Studi Awal pada Nanopartikel Seng Oksida Biodegradable yang Didoping dengan Fe sebagai Bentuk Potensi Pengiriman Besi ke Organisme Hidup
Abstrak
Besi adalah elemen penting untuk organisme hidup dan kekurangannya digambarkan sebagai gangguan nutrisi paling umum di seluruh dunia. Saat ini, strategi suplementasi zat besi yang lebih efektif dan aman baik untuk manusia maupun hewan menjadi salah satu tantangan terpenting dalam terapi defisiensi nutrisi. Studi in vivo kami sebelumnya mengkonfirmasi keamanan dan biodegradabilitas nanopartikel berbasis seng oksida yang diproduksi di rumah dan distribusinya yang cepat ke sebagian besar organ dan jaringan dalam tubuh. Pemeriksaan in vitro yang dilakukan pada garis sel Caco-2, model sel epitel saluran pencernaan, mengungkapkan toksisitas rendah dari bahan nano yang dipelajari. Dalam penelitian ini, kami menyelidiki nanopartikel seng oksida biodegradable yang didoping dengan Fe(III) sebagai strategi suplementasi perspektif untuk defisiensi besi. ZnO:Fe nanopartikel yang dapat terbiodegradasi secara intra-gastrik diberikan kepada tikus dewasa dan setelah 24 jam, hewan dikorbankan dengan pengumpulan organ internal untuk analisis lebih lanjut. Konsentrasi besi yang diukur dengan spektrometri serapan atom dan pewarnaan histologis (metode Perl) menunjukkan distribusi cepat nanopartikel yang didoping besi ke jaringan yang secara khusus terkait dengan homeostasis besi. Akumulasi besi juga terlihat di dalam hepatosit dan di sekitar pembuluh darah di dalam limpa, yang mungkin mengindikasikan transfer nanopartikel yang didoping Fe dari aliran darah ke jaringan. Dengan asumsi kembali, hasil awal yang diperoleh dalam studi saat ini menunjukkan bahwa nanopartikel ZnO biodegradable yang didoping dengan Fe mungkin merupakan pembawa besi eksogen yang baik dalam tubuh makhluk hidup. Oleh karena itu, penyelidikan selanjutnya fokus pada penentuan mekanisme yang tepat terkait dengan deposisi besi dalam jaringan dan pengaruh pembawa nanopartikel pada metabolisme besi diperlukan.
Pengantar
Besi merupakan salah satu komponen terpenting penyusun organisme hidup di muka bumi, termasuk populasi manusia. Pentingnya elemen ini terkait dengan peran penting zat besi dalam banyak struktur dan proses yang terjadi di dalam tubuh, mis. pengangkutan oksigen ke seluruh jaringan dan sel tubuh (bagian dari hemoglobin dan mioglobin), produksi energi (komponen protein rantai pernapasan mitokondria di dalam) masih banyak lagi [1, 2]. Dengan demikian, zat besi mengambil bagian dalam proses kehidupan penting sel dan seluruh organisme dan kekurangannya dapat menyebabkan gangguan yang signifikan dalam fungsi tubuh yang hidup.
Seperti laporan di seluruh dunia menunjukkan kekurangan zat besi menjadi masalah kesehatan masyarakat yang serius pada populasi manusia. Menurut WHO, hampir 30% masyarakat di seluruh dunia pernah terkena anemia pada tahun 1993-2005. Prevalensi anemia masih jauh lebih besar pada anak kecil dan ibu hamil [3]. Pentingnya suplementasi zat besi pada kehamilan terkait dengan fakta bahwa defisiensi zat besi merupakan faktor risiko untuk kelahiran prematur, berat badan lahir rendah pada neonatus, dan kondisi kesehatan yang lebih buruk secara umum [4]. Dalam kasus bayi dan anak-anak pra-sekolah, faktor risiko kekurangan zat besi disebabkan oleh pertumbuhan yang cepat dari seluruh tubuh dan konsumsi selanjutnya dari simpanan zat besi; oleh karena itu, suplementasi zat besi juga direkomendasikan untuk anak-anak berusia antara 0 dan 5 tahun [5]. Menariknya, ada laporan ilmiah yang menunjukkan korelasi tingkat zat besi yang tepat pada anak-anak dan perkembangan emosional dan neuropsikologis mereka [6]. Selain itu, kekurangan zat besi juga merupakan gangguan nutrisi yang serius di antara spesies mamalia lainnya, terutama pada anak babi yang menyusui, di mana pasokan elemen ini dalam kandungan yang terbatas ditambah dengan kandungan zat besi yang rendah dalam susu babi [7, 8]. Juga, pertumbuhan anak babi yang cepat dengan cepat menghabiskan sisa-sisa simpanan zat besi, karena dalam beberapa hari anak babi yang baru lahir menggandakan berat badannya, sehingga meningkatkan jumlah sel darah merah dan volume darah secara umum. Dengan demikian, strategi suplementasi zat besi yang lebih efektif dan aman saat ini baik untuk populasi manusia maupun hewan menjadi salah satu tantangan terpenting dalam pencegahan dan terapi defisiensi nutrisi.
Ada tiga cara utama pengiriman zat besi ekstra ke organisme hidup:intravena, intramuskular, dan oral. Masing-masing dari mereka menunjukkan keuntungan dan kerugian dari metode ini. Pemberian oral tampaknya sederhana dan lebih alami bagi tubuh, melibatkan jalur fisiologis penyerapan zat besi dan sistem transportasi. Juga, metode ini melestarikan sistem alami yang mengendalikan jumlah zat besi yang beredar dalam tubuh berdasarkan hepcidine [9]. Namun, rute suplementasi oral sering terganggu dengan penyerapan yang buruk dan efisiensi akhir yang rendah. Studi ilmiah juga melaporkan bahwa standar, strategi suplementasi zat besi oral yang larut sangat mempengaruhi komposisi dan aktivitas metabolisme mikrobioma usus hewan [10]. Di sisi lain, cara pemberian zat besi secara intravena atau intramuskular ke organisme terhambat oleh risiko efek samping toksik [11]. Selain itu, dalam peternakan babi industri, metode standar suplementasi zat besi berdasarkan individu, pemberian intramuskular dosis tunggal besi-dekstran menimbulkan stres bagi hewan dan menyusahkan bagi peternak. Selain itu, injeksi yang dilakukan secara tidak benar dapat menyebabkan peradangan dan komplikasi lain pada hewan, serta berkontribusi terhadap penyebaran berbagai penyakit dalam kawanan, jika kondisi kemandulan tidak diperhatikan.
Disebutkan di atas efek samping toksik dari pengiriman besi eksogen ke organisme hidup terkait dengan terjadinya unsur besi bebas dan tidak terikat dalam tubuh, yang sebagai logam transisi (melalui perubahan valensi) dapat menyebabkan produksi radikal bebas berbahaya (yaitu oksigen reaktif). spesies-ROS) melalui reaksi Fenton [12]. Laporan ilmiah menunjukkan risiko peningkatan kadar radikal bebas dalam organisme sebagai faktor yang berkontribusi terhadap berbagai kondisi termasuk:infeksi bakteri, neoplasia, atau penyakit hati [13]. Strategi fisiologis alami untuk mencegah pembentukan ROS oleh besi bebas didasarkan pada pengikatan elemen besi dengan protein tertentu pada setiap langkah jalur penyerapan dan transportasinya di dalam tubuh. Dalam kasus kelebihan zat besi oral dan pemberiannya secara intravena/intramuskular, jalur fisiologis sirkulasi zat besi umumnya berlebihan sehingga mengakibatkan peningkatan ROS yang cepat [14].
Nanopartikel berbasis besi (NP berbasis Fe) telah dipelajari secara luas sebagai alat yang menjanjikan untuk tujuan biomedis. Penggunaan paling luas dari struktur nano ini terkait dengan sifat magnetiknya; dengan demikian, mereka sebagian besar telah diuji sebagai agen kontras untuk teknik diagnostik klinis yang ditujukan untuk pencitraan tumor atau akumulasi pada jaringan tertentu [15]. Baru-baru ini, struktur nano juga telah dipelajari sebagai bentuk baru yang lebih efektif dari pengiriman zat bioaktif ke organisme. Pembawa NP dapat mengungkapkan bioavailabilitas yang sangat meningkat untuk organisme hidup, dibandingkan dengan zat dalam bentuk massal, yang sebagian besar terkait dengan ukurannya yang lebih kecil [16, 17]. Dalam salah satu penelitian, efektivitas NP yang mengandung zat besi dibandingkan dengan besi sulfat (suplemen standar untuk mengobati anemia) pada tikus anemia. Berdasarkan analisis darah, hasil yang diperoleh menunjukkan peningkatan bioavailabilitas zat besi setelah pemberian oral, dosis tunggal NP dengan zat besi pada hewan anemia. Dalam kasus beberapa dosis nanopartikel dan besi sulfat, hasil yang diperoleh serupa [18]. Studi lain menggambarkan hasil yang diperoleh dari nanomaterial berbasis Fe sebagai agen pengiriman besi alternatif pada manusia dan model hewan pengerat. Penulis secara khusus menekankan keamanan nanoFe yang lebih unggul dibandingkan dengan bentuk zat besi yang larut, yang mengakibatkan kurangnya akumulasi zat besi di mukosa usus dan promosi mikrobiota yang bermanfaat [19]. Demikian pula hasil yang menjanjikan diperoleh dalam penelitian pada tikus anemia yang diobati dengan NP berbasis Fe yang ditutup dengan vitamin C, yang memungkinkan untuk menghindari rute standar penyerapan Fe dari jalur gastrointestinal. Hasil yang diperoleh menunjukkan pemulihan hewan uji dari penyakit anemia bersama dengan peningkatan parameter darah mereka dalam waktu singkat, dibandingkan dengan metode standar terapi defisiensi besi [20].
Materi dan Metode
Sintesis Nanopartikel
Nanopartikel seng oksida yang didoping dengan besi (ZnO:Fe NPs) disintesis menggunakan teknik microwave hidrotermal. Metode sudah mapan, relatif murah, biofriendly dan skala industri, mampu pengenalan ion asing yang berbeda sebagai dopan fungsional [21,22,23,24,25], ke dalam berbagai oksida [26,27,28]. Konsentrasi besi dalam nanopartikel ini diatur ke 5% molar. Sintesis dilakukan mulai dari nitrat(V):Zn(NO3 )2 ·6H2 O (99%, Sigma–Aldrich) dan Fe(NO3 )3 ·9H2 O (96%, Carl Roth). Kami telah menguji berbagai pemasok dan memilih yang menawarkan produk paling seragam yang tidak mengandung sisa makanan yang tidak larut dalam kadar yang terukur. Senyawa dilarutkan dalam air suling:17,63 g seng nitrat(V) dan 1,25 g besi(III) nitrat(V). Larutan bening kemudian dialkalisasi menggunakan 25% larutan amonia berair (Carl Roth) hingga pH 8. Residu merah yang dihasilkan dicuci menggunakan corong Büchner, dengan ~ 1 l air suling dan disaring dengan suction. Endapan ditempatkan dalam bejana Teflon 100 ml, diisi air sampai volume 80% kemudian ditutup dalam ruang reaktor Ertec Magnum II. Proses hidrotermal gelombang mikro dilakukan pada 4 MPa selama 20 menit. Setelah reaksi, produk berwarna merah pucat dikumpulkan dan dikeringkan semalaman pada suhu 60 °C.
Karakterisasi Nanopartikel
Karakterisasi produk dilakukan dengan menggunakan scanning electron microscopy (SEM), spektroskopi photoluminescence (PL) dan cathodoluminescence (CL), dan energy dispersive elemental analysis (EDX). Pengukuran SEM dilakukan dengan mikroskop Hitachi SU-70 resolusi tinggi (1 nm), dilengkapi dengan detektor radiasi karakteristik dan sistem katodoluminesensi GATAN Mono CL3 dalam mode elektron sekunder (SE) dan transmisi (TE). Spektrum emisi fotoluminesensi dan eksitasi direkam menggunakan spektrofluorimeter Horiba/Jobin-Yvon Fluorolog-3, yang dilengkapi dengan lampu xenon sebagai sumber eksitasi dan photomultiplier Hamamatsu R928P. Dynamic light scattering (DLS) dan zeta potential diukur dengan sistem karakterisasi partikel DelsaMax Pro. Analisis termogravimetri (TGA) dilakukan dengan menggunakan termogravimeter Jupiter NETZSCH STA 449 F1 di bawah aliran argon. Pengukuran SEM dilakukan setelah deposisi nanopartikel pada 400 mesh tembaga berlapis polikarbonat Agar. Sampel disuspensikan dalam aquades menggunakan prosesor ultrasonik Sonics VCX500, kemudian suspensi tersebut diteteskan pada mesh dan dikeringkan. Sampel disiapkan setelah 2 jam sedimentasi partikel yang lebih berat.
Model In Vitro
Untuk penelitian saat ini, garis sel Caco-2 (sel adenokarsinoma usus besar Kaukasia) digunakan, sebagai model sel epitel saluran pencernaan. Garis sel diperoleh dari The European Collection of Authenticated Cell Cultures—ECACC (Sigma–Aldrich, Cat. No. 86010202). Sel diunggulkan pada 0,5 × 10
6
sel/ml ke piring 6-sumur atau 96-sumur dan dipertahankan dalam Dulbecco's Modification of Eagle's Medium—DMEM (Gibco), dilengkapi dengan 10% serum janin sapi—FBS (Gibco), 1% asam amino non-esensial—NEAA (Gibco ), 1% penisilin–streptomisin–neomisin—PSN (Gibco), dan 0,2% natrium bikarbonat (Gibco) pada 37 °C dan 5% CO2 . Ketika pertemuan 95-100% diamati, media kultur sel dihilangkan dan suspensi ZnO:Fe NP dalam media pertumbuhan segar ditambahkan. Sel diinkubasi dengan empat konsentrasi ZnO:Fe NPs yang berbeda (1,0; 0,1; 0,01; dan 0,001 mg ZnO:Fe NPs/ml) selama 24 jam pada 37 °C dan 5% CO2 .
Analisis Viabilitas Sel
Viabilitas sel dinilai untuk Caco-2 menggunakan dua metode:uji XTT dan pewarnaan biru Trypan. Semua reagen yang diperlukan untuk pengujian XTT disediakan dari kit komersial (Cell Proliferation Kit II, Roche). Setelah inkubasi sel yang ditumbuhkan pada pelat 96-sumur dengan konsentrasi ZnO:Fe NP yang berbeda, sel diinkubasi dengan campuran pelabelan XTT 50 μl selama 4 h pada suhu 37 °C dan 5% CO2 . Selanjutnya, konsentrasi formazan dinilai dengan metode spektrofotometri. Absorbansi diukur pada 470/650 nm dan hasilnya dikorelasikan dengan jumlah sel yang hidup. Pada percobaan berikutnya, hasil absorbansi tertinggi diasumsikan sebagai viabilitas sel 100%. Hasil akhir dihitung berdasarkan empat ulangan percobaan terpisah (n =4).
Untuk melakukan pewarnaan trypan blue, setelah sel-sel yang tumbuh pada pelat 6-sumur diinkubasi dengan konsentrasi ZnO:Fe NP yang berbeda, sel-sel dikumpulkan (0,05% tripsin dan 0,2% EDTA selama 10 min), disentrifugasi dan pelet kembali tersuspensi dalam medium pertumbuhan 1 ml. Seratus mikroliter larutan trypan blue 0,4% steril dicampur dengan 100 μl suspensi sel. Sepuluh mikroliter sampel dimuat pada slide penghitungan dan dianalisis menggunakan JuLi Br Couting Software (NanoEnTek) untuk menilai jumlah sel yang layak. Hasil akhir dihitung berdasarkan tiga ulangan percobaan terpisah (n =3).
Model Hewan
Untuk tujuan studi pendahuluan ini, tikus Balb-c jantan dewasa (n =6) secara individual disimpan di bawah kondisi hidup standar dan terkontrol (12/12-jam periode terang-gelap, 25 °C, kelembaban 30%) dengan makanan dan air standar (disediakan ad libitum). Semua prosedur diterima oleh Komite Etik Lokal, kesepakatan no. WAW2/59/2017. Setelah 7 hari aklimatisasi, suspensi ZnO:Fe NP dalam air (10 mg/ml; 0,3 ml/tikus) diberikan secara oral gavage (IG) ke hewan dari kelompok eksperimen (n =4) . Tikus dari kelompok kontrol menerima 0,3 ml air minum melalui IG (n =2). Selama percobaan, kami tidak melihat adanya perubahan perilaku pada hewan uji maupun kelainan jaringan. Setelah 24 jam, tikus dari kelompok eksperimen dan kontrol dikorbankan dalam CO2 -O2 chamber (CO2 Box, Bioscape, Merazet) dengan koleksi jaringan selanjutnya. Setengah dari sampel yang baru dikumpulkan dibekukan dalam suhu 20 °C untuk spektrometri serapan atom (AAS). Paruh kedua jaringan difiksasi dalam formalin buffer 4% dan dipindahkan ke etanol 70% (setelah 24 jam). Selanjutnya, sampel didehidrasi dalam peningkatan konsentrasi etanol, tertanam dalam parafin (Leica TP1020, Leica EG1150) dan 6-μm-tipis (atau 4 μm-tipis untuk pemeriksaan histopatologi) slide mikroskopis disiapkan dengan mikrotom (Leica RM2255).
Akumulasi Besi Dinilai dengan Pewarnaan Perl
Slide mikroskopi limpa, hati, dan otak diwarnai dengan metode Perl (biru Prusia) untuk mengetahui adanya besi. Sampel dideparafinisasi dan dihidrasi ulang menjadi air suling, kemudian ditempatkan dalam larutan kerja dengan bagian yang sama dari 5% kalium ferisianida (Sigma–Aldrich) dan 5% asam klorida (Sigma–Aldrich) dan diwarnai selama 30 menit. Selanjutnya, bagian-bagian dibilas dalam air dan diwarnai dengan warna merah cepat nuklir (Sigma-Aldrich) selama 5 menit, dibilas dalam air, dan dipasang di bawah kaca penutup dengan Permount (Fisher Scientific). Gambar sampel yang diwarnai diambil menggunakan mikroskop Olympus BX60 dan perangkat lunak akuisisi gambar Cell^P. Dari setiap sampel yang diuji, 16 gambar yang dipilih secara acak dipilih untuk pemeriksaan lebih lanjut dengan MicroImage v.4.0 (Olympus) sesuai dengan protokol analisis gambar di rumah [29]. Untuk pemeriksaan limpa, hanya pulpa merah di dalam jaringan yang diperhitungkan selama analisis. Kandungan besi dihitung sebagai rasio area dan intensitas noda besi-positif (warna biru) dengan area inti sel dalam gambar.
Konsentrasi Besi dalam Jaringan yang Diuji Diukur dengan Spektrometri Serapan Atom
Sebelumnya dikumpulkan, disimpan dalam -20 C, dan kemudian sampel jaringan yang dicairkan disiapkan untuk penilaian kuantitatif lebih lanjut dari konsentrasi besi dengan metode spektrometri serapan atom (AAS), sesuai dengan protokol yang dijelaskan secara rinci sebelumnya [24]. Secara singkat, jaringan ditimbang dan disimpan selama> 16 h dalam larutan yang mengandung 5 ml asam nitrat 65% dan 1 ml hidrogen peroksida 30% (Merck). Selanjutnya, sampel dimineralisasi dalam sistem microwave Ethos 900 (Milestone, USA) ke dalam larutan cair dan dievaluasi dengan AAS (Perkin-Elmer) untuk kandungan besi.
Analisis Statistik
Data yang diperoleh dalam penelitian ini disajikan sebagai mean ± standard error of mean (SEM). Untuk evaluasi statistik akumulasi besi yang diperoleh dengan pewarnaan Perl, ANOVA satu arah dengan uji post hoc perbandingan ganda Tukey-Kramer dilakukan untuk semua kelompok. Untuk mengevaluasi perbedaan yang signifikan antara kelompok kontrol dan eksperimen dari analisis AAS, t yang tidak berpasangan tes digunakan. Perbedaan yang signifikan antara kelompok kontrol dan eksperimen dalam percobaan in vitro dievaluasi menggunakan ANOVA satu arah dengan uji perbandingan ganda Dunnett. Analisis statistik dihitung dengan GraphPad InStat 3.10. Untuk semua tes, hasil yang diperoleh dianggap signifikan secara statistik dengan P 0,05 dan P 0,01 dan P 0,001 sebagai sangat dan sangat signifikan.
Hasil
Karakterisasi Nanopartikel
Scanning electron microscopy (SEM) gambar sebagai mengkristal dalam proses microwave hidrotermal ZnO:Fe nanocrystals ditunjukkan pada Gambar. 1. Serbuk kering yang disimpan setelah sintesis didispersikan dalam air menggunakan rendaman ultrasonik, dan kemudian disimpan pada tembaga 400 mesh. Suspensi yang dihasilkan dari perlakuan ultrasonik dibiarkan selama 2 jam untuk aglomerasi dan sedimentasi butiran besar. Pada sampel umumnya terlihat kristal ZnO berbentuk prisma heksagonal memanjang. Kristal memanjang ke arah pertumbuhan bidang-c—[001]. Perpotongan prisma terlihat jelas pada gambar:segi enam berukuran 50–100 nm. Pada dasarnya, nanopartikel diaglomerasi dan membentuk struktur yang lebih besar. Pada Gambar 1b, ditunjukkan struktur kristal ZnO:Fe yang sangat teraglomerasi dan berkelompok. Sampel juga terdiri dari butiran yang tidak seragam yang distribusi ukurannya mengandung antara ratusan nanometer dan mikrometer. Tidak ada indikasi yang jelas dari pemisahan selain keberadaan fase ZnO, menunjukkan tidak adanya kristalisasi fase berbasis besi (misalnya oksida besi) [30].
Memindai gambar mikroskop elektron ZnO:Fe NPs yang diendapkan pada jala tembaga setelah sedimentasi agregat besar. Pembesaran 100 kx (a ) dan 20 kx (b ). Suspensi yang mengandung 1 mg nanopartikel ZnO per mililiter air diteteskan pada mesh tembaga berlapis polikarbonat untuk memungkinkan pengamatan mikroskop pemindaian resolusi tinggi
Analisis termogravimetri (TGA) dan kalorimetri pemindaian diferensial (DSC) dilakukan di bawah aliran argon dari suhu kamar hingga 800 °C dan hasil yang diperoleh ditunjukkan pada Gambar. 2. Kehilangan massa pertama terjadi hingga 200 °C dan itu menyebabkan penurunan massa sampel sebesar 4,78% dibandingkan dengan massa awalnya. Kehilangan kedua tercatat antara 200 dan 400 °C dan nilainya sekitar 7,36%. Tidak ada penurunan massa lainnya hingga 800 °C. Yang pertama terkait dengan penguapan molekul air yang teradsorpsi di permukaan dan yang kedua kemungkinan disebabkan oleh reduksi gugus hidroksil. Kurva DSC menunjukkan puncak endotermik pada 118,3 °C (− 0,6175 mW/mg, penguapan air) dan puncak eksotermik pada 283,1 °C (0,4356 mW/mg, dekomposisi gugus hidroksil). Efek kecil terkait dekomposisi menunjukkan bahwa kristalisasi hampir penuh dari nanopartikel ZnO:Fe terjadi pada proses hidrotermal gelombang mikro.
TGA/DSC dari ZnO:Fe NP dipanaskan dalam argon
Gambar 3 menunjukkan spektrum fotoluminesensi suhu kamar ZnO:Fe NPs. Spektrum emisi (Gbr. 3a) terdiri dari dua fitur:pendaran sempit di dekat tepi pita (NBE) intensitas rendah dan pendaran emisi tingkat dalam (DLE) yang sangat intens. Yang pertama memuncak pada ~ 380 nm sedangkan yang kedua pada 600 nm. Dominasi intensitas DLE pada spektrum menunjukkan bahwa nanocrystals diperoleh sangat membelot pada tingkat kristalografi [31,32,33]. Spektrum eksitasi (Gbr. 3b) menunjukkan mekanisme emisi dari level dalam di celah pita ZnO:Fe.
Emisi fotoluminesensi (PL) (a , kecuali =260 nm) dan eksitasi (b , em =595 nm) spektrum ZnO:Fe NPs. Sampel dituangkan secara longgar ke dalam matriks aluminium kemudian diseimbangkan kembali untuk memungkinkan pengukuran PL. Urutan kedua dan lebih tinggi dari panjang gelombang eksitasi disaring dengan filter bandpass spektral
Spektrum katodoluminesensi ZnO:Fe NP ditunjukkan pada Gambar 4; Rasio intensitas DLE/NBE adalah 25. Puncak pita NBE pada ca. 380 nm, pita DLE berisi empat komponen yang memuncak pada ~ 570, 625, 653 nm dan sangat lemah pada 770 nm. Menurut McCluskey dan Jokela [34], pita 570-nm terkait dengan kekosongan oksigen, sementara yang lain ditugaskan untuk kekosongan seng dalam kisi tipe wurtzite [35].
Spektrum Cathodoluminescence (CL) dari ZnO:Fe NPs. Nanopowder kering dibuat pelet untuk mendapatkan spektrum CL yang berasal dari sampel dalam jumlah besar. Pita yang ditampilkan menggambarkan kuantitas dan kualitas cacat kristalografi yang ada pada nanokristal seng oksida
Kuantitas besi dalam sampel ditentukan dengan menggunakan dua teknik:spektroskopi serapan atom (AAS) dan spektroskopi sinar-X dispersif energi (EDX). Dalam kasus AAS, suspensi disiapkan sama seperti yang digunakan dalam percobaan hewan pengerat dianalisis untuk menunjukkan 3,98 % atom Fe dalam ZnO:Fe. Dengan metode EDX, serbuk kering dianalisa pada kasa tembaga untuk mendapatkan konsentrasi besi sebesar 4,5%at. dalam kaitannya dengan ion seng.
Sifat suspensi diukur menggunakan metode DLS dan TEM, dengan distribusi diameter nanopartikel ditunjukkan pada Gambar 5. Distribusi bimodal:untuk satu populasi, diameter yang paling sering mencapai puncak antara 20 dan 100 nm (TEM) serta antara 50 dan 200 nm (DLS). Populasi kedua berisi jumlah yang lebih rendah dari objek yang lebih besar 100-500 nm (TEM) dan ca. 150–500 nm (DLS). Karakter bimodal nanopartikel diamati dengan jelas oleh kedua metode yang ditunjukkan. Dispersi ukuran yang tinggi dalam populasi yang lebih besar menunjukkan bahwa itu sesuai dengan nanopartikel yang diaglomerasi. Statistik yang ditunjukkan untuk diameter di atas 100 nm menunjukkan banyak cara yang berbeda untuk aglomerasi nanopartikel ZnO:Fe. Nanopartikel dalam suspensi air bermuatan negatif seperti yang diungkapkan oleh potensial zeta di bawah 0 V. Nilai sekitar 40 mV juga menunjukkan bahwa suspensi air akhir stabil dan nanopartikel tidak memiliki afinitas untuk aglomerasi.
Distribusi jari-jari hidrodinamik nanopartikel yang diukur dalam suspensi air (titik) dan diambil langsung dari gambar TEM di sepanjang sisi nanokristal yang lebih pendek dan lebih panjang (lihat teks). Nanopartikel dipindahkan ke suspensi air dengan tanduk ultrasonik daya tinggi. Konsentrasi bahan kering adalah 1 mg per 1 ml air. Setelah sedimentasi selesai, sepuluh pengukuran mobilitas dilakukan untuk mendapatkan mobilitas yang kredibel vs plot diameter nanopartikel. Ukuran TEM diambil langsung dari gambar:sepanjang c sumbu (sisi kristal ZnO yang lebih panjang) dan sepanjang m dan a sumbu (sisi kristal yang lebih pendek)
Evaluasi In Vitro Toksikologis ZnO:Fe Nanopartikel
Kedua analisis viabilitas sel (XTT dan Trypan Blue) mengungkapkan penurunan absorbansi sel Caco-2 yang diinkubasi dengan ZnO:Fe NPs, yang secara langsung berkorelasi dengan jumlah sel yang layak. Perubahan signifikan secara statistik diamati hanya setelah paparan 24 jam sel yang diinkubasi ke konsentrasi tertinggi NP (1,0 dan 0,1 mg/ml), sedangkan tingkat fisiologis konsentrasi NP (0,01 dan 0,001 mg/ml) tidak berpengaruh signifikan pada kultur sel. (Gbr. 6 dan 7).
Viabilitas sel (jalur Caco-2) diuji dengan metode XTT. Sel diekspos selama 24 jam pada suspensi ZnO NP yang didoping dengan besi dalam konsentrasi yang berbeda sebagai berikut:0,001 mg/ml; 0,01 mg/ml; 0,1 mg/ml; dan 1 mg/ml. Hasil mewakili persentase rata-rata sel yang hidup (±SEM) untuk kelompok kontrol dan eksperimen (n =4). Perbedaan yang signifikan dari **P 0,01 vs. kontrol ditandai pada grafik
Viabilitas sel (garis Caco-2) diuji dengan pewarnaan Trypan blue. Sel diekspos selama 24 jam pada suspensi ZnO NP yang didoping dengan besi dalam konsentrasi yang berbeda sebagai berikut:0,001 mg/ml; 0,01 mg/ml; 0,1 mg/ml; dan 1 mg/ml. Hasil mewakili persentase rata-rata sel yang hidup (±SEM) untuk kelompok kontrol dan eksperimen (n =3). Perbedaan yang signifikan dari **P 0,01 vs. kontrol ditandai pada grafik
Distribusi Besi pada Model Hewan
Untuk menilai aksesibilitas besi in vivo dari ZnO:Fe NP, tikus (n =4) suspensi ZnO:Fe NP yang diterima secara oral dan setelah 24 jam, hewan diskarifikasi dengan pengumpulan lebih lanjut dari jaringan penting. Evaluasi kuantitatif kandungan besi dalam jaringan yang diperiksa dianalisis dengan metode AAS untuk semua organ yang dikumpulkan dan dihitung dengan perangkat lunak Micro Image (berdasarkan pewarnaan Perl) untuk jaringan hati, limpa, dan otak. Disajikan pada Gambar. 8, data menunjukkan peningkatan kadar zat besi (vs kontrol) di jantung, otot rangka, limpa, dan jaringan usus kecil 24 jam setelah pemberian oral ZnO:Fe NP (tidak ada peningkatan yang signifikan secara statistik). Dalam kasus tulang, tingkat rata-rata zat besi dalam kelompok eksperimen hanya sedikit lebih tinggi dari pada hasil kontrol. Kandungan zat besi di hati dan jaringan otak meningkat secara signifikan (P 0,01) 24 h setelah IG ZnO:Fe NP, vs. kelompok kontrol (Gbr. 8). Di ginjal, jaringan adiposa viseral dan subkutan, dan paru-paru, kadar Fe turun 24 jam setelah pemberian ZnO:Fe NPs.
Distribusi besi dalam jaringan yang dianalisis 24 jam setelah pemberian IG ZnO:Fe NPs. Data mewakili persentase rata-rata Fe dalam organ yang diuji dari kelompok eksperimen (n = 4) dibandingkan dengan kelompok kontrol (100%—garis horizontal). Kandungan besi dianalisis dengan AAS. Perbedaan yang signifikan dari **P 0,01 vs. kontrol
Evaluasi kandungan besi yang diwarnai dengan metode Perl di dalam hati menunjukkan hasil yang sangat signifikan (P 0,001 peningkatan kadar Fe pada semua hewan percobaan vs. kontrol (Gbr. 9b). Demikian pula, hasil yang diperoleh untuk pulpa merah jaringan limpa menunjukkan sangat signifikan (P 0,001 peningkatan kandungan besi pada semua hewan percobaan vs. kontrol (Gbr. 10b). Data yang diperoleh dari analisis jaringan otak menunjukkan tidak ada peningkatan Fe pada kelompok eksperimen 24 jam setelah IG ZnO:Fe NPs (Gbr. 11b).
Kandungan zat besi di hati dihitung dengan pewarnaan Perl dan perangkat lunak MicroImage. Hasil dihitung sebagai rasio area dan intensitas noda besi-positif terhadap area inti sel. Data disajikan sebagai hasil rata-rata (±SEM) untuk setiap hewan yang diperiksa (a ) dan sebagai nilai rata-rata (±SEM) untuk kelompok kontrol dan eksperimen (b ). Perbedaan signifikan dari *P 0,05, **P 0,01, dan ***P 0,001
Kandungan besi dalam pulp merah limpa dihitung dengan pewarnaan Perl dan perangkat lunak MicroImage. Hasil dihitung sebagai rasio area dan intensitas noda besi-positif terhadap area inti sel. Data presented as mean (±SEM) result for each, examined animal (a ) and as mean (±SEM) value for both control and experimental groups (b ). Significant difference of *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, and ***P ≤ 0.001
Iron content in the brain calculated with Perl’s staining and MicroImage software. Results calculated as a ratio of area and intensity of iron-positive stains to the area of cell nuclei. Data presented as mean (±SEM) result for each, examined animal (a ) and as mean (±SEM) value for both control and experimental groups (b )
In case of content of iron from each animal of experimental and control groups, results were collected at the Figs. 9a, 10a, and 11a. The highest and significantly different (P ≤ 0.05 and P ≤ 0.01) level of iron within liver tissue was detected for mice – 2 (24 h 2), comparing with results from control group (Fig. 9a). Levels of iron stains in red pulps of the spleen within the experimental group were similar; however, most of them were statistically higher (P ≤ 0.05 or P ≤ 0.01) than mice – 1 (CTRL 1) from the control group (Fig. 10a). Results obtained for brain tissue were similar between each animal from experimental and control groups (Fig. 11a).
Sections of liver and spleen tissues stained with Perl’s method were also qualitatively assessed. Increased number of iron depositions (light blue stains) was visible within hepatocytes from liver sections of experimental group (Fig. 12).
Representative microphotographs of liver sections showing staining with Perl’s method. Comparison of the presence of iron (light blue areas) in control and experimental groups of mice (with ZnO:Fe NPs administered 24 h before sacrifice). The arrows point iron deposits in hepatocytes. × 40 lens
General greater accumulation of iron (blue stains) within the red pulp than in white pulp of spleen was observed in both control and experimental groups (Fig. 13). After application of ZnO:Fe NPs, the higher level of iron was particularly visible within the red pulp, comparing with images from control group (Fig. 13c, d). In experimental group, an increased concentration of iron was also noticeable around blood vessels (Fig. 13b, d).
Representative spleen sections following staining with Perl’s method. Comparison of the presence of iron (blue areas ) in control and experimental group of mice (with administered 24 h before ZnO:Fe NPs). Separate presented areas of the tissue:white pulp (a , b ) and red pulp (c , d ). The arrows point iron accumulated around blood vessels (circles). × 10 (a , b ) or × 20 (c , d ) lens
Discussion
As was mentioned in the “Introduction” section, the iron deficiency is a considerable nutritional disorder in human population, as well as in other mammalian species [3, 7, 8]. Consequently, an implementation of new, more efficient and safe iron supplementation strategy seems to be highly desirable. Currently presented results come from preliminary studies aimed at further, detailed investigations related with potential usage of biodegradable ZnO NPs doped with Fe as a novel strategy for iron supplementation. As was confirmed previously, in-house manufactured zinc-based NPs undergo very efficient absorption after their oral administration with further, rapid distribution to major organs and tissues in the living organism [22,23,24]. Moreover, we reported that these nanostructures demonstrated bio-safety and biodegradability within the body along with fast clearance from the organism [36]. Employed in the current study, the oral way of NP administration provides a highly efficient way of fast delivery of the exogenous nanostructures to the body, based on persorption process [37, 38]. Furthermore, this strategy decreases chance of eventual toxic effects related with administration of iron-doped substances, because of the existence physiological “security mechanisms” related to both Zn and Fe absorption from the gastrointestinal tract. This crucial, physiological pathways of iron distribution may be avoided in case of intravenous/intramuscular application iron-doped substances [14], which can result in increased possibility of occurrence iron-related toxic side effects. The examination of the internalization pathways of the nanoparticles, their dynamics, and cellular systems involved in the process is being currently studied in the frame of other publication. In the current paper, we decided to show overall effect of our nanoparticles on living organism, focusing on the effect of iron.
Toxicity of nanostructures may be related with various features of material, not only with chemical composition, but also with e.g. size, shape, or their ability to aggregate [39]. Nevertheless, it was confirmed that smaller NPs were better absorbed than bigger one and high surface-to-volume ratio makes the particles of some metals exceptionally reactive and cytotoxic [40, 41]. Nanostructures were able to enter cells and affect their components, which altered the viability of cells [42, 43]. In one of the previous investigations on cytotoxicity of ZnO or FeO NPs, authors did not observe toxic effects (based on ability of examined cells to grow and divide), even in high doses of NPs [44]. Presented here is a study performed on Caco-2 cell line, as a model of epithelial cells of the gastrointestinal tract, revealing a low toxicity of used nanomaterials. ZnO:Fe NPs in small/physiological doses (0.001 mg/ml and 0.001 mg/ml) did not alter the viability of cells (Figs. 6 and 7). Following the incubation of Caco-2 cells with high doses of ZnO:Fe NPs, a statistically significant decrease of viability was observed. However, IC50 (the half maximal inhibitory concentration), as a measure of the effectiveness of a substance in inhibiting a specific biological or biochemical function, still remained surprisingly high—around 1 mg/ml (Figs. 6 and 7). Observed drop of cell viability was probably associated with the physical deposition of nanoparticles on the surface and overstress of the cells rather than the cytotoxic effect related to the nanoparticles themselves. In another study, authors concluded decrease IC50 of cells from cancer cell line following incubation with ZnO and ZnO:Fe3O4 NPs and relatively low cytotoxicity effect (and non-dose-depended) of examined NPs on noncancerous cells [45]. Similar observations were also reported for ZnO and platinum NPs [46, 47]. Nevertheless, further examinations on chronic toxicity profile of such composites including antioxidant activity profiling, production of reactive oxygen species (ROS), and using another cells and cell line must be performed.
Obtained in the in vivo experiment, results indicated a rapid distribution of ZnO:Fe NPs to tissues mostly related with iron homeostasis (Figs. 8, 9, and 10). Similar studies, concerning the bioavailability of iron from “nano” form, were mostly performed on anemic animals or examined following the iron depletion period [18, 19, 48], where our preliminary studies were carried out on healthy, normally maintained mice. Comparison of data presented in the current work with similar studies may be misleading because of differences in employed NPs e.g. their size, shape and compound or route, dose, and frequency of their administration to animals. Results of iron level in the liver showed significantly increased level at 24 h after application of ZnO:Fe NPs, comparing with control (Figs. 8 and 9). Iron accumulation was visible in hepatocytes of liver tissue (Fig. 12), where the major storage site of the element takes place [49]. Similarly, previous studies with intraperitoneally injected iron oxide, magnetic NPs to rats also resulted in 55% accumulation of these nanomaterials in the liver at 6 h following injection [50]. Likewise, the spleen level of iron in the current study was clearly higher in experimental group, than within control (Figs. 8 and 10). Interestingly, tendency of iron accumulation was detected around blood vessels within the spleen, which might indicate the transfer of ZnO:Fe NPs from general bloodstream into the tissue (Fig. 13b, d). Primary accumulation of nanostructures within the liver and spleen after their application might also be attributed with clearance via mononuclear phagocytes in these tissues, as was also postulated previously [50,51,52].
In case of brain tissue, the measurement of total iron level (AAS method) showed significantly higher level of the element in animals with previously administered ZnO:Fe NPs (Fig. 8), which was not confirmed by analysis based on Perl’s staining (Fig. 11). Inconsistency between both, employed in the study methods, may be related with sensitivity of Perl’s staining. This histological method of iron visualization is dedicated to detect iron aggregates. Iron contained in the “nano” form, additionally distributed within the tissue without physiological deposits of these elements, might not be sensitive enough to stain these extremely small deposits of iron. Possibility of overcoming the blood-brain barrier with manufactured by us nanostructures was already described [23, 24, 53]. In another study, with intraperitoneally administered superparamagnetic maghemite iron oxide NPs to mice, no accumulation of iron in experimental group was detected, nor within brain or heart tissues, which is inconsistent with our results [52]. Another study, focused on a distribution pattern of iron oxide magnetic NPs within living organism, indicated similar circulation mechanism of nanostructures as in our study—increased level of Fe within the brain and heart after administration of NPs [51]. Increased level of iron in heart tissue may be caused by presence of ZnO:Fe NPs in the general blood stream and consequently its higher level within the tissue. Likewise, higher level of iron within a skeletal muscle detected in AAS analyses is probably related with intensive blood circulation within this muscle and in case of small intestine, the improved content of iron is caused by residues of orally administered NPs.
Kesimpulan
In conclusion, we performed the preliminary study on the distribution of biodegradable ZnO:Fe NPs as a perspective, new supplementation strategy in iron deficiency. Deposition of iron in the body of mice following oral administration of the nanostructures was detected within the crucial tissues, where the major storage site of the element takes place. We assumed that obtained in the study results might indicate the biodegradable ZnO:Fe NPs as a good carriers of exogenous iron in the living body. However, further research is needed to completely understand the exact mechanisms of the deposition, elimination, and influence of ZnO:Fe NPs on the body.
Ketersediaan Data dan Materi
The conclusions of the following study are based on the data presented in this manuscript.
