Her2-Fungsionalisasi Emas-Nanoshelled Magnetic Hybrid Nanoparticles:Agen Teranostik untuk Pencitraan Modal Ganda dan Terapi Fototermal Kanker Payudara

Bahan dan Metode

Materi

Poli (asam laktat-ko-glikolat) (PLGA, penghentian asam karboksilat, laktida:glikolida 50:50, Mw 24,000–38,000), polialilamin hidroklorida (PAH, Mw 17,500), dan asam tetrakloroaurat (III) trihidrat (HAuCl ₄ ·3H₂ O) diperoleh dari Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd. (Shanghai, Cina). Nanopartikel besi oksida superparamagnetik berlapis asam oleat (OA-SPIOs) dengan diameter rata-rata 10 nm dibeli dari Shanghai So-Fe Biomedicine Co., Ltd. (Shanghai, Cina). Perfluorooctyl bromide (PFOB), polivinil alkohol (PVA, 87–89% mol terhidrolisis, berat molekul rendah), 1-(3-dime-thylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC), dan N -hidroksisuksinimida (NHS) diperoleh dari Aladdin Chemistry Co., Ltd. (Shanghai, Cina). Poli (etilena glikol) yang diakhiri dengan karboksil (SH-PEG-COOH, Mw 2000) dan antibodi anti-Her2 berlabel fluorescein isothiocyanate (FITC) diperoleh dari Xi'an Ruixi Biological Technology Co., Ltd. (Xi'an, China ) dan Abcam (Cambridge, MA, USA), masing-masing. Semua reagen lain yang digunakan adalah kelas analitis.

Persiapan PFOB/SPIOs@PLGA NP

PFOB/SPIOs@PLGA NP dibuat dengan menggunakan metode penguapan pelarut emulsi minyak/air yang diadaptasi [24, 30]. Secara singkat, SPIO berlapis asam oleat dalam heksana (0,5 mL, 20 mg/mL) ditambahkan ke metilen klorida (3,6 mL) yang melarutkan PLGA (100 mg) dan PFOB (60 μL). Fase organik yang dihasilkan ditambahkan tetes demi tetes ke dalam larutan berair PVA pra-pendingin (20 mL, 2%, w /v ). Selanjutnya, sistem diemulsi selama 2 menit menggunakan sonikasi probe dalam penangas air es di bawah pengaturan amplitudo keluaran 80%. Setelah itu, emulsi diaduk pada suhu kamar selama 5  jam, kemudian disentrifugasi (16.000 rpm, 5 min, 15 °C, Avanti J-25, Beckman Coulter), dan dicuci dua kali dengan air deionisasi (DI) untuk mendapatkan PFOB/SPIOs@ NP PLGA.

Persiapan PFOB/SPIOs@PLGA@Au NP

Pertama, NP emas yang distabilkan sitrat dengan diameter rata-rata 5 nm disiapkan seperti yang dilaporkan sebelumnya [21]. Sementara itu, suspensi PFOB/SPIOs@PLGA NPs (1 mL) dicampur dalam larutan PAH (1,0 mg/mL dalam 0,5 mol/L larutan NaCl) selama 30 min, diikuti dengan sentrifugasi (15.000 rpm, 10 min, 15 °C ) dan dicuci dua kali dengan air DI. Kemudian, campuran ditambahkan dalam suspensi NP emas yang distabilkan sitrat (100 ml) dan diaduk selama 30 min. Setelah langkah sentrifugasi/pencucian berulang, NP Au yang dilapisi PFOB/SPIOs@PLGA NP didispersikan kembali ke dalam HAuCl₄ larutan (2 mL, 1% w /v ) di bawah pengadukan magnet. Selanjutnya, larutan hidroksilamin hidroklorida yang baru disiapkan (NH₂ OH·HCl, 0,3 mL, 0,5 mol/L) ditambahkan untuk mereduksi HAuCl₄ untuk membentuk Au nanoshells pada permukaan PFOB/SPIOs@PLGA NPs.

Persiapan NP Her2-GPH

Larutan berair PFOB/SPIOs@PLGA@Au NPs yang disiapkan (1 mL, 1 mg/mL) dicampur dengan SH-PEG-COOH (5 mg) dan diaduk pada suhu kamar selama 12 h. Setelah sentrifugasi (16.000 rpm, 20 min, 15 °C) dan pencucian dua kali, endapan didispersikan dalam phosphate buffer saline (PBS). Selanjutnya, EDC (10 mg) dan NHS (10 mg) dimasukkan dan diaduk pada suhu kamar selama 2 jam untuk mengaktifkan gugus asam karboksil dari NP pegilasi, dan NP yang diaktifkan (NP GPH) kemudian diperoleh dengan sentrifugasi/pencucian berulang. Langkah. Setelah itu, antibodi anti-Her2 dengan label FITC (10 μL, 0,38 mg/mL) ditambahkan ke dalam dispersi NP yang diaktifkan dan dibiarkan diinkubasi selama 90 min dalam shaker isotermal. Akhirnya, antibodi bebas dihilangkan dengan langkah sentrifugasi/pencucian untuk mendapatkan PFOB/SPIOs@PLGA@Au NP yang difungsikan Her2 (NP Her2-GPH).

Karakterisasi

Struktur permukaan dan morfologi NP Her2-GPH dicirikan oleh mikroskop elektron pemindaian emisi lapangan (FE-SEM, Hitachi S-4800, Tokyo, Jepang). Mikroskop elektron transmisi resolusi tinggi (TEM, JEM-2100; JEOL, Tokyo, Jepang) digunakan untuk mengkonfirmasi struktur internalnya dengan mencelupkan sampel pada kisi-kisi Cu berlapis karbon. Spektroskopi sinar-X dispersif energi (EDS) sampel yang sesuai (tanpa proses sputtering emas) dilampirkan ke TEM untuk menganalisis komposisi unsur NP yang dihasilkan. Ukuran hidrodinamik dan potensi zeta dari NP Her2-GPH diukur menggunakan instrumen hamburan laser dinamis (DLS) (Zetasizer Nano ZS3690; Instrumen Malvern, Malvern, Inggris). Spektrum serapan UV-tampak dari zat pada tahap persiapan yang berbeda diperoleh dengan spektrofotometer UV-tampak (Beckman Coulter DU 730, USA). Jumlah elemen Au dan Fe dalam NP Her2-GPH dievaluasi dengan spektroskopi emisi atom plasma yang digabungkan secara induktif (ICP-AES, Vistampxicp Varian, USA).

Pengukuran Kinerja Fototermal

Kinerja fototermal NP Her2-GPH dievaluasi melalui pemantauan peningkatan suhu di bawah iradiasi laser NIR. Konsentrasi yang berbeda dari larutan berair NP Her2-GPH (50, 100, 150, 200 μg/mL) disinari oleh laser 808 nm (1 W/cm ² ) selama 10 min dalam kuvet kuarsa (volume total 1 mL), dan suhu larutan diukur dengan kamera termal FLIR A300 setiap 10 s. Untuk menilai stabilitas fototermal agen, spektrum penyerapan bahan diperoleh sebelum dan sesudah proses iradiasi. Air DI disinari di bawah kondisi yang sama untuk perbandingan.

Budaya Sel

Karsinoma payudara manusia Garis sel SKBR3 (sel SKBR3) yang mengekspresikan Her2 secara berlebihan dan garis sel MDA-MB-231 kanker payudara manusia (sel MDA-MB-231) Her2 yang mengekspresikan rendah berasal dari Institut Biokimia dan Biologi Sel (Shanghai, Cina). Mereka dikultur dalam medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco (DMEM, Gibco Life Technologies, Grand Island, NY, USA) yang mengandung 20% ​​serum janin sapi (FBS) dan 1% penisilin-streptomisin. Semua sel ditumbuhkan pada lingkungan 37 °C dan 5% CO₂ .

Uji Sitotoksisitas In Vitro

Sitotoksisitas in vitro dari NP Her2-GPH dievaluasi dengan tes penghitungan sel-8 (CCK-8, Dojindo Molecular Technologies Inc., Jepang) pada sel SKBR3 dan MDA-MB-231. Kedua jenis sel diunggulkan masing-masing dalam pelat 96-sumur dengan kepadatan 1 × 10 ⁴ per sumur dan diinkubasi selama 24 jam. Setelah menghilangkan media kultur, sel diperlakukan dengan konsentrasi yang berbeda (0, 10, 20, 50, 100, 200 μg/mL) NP Her2-GPH dan selanjutnya diinkubasi selama 12 atau 24 h. Kemudian, larutan CCK-8 (10 μL CCK-8 dalam 100 μL DMEM) ditambahkan dan diinkubasi selama 2 h tambahan. Terakhir, densitas optik (OD) masing-masing sumur diukur menggunakan pembaca pelat mikro (Thermo Scientific Multiskan MK3) pada panjang gelombang 450 nm.

Studi Penargetan Khusus Reseptor In Vitro

Mikroskopi Pemindaian Laser Confocal

Sel SKBR3 dan MDA-MB-231 disepuh dalam cawan kultur sel dasar kaca (Φ = 20 mm) pada kerapatan 2 × 10 ⁴ sel/sumur selama 24 jam, dan kemudian dibagi menjadi tiga kelompok, masing-masing, termasuk kelompok non-target, kelompok target, dan kelompok penghambatan yang ditargetkan. Dua jenis sel sebagai kelompok non-target diperlakukan dengan 100 μL GPH NP, dan sel-sel dalam kelompok yang ditargetkan diperlakukan dengan 100 μL Her2-GPH NPs. Dalam kelompok penghambatan yang ditargetkan, sel-sel diinkubasi dengan antibodi anti-Her2 gratis (20 μL) selama 30  menit sebelum diobati dengan NP Her2-GPH. Setelah inkubasi masing-masing 30 menit, sel-sel dicuci tiga kali dengan PBS, difiksasi dengan paraformaldehida 4% selama 15 menit. Kemudian sel diwarnai dengan zat pewarna nukleus (DAPI; Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) selama 10 menit dan dicuci lagi dengan PBS. Terakhir, sel diamati menggunakan laser scanning confocal microscopy (LSCM) (Leica TCS SP5 II, Leica Microsystems Ltd., Mannheim, Jerman).

Flow Cytometry

Sel SKBR3 dan MDA-MB-231 dikultur dan diperlakukan seperti dijelaskan di atas, dan pengelompokannya konsisten dengan uji LSCM. Semua sel dicerna dengan tripsin dan kemudian disuspensikan kembali dalam PBS sebelum flow cytometry (FCM) dengan kepadatan 2 × 10 ⁵ sel per tabung. Intensitas fluoresensi sel ditentukan oleh flow cytometer (FC500MCL, Beckman Coulter, Fullerton, CA). Sel SKBR3 dan MDA-MB-231 digunakan sebagai kontrol kosong untuk mengatur gerbang. Kemudian, tegangan dan kompensasi fluoresensi FL1 disesuaikan untuk memastikan bahwa fluoresensi spontan sel berada dalam 10 ¹ dari histogram fluoresensi. Setelah menginkubasi sel dengan NP, penyimpangan intensitas fluoresensi dari kelompok kosong mencerminkan tingkat pengikatan NP ke sel. Semua eksperimen dilakukan dalam rangkap tiga.

In Vitro US Imaging dan Analisis Kuantitatif

Pencitraan Ultrasound Solusi In Vitro

Pencitraan ultrasound larutan in vitro dari NP Her2-GPH dilakukan menggunakan unit Sistem Ultrasound Mylab Twice (Esaote SpA, Genova, Italia). NP Her2-GPH didispersikan dalam air DI yang dihilangkan gasnya ke dalam konsentrasi yang berbeda (0,1, 0,5, 1, 1,5, 2 mg/mL) dan disuntikkan ke dalam tabung Eppendorf (2 mL), dan kemudian tabung itu direndam dalam tangki air ultra murni. Ultrasonografi dilakukan menggunakan transduser LA522 dalam mode skala abu-abu dua dimensi (2D) dan mode peningkatan kontras di bawah parameter berikut:indeks mekanis (MI) = 0,01 dan rentang frekuensi 3–9 MHz. Gambar diperoleh dari penampang memanjang tabung dan direkam untuk analisis kuantitatif Kurva Intensitas Waktu (TIC) menggunakan perangkat lunak QontraXt V3.06.

Pencitraan Sel Kanker Payudara AS yang Ditargetkan

Sel SKBR3 dan sel MDA-MB-231 dikultur dalam pelat 6-sumur dengan kepadatan 2 × 10 ⁶ /well selama 24 jam, dan mereka dibagi menjadi tiga kelompok, termasuk kelompok kontrol, kelompok non-target, dan kelompok sasaran. Sel-sel dalam kelompok yang tidak ditargetkan dan kelompok yang ditargetkan diperlakukan dengan NP GPH (100 μg/mL) dan NP Her2-GPH (100 μg/mL) masing-masing selama 30 mnt. Selanjutnya, sel-sel dicuci dengan PBS, dicerna, dan didispersikan kembali dalam tabung reaksi dengan PBS (0,5 mL). Gel agarosa (1%) disiapkan dalam piring kaca 20 mL. Untuk mensimulasikan efek pencitraan ultrasound yang ditargetkan dari NP pada permukaan sel, suspensi sel dalam enam kelompok tabung reaksi diekstraksi secara terpisah dengan jarum suntik 1 mL dan perlahan-lahan disuntikkan ke dalam gel agar. Pencitraan dilakukan menggunakan transduser SL3116 dalam mode skala abu-abu (gain = 70%; frekuensi tengah = 22 MHz; MI = 0.06). Setelah pemindaian, wilayah yang diminati (ROI) di setiap kelompok gambar ultrasound digambar. Nilai skala abu-abu dari setiap ROI dianalisis secara kuantitatif menggunakan perangkat lunak analisis gambar (DigSubAna; Universitas Shanghai Jiao Tong, Shanghai, Cina) untuk mengevaluasi efek pencitraan ultrasound yang ditargetkan dari NP Her2-GPH.

Pencitraan MR In Vitro dan Analisis Kuantitatif

T ₂ Pengukuran dan Pencitraan MR NP Her2-GPH

Pencitraan MR dari NP Her2-GPH dan pengukuran relaksivitas dilakukan menggunakan sistem 0,5 T (Shanghai Niumag Corporation ransum NM120-Analyst). NP Her2-GPH disuspensikan dalam air DI pada berbagai konsentrasi Fe (0, 0,005, 0,01, 0,02, 0,04, 0,08 mM), dan T ₂ -Gambar MR tertimbang dari sampel diperoleh menggunakan urutan spin-echo (TR = 2000 ms; TE = 100 ms; ketebalan irisan = 3 mm; FOV = 3 × 3 cm). Waktu relaksasi melintang (T ₂ ) proton air dari larutan berair NPs juga diukur, dan relaksivitas transversal (r ₂ ) ditentukan melalui penyesuaian kurva 1/T ₂ (s ⁻¹ ) versus konsentrasi Fe (mM).

Pencitraan MR Target Sel Kanker Payudara

Pengelompokan dan pengobatan sel SKBR3 dan MDA-MB-231 konsisten dengan uji pencitraan AS yang ditargetkan. Setelah inkubasi dengan NP GPH non-target (100 μg/mL) atau NP Her2-GPH yang ditargetkan (100 μg/mL) selama 30 min, sel dicuci dengan PBS, dicerna, dan didispersikan dalam xanthan gum (1 mg/mL) . Semua sampel dipindai menggunakan urutan spin-echo dengan parameter yang sama seperti yang dijelaskan di atas. ROI setiap gambar ditentukan untuk analisis kuantitatif intensitas sinyal dengan perangkat lunak image J.

Evaluasi PTT Bertarget In Vitro

Untuk memvisualisasikan efek PTT yang ditargetkan dari NP Her2-GPH, sel SKBR3 disepuh dalam cawan kultur sel dasar kaca (Φ = 20 mm) pada kepadatan 1 × 10 ⁵ sel / sumur selama 24 h, dan mereka dibagi menjadi lima kelompok masing-masing, termasuk kelompok kontrol DMEM dengan atau tanpa iradiasi laser, kelompok bahan yang ditargetkan dengan atau tanpa iradiasi laser, dan bahan yang tidak ditargetkan dengan iradiasi laser. Kelompok yang ditargetkan diperlakukan dengan dispersi DMEM yang mengandung NP Her2-GPH (100 μg/mL) selama 30 menit dan kelompok yang tidak ditargetkan diobati dengan NP GPH (100 μg/mL) pada kondisi yang sama. Sel dalam kelompok penyinaran laser disinari dengan laser NIR (808 nm, 1 W/cm ² ) selama 10 menit dan selanjutnya diinkubasi pada 37°C selama 2 jam. Kemudian, viabilitas sel dinilai menggunakan kit uji sel hidup/mati (Life Technologies, Grand Island, NY). Akhirnya, gambar sel yang diwarnai diperoleh dengan LSCM. Untuk mengukur sitotoksisitas fototermal, sel SKBR3 (1 × 10 ⁴ per sumur) disepuh di piring 96-sumur dan diinkubasi selama 24 jam. Pengelompokannya konsisten dengan yang di atas, dan viabilitas sel diuji dengan uji CCK-8. Untuk mengevaluasi lebih lanjut secara kuantitatif sitotoksisitas fototermal dari NP Her2-GPH di bawah konsentrasi dan iradiasi laser yang berbeda. Sel-sel diinkubasi dengan dispersi DMEM yang mengandung NP Her2-GPH dengan konsentrasi yang berbeda (0, 50, 100, 150, 200 μg/mL). Setelah dicuci dengan PBS (10 mM, pH 7.0), sel disinari dengan laser NIR (808 nm, 1 W/cm ² ) selama 10 menit dan selanjutnya diinkubasi selama 2 jam. Kemudian viabilitas sel juga ditentukan dengan uji CCK-8. Hasil ditampilkan sebagai mean ± standar deviasi (n = 4).

Untuk mensimulasikan ekspresi heterogen Her2 dalam jaringan tumor payudara, kami melakukan kultur bersama sel SKBR3 dan sel MDA-MB-231 dalam proporsi yang berbeda (0:100%, 25:75%, 50:50%, 75:25%, 100 :0%). Semua sel diperlakukan dengan Her2-GPH NPs (200 μg/mL) selama 30 min, dan disinari dengan laser NIR (808 nm, 1 W/cm ² ) selama 10 menit. Setelah inkubasi lebih lanjut selama 2 jam, viabilitas sel dianalisis dengan uji CCK-8. Hasil ditampilkan sebagai mean ± standar deviasi (n = 4).

Analisis Statistik

Data kuantitatif dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi (mean ± SD). Perbedaan statistik antara beberapa kelompok ditentukan dengan analisis varians (ANOVA), dan data dari dua sampel independen dibandingkan dengan menggunakan t Student tes. P < 0,05 dianggap perbedaan yang signifikan secara statistik. Analisis statistik dilakukan menggunakan SPSS v17.0 (IBM, Armonk, NY, USA).

Hasil dan Diskusi

Karakterisasi

PFOB/SPIOs@PLGA NP dibuat melalui proses penguapan pelarut emulsi minyak/air. Gambar SEM (Gbr. 2a) mengungkapkan bahwa NP PFOB/SPIOs@PLGA memiliki morfologi sferis yang seragam dan permukaan yang halus. Seperti yang ditunjukkan pada TEM (Gbr. 2b), ada perbedaan yang jelas dari kerapatan elektronik antara inti dan cangkang NP PFOB/SPIOs@PLGA, menunjukkan enkapsulasi PFOB di dalam NP. Selain itu, seperti yang digambarkan pada gambar sisipan dengan perbesaran yang lebih tinggi, keberadaan SPIO ditunjukkan sebagai bintik abu-abu yang dalam di cangkang dan wilayah inti PFOB cair dari PFOB/SPIOs@PLGA NPs. Diameter rata-rata NP PFOB/SPIOs@PLGA adalah sekitar 248,3 nm dengan indeks polidispersitas 0,037, dan potensi zeta kira-kira 14.7 mV menurut pengukuran DLS. Oleh karena itu, NP PFOB/SPIOs@PLGA dapat dengan mudah menyerap PAH bermuatan positif sehingga selanjutnya dapat menempelkan nanopartikel Au bermuatan negatif dengan ukuran rata-rata 5–7 nm, yang digunakan sebagai benih untuk nukleasi pertumbuhan kulit nano emas di sekitar permukaan PFOB /SPIOs@PLGA NP melalui prosedur seeding.

Karakterisasi NP Her2-GPH. a SEM (skala = 2 μm) dan b Gambar TEM (skala = 200 nm) dari PFOB/SPIOs@PLGA NP; c SEM (skala = 1 μm) dan d Gambar TEM (skala = 100 nm) dari NP Her2-GPH; e Gambar pemetaan elemen EDS menunjukkan distribusi elemen C, O, Fe, F, Br, dan Au dalam NP Her2-GPH

NP Her2-GPH disiapkan dengan menghubungkan antibodi anti-Her2 ke PFOB/SPIOs@PLGA@Au NP melalui SH-PEG-COOH. Dalam proses ini, teknologi karbodiimida klasik digunakan untuk mengaktifkan gugus asam karboksilat dari PEGylated PFOB/SPIOs@PLGA@Au NPs dan mempromosikan ikatan kovalen gugus amino dengan antibodi [31]. Seperti yang diilustrasikan dalam gambar SEM dan TEM (Gbr. 2c, d), NP Her2-GPH mempertahankan morfologi sferis yang terdefinisi dengan baik dengan permukaan kasar, dan NP Au padat dengan diameter puluhan nanometer dapat terlihat jelas di permukaan NP, yang menunjukkan keberhasilan fabrikasi kulit nano emas. Pemetaan elemen EDS (Gbr. 2e) dan hasil analisis elemen (Gbr. 3a) dari NP Her2-GPH dengan jelas mengungkapkan sejumlah besar elemen Au dan adanya elemen Fe, F, dan Br, yang menunjukkan keberhasilan enkapsulasi SPIO dan PFOB dan pembentukan nanoshell Au. Selain itu, kandungan elemen Au dan Fe dalam NP Her2-GPH dievaluasi masing-masing menjadi 67,71 ± 7.34% berat dan 2.13 ± 0,52% berat oleh ICP-AES.

Karakterisasi NP Her2-GPH. a analisis elemen EDS NP Her2-GPH; b Spektrum penyerapan UV-Vis dari NP Her2-GPH pada tahap persiapan yang berbeda; c Distribusi ukuran dan d Potensi zeta dari NP Her2-GPH

Selain itu, spektrum penyerapan UV-Vis dari NP Her2-GPH pada tahap persiapan yang berbeda juga diperiksa (Gbr. 3b). PFOB / SPIOs @ PLGA NP tidak menunjukkan puncak penyerapan yang jelas dalam kisaran 400 hingga 800 nm sementara Au NP menunjukkan puncak resonansi plasma sekitar 520 nm. Baik PFOB/SPIOs@PLGA@Au NPs dan NP Her2-GPH menunjukkan puncak luas yang berkelanjutan mulai dari 600 hingga 900 nm (wilayah NIR) karena benih Au yang terpasang tumbuh cukup besar melalui proses penyemaian ke cluster. Spektrum penyerapan yang luas di wilayah NIR memastikan NP Her2-GPH dapat beroperasi sebagai penyerap foto untuk terapi fototermal NIR. Lebih lanjut, dibandingkan dengan NP PFOB/SPIOs@PLGA, NP Her2-GPH memiliki distribusi ukuran yang meningkat sebesar 282,3 nm dengan indeks polidispersitas 0,18 (Gbr. 3c). Dan potensi zeta adalah 31.3 mV (Gbr. 3d), yang menyiratkan stabilitas yang baik.

Pengukuran Kinerja Fototermal

Efek konversi fototermal dari larutan NP Her2-GPH dievaluasi di bawah iradiasi laser NIR (808 nm, 1 W/cm ² ), dan variasi suhu dipantau dengan kamera pencitraan termal IR setiap 10 s. Setelah 10  menit penyinaran laser, warna pencitraan termal dari berbagai konsentrasi larutan NP Her2-GPH berubah, menandakan bahwa suhu meningkat dengan meningkatnya konsentrasi NP Her2-GPH (Gbr. 4a). Pengukuran suhu fototermal konsisten dengan data pencitraan. Dapat diamati bahwa suhu larutan NP meningkat dengan meningkatnya waktu pemaparan dan konsentrasi (Gbr. 4b). Secara rinci, kenaikan suhu larutan NP Her2-GPH adalah 18,5 °C pada konsentrasi 0,2 mg/mL, sedangkan untuk air DI hanya naik 1,2 °C. Untuk membunuh sel kanker, suhu harus dinaikkan ke kisaran suhu hipertermia (40-47 °C) menurut penelitian sebelumnya [32]. Namun, karena kehilangan termal in vitro, peningkatan suhu sekitar 10 °C tidak cukup untuk menginduksi kematian sel [33]. NP Her2-GPH dapat meningkatkan suhu sekitar 18 °C pada konsentrasi yang relatif rendah, sehingga berpotensi untuk membunuh sel kanker dengan cara hipertermia. Selanjutnya, untuk memverifikasi stabilitas fototermal NP Her2-GPH, spektrum serapan NIR UV-tampak sampel dikumpulkan sebelum dan sesudah iradiasi laser. Dan spektrum penyerapan hampir tidak berubah sebelum dan sesudah paparan laser (Gbr. 4c), memastikan NP Her2-GPH dapat berfungsi sebagai penyerap foto yang efisien untuk PTT kanker.

Efek fototermal dari NP Her2-GPH. a Gambar termal NIR dan b variasi suhu NP Her2-GPH pada konsentrasi yang berbeda, setelah iradiasi oleh laser NIR (808 nm, 1 W/cm ² ,10 menit); c Spektrum serapan UV-Vis-NIR sebelum dan sesudah uji iradiasi fototermal

Uji Sitotoksisitas In Vitro

Telah diketahui dengan baik bahwa biokompatibilitas NP adalah salah satu perhatian utama dalam aplikasi biomedis dan harus ditentukan terlebih dahulu. Jadi, uji CCK-8 digunakan untuk mengevaluasi sitotoksisitas NP Her2-GPH pada sel kanker payudara MDA-MB-231 dan SKBR3, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5a dan b. Dibandingkan dengan kontrol, kelangsungan hidup sel MDA-MB-231 dan SKBR3 yang diobati dengan NP Her2-GPH tetap lebih dari 90% pada konsentrasi mulai dari 10 hingga 200 μg/mL selama 24 h, menunjukkan sitotoksisitas rendah dan biokompatibilitas yang baik dari menghasilkan NP, yang dapat memastikan keamanannya untuk eksperimen sel dan studi klinis lebih lanjut.

Viabilitas sel a MDA-MB-231 dan b Sel SKBR3 pada dosis berbeda dari NP Her2-GPH (0, 10, 20, 50, 100, 200 μg/mL) selama 12 h dan 24 h (data dinyatakan sebagai mean ± SD, n = 4)

Studi Penargetan Khusus Reseptor In Vitro

Mikroskopi Pemindaian Laser Confocal

Fluorescein isothiocyanate (FITC) banyak digunakan sebagai probe fluoresensi hijau untuk deteksi kekebalan dan dapat dengan mudah mengikat beberapa jenis antibodi monoklonal. Jadi, kami memilih antibodi anti-Her2 berlabel FITC, dan hubungan NP dengan antibodi dapat diamati lebih visual dengan uji imunofluoresensi. Untuk memverifikasi pengikatan antibodi anti-her2 ke NP GPH, NP GPH dan NP Her2-GPH ditempatkan di piring (Φ = 20 mm) untuk analisis CLSM. Seperti yang diilustrasikan pada Gambar. 6, NP Her2-GPH dan NP GPH dapat diamati dengan jelas di bidang terang. NP GPH tidak menunjukkan sinyal fluoresensi, sedangkan NP Her2-GPH menunjukkan fluoresensi hijau terang di FITC dan saluran gabungan, yang mengkonfirmasi keberhasilan konjugasi antibodi anti-her2 dengan NP GPH.

Gambar mikroskopis confocal NP Her2-GPH dan NP GPH di bidang terang, fluoresensi FITC, dan saluran gabungan (bar skala = 5 μm)

Kami menggunakan LSCM untuk mengkonfirmasi spesifisitas penargetan NP Her2-GPH in vitro. Seperti dapat dilihat dari Gambar. 7, dibandingkan dengan kelompok non-target (b), sel SKBR3 yang diinkubasi dengan NP Her2-GPH yang ditargetkan (a) menunjukkan sinyal fluoresensi hijau terang pada permukaan membran sel, menunjukkan NP yang membawa antibodi Her2 dapat secara efektif mengikat sel-sel Her2-positif [34]. Untuk mengamati dengan jelas distribusi NP Her2-GPH dalam sel SKBR3, kami menyediakan gambar cerah (a1), gambar fluoresensi FITC (a2), gambar nuklir (a3), dan gambar overlay (a4). Karena waktu inkubasi NP yang singkat, mereka terutama didistribusikan pada permukaan membran sel dan dikumpulkan menjadi bintik-bintik hitam. Dalam studi kompetisi, ada sinyal fluoresensi yang dapat diabaikan ketika sel SKBR3 diberi pra-perawatan dengan antibodi anti Her2 bebas berlebih dan kemudian diinkubasi dengan NP Her2-GPH (Gbr. 7c). Hasil ini menunjukkan bahwa perilaku penargetan NP Her2-GPH dimediasi reseptor dan dapat diblokir oleh antibodi anti-Her2 bebas yang berlebihan [26]. Selain itu, sedikit fluoresensi terdeteksi dalam sel MDA-MB-231 yang diobati dengan NP Her2-GPH dalam kondisi yang sama (Gbr. 7d), yang menegaskan bahwa NP Her2-GPH secara khusus mengikat sel SKBR3 yang mengekspresikan reseptor Her2 secara berlebihan.

Gambar mikroskopis confocal dan hasil flow cytometry dari sel SKBR3 yang diinkubasi dengan NP Her2-GPH yang ditargetkan (a /a1 –a4 , e ) dan NP GPH yang tidak ditargetkan (b , f ), sel SKBR3 bebas antibodi Her2 yang telah diobati sebelumnya yang diinkubasi dengan NP Her2-GPH (c , g ), dan sel MDA-MB-231 yang diinkubasi dengan NP Her2-GPH (d , h ). a1 gambar bidang terang; a2 gambar saluran DAPI; a3 gambar saluran FITC; dan a4 gambar saluran yang digabungkan (bilah skala = 10 μm)

Flow Cytometry

Tingkat pengikatan NP Her2-GPH terhadap sel dinilai lebih lanjut secara kuantitatif melalui FCM. Seperti yang diilustrasikan dengan jelas pada Gambar. 7, tingkat pengikatan NP target ke sel SKBR3 (e) jauh lebih tinggi daripada sel MDA-MB-231 (h) (86% ± 3,72% vs 2,31% ± 0,36%, P < 0,001), menunjukkan kemampuan penargetan spesifik NP Her2-GPH ke sel Her2-positif. Selain itu, NP Her2-GPH memiliki sedikit pengikatan penargetan ke sel SKBR3 yang sebelumnya diobati dengan antibodi anti-Her2 bebas berlebih (Gbr. 7g), dan ada perbedaan yang signifikan antara kelompok penghambat yang ditargetkan dan kelompok yang ditargetkan (3,16% ± 0,41 % vs 86% ± 3,72%, P < 0,001). Berdasarkan hal di atas, hasil FCM memberikan bukti kuat lebih lanjut bahwa NP Her2-GPH memiliki kemampuan penargetan khusus untuk mengenali dan menggabungkan dengan sel SKBR3 yang mengekspresikan reseptor Her2 secara berlebihan dan perilaku penargetan dimediasi oleh reseptor.

In Vitro US Imaging dan Analisis Kuantitatif

Pencitraan Ultrasound Solusi In Vitro

Dalam penelitian kami, efek pencitraan AS dari larutan NP Her2-GPH dinilai secara in vitro di bawah mode yang berbeda menggunakan unit Sistem Ultrasound Mylab Twice. Diamati dari Gambar. 8a, tabung yang diisi dengan larutan NP Her2-GPH menampilkan gema bertitik yang kuat dalam mode skala abu-abu 2D dan CEUS. Sebaliknya, air DI ditampilkan sebagai gema. Selanjutnya, dengan meningkatnya konsentrasi NP Her2-GPH, sinyal peningkatan kontras ultrasound secara bertahap meningkat. Seperti yang diilustrasikan dalam TIC, intensitas sinyal rata-rata dari NP Her2-GPH secara bertahap meningkat ketika konsentrasi NP meningkat dan itu tetap sesuai dengan hasil CEUS. Agen pada konsentrasi 2 mg/mL memiliki sinyal peningkatan kontras yang secara signifikan lebih kuat daripada NP pada 0,1 mg/mL (82 ± 0.69 dB vs 27 ± 6.7 dB, P < 0.01), menunjukkan hamburan balik yang lebih kuat dihasilkan oleh konsentrasi NP yang lebih tinggi. Hal di atas menunjukkan bahwa NP Her2-GPH memiliki efek peningkatan kontras yang memuaskan secara in vitro dan peningkatan kontras tersebut bergantung pada konsentrasi. Selain itu, lamanya waktu pencitraan ultrasound NP Her2-GPH pada konsentrasi 2 mg/mL juga diselidiki (Gbr. 8b). NP Her2-GPH menunjukkan sinyal peningkatan kontras yang sangat baik sebelum 2 menit, dan intensitas sinyal secara bertahap menurun seiring berjalannya waktu. Namun, masih ada sinyal peningkatan yang jelas dalam waktu 5 menit, yang dapat memenuhi persyaratan ultrasonografi yang ditingkatkan kontras klinis. Gelembung mikro berisi gas konvensional seperti UCA dapat meningkatkan sinyal hamburan balik darah dengan osilasi non-linier di bawah ultrasound tetapi tidak cocok untuk evaluasi molekuler jaringan karena keterbatasannya dalam pencitraan intravaskular dan stabilitas yang buruk [35]. Dibandingkan dengan bahan pengisi gas, nanokapsul PLGA berisi fluorokarbon cair memiliki stabilitas akustik dengan waktu paruh sirkulasi yang lama [16]. Selain itu, penelitian kami sebelumnya menemukan bahwa nanoshell Au memiliki sifat refleksi yang baik karena nomor atom dan kepadatannya yang tinggi [36]. Oleh karena itu, kami menggabungkan sifat resonansi ultrasonik dari nanokapsul PLGA berisi PFOB dengan ekogenisitas besar dari nanoshells Au, yang secara mencolok meningkatkan sinyal hamburan balik NP Her2-GPH in vitro.

a Gambar ultrasonografi skala abu-abu (AS) dua dimensi (2D) in vitro dan ultrasound yang ditingkatkan kontras (CEUS) dan kurva intensitas waktu (TIC) NP Her2-GPH di bawah konsentrasi yang berbeda (0, 0,1, 1, 1,5, 2 mg/mL). b Gambar AS in vitro dari NP Her2-GPH (2 mg/mL) dengan berlalunya waktu

Pencitraan Sel Kanker Payudara AS yang Ditargetkan

Kemampuan pencitraan ultrasound yang ditargetkan dari NP Her2-GPH pada sel kanker payudara dievaluasi dalam mode skala abu-abu 2D menggunakan unit Sistem Ultrasound Mylab Twice. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 9a, baik sel yang diobati dengan NP dan sel kontrol menampilkan pita hyperechoic yang seragam dalam gel dengan batas yang jelas. Dapat diamati dengan jelas bahwa pita ekogenik sel SKBR3 yang diobati dengan NP Her2-GPH lebih terang dan lebih padat daripada sel SKBR3 yang tidak ditargetkan dan kontrol. Namun, tidak ada perbedaan sinyal gema yang signifikan yang diamati pada sel MDA-MB-231 yang diobati dengan NP yang ditargetkan atau tidak. Kami selanjutnya menghitung nilai skala abu-abu rata-rata gambar berdasarkan ROI yang ditentukan, dan hasilnya ditunjukkan pada Gambar. 9b. Nilai skala abu-abu sel SKBR3 yang diobati dengan NP Her2-GPH yang ditargetkan secara signifikan lebih tinggi daripada SKBR3 yang tidak ditargetkan dan kelompok kontrol (P < 0,01). Selain itu, sel SKBR3 yang diobati dengan NP Her2-GPH target menunjukkan nilai skala abu-abu yang lebih tinggi dibandingkan dengan sel MDA-MB-231 yang diobati dengan NP yang sama (P < 0,05). Hasil ini menunjukkan bahwa NP Her2-GPH dapat secara khusus mengikat sel SKBR3 Her2-positif dan memiliki potensi untuk meningkatkan efek pencitraan molekuler ultrasound dari sel yang ditargetkan.

a Pencitraan ultrasound in vitro dan b analisis nilai skala abu-abu dari sel MDA-MB-231 dan SKBR3 yang diobati dengan NP Her2-GPH yang ditargetkan atau NP GPH yang tidak ditargetkan. Sel MDA-MB-231 dan SKBR3 berfungsi sebagai kontrol (data dinyatakan sebagai mean ± SD, *P < 0,05, **P < 0.01, n = 3)

Pencitraan MR In Vitro dan Analisis Kuantitatif

T ₂ Pengukuran dan Pencitraan MR NP Her2-GPH

SPIO telah diselidiki secara intensif di T ₂ Pencitraan MR tertimbang karena kemampuannya untuk mempersingkat waktu relaksasi transversal dari proton air di sekitarnya, yang menghasilkan penurunan intensitas sinyal MR dan memungkinkan untuk memberikan peningkatan kontras negatif dari lesi target [37, 38]. T ₂ kemampuan pencitraan kontras NP Her2-GPH dengan berbagai konsentrasi Fe dievaluasi pada medan magnet 0,5 T. Gambar 10 a menampilkan tingkat relaksasi transversal (1/T ₂ ) dari proton air sebagai fungsi konsentrasi besi dalam larutan berair NP Her2-GPH. Dan relaksivitas (r ₂ ) dihitung berdasarkan kemiringan menjadi 441,47 mM ⁻¹ s ⁻¹ , yang lebih dari 2 kali lebih tinggi dari agen kontras pencitraan MR komersial berbasis SPIO Feridex (152 mM ⁻¹ s ⁻¹ ) di bawah kekuatan medan magnet yang sama [39]. Semakin tinggi T ₂ relaksivitas mungkin disebabkan oleh fakta bahwa agregasi SPIO di dalam matriks polimer menghasilkan ukuran NP magnetik yang relatif membesar dan meningkatkan interaksi magnetik [37, 40]. Selain itu, intensitas sinyal T ₂ -Pencitraan MR tertimbang secara bertahap menurun seiring dengan peningkatan konsentrasi zat besi (Gbr. 10b), yang selanjutnya menegaskan NP Her2-GPH memiliki kemampuan untuk T ₂ -pencitraan kontras MR berbobot.

Pencitraan MR in vitro. a Tingkat relaksasi melintang (1/T ₂ ) larutan berair NP Her2-GPH sebagai fungsi konsentrasi besi dalam medan magnet 0,5 T. b T ₂ -gambar MR tertimbang dari NP Her2-GPH dengan konsentrasi besi yang berbeda diperoleh menggunakan urutan spin-echo. c T ₂ -gambar MR berbobot dan d intensitas sinyal NP Her2-GPH (100 μg/mL) dan NP GPH (100 μg/mL) yang diinkubasi dengan sel MDA-MB-231 dan SKBR3. Sel MDA-MB-231 dan SKBR3 berfungsi sebagai kontrol (data dinyatakan sebagai mean ± SD, *P < 0,05, **P < 0.01, ***P < 0.001, n = 3)

Pencitraan MR Target Sel Kanker Payudara

Efek pencitraan MR yang ditargetkan dari NP Her2-GPH pada sel SKBR3 dan MDA-MB-231 dikonfirmasi oleh in vitro T ₂ -pencitraan MR tertimbang. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 10 c dan d, sel SKBR3 yang diobati dengan NP Her2-GPH yang ditargetkan menunjukkan peningkatan kontras negatif yang nyata, dan intensitas sinyal menurun sebesar 48% dibandingkan dengan sel kontrol (P < 0,001). Namun, intensitas sinyal MR dari sel SKBR3 yang diobati dengan NP GPH non-target menunjukkan sedikit pengurangan. Selain itu, intensitas sinyal sel MDA-MB-231 yang diberi label dengan NP Her2-GPH atau NP GPH tidak berubah secara signifikan dibandingkan dengan kelompok kontrol (P> 0,05). Lebih lanjut, sel SKBR3 yang diobati dengan NP Her2-GPH menunjukkan tingkat pengurangan intensitas sinyal yang lebih tinggi daripada sel MDA-MB-231 (P < 0.001), yang dapat digunakan untuk membedakan dua sel satu sama lain. Hasil di atas bersama-sama menunjukkan bahwa NP Her2-GPH dapat meningkatkan T ₂ -pencitraan MR tertimbang melalui serapan spesifik sel yang dimediasi reseptor [41].

Evaluasi PTT Bertarget In Vitro

Awalnya, pewarnaan calcein-AM/propidium iodide (PI) digunakan untuk mengevaluasi secara visual sitotoksisitas fototermal yang ditargetkan secara in vitro. Calcein AM, pewarna sel hidup non-fluoresen, dapat menembus membran sel dan terhidrolisis untuk menghasilkan pewarna calcein fluoresen hijau dalam sel hidup. Propidium iodida (PI) adalah noda sel mati, yang mengikat DNA sel mati untuk menghasilkan fluoresensi merah [33]. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 11a, tidak ada sel mati yang jelas ketika iradiasi laser NIR atau NP Her2-GPH digunakan secara terpisah, menunjukkan bahwa baik iradiasi laser maupun NP itu sendiri tidak sitotoksik. Demikian juga, sel yang diobati dengan NP GPH yang tidak ditargetkan dalam kombinasi dengan laser NIR menunjukkan sedikit kematian sel. Sebaliknya, sejumlah besar sel mati dapat diamati ketika NP Her2-GPH dirawat dengan adanya iradiasi laser, yang menunjukkan bahwa agen tersebut dapat menginduksi kematian sel hipertermik dengan menargetkan efek fototermal. Viabilitas sel selanjutnya dievaluasi secara kuantitatif dengan uji CCK-8. Seperti yang diilustrasikan pada Gambar. 11b, sel SKBR3 yang diobati dengan NP Her2-GPH dan iradiasi laser menunjukkan penurunan viabilitas sel (62 ± 4,56%) dibandingkan dengan kelompok kontrol (P < 0,001). Selanjutnya, di bawah iradiasi laser selama 10 menit, viabilitas sel kelompok NP Her2-GPH yang ditargetkan secara signifikan lebih rendah daripada kelompok yang tidak ditargetkan (38 ± 4,56% vs 87,6 ± 4,06%, P < 0.05).

Uji fototermal bertarget in vitro. a Gambar mikroskopis confocal dari sel SKBR3 yang diwarnai calcein-AM/PI dalam kelompok perlakuan yang berbeda (kelompok NP Her2-GPH, kelompok laser, NP GPH + kelompok laser, NP Her2-GPH + kelompok laser) (bilah skala = 100 μm). Sel SKBR3 berfungsi sebagai kontrol. b Viabilitas sel relatif sel SKBR3 dalam lima kelompok setelah pengobatan seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 11 a (data dinyatakan sebagai mean ± SD, *P < 0,05, ***P < 0.001, n = 4); c viabilitas sel sel SKBR3 yang diinkubasi dengan NP Her2-GPH pada konsentrasi yang berbeda (0, 50, 100, 150, 200 μg/mL) dengan atau tanpa penyinaran laser NIR (808 nm, 1 W/cm ² , 10 mnt) (data dinyatakan sebagai mean ± SD, *P < 0,05, ***P < 0.001, n = 4)

Selain itu, kami menggunakan uji CCK-8 untuk menilai lebih lanjut secara kuantitatif sitotoksisitas fototermal dari NP Her2-GPH pada berbagai konsentrasi. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 11c, viabilitas sel SKBR3 yang diobati dengan NP Her2-GPH tanpa iradiasi laser NIR tetap lebih dari 90%, sedangkan viabilitas sel yang disinari laser menurun secara signifikan dengan meningkatnya konsentrasi NP Her2-GPH. Hanya kurang dari 20% sel yang disinari laser tetap bertahan pada konsentrasi 200 μg/mL dibandingkan dengan sel yang tidak disinari laser pada konsentrasi yang sama (P < 0,001). Hasil ini lebih lanjut menegaskan bahwa konsentrasi NP Her2-GPH yang relatif rendah cukup untuk memberikan peningkatan suhu yang cukup untuk membunuh sel SKBR3.

Lebih lanjut, kami membiakkan sel SKBR3 dan MDA-MB-231 bersama dalam proporsi yang berbeda untuk mensimulasikan ekspresi heterogen Her2 dalam jaringan tumor payudara. Hasil penelitian menunjukkan bahwa total viabilitas sel setelah induksi fototermal NP Her2-GPH menurun dengan meningkatnya proporsi sel SKBR3, dan total viabilitas sel dari kelompok proporsi lainnya secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok sel SKBR3 100% ( P < 0.05) (File tambahan 1:Gambar S1). Selain itu, dengan adanya NP Her2-GPH selama 30 menit, total viabilitas sel setelah induksi dengan laser NIR secara signifikan lebih rendah daripada sel iradiasi non-laser (P < 0,05), kecuali untuk kelompok sel 100% MDA-MB-231. Secara bersama-sama, NP Her2-GPH dapat secara khusus mengikat sel SKBR3 dan memiliki potensi besar untuk menginduksi kematian sel kanker melalui efek fototermal. Kemungkinan mekanisme hipertermia fototermal untuk sel SKBR3 terutama disebabkan oleh paparan sel kanker pada suhu yang lebih tinggi, yang menghambat pertumbuhan dan proliferasi sel normal dengan mendenaturasi protein intraseluler [42].

Kesimpulan

NP Her2-GPH, agen theranostik yang difungsikan Her2 yang mengintegrasikan pencitraan US/MR dual-modal dan PTT yang ditargetkan telah berhasil dirancang, dibuat, dan diselidiki secara in vitro. Dengan konjugasi dengan antibodi anti-Her2, agen dapat mengenali atau mengikat sel SKBR3 kanker payudara yang mengekspresikan Her2 secara berlebihan dengan spesifisitas dan sensitivitas yang tinggi. Selain itu, melalui pemuatan bersama PFOB dan SPIO, dan konstruksi "struktur inti cangkang" PLGA Au-nanoshell, NP Her2-GPH yang dihasilkan memberikan peningkatan kontras yang sangat baik secara in vitro US dan T ₂ -pencitraan MR tertimbang. Lebih lanjut, pembentukan Au nanoshells memungkinkan agen tersebut berfungsi sebagai penyerap foto yang efisien untuk NIR PTT yang ditargetkan dalam sel kanker payudara. Hasil kami memberikan studi eksplorasi awal untuk integrasi diagnosis kolaboratif dan terapi adjuvant kanker payudara, dan studi lebih lanjut in vivo masih diperlukan.

Ketersediaan Data dan Materi

Kumpulan data yang dihasilkan dan dianalisis selama studi saat ini disertakan dalam artikel ini.

Singkatan

NP Au:

Nanopartikel emas

CCK-8:

Kit penghitung sel-8

DAPI:

4′,6-Diamidino-2-phenylindole

DI:

Dideionisasi

DLS:

Hamburan laser dinamis

DMEM:

Medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco

EDC:

Etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimida

EDS:

Spektroskopi sinar-X dispersif energi

FCM:

Aliran sitometri

FDA:

Administrasi Makanan dan Obat

FE-SEM:

Mikroskop elektron pemindaian emisi medan

FITC:

Fluorescein isothiocyanate

NP GPH:

Nanopartikel hibrida magnetik berlapis emas

Her2:

Reseptor faktor pertumbuhan epidermis manusia 2

HR-TEM (TEM):

Mikroskop elektron transmisi resolusi tinggi

Sel HUVEC:

Sel endotel vena umbilikalis manusia

ICP-AES:

Spektroskopi emisi atom plasma yang digabungkan secara induktif

LSCM:

Mikroskop confocal pemindaian laser

MRI:

Pencitraan resonansi magnetik

NIR:

Inframerah dekat

PAH:

Polialilamin hidroklorida

PFOB:

Perfluorooctyl bromide

PLGA:

Asam polilaktat-co-glikolat

PTT:

Terapi fototermal

PVA:

Alkohol polivinil

SPIO:

Nanopartikel oksida besi superparamagnetik

TIC:

Kurva intensitas waktu

UCA:

Agen kontras ultrasound

AS:

Pencitraan ultrasound

Double-Gated Nanohelix sebagai Superlattice Biner Tunable Novel Perilaku Adsorpsi Molekul Gas CH4 pada Monolayer MoX2(S, Se, Te):Studi DFT