untuk memeriksa batas deteksi, konsentrasi FIX yang berbeda dicampur secara independen dengan GNP, diimobilisasi pada permukaan IDE yang dimodifikasi amina, dan kemudian dideteksi oleh antibodi; batas deteksi ditentukan dengan perhitungan 3σ. Kelimpahan FIX dalam serum manusia yang diencerkan yang dicampur dengan GNP diimobilisasi pada permukaan IDE yang dimodifikasi amina dan kemudian dideteksi oleh antibodinya. Pembuatan permukaan di atas mengikuti seperti yang dinyatakan sebelumnya [31].
Hasil dan Diskusi
Pretreatment pada Permukaan PS ELISA
Imobilisasi efektif protein atau antibodi pada permukaan ELISA polistiren (PS) tampaknya meningkatkan batas deteksi interaksi target-probe. Metode imobilisasi yang berbeda telah digunakan untuk perlekatan protein atau antibodi pada pelat ELISA. Dalam karya ini, kami memperkenalkan permukaan ELISA yang dimodifikasi secara kimia dengan GNP untuk imobilisasi protein atau antibodi. Kami ingin menggunakan salah satu faktor pembekuan penting, seperti faktor IX (FIX), yang telah banyak dilaporkan penting [32,33,34,35,36]. Gambar 1 menunjukkan representasi skema dari imobilisasi protein pada permukaan ELISA polistirena. Pertama, permukaan ELISA diaktifkan oleh 1% KOH. Dengan tidak adanya pretreatment KOH, jumlah molekul APTES yang akan terikat pada permukaan PS menjadi minimal. Hal ini karena kurangnya gugus penerima ikatan polar dan hidrogen, yang memfasilitasi adsorpsi awal APTES pada polimer [11]. Setelah perlakuan KOH, permukaan dimodifikasi dengan amina dengan konsentrasi APTES yang sesuai untuk menangkap GNP.
Karakterisasi GNP
Sebelum melangkah lebih jauh, kami mengkarakterisasi GNP yang diterima (15 nm) dengan pengukuran optik, morfologi, dan distribusi ukuran. Gambar 2a menampilkan analisis spektrofotometri UV-Vis dari GNP, yang tampaknya menampilkan puncak maksimum pada 550 nm. Pengamatan mikroskop elektron transmisi menunjukkan ukuran GNP menjadi ~ 15 nm dan bentuknya bagus (Gbr. 2b dan inset). Analisis spektroskopi inframerah transformasi Fourier dilakukan dari bilangan gelombang 500 sampai 4000 cm
−1
(Gbr. 2c). Puncak tunggal yang tampak pada 1650 cm
−1
diperhatikan untuk emas bersama dengan puncak kecil lainnya, sedangkan keberadaan puncak untuk gugus amina mewakili perlekatan APTES. Dukungan lebih lanjut diberikan oleh distribusi volume dan analisis potensi zeta. Berdasarkan analisis ini, distribusi volume menunjukkan bahwa ada sedikit variasi dalam distribusi ukuran (Gbr. 2d) dan potensi zeta adalah 6,9, mewakili stabilitas GNP yang digunakan dalam penelitian ini (Gbr. 2e).
Karakterisasi nanopartikel emas. Dilakukan dengan ukuran optimal 15 nm. a Analisis spektrofotometri UV-Vis. Sebuah puncak tunggal yang menonjol ditemukan pada 550 nm. b Pengamatan mikroskop elektron transmisi. Gambar inset menunjukkan gambar diperbesar. Bilah skala ditampilkan. c Analisis spektroskopi inframerah transformasi Fourier. Posisi puncak yang jelas untuk emas dan NH2 ditunjukkan. d Analisis distribusi volume GNP. Distribusi yang diperoleh ditampilkan. e analisis potensial Zeta. Nilai yang ditemukan adalah 6,9
Persiapan dan Optimalisasi Permukaan Amina untuk Menangkap GNP
Jumlah APTES sangat mempengaruhi imobilisasi GNP atau antibodi pada permukaan PS. Secara umum, molekul APTES yang sangat padat memiliki kemungkinan menghasilkan hasil positif palsu. Karena APTES telah digunakan dari 1 hingga 2% untuk melumpuhkan antibodi di beberapa permukaan sensor, di sini, kami melakukan titrasi dari 1,25 hingga 5% APTES, yang disiapkan dalam etanol absolut. Selanjutnya, tujuan kami adalah melumpuhkan GNP pada permukaan yang dimodifikasi APTES. Ada kemungkinan jumlah GNP yang lebih tinggi menghasilkan efek crowding, sehingga GNP dengan 25, 50, atau 100% 15 nm diuji pada permukaan yang dimodifikasi APTES untuk mengoptimalkan pengenceran yang sesuai. Pada permukaan yang dimodifikasi ini, 250 nM FIX terdeteksi dengan antibodi FIX. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 2a dan b, 1,25% APTES menunjukkan absorbansi optik (OD) yang lebih rendah dengan semua pengenceran GNP (25, 50, dan 100%), sedangkan APTES 2,5 dan 5% menunjukkan absorbansi yang lebih tinggi dengan 50 dan 100% GNP. Pada saat yang sama, rasio signal-to-noise ditingkatkan dengan meningkatnya konsentrasi APTES dan GNP (Gbr. 3a, b). APTES 5% dengan GNP 50 dan 100% menunjukkan pengikatan nonspesifik, dan GNP 50 dan 100% dengan APTES 2,5% menunjukkan absorbansi yang serupa. Berdasarkan nilai yang diperoleh ini, kami memilih 2,5% APTES dan 25% pengenceran GNP untuk eksperimen lebih lanjut.
Menentukan jumlah APTES dan GNP. Tiga konsentrasi berbeda (1,25, 2,5, dan 5%) dari APTES digunakan dengan tiga pengenceran GNP (25, 50, dan 100%). a Deteksi visual FIX setelah menambahkan substrat. Jalur kontrol tanpa FIX disertakan. b Representasi grafis dari level APTES yang optimal. 2,5% APTES dan 25% GNP ditemukan optimal
Penentuan ukuran GNP potensial
Setelah optimasi pengenceran APTES dan GNP, selanjutnya kami mengevaluasi ukuran GNP yang sesuai. Karena luas permukaan memainkan peran penting dalam imobilisasi protein, di sini, kami mencoba melumpuhkan tiga ukuran GNP yang berbeda, termasuk 10, 15, dan 80 nm. Ukuran GNP yang berbeda memiliki luas permukaan yang berbeda dan muatan yang berbeda untuk menarik protein, dan kemampuan pengikatan pada permukaan yang dimodifikasi APTES juga berbeda. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4a, FIX 250 nM terdeteksi dengan permukaan ELISA yang dimodifikasi dengan GNP 10, 15, dan 80 nm. Ditemukan bahwa GNP 15 dan 80 nm menunjukkan absorbansi 0,4 (OD) yang hampir sama untuk mendeteksi FIX 250 nM, tetapi GNP berukuran 10nm hanya menunjukkan 0,34 OD. Dari eksperimen ini, kami mengonfirmasi bahwa GNP 15 atau 80 nm cocok untuk eksperimen lebih lanjut, dan kami melanjutkan dengan GNP 15 nm.
a Menentukan ukuran GNP yang ideal. Di antara 10, 15, dan 80 nm, 15 dan 80nm menunjukkan hasil yang serupa. Lima belas nanometer digunakan untuk menentukan batas deteksi dengan FIX. b Eksperimen kontrol untuk mendeteksi FIX. Tiga eksperimen kontrol yang berbeda (C1—tanpa antibodi FIX; C2—tanpa IgG anti-tikus; C3—tanpa FIX) dilakukan. Tidak ada sinyal signifikan yang ditemukan di salah satu eksperimen kontrol. Sisipan gambar menampilkan hasil visual
Strategi eksperimental untuk mengonfirmasi nonfouling dan kinerja tinggi
Sebelum mendeteksi FIX pada permukaan ELISA yang dimodifikasi GNP, kami melakukan tiga jenis eksperimen kontrol yang berbeda seperti yang dijelaskan di bagian “Bahan dan Metode”. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4b, kami tidak dapat mengamati absorbansi yang signifikan dalam sumur untuk percobaan kontrol 1, 2, dan 3 (C1, C2, dan C3). Pada percobaan khusus (S), tingkat absorbansi yang lebih tinggi jelas terkait dengan perubahan warna yang tampak. Dalam kasus C1, kami tidak menambahkan antibodi FIX, yang menegaskan bahwa antibodi FIX secara khusus berinteraksi dengan FIX (dalam S). Tidak ada sinyal yang dapat diamati yang ditemukan tanpa adanya IgG anti-tikus di C2, yang memberikan penjangkaran lebih lanjut untuk interaksi yang tepat dari FIX dan antibodi yang diikuti oleh IgG anti-tikus. Di C3, dengan tidak adanya FIX, kami tidak dapat mengukur absorbansi yang signifikan. Dari hasil ini, interaksi yang tepat dari FIX dengan antibodinya pada permukaan ELISA dikonfirmasi tanpa ikatan nonspesifik.
ELISA Berbantuan GNP vs. ELISA Konvensional:Penentuan Sensitivitas
Setelah melakukan eksperimen kontrol, kami mendeteksi FIX dengan permukaan yang dimodifikasi GNP dan membandingkan hasilnya dengan metode ELISA konvensional. Kami melakukan tiga eksperimen berbeda untuk mendeteksi FIX. Pertama, GNP diimobilisasi pada permukaan yang dimodifikasi APTES, dan kemudian FIX dilekatkan ke permukaan GNP melalui interaksi elektrostatik. Karena interaksi elektrostatik, sebagian besar protein memiliki kemungkinan untuk mengikat ke permukaan GNP; dengan cara itu, kita bisa melumpuhkan FIX pada permukaan ELISA PS. Imobilisasi protein juga tergantung pada muatan yang timbul dari asam amino dan GNP. Gopinath dkk. [37] telah membuktikan pengikatan FIX yang kuat pada permukaan GNP, dan mereka juga menemukan bahwa FIX stabil dalam kondisi garam tinggi. Pada metode kedua, GNP dan protein terlebih dahulu dicampur sebelum diimobilisasi pada permukaan ELISA PS yang diaminasi. Diharapkan lebih banyak protein dapat mengikat dengan cara ini, karena ada kemungkinan lebih tinggi bahwa molekul protein dapat mengikat ke permukaan GNP dalam keadaan larutan. Solusi premixed kemudian bergerak pada permukaan amina yang dimodifikasi APTES. Metode ini dibandingkan dengan metode ELISA konvensional. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5a, ketika kami mentitrasi konsentrasi FIX dari 0 hingga 200 nM, ELISA konvensional (metode 1) menunjukkan batas deteksi 6 nM. Metode APTES-GNP-FIX (metode 2) menampilkan batas deteksi 200 pM, yang sensitivitasnya lebih dari 30 kali lebih tinggi dibandingkan dengan ELISA konvensional. Peningkatan sensitivitas dicapai melalui orientasi yang tepat dari sejumlah besar antigen yang diimobilisasi pada pelat ELISA PS, dan pada akhirnya lebih banyak antibodi akan berinteraksi. Dalam penelitian ini, nanopartikel emas digunakan untuk melumpuhkan lebih banyak antigen melalui modifikasi amina pada pelat ELISA. Dalam ELISA konvensional, antigen secara langsung diimobilisasi pada pelat ELISA, yang mengarah pada jumlah molekul yang lebih sedikit yang mengikat pada permukaan dan menyebabkan sensitivitas yang berkurang dibandingkan strategi yang dimediasi nanopartikel emas saat ini. Selain itu, resonansi plasmon permukaan yang terlokalisasi memberikan peningkatan sensitivitas lebih lanjut, seperti yang diungkapkan dalam penelitian dengan GNP. Ketika kami menggabungkan GNP dengan FIX, seperti yang diharapkan, batas deteksi sangat ditingkatkan dan mencapai level 100 pM, yang merupakan sensitivitas 60 kali lebih tinggi daripada ELISA konvensional. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5a, dapat dilihat dengan jelas bahwa ketika kami menggunakan GNP untuk imobilisasi protein, absorbansi maksimum mencapai ~ 0,6 untuk protein yang dicampur dan diimobilisasi langsung pada permukaan GNP, tetapi absorbansi yang ditemukan dengan ELISA konvensional adalah ~ 0,4 menggunakan konsentrasi yang sama (200 nM) dari FIX. Bahkan dengan konsentrasi lain, metode 3 menunjukkan perbedaan absorbansi yang lebih tinggi dibandingkan dengan ELISA konvensional, dan ini juga cukup tinggi daripada metode 2. Dalam kasus ELISA konvensional, deteksi yang terlihat ditemukan dari 25 nM, dan dari 3 nM dalam metode 2. Dengan metode 3, kita dapat melihat perubahan warna dari 200 pM FIX karena absorbansi yang lebih tinggi (Gbr. 5a). Absorbansi dijenuhkan pada 25 nM dalam metode 3. Karena kami dapat memvisualisasikan perubahan warna dari 200 pM FIX, kami mengevaluasi batas deteksi dan dititrasi menggunakan konsentrasi FIX yang lebih rendah. Jelas bahwa batas deteksi mencapai 100 pM saat kami mencampur GNP dan FIX (Gbr. 5b).
a Membandingkan sensitivitas FIX dalam ELISA yang dimodifikasi GNP dengan ELISA konvensional. FIX dititrasi dari 0,2 hingga 200 nM. ELISA konvensional menunjukkan batas deteksi 6 nM. Pada ELISA yang dimodifikasi GNP, sinyal diamati hingga 200 pM. Gambar inset menampilkan hasil visual. b Batas deteksi FIX pada pelat ELISA yang dimodifikasi GNP. FIX dititrasi dari 25 hingga 100 pM. Batas deteksi ditemukan 100 pM. Sisipan gambar menampilkan hasil visual
Deteksi FIX dalam Serum Manusia dan Enhancement dengan Spiking FIX
Sejak FIX ditemukan memainkan peran penting dalam kaskade pembekuan [38, 39], setelah memeriksa batas deteksi, kami juga mendeteksi FIX dalam serum manusia. Untuk analisis ini, kami melakukan titrasi serum manusia dalam kisaran antara pengenceran 1:1280 dan 1:20. Serum yang diencerkan dicampur dengan GNP dan diimobilisasi pada permukaan ELISA yang dimodifikasi APTES, seperti yang dinyatakan di atas. Jelas bahwa FIX terdeteksi dari pengenceran serum 1:640, yang setara dengan FIX 125 pM (Gbr. 6a). Serum manusia yang sehat biasanya mengandung sekitar 87 nM FIX, bersama dengan protein utama lainnya seperti albumin dan globulin. Dengan strategi kami, kami mencapai batas deteksi spesifik 125 pM dalam serum manusia, yang berguna untuk mengidentifikasi cacat pembekuan darah. Di sisi lain, ketika kami menambahkan FIX dari 1 ke 8 nM ke dalam pengenceran 1:640 serum manusia, ini menunjukkan peningkatan absorbansi yang secara bersamaan meningkat dengan konsentrasi FIX (Gbr. 6b).
a Deteksi FIX dalam serum manusia. Serum manusia diencerkan dari 1:20 menjadi 1:1280. FIX terdeteksi dalam serum manusia yang diencerkan 1:640 (gambar di dalam menunjukkan representasi skema). b Spiking FIX (0,125 hingga 8 nM) ke dalam pengenceran 1:640 serum manusia. Dengan peningkatan konsentrasi FIX, absorbansi meningkat. Sisipan gambar menampilkan hasil visual
Deteksi GNP-FIX pada Permukaan IDE:Analisis Komplementasi
Karena ditemukan bahwa FIX terkonjugasi GNP meningkatkan batas deteksi, kami menerapkan strategi serupa menggunakan sensor elektrokimia dengan permukaan IDE untuk melengkapi temuan ini. Kami mentitrasi FIX dari 25 hingga 200 pM (dicampur dengan GNP), melumpuhkannya pada permukaan IDE yang dimodifikasi amina, dan kemudian mendeteksinya dengan antibodi FIX. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 7a, dengan peningkatan konsentrasi FIX, level saat ini juga meningkat secara bersamaan dari baseline. Tingkat FIX jenuh dari 200 pM, dan batas deteksi ditemukan menjadi 25 pM. Deteksi ini ditingkatkan empat kali lipat dibandingkan dengan ELISA (100 pM). Selain itu, deteksi FIX dibuktikan dalam serum manusia yang diencerkan (Gbr. 7b). Untuk percobaan ini, serum manusia diencerkan dari 1:80 menjadi 1:1280. Seperti yang ditunjukkan pada gambar, pengenceran 1:1280 (kurva merah) menunjukkan perbedaan yang nyata dari garis dasar (kurva hitam) dengan estimasi 3σ, menunjukkan bahwa deteksi nyata FIX dari serum manusia dengan pengenceran 1:1280 cocok dengan hasil dari ELISA (terdeteksi pada 1:640). Deteksi dari IDE dengan pengenceran yang lebih rendah menunjukkan peningkatan sensitivitas.
a Limit of detection of FIX-conjugated GNP on IDE sensing surface. FIX was titrated from 25 to 400 pM. The limit of detection was found to be 25 pM. b Detection of FIX in human serum on the IDE sensing surface. Human serum was diluted from 1:80 to 1:1280. FIX was detected in human serum diluted 1:1280
Conclusion
Efficient immobilization of protein or antibody on the PS ELISA surface is a crucial step to improve the limit of detection. Here, we introduced a new and easy protein immobilization strategy on the PS ELISA surface assisted by GNPs. Two different methods were used:one is the direct immobilization of FIX on the GNP-modified surface, and another one is premixing of FIX with GNPs before attachment. It was found with the former method that improvement of the limit detection is 30-fold higher compared with the conventional ELISA. The latter method showed a 60-fold improved limit of detection compared to the conventional ELISA. We also demonstrated the detection of FIX in 1:650 diluted human serum, which is equivalent to 125 pM. Obviously, these strategies proved that the higher binding of proteins on the ELISA surface was able to improve the sensitivity and to be useful for detecting a wide range of biomarkers on the ELISA surface.
Ketersediaan Data dan Materi
All of the data are fully available without restriction.
