Nanopartikel Zink Oksida Terdop Fe yang Biodegradasi: Sistem Pengiriman Besi yang Menjanjikan untuk Aplikasi Biologis

Abstrak

Besi adalah elemen krusial untuk organisme hidup dan kekurangannya dijelaskan sebagai gangguan nutrisi paling umum di seluruh dunia. Saat ini, strategi suplimensi besi yang lebih efektif dan aman baik untuk manusia maupun hewan menjadi salah satu tantangan terbesar dalam terapi kekurangan nutrisi. Studi in vivo kami sebelumnya memvalidasi keamanan dan biodegradasi nanopartikel berbasis oksida zink yang diproduksi internal dan distribusi cepatnya ke mayoritas organ dan jaringan dalam tubuh. Pemeriksaan in vitro yang dilakukan pada sel Caco-2, model sel epitel saluran pencernaan, mengungkapkan toksisitas rendah dari nanomaterial yang diteliti. Dalam studi saat ini, kami menyelidiki nanopartikel oksida zink yang biodegradasi dan terdop Fe(III) sebagai strategi suplimensi yang menjanjikan untuk kekurangan besi. Nanopartikel ZnO:Fe yang biodegradasi diberikan secara intra-gastrik pada tikus dewasa dan setelah 24 jam, hewan disembelih dengan pengumpulan organ internal untuk analisis lebih lanjut. Konsentrasi besi yang diukur dengan spektrometri absorpsi atom dan pewarnaan histology (metode Perl) menunjukkan distribusi cepat nanopartikel terdop besi ke jaringan yang khusus terkait dengan homeostasis besi. Akumulasi besi juga terlihat dalam hepatosit dan di sekitar pembuluh darah dalam limpa, yang mungkin menunjukkan transfer nanopartikel terdop Fe dari aliran darah ke jaringan. Menyimpulkan, hasil preliminer yang diperoleh dalam studi saat ini menunjukkan bahwa nanopartikel oksida zink terdop Fe mungkin menjadi pengempa yang baik untuk besi eksogen dalam tubuh hidup. Oleh karena itu, penyelidikan selanjutnya difokuskan pada penentuan mekanisme yang tepat terkait dengan deponesi besi di jaringan dan pengaruh pengempa nanopartikel terhadap metabolisme besi diperlukan.

Pendahuluan

Besi adalah salah satu komponen terpenting yang membentuk organisme hidup di Bumi, termasuk populasi manusia. Pentingnya elemen ini terkait dengan peran esensial besi dalam banyak struktur dan proses yang terjadi dalam tubuh, misalnya pengangkutan oksigen ke seluruh jaringan dan sel tubuh (bagian dari hemoglobin dan mioglobin), produksi energi (komponen protein rantai respirasi mitokondria dalam) dan banyak lagi [1, 2]. Oleh karena itu, besi berpartisipasi dalam proses kehidupan krusial sel dan organisme keseluruhan dan kekurangannya dapat menyebabkan gangguan signifikan dalam fungsi tubuh hidup.

Seperti yang dilaporkan di seluruh dunia, kekurangan besi menjadi masalah kesehatan publik yang serius dalam populasi manusia. Menurut WHO, hampir 30% masyarakat di seluruh dunia terpengaruh oleh anemia pada tahun 1993–2005. Prevalensi anemia masih jauh lebih tinggi pada anak-anak kecil dan wanita hamil [3]. Pentingnya suplimensi besi pada kehamilan terkait dengan fakta bahwa kekurangan besi adalah faktor risiko untuk persalinan preterm, berat badan lahir rendah neonatus, dan kondisi kesehatan umum yang lebih buruk [4]. Dalam hal anak-anak bayi dan usia prasekolah, faktor risiko kekurangan besi disebabkan oleh pertumbuhan cepat seluruh tubuh dan konsesumsi cadangan besi selanjutnya; oleh karena itu, suplimensi besi juga direkomendasikan untuk anak-anak antara 0 dan 5 tahun [5]. Menariknya, ada laporan ilmiah yang menunjukkan korelasi antara tingkat besi yang tepat pada anak-anak dan perkembangan emosional serta neuropsikologis mereka [6]. Selain itu, kekurangan besi juga merupakan gangguan nutrisi yang serius pada spesies mamalia lainnya, terutama pada bayi babi menyusui, di mana pasokan intrauterin yang terbatas elemen ini dikombinasikan dengan kandungan besi rendah dalam susu induk babi [7, 8]. Selain itu, pertumbuhan cepat bayi babi dengan cepat menguras sisa cadangan besi, karena dalam beberapa hari bayi babi baru lahir menggandakan berat badan mereka, sehingga meningkatkan jumlah sel darah merah dan volume darah keseluruhan. Oleh karena itu, saat ini strategi suplimensi besi yang lebih efektif dan aman baik untuk populasi manusia maupun hewan menjadi salah satu tantangan terpenting dalam pencegahan dan terapi kekurangan nutrisi.

Ada tiga cara utama untuk pengiriman besi tambahan ke organisme hidup: intravenus, intramuskular, dan oral. Setiap metode menunjukkan kelebihan dan kekurangannya. Pemberian oral tampak sederhana dan lebih alami bagi tubuh, melibatkan jalur fisiologis penyerapan dan sistem transportasi besi. Selain itu, metode ini mempertahankan sistem alami yang mengontrol jumlah besi yang beredar dalam tubuh berdasarkan hepsidin [9]. Namun, rute oral suplimensi seringkali didera oleh penyerapan yang buruk dan efisiensi akhirnya rendah. Studi ilmiah juga melaporkan bahwa strategi suplimensi besi oral standar yang larut sangat mempengaruhi komposisi dan aktivitas mikrobioma usus hewan [10]. Di sisi lain, rute intravenus atau intramuskular untuk pengiriman besi ke organisme dihalangi oleh risiko efek samping toksik [11]. Secara tambahan, dalam peternakan babi industri, metode standar suplimensi besi berdasarkan pemberian tunggal intramuskular dosis tunggal besi-dextran stres bagi hewan dan merepotkan bagi peternak. Selain itu, suntikan yang tidak dilakukan dengan benar dapat menyebabkan inflamasi dan komplikasi lain pada hewan, serta berkontribusi pada penyebaran berbagai maladi di kawanan, ketika kondisi sterilitas tidak diperhatikan.

Efek samping toksik dari pengiriman besi eksogen ke organisme hidup yang disebutkan di atas terkait dengan munculnya elemen besi bebas dan tidak terikat dalam tubuh, yang sebagai logam transisi (melalui perubahan valensi) dapat menghasilkan radikal bebas berbahaya (yaitu spesies reaktif oksigen—ROS) melalui reaksi Fenton [12]. Laporan ilmiah menunjukkan risiko peningkatan tingkat radikal bebas dalam organisme sebagai faktor yang berkontribusi pada berbagai kondisi termasuk: infeksi bakteri, neoplasia, atau penyakit hati [13]. Strategi fisiologis alami untuk mencegah generasi ROS oleh besi bebas berdasarkan pada pengikatan elemen besi dengan protein tertentu pada setiap langkah jalur penyerapan dan transportasinya dalam tubuh. Dalam hal beban oral besi dan pemberian intravenus/intramuskularnya, jalur sirkulasi besi fisiologis secara umum terkewalahan menghasilkan peningkatan cepat ROS [14].

Nanopartikel berbasis besi (NPs berbasis Fe) telah banyak diteliti sebagai alat yang menjanjikan untuk tujuan biomedis. Penggunaan paling luas dari struktur nano ini terkait dengan properti magnetik mereka; oleh karena itu, mereka sebagian besar diuji sebagai agen kontras untuk teknik diagnostik klinis yang bertujuan pada citra tumor atau akumulasi pada jaringan tertentu [15]. Baru-baru ini, struktur nano juga telah diteliti sebagai bentuk baru dan lebih efektif untuk pengiriman zat bioaktif ke organisme. Pengempa NPs dapat mengungkapkan bioavailabilitas yang secara signifikan meningkat bagi organisme hidup, dibandingkan dengan zat dalam bentuk massa, yang sebagian besar terkait dengan ukuran yang lebih kecil mereka [16, 17]. Dalam salah satu studi, efektivitas NPs yang mengandung besi dibandingkan dengan sulfat besi ferrous (suplemen standar untuk mengobati anemia) pada tikus anemik. Berdasarkan analisis darah, hasil yang diperoleh menunjukkan peningkatan bioavailabilitas besi setelah pemberian tunggal oral NPs dengan besi pada hewan anemik. Dalam hal beberapa dosis nanopartikel dan sulfat besi ferrous, hasil yang diperoleh serupa [18]. Studi lain menggambarkan hasil yang diperoleh dari nanomaterial berbasis Fe sebagai agen pengiriman besi alternatif pada manusia dan model rodent. Penulis terutama menekankan keamanan yang superior dari nanoFe dibandingkan dengan bentuk larut besi, yang mengakibatkan tidak adanya akumulasi besi pada mukosa usus dan promosi mikrobiota bermanfaat [19]. Hasil yang sama menjanjikan diperoleh dalam studi pada tikus anemik yang diobati dengan NPs berbasis Fe yang dicap dengan vitamin C, yang memungkinkan untuk menghindari rute standar penyerapan Fe dari saluran pencernaan. Hasil yang diperoleh menunjukkan pemulihan hewan yang diuji dari penyakit anemia bersama dengan perbaikan parameter darah mereka dalam waktu singkat, dibandingkan dengan metode standar terapi kekurangan besi [20].

Materi dan Metode

Sintesis Nanopartikel

Nanopartikel oksida zink terdop besi (NPs ZnO:Fe) disintesis menggunakan teknik hidrotermal mikrogelombang. Metode ini sudah terbukti, relatif murah, ramah lingkungan, dan dapat diskalakan secara industri, mampu untuk memperkenalkan ion asing berbeda sebagai dopan fungsional [21,22,23,24,25] ke dalam berbagai oksida [26,27,28]. Konsentrasi besi pada nanopartikel saat ini ditetapkan pada 5% molar. Sintesis dilakukan dimulai dari nitrat(V): Zn(NO₃)₂·6H₂O (99%, Sigma–Aldrich) dan Fe(NO₃)₃·9H₂O (96%, Carl Roth). Kami telah menguji berbagai pemasok dan memilih yang menawarkan produk paling seragam yang tidak mengandung sisa terlarut yang dapat diukur. Senyawa dilarutkan dalam air tisu: 17,63 g zink nitrat(V) dan 1,25 g besi(III) nitrat(V). Larutan jernih kemudian dibasahkan menggunakan larutan amoniak kuat 25% (Carl Roth) hingga pH 8. Sisa merah yang dihasilkan dicuci menggunakan funnel Büchner, dengan ~ 1 l air tisu dan difilter hisap. Endapan ditempatkan dalam wadah Teflon 100 ml, diisi air hingga 80% volume lalu ditutup dalam ruang reaktor Ertec Magnum II. Proses hidrotermal mikrogelombang dilakukan pada 4 MPa selama 20 menit. Setelah reaksi, produk merah pucat dikumpulkan dan dikeringkan selama semalaman pada 60 °C.

Karakterisasi Nanopartikel

Karakterisasi produk dilakukan menggunakan mikroskopi elektron pemindai (SEM), spektroskopi luminescensi foto (PL) dan katodoluminescensi (CL), dan analisis elemen dispersif energi (EDX). Pengukuran SEM dilakukan dengan mikroskop Hitachi SU-70 resolusi tinggi (1 nm), dilengkapi dengan detektor radiasi karakteristik dan sistem katodoluminescensi GATAN Mono CL3 dalam mode elektron sekunder (SE) dan transmisi (TE). Spektra emisi dan eksitasi luminescensi foto direkam menggunakan spektrofluorimeter Horiba/Jobin-Yvon Fluorolog-3, dilengkapi dengan lampu xenon sebagai sumber eksitasi dan pemultiplier foto Hamamatsu R928P. Pencaran cahaya dinamis (DLS) dan potensial zeta diukur dengan sistem karakterisasi partikel DelsaMax Pro. Analisis termogravimetri (TGA) dilakukan menggunakan termogravimeter NETZSCH STA 449 F1 Jupiter dalam aliran argon. Pengukuran SEM dilakukan setelah deponesi nanopartikel pada jaringan tembaga 400 dilapisi policarbonat Agar. Sampel disuspendi dalam air tisu menggunakan processor ultrasonik Sonics VCX500, dan kemudian titik suspensi ditempatkan pada jaringan lalu dikeringkan. Sampel disiapkan setelah sedimentasi 2 jam partikel yang lebih berat.

Model In Vitro

Untuk studi saat ini, sel baris Caco-2 (sel adenocarcinoma kolon kaukasus) digunakan, sebagai model sel epitel saluran pencernaan. Baris sel diperoleh dari Koleksi Sel Terotentikasi Eropa—ECACC (Sigma–Aldrich, Cat. No. 86010202). Sel ditanam pada 0,5 × 10⁶ sel/ml pada plate 6-lubang atau 96-lubang dan dipertahankan dalam Medium Modifikasi Dulbecco’s Eagle—DMEM (Gibc), dilengkapi dengan 10% serum sapi janin—FBS (Gibc), 1% asam amino non-esensial—NEAA (Gibc), 1% penisilin–streptomisin–neomisin—PSN (Gibc), dan 0,2% bikarbonat natrium (Gibc) pada 37 °C dan 5% CO₂. Ketika konfluensi 95–100% diamati, medium kultur sel dihilangkan dan suspensi ZnO:Fe NPs dalam medium pertumbuhan segar ditambahkan. Sel diinkubasi dengan empat konsentrasi berbeda ZnO:Fe NPs (1,0; 0,1; 0,01; dan 0,001 mg ZnO:Fe NPs/ml) selama 24 jam pada 37 °C dan 5% CO₂.

Analisis Keberadaan Sel

Keberadaan sel dievaluasi untuk Caco-2 menggunakan dua metode: uji XTT dan pewarnaan Trypan blue. Semua reagien yang diperlukan untuk uji XTT disediakan dari komersial kit (Cell Proliferation Kit II, Roche). Setelah inkubasi sel yang ditanam pada plate 96-lubang dengan konsentrasi berbeda ZnO:Fe NPs, sel diinkubasi dengan 50 μl campuran labeling XTT selama 4 jam pada 37 °C dan 5% CO₂. Selanjutnya, konsentrasi formazan dievaluasi dengan metode spektrofotometrik. Serapan diukur pada 470/650 nm dan hasil dikorelasikan dengan jumlah sel hidup. Dalam eksperimen berikutnya, hasil serapan tertinggi diasumsikan sebagai keberadaan sel 100%. Hasil akhir dihitung berdasarkan empat replikasi eksperimen terpisah (n = 4).

Untuk melakukan pewarnaan trypan blue, setelah sel yang ditanam pada plate 6-lubang diinkubasi dengan konsentrasi berbeda ZnO:Fe NPs, sel dikumpulkan (0,05% tripsin dan 0,2% EDTA selama 10 menit), sentrifugasi dan pelet di-resuspen dalam 1 ml medium pertumbuhan. Seratus mikrolit larutan trypan blue 0,4% steril dicampur dengan 100 μl suspensi sel. Sepuluh mikrolit sampel dimuat pada slide perhitungan dan dianalisis menggunakan JuLi Br Counting Software (NanoEnTek) untuk menilai jumlah sel hidup. Hasil akhir dihitung berdasarkan tiga replikasi eksperimen terpisah (n = 3).

Model Hewan

Untuk tujuan studi preliminer ini, tikus Balb-c dewasa, jantan (n = 6) dijaga secara individu dalam kondisi hidup standar dan terkontrol (periode cahaya-gelap 12/12 jam, 25 °C, kelembaban 30%) dengan makanan dan air standar (disediakan ad libitum). Semua prosedur disetujui oleh Komite Etik Lokal, nomor persetujuan WAW2/59/2017. Setelah 7 hari aklimatisasi, suspensi ZnO:Fe NPs dalam air (10 mg/ml; 0,3 ml/tikus) diberikan melalui sonde oral (IG) pada hewan dari grup eksperimental (n = 4). Tikus dari grup kontrol menerima 0,3 ml air minuman melalui IG (n = 2). Selama eksperimen, kami tidak memperhatikan perubahan perilaku pada hewan yang diuji maupun abnormality jaringan apa pun. Setelah 24 jam, tikus dari grup eksperimental dan kontrol disembelih dalam kamar CO₂-O₂ (CO2 Box, Bioscape, Merazet) dengan kemudian pengumpulan jaringan. Setengah dari sampel yang baru dikumpulkan dibeku pada −20 °C untuk spektrometri absorpsi atom (AAS). Setengah lagi jaringan dikonstansi dalam formalin 4% yang ditampung dan dipindahkan ke dalam etanol 70% (setelah 24 jam). Selanjutnya, sampel dihidrasi dalam konsentrasi etanol yang meningkat, ditanam dalam parafin (Leica TP1020, Leica EG1150) dan slide mikroskop tipis 6 μm (atau 4 μm untuk pemeriksaan histopatologis) disiapkan dengan mikroton (Leica RM2255).

Akumulasi Besi yang Dinilai dengan Pewarnaan Perl

Slide mikroskop limpa, hati, dan otak diwarnai dengan metode Perl (biru Prussia) untuk kehadiran besi. Sampel dideparafinasi dan dihidrasi ulang ke air tisu, lalu ditempatkan dalam larutan kerja dengan bagian yang sama dari kalium ferosianida 5% (Sigma–Aldrich) dan asam klorida 5% (Sigma–Aldrich) dan diwarnai selama 30 menit. Selanjutnya, sisi dicuci dalam air dan diwarnai tambahan dengan nuclear-fast red (Sigma–Aldrich) selama 5 menit, dicuci dalam air, dan dipasang di bawah slide lipatan dengan Permount (Fisher Scientific). Citra sampel yang diwarnai diambil menggunakan mikroskop Olympus BX60 dan perangkat lunak akuisisi citra Cell^P. Dari setiap sampel yang diuji, 16 citra yang dipilih secara acak dipilih untuk pemeriksaan lebih lanjut dengan MicroImage v.4.0 (Olympus) sesuai protokol analisis citra internal [29]. Untuk pemeriksaan limpa, hanya pulp merah dalam jaringan yang dipertimbangkan selama analisis. Kandungan besi dihitung sebagai rasio luas dan intensitas pewarnaan positif besi (warna biru) ke luas inti sel dalam citra.

Konsentrasi Besi pada Jaringan yang Diuji diukur dengan Spektrometri Absorpsi Atom

Sampel jaringan yang sebelumnya dikumpulkan, disimpan pada −20 °C, dan kemudian dilelehkan disiapkan untuk penilaian kuantitatif lebih lanjut konsentrasi besi dengan metode spektrometri absorpsi atom (AAS), sesuai protokol yang dijelaskan secara detail sebelumnya [24]. Singkatnya, jaringan ditimbang dan disimpan selama > 16 jam dalam larutan yang berisi 5 ml asam nitrat 65% dan 1 ml peroksida hidrogen 30% (Merck). Selanjutnya, sampel dimineral dalam sistem mikrogelombang Ethos 900 (Milestone, USA) menjadi larutan cair dan dievaluasi dengan AAS (Perkin-Elmer) untuk kandungan besi.

Analisis Statistik

Data yang diperoleh dalam studi disajikan sebagai rata-rata ± standar error rata-rata (SEM). Untuk evaluasi statistik akumulasi besi yang diperoleh dengan pewarnaan Perl, one-way ANOVA dengan uji post hoc multiple comparison Tukey–Kramer dilakukan untuk semua grup. Untuk mengevaluasi perbedaan signifikan antara grup kontrol dan eksperimental dari analisis AAS, uji t tidak berpasangan digunakan. Perbedaan signifikan antara grup kontrol dan eksperimental dalam eksperimen in vitro dievaluasi menggunakan one-way ANOVA dengan uji multiple comparisons Dunnett. Analisis statistik dihitung dengan GraphPad InStat 3.10. Untuk semua tes, hasil yang diperoleh dianggap signifikan secara statistik dengan P ≤ 0,05 dan P ≤ 0,01 dan P ≤ 0,001 sebagai sangat dan sangat tinggi signifikansi.

Hasil

Karakterisasi Nanopartikel

Citra mikroskopi elektron pemindai (SEM) dari kristal nano ZnO:Fe yang kristal dalam proses mikrogelombang hidrotermal ditunjukkan dalam Gambar 1. Bubuk kering yang disimpan setelah sintesis disperdi dalam air menggunakan mandi ultrasonik, lalu ditetapkan pada jaringan tembaga 400. Suspensi yang dihasilkan dari perlakuan ultrasonik dibiarkan selama 2 jam untuk aglomerasi dan sedimentasi butir besar. Dalam sampel umumnya terlihat kristal oksida zink berbentuk prisma heksagonal panjang. Kristal panjang di arah pertumbuhan bidang c—[001]. Potongan prisma terlihat jelas pada citra: heksagon berukuran 50–100 nm. Dasarnya, nanopartikel teraglomerasi dan membentuk struktur yang lebih besar. Dalam Gambar 1b, ditunjukkan struktur kristal ZnO:Fe yang teraglomerasi dan dikelompokkan secara berat. Sampel juga terdiri dari butir yang tidak seragam yang distribusi ukurannya berkisar antara ratusan nanometer dan mikrometer. Tidak ada indikasi jelas dari keberadaan fase selain oksida zink, yang menunjukkan tidak adanya kristalisasi fase berbasis besi (misalnya oksida besi) [30].

Analisis termogravimetri (TGA) dan kalorimetri pemindaian diferensial (DSC) dilakukan dalam aliran argon dari suhu kamar hingga 800 °C dan hasil yang diperoleh ditunjukkan dalam Gambar 2. Hilang massa pertama terjadi hingga 200 °C dan menyebabkan penurunan massa sampel sebesar 4,78% terhadap massa awalnya. Hilang kedua tercatat antara 200 dan 400 °C dan nilainya sekitar 7,36%. Tidak ada penurunan massa lain hingga 800 °C. Pertama terkait dengan evaporasi molekul air yang teradsorpsi pada permukaan dan kedua kemungkinan disebabkan oleh reduksi grup hidroksil. Kurva DSC menunjukkan puncak endoterm pada 118,3 °C (− 0,6175 mW/mg, evaporasi air) dan puncak eksoterm pada 283,1 °C (0,4356 mW/mg, dekomposisi grup hidroksil). Efek kecil terkait dekomposisi menunjukkan bahwa hampir kristalisasi penuh nanopartikel ZnO:Fe terjadi dalam proses mikrogelombang hidrotermal.

Gambar 3 menunjukkan spektrum luminescensi foto suhu kamar ZnO:Fe NPs. Spektra emisi (Gambar 3a) terdiri dari dua fitur: luminescensi tepi narrow band (NBE) dengan intensitas rendah dan luminescensi deep level (DLE) yang sangat intens dan lebar. Pertama puncaknya pada ~ 380 nm sementara yang kedua pada 600 nm. Dominansi intensitas DLE pada spektrum menunjukkan bahwa kristal nano yang dihasilkan sangat cacat pada tingkat kristalografi [31,32,33]. Spektra eksitasi (Gambar 3b) menunjukkan mekanisme emisi dari level dalam pada jarak bandgap ZnO:Fe.

Spektrum katodoluminescensi ZnO:Fe NPs ditunjukkan dalam Gambar 4; rasio intensitas DLE/NBE ≈ 25. Pita NBE puncaknya pada sekitar 380 nm, pita DLE terdiri dari empat komponen yang puncaknya pada ~ 570, 625, 653 nm dan sangat lemah pada 770 nm. Menurut McCluskey dan Jokela [34], pita 570 nm terkait dengan rongga oksigen, sementara yang lainnya ditetapkan pada rongga zink dalam jaringan wurtzite [35].

Jumlah besi dalam sampel ditentukan menggunakan dua teknik: spektroskopi absorpsi atom (AAS) dan spektroskopi X-ray dispersif energi (EDX). Dalam hal AAS, suspensi yang disiapkan secara serupa seperti yang digunakan dalam eksperimen rodent dianalisis untuk menunjukkan 3,98 atom % Fe dalam ZnO:Fe. Dengan metode EDX, bubuk kering dianalisis pada jaringan tembaga untuk menemukan konsentrasi besi sebesar 4,5%at. terhadap ion zink.

Properti suspensi diukur dengan metode DLS dan TEM, dengan distribusi diameter nanopartikel ditunjukkan dalam Gambar 5. Distribusi bimodal: untuk satu populasi, diameter paling sering puncaknya antara 20 dan 100 nm (TEM) serta antara 50 dan 200 nm (DLS). Populasi kedua berisi kuantitas lebih rendah objek yang lebih besar 100–500 nm (TEM) dan sekitar 150–500 nm (DLS). Karakter bimodal nanopartikel jelas diamati oleh kedua metode yang ditunjukkan. Dispersi ukuran yang tinggi dalam populasi yang lebih besar menunjukkan bahwa itu sesuai dengan nanopartikel yang teraglomerasi. Statistik yang ditunjukkan untuk diameter di atas 100 nm menunjukkan banyak cara berbeda ZnO:Fe nanopartikel mengaglomerasi. Nanopartikel dalam suspensi air bermuatan negatif seperti yang terungkap oleh potensial zeta di bawah 0 V. Nilai sekitar −40 mV juga menunjukkan bahwa suspensi air akhir stabil dan nanopartikel tidak memiliki affinensi untuk mengaglomerasi.

Evaluasi Toksikologi In Vitro Nanopartikel ZnO:Fe

Kedua analisis keberadaan sel (XTT dan Trypan Blue) mengungkapkan penurunan serapan sel Caco-2 yang diinkubasi dengan ZnO:Fe NPs, yang berkorelasi langsung dengan jumlah sel hidup. Perubahan yang signifikan secara statistik hanya diamati setelah paparan 24 jam sel yang diinkubasi pada konsentrasi tertinggi NPs (1,0 dan 0,1 mg/ml), sementara konsentrasi fisiologis NPs (0,01 dan 0,001 mg/ml) tidak memiliki efek signifikan pada kultur sel (Gambar 6 dan 7).

Distribusi Besi pada Model Hewan

Untuk menilai ketersediaan besi in vivo dari ZnO:Fe NPs, tikus (n = 4) secara oral menerima suspensi ZnO:Fe NPs dan setelah 24 jam, hewan disembelih dengan pengumpulan jaringan kunci lebih lanjut. Evaluasi kuantitatif kandungan besi dalam jaringan yang diperiksa dianalisis dengan metode AAS untuk semua organ yang dikumpulkan dan dihitung dengan perangkat lunak Micro Image (berdasarkan pewarnaan Perl) untuk jaringan hati, limpa, dan otak. Seperti yang ditampilkan dalam Gambar 8, data menunjukkan tingkat kandungan besi yang meningkat (vs. kontrol) pada jaringan jantung, otot rangka, limpa, dan usus halus 24 jam setelah pemberian oral ZnO:Fe NPs (tidak ada peningkatan yang signifikan secara statistik). Dalam hal tulang, tingkat rata-rata besi dalam grup eksperimental hanya sedikit lebih tinggi dibandingkan hasil kontrol. Kandungan besi pada jaringan hati dan otak meningkat secara signifikan tinggi (P ≤ 0,01) 24 jam setelah IG ZnO:Fe NPs, vs. grup kontrol (Gambar 8). Pada ginjal, jaringan lemak viseral dan subkutan, dan paru-paru, tingkat Fe menurun 24 jam setelah pemberian ZnO:Fe NPs.

Evaluasi kandungan besi yang diwarnai dengan metode Perl dalam hati mengungkapkan tingkat Fe yang meningkat secara sangat signifikan (P ≤ 0,001) pada semua hewan eksperimental vs. kontrol (Gambar 9b). Demikian pula, hasil yang diperoleh untuk pulp merah jaringan limpa menunjukkan peningkatan kandungan besi yang sangat signifikan (P ≤ 0,001) pada semua hewan eksperimental vs. kontrol (Gambar 10b). Data yang diperoleh dari analisis jaringan otak menunjukkan tidak ada peningkatan Fe pada grup eksperimental 24 jam setelah IG ZnO:Fe NPs (Gambar 11b).

Dalam hal kandungan besi dari setiap hewan dari grup eksperimental dan kontrol, hasil dikumpulkan pada Gambar 9a, 10a, dan 11a. Tingkat besi tertinggi dan yang berbeda secara signifikan (P ≤ 0,05 dan P ≤ 0,01) dalam jaringan hati terdeteksi untuk tikus – 2 (24 h 2), dibandingkan dengan hasil dari grup kontrol (Gambar 9a). Tingkat pewarnaan besi pada pulp merah limpa dalam grup eksperimental serupa; namun, sebagian besar dari mereka lebih tinggi secara statistik (P ≤ 0,05 atau P ≤ 0,01) dibandingkan tikus – 1 (CTRL 1) dari grup kontrol (Gambar 10a). Hasil yang diperoleh untuk jaringan otak serupa antara setiap hewan dari grup eksperimental dan kontrol (Gambar 11a).

Bagian hati dan jaringan limpa yang diwarnai dengan metode Perl juga dievaluasi secara kualitatif. Jumlah peningkatan deponesi besi (pecahan biru muda) terlihat dalam hepatosit dari bagian hati grup eksperimental (Gambar 12).

Akumulasi besi yang lebih besar (pecahan biru) dalam pulp merah daripada pulp putih limpa diamati pada kedua grup kontrol dan eksperimental (Gambar 13). Setelah aplikasi ZnO:Fe NPs, tingkat besi yang lebih tinggi terutama terlihat dalam pulp merah, dibandingkan dengan citra dari grup kontrol (Gambar 13c, d). Dalam grup eksperimental, konsentrasi besi yang meningkat juga terlihat di sekitar pembuluh darah (Gambar 13b, d).

Pembahasan

Seperti yang disebutkan dalam bagian “Pendahuluan”, kekurangan besi adalah gangguan nutrisi yang signifikan dalam populasi manusia, serta pada spesies mamalia lainnya [3, 7, 8]. Akibatnya, penerapan strategi suplimensi besi yang baru, lebih efisien dan aman tampak sangat diinginkan. Hasil yang saat ini disajikan berasal dari studi preliminer yang bertujuan pada penyelidikan lebih detail terkait dengan potensi penggunaan nanopartikel oksida zink biodegradasi terdop Fe sebagai strategi baru untuk suplimensi besi. Seperti yang dikonfirmasi sebelumnya, nanopartikel berbasis zink yang diproduksi internal mengalami penyerapan yang sangat efisien setelah pemberian oral dengan distribusi cepat selanjutnya ke organ dan jaringan utama dalam organisme hidup [22,23,24]. Selain itu, kami melaporkan bahwa struktur nano ini menunjukkan bio-keamanan dan biodegradasi dalam tubuh bersama dengan klarifikasi cepat dari organisme [36]. Rute oral pemberian NPs yang digunakan dalam studi saat ini menyediakan cara yang sangat efisien untuk pengiriman cepat struktur nano eksogen ke tubuh, berdasarkan proses persorpsi [37, 38]. Selain itu, strategi ini mengurangi kemungkinan efek toksik yang mungkin terkait dengan pemberian zat terdop besi, karena adanya “mekanisme keamanan” fisiologis terkait dengan penyerapan zink dan besi dari saluran pencernaan. Jalur fisiologis kunci untuk distribusi besi ini dapat dihindari dalam hal aplikasi intravenus/intramuskular zat terdop besi [14], yang dapat menghasilkan kemungkinan yang lebih besar dari munculnya efek samping toksik terkait besi. Pemeriksaan jalur internalisasi nanopartikel, dinamikanya, dan sistem seluler yang terlibat dalam proses sedang saat ini diteliti dalam kerangka terbitan lain. Dalam naskah saat ini, kami memutuskan untuk menunjukkan efek keseluruhan nanopartikel kami pada organisme hidup, fokus pada efek besi.

Toksisitas struktur nano dapat terkait dengan berbagai fitur material, tidak hanya komposisi kimia, tetapi juga dengan ukuran, bentuk, atau kemampuannya untuk mengaglomerasi [39]. Namun, telah dikonfirmasi bahwa nanopartikel yang lebih kecil diserap lebih baik daripada yang lebih besar dan rasio luas permukaan terhadap volume yang tinggi membuat partikel beberapa logam sangat reaktif dan sitotoksik [40, 41]. Struktur nano mampu masuk ke sel dan mempengaruhi komponennya, yang mengubah keberadaan sel [42, 43]. Dalam salah satu penyelidikan sebelumnya tentang sitotoksisitas nanopartikel ZnO atau FeO, penulis tidak mengamati efek toksik (berdasarkan kemampuan sel yang diperiksa untuk tumbuh dan membelah), bahkan dalam dosis tinggi nanopartikel [44]. Ditampilkan di sini adalah studi yang dilakukan pada baris sel Caco-2, sebagai model sel epitel saluran pencernaan, yang mengungkapkan toksisitas rendah dari nanomaterial yang digunakan. ZnO:Fe NPs dalam dosis kecil/fisiologis (0,001 mg/ml dan 0,001 mg/ml) tidak mengubah keberadaan sel (Gambar 6 dan 7). Setelah inkubasi sel Caco-2 dengan dosis tinggi ZnO:Fe NPs, penurunan yang signifikan secara statistik keberadaan sel diamati. Namun, IC50 (konsentrasi inhibitor setengah maksimal), sebagai ukuran efektivitas zat dalam menghambat fungsi biologis atau biokimia tertentu, masih tetap surprinsing tinggi—sekitar 1 mg/ml (Gambar 6 dan 7). Penurunan yang diamati keberadaan sel kemungkinan terkait dengan deponesi fisik nanopartikel pada permukaan dan stres berlebih pada sel daripada efek sitotoksik yang terkait dengan nanopartikel itu sendiri. Dalam studi lain, penulis menyimpulkan penurunan IC50 sel dari baris sel kanker setelah inkubasi dengan nanopartikel ZnO dan ZnO:Fe3O4 dan efek sitotoksisitas yang relatif rendah (dan tidak bergantung pada dosis) dari nanopartikel yang diperiksa pada sel non-kanker [45]. Observasi serupa juga dilaporkan untuk nanopartikel ZnO dan platinum [46, 47]. Namun, pemeriksaan lebih lanjut pada profil toksisitas kronis komposit seperti ini termasuk profil aktivitas antioksidan, produksi spesies reaktif oksigen (ROS), dan penggunaan sel dan baris sel lain harus dilakukan.

Hasil yang diperoleh dalam eksperimen in vivo menunjukkan distribusi cepat ZnO:Fe NPs ke jaringan yang sebagian besar terkait dengan homeostasis besi (Gambar 8, 9, dan 10). Studi serupa yang berkaitan dengan bioavailabilitas besi dari bentuk “nano” sebagian besar dilakukan pada hewan anemik atau diperiksa setelah periode depletasi besi [18, 19, 48], sedangkan studi preliminer kami dilakukan pada tikus sehat yang dipertahankan secara normal. Perbandingan data yang disajikan dalam pekerjaan saat ini dengan studi serupa mungkin menyesatkan karena perbedaan pada NPs yang digunakan misalnya ukuran, bentuk dan senyawa atau rute, dosis, dan frekuensi pemberiannya pada hewan. Hasil tingkat besi pada hati menunjukkan tingkat yang meningkat secara signifikan pada 24 jam setelah aplikasi ZnO:Fe NPs, dibandingkan dengan kontrol (Gambar 8 dan 9). Akumulasi besi terlihat dalam hepatosit jaringan hati (Gambar 12), di mana situs penyimpanan utama elemen tersebut terjadi [49]. Demikian pula, studi sebelumnya dengan oksida besi yang diinjeksikan intraperitoneally, nanopartikel magnetik pada tikus juga menghasilkan 55% akumulasi nanomaterial ini pada hati pada 6 jam setelah injeksi [50]. Demikian pula, tingkat besi limpa dalam studi saat ini jelas lebih tinggi pada grup eksperimental, dibandingkan dengan kontrol (Gambar 8 dan 10). Menariknya, kecenderungan akumulasi besi terdeteksi di sekitar pembuluh darah dalam limpa, yang mungkin menunjukkan transfer ZnO:Fe NPs dari aliran darah umum ke jaringan (Gambar 13b, d). Akumulasi primer struktur nano dalam hati dan limpa setelah aplikasi mereka mungkin juga dapat diatribusikan pada klarifikasi melalui makrofag sistem mononuklear dalam jaringan ini, seperti yang juga diusulkan sebelumnya [50,51,52].

Dalam hal jaringan otak, pengukuran tingkat besi total (metode AAS) menunjukkan tingkat yang lebih tinggi dari elemen pada hewan yang sebelumnya diobati ZnO:Fe NPs (Gambar 8), yang tidak dikonfirmasi oleh analisis berdasarkan pewarnaan Perl (Gambar 11). Ketidakkonsistenan antara kedua metode yang digunakan dalam studi ini mungkin terkait dengan sensitivitas pewarnaan Perl. Metode histologis untuk visualisasi besi ini didedikasikan untuk mendeteksi agregat besi. Besi yang terkandung dalam bentuk “nano”, yang didistribusikan dalam jaringan tanpa deponesi fisiologis elemen ini, mungkin tidak cukup sensitif untuk mewarnai deponesi besi yang sangat kecil ini. Kemungkinan untuk melewati darah-otak dengan struktur nano yang diproduksi oleh kami telah dijelaskan sebelumnya [23, 24, 53]. Dalam studi lain, dengan nanopartikel oksida besi maghemite superparamagnetik yang diinjeksikan intraperitoneally pada tikus, tidak ada akumulasi besi yang terdeteksi pada grup eksperimental, baik dalam otak atau jaringan jantung, yang tidak konsisten dengan hasil kami [52]. Studi lain, yang difokuskan pada pola distribusi nanopartikel oksida besi magnetik dalam organisme hidup, menunjukkan mekanisme sirkulasi struktur nano yang serupa seperti dalam studi kami—tingkat Fe yang meningkat pada otak dan jantung setelah pemberian NPs [51]. Tingkat besi yang meningkat pada jaringan jantung mungkin disebabkan oleh kehadiran ZnO:Fe NPs dalam aliran darah umum dan consequently tingkat yang lebih tinggi dalam jaringan. Demikian pula, tingkat besi yang lebih tinggi pada otot rangka yang terdeteksi dalam analisis AAS kemungkinan terkait dengan sirkulasi darah yang intens dalam otot ini dan dalam hal usus halus, konten besi yang ditingkatkan disebabkan oleh sisa NPs yang diberikan secara oral.

Kesimpulan

Secara kesimpulan, kami melakukan studi preliminer tentang distribusi nanopartikel ZnO:Fe biodegradasi sebagai strategi suplimensi baru yang menjanjikan dalam kekurangan besi. Deponesi besi dalam tubuh tikus setelah pemberian oral struktur nano terdeteksi dalam jaringan kunci, di mana situs penyimpanan utama elemen tersebut terjadi. Kami mengasumsikan bahwa hasil yang diperoleh dalam studi ini mungkin menunjukkan nanopartikel ZnO:Fe biodegradasi sebagai pengempa yang baik untuk besi eksogen dalam tubuh hidup. Namun, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk sepenuhnya memahami mekanisme yang tepat dari deponesi, eliminasi, dan pengaruh nanopartikel ZnO:Fe pada tubuh.

Ketersediaan Data dan Bahan

Kesimpulan dari studi berikut ini didasarkan pada data yang disajikan dalam naskah ini.

Singkatan

NPs:

Nanopartikel

ZnO:Fe NPs:

Nanopartikel oksida zink terdop besi

IG:

Intra-gastris

ROS:

Spesies reaktif oksigen

SEM:

Mikroskopi elektron pemindai

PL:

Spektroskopi luminescensi foto

CL:

Spektroskopi katodoluminescensi

DLS:

Pencaran cahaya dinamis

Caco-2 cells:

Sel adenocarcinoma kolon kaukasus

DMEM:

Modifikasi Dulbecco’s Eagle’s medium

FBS:

Serum sapi janin

NEAA:

Asam amino non-esensial

PSN:

Penisilin–streptomisin–neomisin

EDTA:

Asam etilenediaminotetraasetat

AAS:

Spektrometri absorpsi atom

SEM (in statistical analysis):

Standar error rata-rata