Nanopartikel Gadolinium Oksida Berfungsi Asam Hyaluronic untuk Radioterapi Tumor dengan Pencitraan Resonansi Magnetik
Abstrak
Lokalisasi yang tidak akurat dan radioresistensi intrinsik tumor padat sangat menghambat implementasi klinis radioterapi. Dalam penelitian ini, kami membuat nanopartikel gadolinium oksida yang difungsikan dengan asam hialuronat (HA-Gd2 O3 NP) melalui proses hidrotermal satu pot untuk pencitraan resonansi magnetik (MR) yang efektif dan radiosensitisasi tumor. Berdasarkan fungsionalisasi HA, HA-Gd2 . yang telah disiapkan O3 NP dengan diameter 105 nm menunjukkan dispersibilitas yang baik dalam air, sitotoksisitas rendah, dan biokompatibilitas yang sangat baik dan mudah masuk ke dalam sitoplasma sel kanker oleh endositosis yang dimediasi reseptor HA. Yang penting, HA-Gd2 O3 NP menunjukkan relaksivitas longitudinal yang tinggi (r1 ) 6.0 mM
−1
S
−1
sebagai agen kontras MRI dan peningkatan radiosensitisasi dengan cara yang bergantung pada dosis. Temuan ini menunjukkan bahwa HA-Gd yang disintesis2 O3 NP sebagai agen theranostik bifungsional memiliki potensi besar dalam diagnosis tumor dan radioterapi.
Pengantar
Radioterapi telah diterapkan secara luas pada kanker, yang melibatkan sinar-X energi tinggi dan pengendapan dosis iradiasi di lokasi tumor dengan menyebabkan kerusakan radikal bebas atau kerusakan DNA [1,2,3,4]. Namun, radiosensitivitas yang buruk, ketidaktepatan lokalisasi tumor dan diskriminasi yang buruk antara lesi, dan jaringan normal yang menyebabkan efek samping iradiasi membatasi implementasi klinis radioterapi [5]. Oleh karena itu, penting untuk mengembangkan metode untuk meningkatkan radiosensitivitas tumor sambil meminimalkan efek samping sistemik. Kombinasi nanoteknologi dan radioterapi merupakan prioritas mapan untuk radiosensitisasi.
Dalam beberapa tahun terakhir, nanoteknologi telah dianggap sebagai strategi yang menarik untuk diagnosis dan terapi kanker [6,7,8,9,10,11]. Salah satu fungsi utama nanopartikel (NP) adalah penargetan tumor yang akurat berdasarkan akumulasi selektif NP dalam jaringan tumor melalui penargetan pasif, efek peningkatan permeabilitas dan retensi (EPR), penargetan aktif, dan waktu sirkulasi yang berkepanjangan [12, 13,14]. Pekerjaan kami sebelumnya menunjukkan bahwa doping NP karbon dengan heteroatom secara efektif menyesuaikan sifat intrinsiknya dan memperkenalkan fitur yang bermanfaat [15,16,17]. Menariknya, NP dapat digunakan sebagai radiosensitizer [18]. NP logam berat (dengan elemen Z tinggi) (misalnya, Au, Bi, Gd) sebagai radiosensitizer yang menjanjikan dapat digunakan dalam terapi radiosensitisasi karena penampang tangkapan foton sinar-X yang tinggi dan efek hamburan Compton [19]. Ketika sinar-X berinteraksi dengan nanopartikel Z tinggi, elektron Auger, dan fotoelektron, pelepasan elektron sekunder melukai sel kanker, memberikan peningkatan dosis selama terapi radiasi [20]. Sampai saat ini, NP berbasis gadolinium (GdNPs) terbukti efektif sebagai agen kontras MRI (CA) [21, 22] dan membedakan jaringan normal dari jaringan dan lesi yang sakit secara non-invasif dan secara real-time. Agen ini mempersingkat waktu relaksasi longitudinal untuk mempengaruhi relaksasi longitudinal r1 [23], dan penargetannya yang tidak akurat sering kali menimbulkan efek samping. Telah diketahui dengan baik bahwa asam hialuronat (HA) adalah ligan utama dan pembawa penghantaran obat ke situs target dengan reseptor HA seperti penentu cluster 44 (CD44) [24,25,26].
Berdasarkan hasil penelitian sebelumnya, kami menggunakan HA sebagai ligan penargetan untuk memfungsikan Gd2 O3 NP dengan fungsi ganda:CA MRI dan radiosensitizer penargetan tumor yang efektif untuk mengatasi radioresistensi yang melekat dan ketidakakuratan lokalisasi tumor. Selain itu, HA-Gd2 O3 NP menampilkan relaksivitas longitudinal yang tinggi (r1 ) sebagai agen pencitraan MR yang menjanjikan dengan kualitas pencitraan MR yang lebih baik. Dibandingkan dengan CA yang tersedia saat ini [27, 28], hasil HA-Gd2 O3 NP menunjukkan tiga keuntungan signifikan:pertama, HA-Gd2 O3 NP menunjukkan biokompatibilitas yang menguntungkan karena menggunakan matriks ekstraseluler alami sebagai prekursor. Kedua, fungsionalisasi HA secara signifikan meningkatkan penargetan tumor dan mengurangi efek samping. Akhirnya, HA-Gd2 O3 NP memiliki kemampuan bifungsional dalam diagnosis dan terapi. Untuk memverifikasi keefektifan dan mengeksplorasi mekanisme peningkatan radiosensitisasi, kami mengevaluasi efek radiosensitisasi HA-Gd2 O3 NP pada viabilitas sel tumor, siklus sel, dan apoptosis.
Hasil dan Diskusi
Persiapan dan Karakterisasi HA-Gd2 O3 NP
Dalam penelitian ini, HA-Gd2 O3 NP berhasil disiapkan menggunakan proses hidrotermal sederhana seperti yang ditunjukkan pada Skema 1. Ukuran partikel dianalisis dengan hamburan cahaya dinamis, sedangkan pemeriksaan morfologi dilakukan dengan mikroskop elektron transmisi. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1a, HA-Gd2 O3 NP menunjukkan dispersi seragam dan bentuk kuasi-bola diskrit tanpa agregasi yang jelas. Diameter rata-rata HA-Gd2 O3 NP adalah 105 nm. Dibandingkan dengan jaringan normal, permeabilitas endotel kapiler jaringan tumor meningkat dan celah endotel adalah 100-600 nm [29]. Oleh karena itu, NP dengan ukuran yang diinginkan mudah dibenamkan dalam jaringan tumor, dan mereka dapat secara dramatis meningkatkan efisiensi penghantaran obat penargetan pasif.
Sintesis skematis HA-Gd2 O3 NP dari metode hidrotermal (A) dan aplikasi biomedis berikut (B)
Karakterisasi HA-Gd2 O3 NP. Rendah (a ) dan tinggi (b ) perbesaran gambar TEM. Distribusi diameter (c ) dan pola XRD (d ) dari HA-Gd2 O3 NP
Struktur fase HA-Gd2 O3 NP diselidiki oleh XRD menggunakan kekuatan grafit oksida (GO) sebagai kontrol. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 1d, satu puncak difraksi utama (2θ =12,04°) dan dua puncak kecil (2θ =29,6°, 42,1°) diamati di HA-Gd2 O3 Pola difraksi NP, yang sesuai dengan puncak karakteristik GO (bidang 100) dan grafit (bidang (002), masing-masing. Spasi kisi utama HA-Gd2 O3 NP menunjukkan jarak yang lebih kecil (0,73 nm dihitung dengan rumus Bragg) daripada jarak GO d001 =0,85 nm, di mana pergeseran ke atas pada posisi puncak dapat dikaitkan dengan penurunan jarak antara sp
3
lapisan. Semua puncak difraksi luas menunjukkan bahwa HA-Gd2 O3 NP memiliki struktur amorf, yang dapat dikaitkan dengan karbon yang sangat tidak teratur dan penurunan sp
2
(C–C) jarak lapisan selama proses karbonisasi. Hasilnya lebih lanjut menunjukkan HA-Gd2 O3 NP dengan sifat kristal yang buruk memiliki struktur berlapis-lapis yang heterogen, yang konsisten dengan laporan kami sebelumnya mengenai titik karbon [30, 31].
Struktur Kimia dan Komposisi Permukaan HA-Gd2 O3 NP
Gugus fungsi permukaan dan komposisi HA-Gd2 O3 NP diselidiki menggunakan spektrum inframerah transformasi Fourier dan spektroskopi fotoelektron sinar-X. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 2a, spektrum XPS menunjukkan empat puncak khas pada 284.0, 400.0, 530.6, dan 1188.5 eV, menunjukkan bahwa HA-Gd2 O3 NP terutama terdiri dari unsur-unsur gadolinium, karbon, oksigen, dan hidrogen. Spektrum resolusi tinggi Gd3d (Gbr. 2b) mengungkapkan adanya dua puncak kuat pada 1187,5 eV dan 1221 eV, yang sesuai dengan pemisahan spin-orbit 32 eV, masing-masing sesuai dengan 3d5/2 dan 3hari3/2 tingkat energi Gd. Pengamatan ini sesuai dengan laporan sebelumnya tentang HA-Gd2 O3 NP. O (1 ) spektrum yang ditunjukkan pada Gambar. 2c didominasi oleh satu puncak utama yang diposisikan pada 531,4 eV, yang sesuai dengan ikatan antara O
2−
dan Gd
3+
. Spektroskopi FITR dilakukan untuk telanjang dan HA-Gd2 O3 Sampel NP (Gbr. 2d). Untuk sampel telanjang, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2a, pita serapan karakteristik vsebagai O–C–O pada 1580 dan 1380 cm
−1
menunjukkan adanya gugus karbonat. Puncak lebar pada 3340 dan 2900 cm
−1
dikaitkan dengan getaran peregangan O-H dan C-H, masing-masing, yang sesuai dengan air yang diserap permukaan. Untuk HA-Gd2 O3 NP, getaran peregangan COO
−
pada 1580 dan 1380 cm
−1
ditingkatkan, menunjukkan pengenalan gugus karboksilat asam hialuronat. Hasil ini mengungkapkan bahwa gugus fungsi HA-Gd2 O3 NP terutama mengandung banyak gugus karbonil, karboksilat, dan hidroksil tertentu. Kehadiran gugus fungsi ini yang terletak di permukaan memberikan HA-Gd2 O3 NP dengan dispersibilitas yang sangat baik dalam air. Yang penting, ion Gd yang tertanam di permukaan NP mungkin berguna untuk pencitraan MR dan radiosensitisasi, yang secara dramatis mencegah ion Gd bocor ke lingkungan sekitarnya.
Struktur kimia dan komposisi HA-Gd2 O3 NP. a Spektrum XPS pemindaian penuh HA-Gd2 O3 NP. b Gd3d spektrum. c O1S spektrum. d Spektrum FTIR HA-Gd2 O3 NP
Biokompatibilitas HA-Gd2 O3 NP
Biokompatibilitas HA-Gd2 O3 NP, sebagai agen biomedis potensial, sangat penting untuk aplikasi biomedisnya. Pertama, sitotoksisitas yang melekat pada HA-Gd2 O3 NP dinilai dalam sel HepG2 dan VSMC menggunakan uji CCK-8. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 3a dan S. Gambar. 1, HA-Gd2 O3 NP tidak menunjukkan sitotoksisitas yang jelas hingga 3 hari. Bahkan pada konsentrasi 200 μg/mL setelah waktu pemaparan 24 jam, viabilitas sel sekitar 90%. Kedua, hemokompatibilitas HA-Gd2 O3 NP in vivo diperkirakan menggunakan uji hemolisis. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3b, kami mengamati hemolisis sel darah merah di dalam air (kontrol positif). Sebaliknya, tidak ada hemolisis yang jelas diamati setelah HA-Gd2 O3 Inkubasi NP pada konsentrasi yang berbeda dari 0 hingga 200 μg/mL selama 2 h, yang serupa dengan hasil untuk larutan PBS (kontrol negatif). Dibandingkan dengan kontrol negatif, persentase hemolisis pada konsentrasi HA-Gd yang berbeda2 O3 NP sedikit dievaluasi berdasarkan absorbansi supernatan pada 541 nm. Hasil penelitian menunjukkan bahwa persentase hemolisis HA-Gd2 O3 NP semuanya kurang dari 3% dalam konsentrasi yang dipelajari, memverifikasi hemokompatibilitasnya yang menguntungkan. Untuk memeriksa potensi toksisitas, HA-Gd2 O3 NP disuntikkan secara intravena ke tikus Balb/c (seperti terlihat pada S. Gambar 2). Setelah 1 minggu, tikus ini dieksekusi, dan kandung kemih, ginjal, dan limpa dipanen untuk analisis bagian patologis. Seperti yang ditunjukkan pada S. Gambar. 2, hasil potongan patologis menunjukkan bahwa tidak ada lesi atau respon inflamasi yang terlihat pada organ HA-Gd2 O3 tikus yang diberi NP. Hasil ini dengan jelas menunjukkan bahwa HA-Gd2 . yang disintesis sebagai O3 NP memiliki sitokompatibilitas yang baik dan hemokompatibilitas yang baik.
a Pengaruh HA-Gd2 O3 NP pada viabilitas sel HepG2 dan VSMC menggunakan uji CCK-8. b Aktivitas hemolitik HA-Gd2 O3 NP pada konsentrasi yang berbeda (50, 100, 200, 300, dan 400 μg/mL). PBS dan air digunakan sebagai kontrol negatif dan positif, masing-masing
Studi Phantom MRI
Membujur (T1 ) waktu relaksasi HA-Gd2 O3 NP diselidiki secara in vitro bersama dengan kontras Magnevist komersial (Gd-DTPA) sebagai kontrol menggunakan saline buffer fosfat (pH =7,4, 0,2 M). Dengan meningkatnya konsentrasi Gd, intensitas sinyal T1 -gambar phantom berat jelas meningkat, menunjukkan bahwa semua sampel dapat menghasilkan peningkatan kontras MRI pada T1 -urutan berbobot (Gbr. 4a). Selanjutnya, plot intensitas sinyal versus waktu inversi memberikan T1 -waktu relaksasi masing-masing zat kontras pada konsentrasi tertentu. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4b, r1 nilai HA-Gd2 O3 NP diukur menjadi 6,0 mM
−1
S
−1
, yang secara signifikan lebih tinggi daripada Magnevist (3,86 mM
−1
S
−1
) dalam kondisi yang sama. r . yang ditingkatkan 1 dapat dianggap berasal dari radius hidrodinamika dan luas permukaan HA-Gd yang jauh lebih tinggi2 O3 NP; oleh karena itu, lebih banyak atom Gd yang didoping dalam kisi NP menjadi dapat diakses oleh molekul air, memperpendek relaksasi longitudinal dan meningkatkan r1 nilai.
a T1 gambar hantu HA-Gd2 O3 NP dengan konsentrasi ion Gd total yang berbeda. b Plot yang sesuai dari 1/T1 terhadap konsentrasi ion Gd total. c In vivo T1 Pencitraan MR dan analisis tikus setelah injeksi intravena HA-Gd2 O3 NP sebagai agen kontras. d Kuantifikasi perubahan sinyal (rasio SNR) di kandung kemih dan ginjal pada titik waktu yang berbeda setelah pemberian (n =3). *p <0,05
MR Imaging Di Vivo
Untuk menentukan aplikasi potensial in vivo, kinerja pencitraan MR dan nasib sirkulasi HA-Gd2 O3 NP (10 mg/kg) diselidiki menggunakan pemindai MRI dengan tikus BALB/c normal sebagai model. Dibandingkan dengan gambar pra-injeksi (Gbr. 4c), daerah ginjal dan kandung kemih yang lebih cerah seperti yang ditunjukkan oleh lingkaran putus-putus diamati dengan jelas pada 10 menit pasca-injeksi, menunjukkan bahwa HA-Gd2 O3 NP dapat digunakan sebagai peningkatan CA T1 relaksasi di organ-organ utama in vivo. Yang penting, peningkatan kontras HA-Gd2 O3 NP dipertahankan hingga 60 menit pasca injeksi, yang jauh lebih lama daripada molekul kecil kompleks Gd (waktu paruh sekitar beberapa menit pada hewan kecil) [27], menunjukkan bahwa HA-Gd2 O3 NP memiliki waktu retensi yang lebih lama secara in vivo daripada kontras komersial. Untuk menganalisis efek kontras MR secara kuantitatif, kami menghitung rasio signal-to-noise (SNR) dengan menganalisis daerah yang menarik dari gambar MRI dan menghitung nilai SNRpost /SNRsebelum untuk mewakili peningkatan sinyal relatif (RSE) (Gbr. 4d). Nilai RSE dari HA-Gd2 O3 NP di ginjal adalah 1,35, 1,99, dan 1,86. Demikian pula, nilai RSE dari HA-Gd2 O3 NP di kandung kemih lebih tinggi daripada di ginjal (1,29, 3,59, dan 2,26). HA-Gd2 O3 NP dengan ukuran besar (lebih dari 100 nm) menunjukkan waktu sirkulasi yang lama, kemudian dapat dieliminasi dengan jalur bilier-intestinal sesuai dengan hasil sebelumnya [32]. Selain itu, waktu sirkulasi yang lama in vivo mungkin telah meningkatkan penargetan pasif pada tumor dengan meningkatkan efek EPR.
Pencitraan Tumor
HA-Gd2 O3 NP dengan kinerja pencitraan MR yang sangat baik dan waktu sirkulasi yang lama memberikan peluang besar untuk pencitraan tumor melalui efek EPR. Dengan demikian kami menetapkan model tumor hati subkutan untuk menyelidiki apakah karsinoma hepatoseluler (HCC) dapat dideteksi oleh HA-Gd2 O3 MRI yang ditingkatkan NP. Setelah injeksi intravena HA-Gd2 O3 NP, kami mengamati bahwa wilayah tumor subkutan menjadi lebih terang daripada jaringan di sekitarnya seperti yang terlihat dengan pemindaian koronal dan transversal (Gbr. 5a). RES tumor subkutan secara dramatis mencapai 1,54 dan 1,83 dengan pemindaian transversal dan koronal, masing-masing, menunjukkan akumulasi efektif HA-Gd2 O3 NP di wilayah tumor melalui efek EPR. Temuan ini menunjukkan bahwa HA-Gd2 O3 NP sangat sensitif untuk visualisasi tumor MRI. Banyak penelitian menunjukkan bahwa waktu sirkulasi yang lama dapat meningkatkan efisiensi penargetan pasif melalui kebocoran pembuluh darah tumor padat [33].
T1 -pencitraan MR tertimbang (a ) dan analisis kuantifikasi yang sesuai (b ) tumor xenograft kanker hati tikus Heps setelah injeksi intravena HA-Gd2 O3 NP
Peningkatan Radiosensitisasi HA-Gd2 O3 NP
Performa luar biasa dari HA-Gd2 O3 NP sebagai T1 agen kontras mendorong kami untuk menentukan lokasinya di radiosensitisasi tumor secara akurat. Pertama, apakah peningkatan dosis terjadi dengan pengobatan kombinasi ini dieksplorasi menggunakan uji CCK-8. Seperti yang digambarkan pada Gambar. 6a, HA-Gd tunggal2 O3 NP (konsentrasi 0–200 μg/mL) tidak secara signifikan mempengaruhi viabilitas HepG-2, tetapi penyinaran sinar-X (kisaran 0–9 Gy) menurunkan viabilitas sel HepG-2 hingga kurang dari 70% pada 9 Gy. Yang penting, kombinasi penyinaran sinar-X dengan HA-Gd2 O3 NP secara dramatis menurunkan viabilitas sel HepG-2 menjadi kurang dari 50%, terutama pada konsentrasi 200 μg/mL pada 9 Gy. Selanjutnya, uji klonogenik dilakukan untuk mengevaluasi viabilitas sel dalam sel HepG-2 setelah kombinasi penyinaran sinar-X dan HA-Gd2 O3 NP. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 6b, HA-Gd tunggal2 O3 NP tidak memiliki pengaruh dramatis pada pembentukan koloni sel HepG-2, tetapi penyinaran sinar-X menurunkan pembentukan koloni sel HepG-2 menjadi 46,7%. Namun, pengobatan dengan penyinaran sinar-X dan HA-Gd2 O3 NP terutama menghambat kelangsungan pembentukan koloni sel hingga 29,8%. Gambar terkait selanjutnya memverifikasi radiosensitisasi HA-Gd2 O3 NP terhadap sel HepG-2.
Efek radiosensitisasi HA-Gd2 O3 NP in vitro. a Efek sinergis dari HA-Gd2 O3 NP (0 μg/mL, 12,5 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, dan 200 μg/mL) dan radiasi sinar-X (0 Gy, 3 Gy, 6 Gy, dan 9 Gy) pada viabilitas sel HepG2 menggunakan uji CCK-8. *p <0,05, **p <0,01, perbedaannya signifikan secara statistik. b Uji kelangsungan hidup koloni sel HepG2 yang diobati dengan HA-Gd2 O3 NP dan radiasi sinar-X dan c analisis kuantitatif yang sesuai dari kemampuan clonegenesis. d Kurva pertumbuhan volume tumor dari kelompok tikus yang berbeda setelah perawatan yang berbeda. Grup:a kontrol, b radiasi, c HA-Gd2 O3 NP, dan d radiasi + HA-Gd2 O3 NP. e Foto tumor yang dikumpulkan dari kelompok tikus yang berbeda pada akhir pengobatan
Efektivitas radioterapi in vitro mendorong kami untuk menerapkan HA-Gd2 O3 NP dikombinasikan dengan iradiasi untuk mengontrol pertumbuhan tumor pada tikus yang mengandung tumor. Volume tumor dalam kontrol dan HA-Gd tunggal2 O3 Perawatan NP tumbuh pesat dan keduanya meningkat 180%. Dibandingkan dengan perlakuan iradiasi tunggal 58%, HA-Gd2 O3 NP yang dikombinasikan dengan radiasi menunjukkan penghambatan tumor yang efisien sebesar 38% setelah 10 hari penyinaran (Gbr. 6d). Tumor difoto, dan rata-rata volume tumor pada setiap kelompok menunjukkan bahwa rata-rata volume tumor pada kelompok (a) adalah yang tertinggi sedangkan pada kelompok (d) adalah yang terendah di antara semua kelompok (Gbr. 6e). Hasil ini mengungkapkan bahwa HA-Gd2 . yang telah disiapkan O3 NP menjanjikan untuk menghambat pertumbuhan tumor di bawah iradiasi sinar-X.
Uji aliran cytometry dan uji pewarnaan hidup/mati dilakukan untuk lebih memahami mekanisme radiosensitisasi dalam pengobatan gabungan HA-Gd2 O3 NP dan radiasi sinar-X. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 7a, fluoresensi hijau intensif tanpa merah diamati pada sel HepG-2 yang diobati dengan HA-Gd2 tunggal. O3 NP, yang memverifikasi viabilitas sel yang tinggi. Sejumlah kecil fluoresensi merah diamati setelah perawatan radiasi sinar-X, menunjukkan tingkat apoptosis sel yang rendah. Namun, fluoresensi merah kuat diamati setelah pengobatan kombinasi HA-Gd2 O3 NP (200 μg/mL) dan radiasi, menunjukkan bahwa HA-Gd2 O3 NP dapat secara dramatis meningkatkan apoptosis sel yang diinduksi iradiasi sinar-X. Mekanisme radiosensitisasi HA-Gd2 O3 NP diselidiki lebih lanjut menggunakan flow cytometry. Seperti yang digambarkan pada Gambar 7b, radiasi tunggal dan HA-Gd2 O3 NP masing-masing menginduksi 27,55% dan 19,12% penangkapan fase G2/M. Namun, pengobatan kombinasi HA-Gd2 O3 NP dan radiasi terutama meningkatkan penghentian fase G2/M, mulai dari 30,89 hingga 33,27% dengan cara yang bergantung pada dosis. Sementara itu, pengobatan kombinasi menginduksi kematian sel apoptosis dari 10,63 menjadi 22,67%, sebagaimana tercermin dari proporsi sub-G1 ketika HA-Gd2 tunggal. O3 NP dan radiasi yang diinduksi 3,02% dan 13,87%. Untuk menyelidiki lebih lanjut kemungkinan mekanisme kematian sel, metode Annexin V-EGFP/PI dilakukan dengan flow cytometry. Sinyal emisi Annexin V-EGFP diplot pada x -sumbu, sementara sinyal emisi PI diplot pada y -sumbu (Gbr. 8). Jumlah sel nekrosis, sel apoptosis awal, sel apoptosis akhir, dan sel hidup ditentukan oleh persentase Annexin V
−
/PI
+
(Q3), Lampiran V
+
/PI
+
(Q2), dan Lampiran V
−
/PI
−
(Q4), masing-masing. Persentase apoptosis sel dalam kelompok kontrol dan HA-Gd tunggal2 O3 Kelompok NP (100 μg/mL) kurang dari 5%, menghasilkan pengaruh yang tidak kentara. Dibandingkan dengan kelompok perlakuan radiasi tunggal (8,8%), tingkat apoptosis kombinasi HA-Gd2 O3 NP dan radiasi meningkat dengan peningkatan konsentrasi mulai dari 50 hingga 200 μg/mL. Khususnya, tingkat apoptosis awal sel jelas meningkat menjadi 33,2%, dan apoptosis awal dan akhir mencapai 44,3% ketika konsentrasinya 200 μg/mL. Umumnya, kombinasi HA-Gd2 O3 NP dan iradiasi sinar-X memiliki efek sinergis pada pembentukan koloni sel, kelangsungan hidup sel dengan cara yang bergantung pada dosis, dan efek peningkatan radiosensitisasi. Berdasarkan hasil ini, HA-Gd2 O3 NP dapat menjadi alternatif yang efisien untuk meningkatkan radiosensitisasi untuk radioterapi.
Peningkatan dosis radiasi HA-Gd2 O3 NP. a Pewarnaan sel HepG2 hidup-mati. Hijau (pewarnaan fluorescein diacetate) =sel hidup, merah (pewarnaan propidium iodida) =sel mati. Bilah skala =200 mm. b Distribusi siklus sel setelah perlakuan yang berbeda dianalisis dengan mengukur kandungan DNA menggunakan uji flow cytometry
Analisis apoptosis HA-Gd2 O3 NP. a Tingkat apoptosis sel HepG-2 pada 24 h setelah pengobatan radiasi sinar-X. b Analisis kuantitatif yang sesuai
Kesimpulan
Sebagai kesimpulan, kami mengembangkan HA-Gd bifungsional2 O3 NP untuk pencitraan MR yang efektif dan radiosensitisasi tumor dalam proses hidrotermal satu pot. Setelah dilapisi dengan HA, HA-Gd yang disintesis2 O3 NP menunjukkan dispersibilitas yang baik dalam air, biokompatibilitas yang sangat baik. HA-Gd yang dihasilkan2 O3 NP yang mengenkapsulasi atom Gd tidak hanya secara efektif menunjukkan relaksivitas longitudinal yang tinggi (r1 ) untuk MRI sebagai T1 agen kontras, tetapi juga meningkatkan radiosensitivitas tumor dengan menginduksi apoptosis sel dan memblokir siklus sel sebagai radiosensitizer. Jadi, novel HA-Gd2 O3 NP menunjukkan potensi yang menjanjikan untuk diagnosis tumor dan radioterapi.
Bahan dan Metode
Materi
Fluorescein diacetate (FDA) dan propidium iodide (PI) diperoleh dari Sigma (New York, NY, USA). GdCl3 ·6H2 O, etilen glikol (99%) dibeli dari Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. (Lianyungang, Jiangsu, Republik Rakyat Tiongkok). Cell Counting Kit-8 (CCK-8) dibeli dari Dojindo (Kumamoto, Jepang). NaH2 PO4 , Na2 HPO4 , dan H2 JADI4 diperoleh dari Guangfu Fine Chemical Research Institute (Nankai, Tianjin, Republik Rakyat Tiongkok). Serum janin sapi dan medium esensial minimum Dulbecco (DMEM) dibeli dari Invitrogen China Limited (Shanghai, Republik Rakyat China). Semua bahan kimia memiliki tingkat analitik dan digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut.
Sintesis HA-Gd2 O3 NP
HA-Gd2 O3 NP disiapkan menggunakan pendekatan hidrotermal satu pot sebagai berikut:Pertama, 0,1 g HA dilarutkan dalam 20 mL air di bawah pengadukan kuat pada suhu sekitar semalaman. Selanjutnya, 0,1 g GdCl3 ·6H2 O dan 0,5 mL NaOH (1 M) ditambahkan, masing-masing. Kemudian, campuran diaduk selama 5 menit lagi untuk membentuk larutan bening yang homogen dan dipindahkan ke autoklaf 50 mL, disegel, dan diberi perlakuan hidrotermal pada suhu 120 ° C selama 6 jam. Setelah didinginkan sampai suhu kamar secara alami, suspensi transparan disaring dengan membran 0,22 m untuk menghilangkan aglomerasi berukuran besar. Larutan yang telah disiapkan kemudian didialisis terhadap air selama 3 hari dalam kantong dialisis dengan potongan berat molekul 14 kDa. Larutan dialisis dikumpulkan dan dikeringkan dengan menggunakan pengering beku vakum. HA-Gd2 O3 Bubuk NP diperoleh dan disimpan untuk karakterisasi lebih lanjut.
Instrumentasi dan Karakterisasi
Morfologi HA-Gd2 O3 NP diperiksa dengan mikroskop elektron transmisi resolusi tinggi pada mikroskop JEM-2100 (JEOL, Tokyo, Jepang) di bawah tegangan akselerasi 200 kV. Komposisi unsur HA-Gd2 O3 NP ditentukan dengan pengukuran XPS dalam spektrometer fotoelektron MK II, menggunakan Al-Ka (1486,6 eV) sebagai sumber sinar-X dan spektrometer Fourier transform infrared (FTIR) (Nicolet Nexus 470, GMI, Ramsey, MN, USA). Struktur kristal HA-Gd2 O3 NP dikarakterisasi melalui pola difraksi sinar-X (XRD) pada difraktometer Rigaku-D/MAX2500 (Rigaku, Jepang) yang dilengkapi dengan Cu Kα (λ =0,15405 nm) radiasi pada kecepatan pemindaian 4°/menit dalam kisaran dari 5 hingga 80°.
Uji Viabilitas Sel
Pengaruh HA-Gd2 O3 NP pada viabilitas sel dipelajari melalui Cell Counting Kit CCK-8 assay (CCK-8 assay). HepG2 (hepatokarsinoma manusia, Nomor ATCC:HB-8065) dan VSMCs (sel otot polos vaskular) diunggulkan dalam pelat 96-sumur dengan kepadatan 3 × 10
3
sel/sumur dan dikultur pada 37 °C dalam 5% CO2 inkubator selama 24 jam, kemudian menggunakan DMEM yang mengandung konsentrasi HA-Gd yang berbeda2 O3 NP (0 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, dan 200 μg/mL) menggantikan media pertumbuhan. Setelah inkubasi selama 4 h lagi, menambahkan 10-μL CCK-8 solusi untuk setiap sumur, sel diinkubasi selama 4h di tempat gelap. Absorbansi diukur pada 490 nm menggunakan Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader (Bio Tek, Winooski, VT, USA). Sel yang tidak diobati (dalam DMEM) digunakan sebagai kontrol, dan viabilitas sel relatif (rata-rata SD, n =5) dinyatakan sebagai Abssample/Abscontrol × 100%.
Uji Hemolisis
Secara singkat, 19–21 g, tikus BALB / c betina usia 6 minggu disiapkan dengan baik oleh Aturan Manajemen Hewan dari Kementerian Kesehatan Republik Rakyat Tiongkok. Tiga mililiter darah yang distabilkan dengan natrium heparin diperoleh dari pengambilan bola mata. Kemudian, disentrifugasi untuk menghilangkan supernatan dengan 1200 rpm, 15 min sesuai dengan literatur. Setelah itu dilakukan pencucian sedimentasi dengan PBS sebanyak lima kali untuk mendapatkan sel darah merah tikus (MRBCs), kemudian diambil darah sekitar 3 mL dengan membuang bola mata, distabilkan dengan natrium heparin, disentrifugasi (1, 200 rpm, 15 min) untuk menghilangkan supernatan menurut literatur [27], dicuci dengan PBS selama lima kali untuk mendapatkan sel darah merah tikus (MRBCs). Pengenceran sepuluh kali dengan PBS, MRBC 0,1 mL dipindahkan ke dalam tabung 1,5 mL yang telah diisi sebelumnya dengan 0,9 mL PBS yang mengandung konsentrasi partikel yang berbeda (50–200 μg/mL) HA-Gd2 O3 NP, 0,9 mL air (sebagai kontrol positif), dan 0,9 mL PBS (sebagai kontrol negatif), masing-masing. Campuran diinkubasi selama 2 jam pada suhu kamar setelah dikocok perlahan, kemudian disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 1 menit. Akhirnya, foto-foto semua sampel diambil dan absorbansi supernatan (hemoglobin) diukur dengan spektrofotometer UV-2450 UV-Vis. Persentase hemolisis dari sampel yang berbeda dihitung dengan membagi perbedaan absorbansi antara sampel, kontrol positif, dan negatif pada 541 nm.
MR Phantom Mempelajari In Vitro dan In Vivo
Gambar MR in vitro dan in vivo diperoleh pada pemindai MRI 3 Tesla (Magnetom Trio Tim, Siemens, Jerman). Untuk mempelajari T1 gambar hantu in vitro, solusi HA-Gd2 O3 NPs with different concentrations ranging from 0 to 16 mM was added to a 96-well culture plate, using the Magnevist (commercial MR contrast agent, Gd-DTPA) as control. For MR imaging in vivo, we chose the normal BALB/c mice as the model (n =4). Animal experiments were strictly conformed to the Animal Management Rules of the Ministry of Health of the People’s Republic of China. Ten milligrams per kilogram of HA-Gd2 O3 NPs filtering through sterilized membrane filters (pore size 0.22 μm) were intravenously injected into the animals, then immediately investigated with a MRI scanner. These samples for MR imaging in vitro and animals in vivo were imaged with the following parameters:TR/TE =300/10 ms, 256 × 256 matrices, slices =5, thickness =2 mm, averages =2, FOV =80 × 80.
Radiosensitization Effect In Vitro
CCK-8 assay was used to evaluate radiosensitizing activity of HA-Gd2 O3 NPs in vitro. Cells were seeded in five 96-well plates at a density of 3 × 10
3
cells/well, and each plate was treated at the same condition:cultured at 37 °C in 5% CO2 incubator for 24 h, then using DMEM containing different concentrations of HA-Gd2 O3 NPs (0 μg/mL, 12.5 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, and 200 μg/mL) replacing the growth medium. After incubation for 4 h, five plates were irradiated at different X-ray doses (0 Gy, 3 Gy, 6 Gy, and 9 Gy), 300 cGy/min, respectively. After radiation, all the plates were incubated for 4 h, then measuring the absorbance under the same parameters.
Clonogenic survival assay was also conducted to study the radiosensitization effect in vitro. HepG2 cells were seeded in six-well plates at 4.0 × 10
4
cells/well and allowed to grow for 16 h. The cells were incubated with HA-Gd2 O3 NPs diluted in cell culture medium for 6 h. The cells were then irradiated at 6 Gy using a clinical linear accelerator (Oncor, Siemens, Germany) with 6 MeV irradiation using a 10 cm × 10 cm radiation field at a source-to-skin distance (SSD) of 100 cm to cover the entire cells. Then, these irradiated cells were allowed to grow for 14 days, fixed with 4% paraformaldehyde at room temperature for 40 min, stained with a 1% crystal violet after washing the cells.
Live-Dead Staining Assay and Flow Cytometry
To study the radiosensitization effect of HA-Gd2 O3 NPs, HepG2 cells were seeded in six-well plates at a density of 4.0 × 10
4
cells/well and allowed to grow for 12 h and set six groups (control, HA-Gd2 O3 NPs, radiation, radiation + 50 μg/mL HA-Gd2 O3 NPs, radiation + 100 μg/mL HA-Gd2 O3 NPs and radiation + 200 μg/mL HA-Gd2 O3 NPs). When cells were grown to 80% in plates, the first group had no treatment, the second group was incubated with 100 μg/mL HA-Gd2 O3 NPs for 24 h, the third group was just irradiated, and the fourth group to the sixth group were irradiated and incubated with different concentrations of HA-Gd2 O3 NPs (50, 100, and 200 μg/mL) for 24 h, respectively. After that, FDA and PI working buffer were added for cell staining. The fluorescence of stained cells was observed under a fluorescence microscope (×20), and live cells showed green color and dead ones exhibited red color. Furthermore, cells by different treatments were washed three times with PBS, digested, collected, and centrifuged at a speed of 2000 rpm for 5 min, then fixed with 70% ethanol at − 20 °C overnight followed by PI staining. DNA fragmentation was quantified by the fluorescence intensity of PI on a flow cytometer (BD, Accuri, C6BD, Accuri, C6), analyzed by software (FLOWJO 7. 6. 2) to make clear the cell cycle distribution.
Radiosensitization Effect In Vivo
Female BALB/c mice with body weights of 19–21 g and ages of 6 weeks were obtained from the Yangzhou University Laboratory Animal Center under the standard conditions. Animal experiments were compliant with the Animal Management Rules of the Ministry of Health of the People’s Republic of China. A subcutaneous tumor model was established as the following procedures:First, 1 × 10
6
HepS cells were inoculated into mice intraperitoneal, and the ascites were collected after 5 days. Then, these ascites were injected into subcutaneous. When the tumor sizes reached approximately 100 mm
3
, subcutaneous tumors models were established and applied to the following experiments.
Eight mice bearing subcutaneous tumors per group were treated with radiation at 3 Gy per fraction to a total dose of 9 Gy within 7 days. The radiotherapy was conducted after 3 h intravenous injection of HA-Gd2 O3 NPs (10 mg/Kg), on a Siemens Primus clinical linear accelerator (6 MeV) using a self-made device to cover the entire tumor. These mice were anesthetized by 1% pentobarbital (50 mg/kg) to assure immobility during irradiation. The volume was measured and recorded every day, determined from caliper measurement, and calculated by the formulae:V =0.5 × a × b
2
, di mana V (mm
3
) is the volume of the tumor, and a (mm) and b (mm) are the tumor length and tumor width, respectively. Relative tumor volumes were normalized to their initial sizes. Each group was conducted on eight mice, wherein statistical analysis was performed using Student’s two-tailed t test (*p <0,05, **p <0.001).
Ketersediaan Data dan Materi
The data sets supporting the results of this article are included within the article.
