Pendekatan Mudah untuk Mempersiapkan Mikrosfer rGO@Fe3O4 untuk Terapi Kombinasi Kemo-fototermal yang Ditargetkan Secara Magnetik dan Responsif NIR

Abstrak

Grafena responsif cahaya dekat-inframerah (NIR) telah menunjukkan efek menarik pada terapi ablasi fototermal kanker. Berikut kami laporkan pembuatan Fe₃ O₄ -dekorasi mikrosfer graphene berongga (rGO@Fe₃ O₄ ) dengan metode pengeringan semprot dan kopresipitasi yang mudah untuk terapi kombinasi kemo-fototermal yang ditargetkan secara magnetis dan responsif terhadap NIR. Mikrosfer menampilkan luas permukaan spesifik yang sangat tinggi (~ 120,7 m² g⁻¹ ) dan volume pori besar (~ 1.012 cm³ g⁻¹ ), menunjukkan keunggulan berbeda untuk kapasitas pemuatan DOX yang tinggi (~ 18,43%). NIR memicu efek fototermal dari rGO@Fe₃ O₄ mikrosfer merespon secara on-off dan menginduksi efisiensi konversi fototermal yang tinggi. Apalagi The Fe₃ O₄ pada mikrosfer menunjukkan kemampuan penargetan sel tumor yang sangat baik. Perlakuan kemo-fototermal berdasarkan rGO@Fe₃ O₄ /DOX menunjukkan sitotoksisitas superior terhadap sel Hela in vitro. Studi kami menunjukkan bahwa rGO@Fe₃ O₄ Mikrokapsul /DOX memiliki potensi besar dalam kombinasi pengobatan kanker kemo-fototermal.

Pengantar

Kanker merupakan salah satu penyakit paling ganas di dunia dan merupakan penyebab utama kematian manusia [1, 2]. Meskipun kemoterapi umumnya digunakan dalam pengobatan kanker klinik, beberapa masalah utama termasuk efisiensi terapi yang rendah dan efek samping yang luas sangat membatasi penerapannya [3]. Sistem penghantaran obat (DDS) telah menunjukkan keuntungan besar dalam meningkatkan kelarutan obat, bioavailabilitas, dan akumulasi tumor, yang diharapkan dapat meningkatkan efisiensi antitumor mereka [4]. Baru-baru ini, mikrosfer berongga yang digunakan sebagai sistem penghantaran obat telah mendapatkan perhatian yang meningkat karena luas permukaannya yang besar dan struktur berpori yang melimpah [5,6,7,8], dan beberapa bahan mikrosfer berongga telah dirancang dengan teknologi inovatif [9,10,11 ,12,13].

Grafena oksida (GO), jenis baru dari bahan logam bebas anorganik, telah banyak diselidiki dalam penghantaran obat karena fitur uniknya, seperti biokompatibilitas yang baik, biaya rendah, dan persiapan yang sederhana [14,15,16,17]. Khususnya, graphene oxide dapat secara efektif mengubah cahaya menjadi panas ketika dipicu oleh iradiasi NIR [18,19,20], menjadi strategi yang menjanjikan untuk meningkatkan efek terapi fototermal kanker. Kelompok Chen telah melaporkan bahwa GO dapat menghantarkan obat antikanker melalui interaksi non-kovalen seperti penumpukan -π, ikatan hidrogen, dan adsorpsi elektrostatik [21]. Namun, nanosheet graphene oxide 2D cenderung menggumpal karena permukaan spesifik yang besar serta ikatan van der Waals di antara lapisan graphene [17, 22], menghasilkan kelarutan yang buruk dalam air dan menurunkan kemampuan pemuatan obat. Beberapa strategi telah dijajaki untuk mengatasi kekurangan tersebut. Grup Tsukruk telah mengembangkan kapsul berongga graphene menggunakan teknologi perakitan lapis demi lapis [23], yang menunjukkan pemuatan obat yang sangat tinggi dibandingkan dengan bahan GO lainnya. Ini dapat berkontribusi pada luas permukaan spesifik yang tinggi dan volume pori besar dari kapsul berongga yang distabilkan oleh GO. Namun, hanya sedikit laporan yang merujuk pada studi GO dengan struktur pori yang terhubung tiga dimensi untuk penghantaran obat.

Meskipun banyak sistem penghantaran obat yang dilaporkan telah menunjukkan kemampuan pemuatan obat yang unggul dan perilaku pelepasan obat yang terkontrol, penelitian dan aplikasi praklinisnya juga terbatas karena spesifisitas yang tidak memadai untuk menargetkan jaringan tumor [24]. Di antara berbagai sistem pengiriman target obat, Fe₃ O₄ , bahan target magnetik secara liar digunakan dalam terapi kanker karena respons magnetiknya yang tinggi, kualitas yang stabil, dan pencapaian yang mudah [25,26,27,28,29]. Grup Ni telah mengembangkan Fe₃ O₄ @SiO₂ nanopartikel struktur inti-cangkang dengan properti superparamagnetik untuk penargetan magnetik tumor [30]. Selanjutnya, Fe₃ O₄ nanopartikel GO berlabuh telah dipelajari dengan baik dalam kombinasi pengiriman target magnetik dan terapi fototermal [31,32,33,34].

Dalam penelitian ini, kami melaporkan strategi lanjutan untuk mengembangkan platform DDS yang terdiri dari mikrosfer berongga rGO yang didekorasi dengan oksida besi (rGO@Fe₃ O₄ ) untuk terapi fototermal (PTT) yang ditargetkan secara magnetis dan NIR yang dipicu. Seperti yang digambarkan dalam Skema 1, rGO@Fe₃ O₄ mikrosfer berongga disiapkan melalui tiga langkah. Pertama, rGO-SiO₂ disintesis dengan metode spray drying menggunakan SiO₂ sebagai templat dan kemudian mikrosfer berongga rGO diperoleh dengan menghilangkan SiO₂ dengan etsa HF. Setelah itu, Fe₃ O₄ nanopartikel ditambatkan ke mikrosfer berongga rGO untuk membangun rGO@Fe₃ O₄ mikrosfer. Dalam sistem ini, rGO berfungsi sebagai agen PTT yang dipicu NIR, dan Fe₃ O₄ dapat menawarkan properti penargetan magnetik menuju ke sel Hela. Doksorubisin (DOX), mikrosfer terenkapsulasi (rGO@Fe₃ O₄ /DOX) berdasarkan adsorpsi pori dan penumpukan -π, diharapkan menunjukkan kapasitas pemuatan obat yang sangat tinggi dan perilaku pelepasan obat yang responsif terhadap pH, dan dapat secara signifikan meningkatkan efek antikanker untuk kombinasi kemoterapi-fototermal.

Ilustrasi skema rGO@Fe₃ O₄ /DOX mikrosfer dan kombinasi fototermal-kemoterapi untuk penghambatan tumor

Bahan dan Metode

Materi

Besi klorida heksahidrat (FeCl₃ ·H₂ O), natrium hidroksida (NaOH), dan besi sulfat heptahidrat (FeSO₄ ·7H₂ O) dibeli dari Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Sel Hela berasal dari Rumah Sakit Kanker Tianjin. saline buffer fosfat (PBS)_, Doxorubicin hydrochloride (DOX·HCl), Dulbecco's minimum essential medium (DMEM), 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), dan cell counting kit-8 (CCK-8) dibeli dari Solarbio Science and Technology Co. , Ltd. SiO₂ (~ 300 nm) dibeli dari Shanghai Yuanjiang Chemical Company. Larutan air deion oksida grafena (2 mg/ml) adalah produk yang tersedia secara komersial dari Perusahaan Nanjing Xianfeng.

Persiapan rGO@Fe₃ O₄ Mikrosfer

Mikrosfer graphene berongga disiapkan melalui metode pengeringan semprot menggunakan SiO₂ (300 nm) sebagai templat. Secara singkat, 100 mL SiO₂ cairan suspensi (50 mg mL⁻¹ ) secara perlahan diteteskan ke dalam larutan berair GO 300 mL (2 mg mL⁻¹ ) di bawah pengadukan drastis, larutan campuran dikeringkan dengan semprotan pada 200 °C dalam unit pengering semprot. Selanjutnya, produk disimpan pada suhu 300 °C di bawah perlindungan Ar selama 2 h dan rGO-SiO₂ diperoleh. Untuk menghapus SiO₂ , rGO-SiO₂ ditempatkan dalam larutan HF (10%) selama 48 h pada 60 °C. Produk padat dicuci beberapa kali dan dikeringkan dalam oven pengering vakum pada suhu 60°C selama 12 jam, rGO akhirnya diperoleh dengan hasil 75%.

rGO@Fe₃ O₄ nanopartikel disiapkan melalui metode kopresipitasi. Dalam proses khas untuk sintesis rGO@Fe₃ O₄ nanopartikel, 0,27 g FeCl₃ ·H₂ O, 0,28 g FeSO₄ ·7H₂ O, dan 0,1 g rGO mikrosfer berongga dilarutkan dalam 10 mL air deionisasi dan diaduk selama 30 menit pada 50 °C. Kemudian 60 mL NaOH (0,15 mol L⁻¹ ) ditambahkan perlahan-lahan di bawah pengadukan terus menerus pada 50 °C selama 12 h. Produk akhirnya dipisahkan secara magnetis dan dicuci berulang kali dengan air deionisasi dan etanol beberapa kali diikuti dengan pengeringan pada suhu 60°C di bawah vakum selama 12 jam.

Karakterisasi Struktural

Ukuran dan morfologi sampel dianalisis menggunakan mikroskop elektron pemindaian emisi medan (FE-SEM, Hitachi, S-4800) dan mikroskop elektron transmisi (TEM, JEM2100F, JEOL). Komposisi produk dianalisis melalui sistem difraksi sinar-X (XRD, D8 Focus, radiasi Cu Ka, Bruker, Jerman) pada laju pemindaian 12 °/menit berkisar dari 10 hingga 80°. Juga, spektroskopi fotoelektron sinar-X (XPS) dilakukan pada spektrometer XPS (Thermo Fisher Scientific, ESCALAB 250Xi, America). FTIR (FT-IR, AVATAR360, Nicolet) direkam dari 500 hingga 4000 cm⁻¹ pada resolusi 4 cm⁻¹ . Pengukuran magnetik dilakukan menggunakan magnetometer perangkat interferensi kuantum superkonduktor (SQUID, Quantum Design MPMS) pada suhu kamar (300 K). Spektrum Raman dikumpulkan menggunakan spektroskop Raman (Renishaw, inVia Reflex, Inggris) dengan laser panjang gelombang 532 nm. Isi rGO dievaluasi menggunakan penganalisis termogravimetri (TGA, TA Instruments-water LLC, SDTQ-600). Luas permukaan spesifik diukur menggunakan teknik Brunauer-Emmett-Teller (BET). Spektrum UV-Vis direkam menggunakan penganalisis asam nukleat/protein Beckman DU 800 (Beck-man Instruments, Inc., Rosemead, CA).

Pemuatan dan Rilis DOX

DOX, model obat kemoterapi doxorubicin, dienkapsulasi ke dalam inti rGO@Fe₃ O₄ untuk mengevaluasi perilaku pemuatan dan pelepasan obat antikanker secara in vitro. rGO@Fe₃ O₄ /DOX disiapkan sesuai dengan referensi sebelumnya. Singkatnya, 10 mL (0.2 mg mL⁻¹ ) larutan berair DOX ditambahkan ke 10 mg rGO@Fe₃ O₄ larutan, campuran dihomogenkan secara ultrasonik untuk memastikan tidak ada presipitasi yang signifikan. Kemudian, campuran tersebut diseimbangkan pada reciprocating shaker (SK-O180-Pro) dengan kecepatan 150 rpm selama 24 h. Setelah sentrifugasi pada 6000 rpm selama 10 min, DOX yang tidak terbebani dibuang, supernatan rGO@Fe₃ O₄ /DOX diukur melalui spektrofotometer UV-Vis untuk menentukan jumlah DOX yang dimuat. OD DOX tercatat sebesar 490 nm, persamaan berikut digunakan untuk menghitung efisiensi pemuatan (LE) dan kapasitas pemuatan (LC) DOX:

$$ \mathrm{LE}=\left(\mathrm{total}\ \mathrm{jumlah}\ \mathrm{of}\ \mathrm{DOX}-\mathrm{Gratis}\ \mathrm{DOX}\right)/ \mathrm{total}\ \mathrm{jumlah}\ \mathrm{of}\ \mathrm{DOX} $$$$ \mathrm{LC}=\left(\mathrm{total}\ \mathrm{jumlah}\ \mathrm {of}\ \mathrm{DOX}-\mathrm{Gratis}\ \mathrm{DOX}\right)/\mathrm{jumlah}\ \mathrm{of}\mathrm{rGO}@{\mathrm{Fe}}_3 {\mathrm{O}}_4/\mathrm{DOX} $$

Studi pelepasan DOX in vitro dilakukan dengan meletakkan rGO@Fe₃ O₄ /DOX (10 mg) dalam kantong dialisis (MWCO =1000) dengan phosphate-buffered saline (PBS, 30 mL) pada pH 5.4, 6.5, atau 7.4, masukkan ke dalam penangas air 37 °C dan kocok pada 80 rpm. Pada interval yang telah ditentukan, 3 mL media pelepasan dikumpulkan dan jumlah DOX yang dilepaskan dihitung dengan mengukur UV-Vis pada 480 nm.

Efek Fototermal yang Dipicu NIR dari rGO@Fe₃ O₄ Mikrosfer

Untuk memantau pengaruh rGO@Fe₃ O₄ dosis pada efek fototermal yang dipicu NIR, rGO@Fe₃ O₄ larutan dengan konsentrasi berbeda (0,0625, 0,125, 0,25, 0,5, dan 1 mg mL⁻¹ ) disinari dengan laser NIR pada 2 W cm⁻² masing-masing selama 5 menit. Selanjutnya, pengaruh energi NIR terhadap efek fototermal dievaluasi dengan penyinaran rGO@Fe₃ O₄ (0,25 mg mL⁻¹ ) dengan kekuatan berbeda (1 W cm⁻² , 1,5 W cm⁻² , 2 W cm⁻² ) selama 5 menit. Suhu waktu nyata diukur menggunakan kamera termal inframerah FLIR I5.

Serapan In Vitro

Sel Hela diunggulkan dalam 35 mm² piring confocal dengan kepadatan 1 × 10⁵ sel / sumur. Setelah diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator (5% CO₂ , 37 °C), media dibuang, dan media segar yang mengandung rGO@Fe₃ O₄ /DOX mikrosfer dan rGO@Fe₃ O₄ /DOX dengan magnet ditambahkan dan diolah selama 5 h lagi. rGO@Fe₃ O₄ Konsentrasi /DOX adalah 0,1 mg mL⁻¹ . Sel kemudian dicuci tiga kali dengan PBS dingin (pH =7,4) dan difiksasi dengan larutan paraformaldehyde 4% selama 20 menit (CLSM, TCSSP5II, Leica, Ernst-Leitz-Strasse, Jerman).

Uji Viabilitas Sel

Sitotoksisitas mikrosfer ini dievaluasi dengan uji CCK-8 setelah pengobatan NIR. Sel HeLa diunggulkan ke piring 96-sumur (5 × 10³ sel/sumur) dalam 100 μL media dan dikultur dalam 5% CO₂ pada suhu 37 °C selama 24 jam. Untuk penilaian biokompatibilitas, rGO@Fe₃ O₄ ditambahkan ke sumur dengan rentang konsentrasi dari 0,01 hingga 0,2 mg mL⁻¹ ; untuk kelompok terapi fototermal tunggal, rGO@Fe₃ O₄ ditambahkan dengan rentang konsentrasi dari 0,01 hingga 0,2 mg mL⁻¹ , dan menerapkan penyinaran cahaya NIR selama 10 min (2 W cm⁻² , 808 nm); untuk kelompok gabungan fototermal-kemoterapi, rGO@Fe₃ O₄ /DOX ditambahkan dengan rentang konsentrasi rGO@Fe₃ O₄ /DOX dari 0,01 hingga 0,2 mg mL⁻¹ , dan menerapkan penerangan cahaya NIR selama 10 mnt (2 W cm⁻² ,808 nm). Sel-sel itu melanjutkan diinkubasi selama 24 jam atau 48 jam. Setelah itu, sel-sel dicuci dengan PBS dan diinkubasi dalam media DMEM 100 μL yang mengandung larutan CCK-8 10 μL selama 40 menit lagi. Viabilitas dideteksi menggunakan pembaca lempeng mikro pada panjang gelombang 450 nm. Semua eksperimen dilakukan dalam rangkap tiga.

Hasil dan Diskusi

Karakterisasi Sintesis dan Morfologi

Persiapan rGO@Fe₃ O₄ mikrosfer dilakukan melalui tiga langkah. Pertama, rGO-SiO₂ mikrosfer disintesis dengan pengeringan semprot menggunakan SiO₂ sebagai templat. Morfologi rGO-SiO₂ mikrosfer ditandai dengan SEM dan TEM. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 1a, rGO-SiO₂ mikrosfer dengan diameter 3 μm menunjukkan bentuk bola yang seragam dan terdiri dari banyak SiO₂ nanopartikel (~ 300 nm). Data TEM dan diameter hidrodinamik yang diukur dengan hamburan cahaya dinamis juga mengkonfirmasi hasilnya. (Gbr. 1d, g). Kemudian, mikrosfer rGO berongga diperoleh dengan menghilangkan SiO₂ dari rGO-SiO₂ dengan pemanasan pada 300 °C dan etsa HF. Pori-pori yang jelas dengan ukuran pori sekitar 300 nm dapat diamati karena SiO₂ pembubaran (Gbr. 1b, e). Akhirnya, Fe₃ O₄ berdasarkan kemampuan bertarget magnetik didekorasi ke rGO berpori dengan metode kopresipitasi. Pengamatan SEM dan TEM menggambarkan bahwa penurunan ukuran pori yang luar biasa setelah Fe₃ O₄ pemuatan diperoleh, (Gbr. 1c, f), memberikan kelayakan pengiriman obat dan pelepasan obat terkontrol. Khususnya, ukuran partikel dan distribusi ukuran hidrodinamik rGO-SiO₂ , rGO, rGO@Fe₃ O₄ tidak ada lagi perubahan yang terlihat selama perawatan ini (Gbr. 1g, h, i).

Karakterisasi morfologi mikrosfer. Gambar SEM dari (a ) rGO-SiO₂ , (b ) rGO, (c ) rGO@Fe₃ O₄; Gambar TEM dari (d ) rGO-SiO₂ , (e ) rGO, (f ) rGO@Fe₃ O₄; distribusi ukuran hidrodinamik dari sampel yang sesuai (g ) rGO-SiO₂ , (h ) rGO, (i ) rGO@Fe₃ O₄

Karakterisasi Struktur dan Komposisi

Untuk mengkonfirmasi lebih lanjut keberhasilan persiapan rGO@Fe₃ O₄ , SEM dengan EDS digunakan untuk menyelidiki struktur dan komposisi mikrosfer. Gambar EDS rGO@Fe₃ O₄ dicirikan dengan memvisualisasikan elektron yang tersebar secara inelastis di jendela kehilangan energi untuk unsur O, Fe, dan C, dan area warna yang berbeda masing-masing mewakili lokasi yang diperkaya O, Fe, dan C dalam struktur nyata. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 2a dan b, Fe dan O terdistribusi secara luas di rGO@Fe₃ O₄ mikrosfer dengan kepadatan beban tinggi. Gambar 2d menegaskan bahwa Fe₃ O₄ nanopartikel terdispersi secara merata dalam rGO dengan diameter sekitar 18 nm, menghasilkan penurunan tajam ukuran pori pada rGO@Fe₃ O₄ mikrosfer. Pola difraksi elektron area (SAED) yang dipilih selanjutnya memverifikasi keberadaan Fe₃ O₄ dalam rGO (Gbr. 2e), resonansi karakteristik dalam jarak muka 2.98 nm, 2.53 nm, 2.09 nm, 1.62 nm, dan 1,49 nm yang ditetapkan untuk bidang 220, 311, 400, 511, dan 440 bidang kubik berpusat muka fase Fe₃ O₄ , masing-masing. Puncak muncul pada 220, 311, 400, 511, dan 440 sesuai dengan Fe₃ O₄ juga terdeteksi dalam spektrum XRD, yang konsisten dengan hasil SAED (Gbr. 2c). Namun, dilaporkan bahwa Fe₃ O₄ dan -Fe₂ O₃ tidak dapat dibedakan dengan pola XRD secara independen untuk lokasi puncak karakteristik yang sama [35]. Hasil XPS menunjukkan bahwa puncak dominan pada 725.9/724.5 eV dan 714.1/711.0 eV, sesuai dengan Fe2p_1/2 dan Fe 2p_3/2 dari rGO@Fe₃ O₄ (Gbr. 2g, h), masing-masing, menunjukkan koeksistensi Fe³⁺ dan Fe²⁺ di Fe₃ O₄ [36]. Analisis termogravimetri (TGA) dilakukan untuk memantau perilaku degradasi termal rGO di rGO@Fe₃ O₄ mikrosfer dengan memanaskan sampel hingga 800 °C dan mendinginkan hingga 100 °C dalam atmosfer udara (Gbr. 2f). Kurva kehilangan massa menunjukkan dua daerah kehilangan massa yang berbeda termasuk daerah dehidrasi (40-300 °C) dan daerah devolatilisasi (300-800 °C) rGO di rGO@Fe₃ O₄ , kandungan karbon yang dihitung dari sampel adalah 25,6 wt.%.

Karakterisasi struktur dan komposisi rGO@Fe3O4. (a , b ) SEM dengan gambar pemetaan EDS rGO@Fe₃ O₄ mikrosfer:unsur C, Fe, dan O; (c ) pola XRD dari rGO-SiO₂ , rGO dan rGO@Fe₃ O₄ mikrosfer; (d , e ) gambar SEAD dari rGO@Fe₃ O₄ mikrosfer; (f ) Kurva TG dari rGO@Fe₃ O₄ mikrosfer; (g , h ) Spektrum XPS dari rGO@Fe₃ O₄ mikrosfer; (i ) Loop histeresis magnetik Fe₃ O₄ dan rGO@Fe₃ O₄ mikrosfer (bagian atas menunjukkan nilai medan koersif (Hc) sampel, dan bagian bawah menunjukkan suspensinya sebelum dan sesudah pemisahan magnetik oleh magnet eksternal)

Sifat magnetik rGO@Fe₃ O₄ mikrosfer diselidiki menggunakan perangkat interferensi kuantum superkonduktor. Medan magnet dilakukan dengan rentang pemindaian dari 20.000 hingga 20.000 Oe pada suhu kamar. Gambar 2i menunjukkan nilai magnetisasi saturasi (Ms) dan nilai medan koersif (Hc) Fe₃ O₄ adalah 66.6 emu g⁻¹ dan 9.3 Oe. Setelah memuat Fe₃ O₄ ke rGO, nilai Ms dan nilai Hc dari rGO@Fe₃ O₄ mikrosfer berkurang menjadi 33.9 emu g⁻¹ dan 7.44 Oe. Penurunan saturasi magnetik yang luar biasa dapat berkontribusi pada sifat diamagnetik rGO di rGO@Fe₃ O₄ mikrosfer. Selain itu, Kemampuan aglomerasi selektif rGO@Fe₃ O₄ mikrosfer dilakukan secara intuitif dengan eksperimen pemisahan magnetik. Penangguhan Fe₃ O₄ dan rGO@Fe₃ O₄ mikrosfer dimasukkan ke dalam vial dengan magnet luar selama 2 menit, suspensi dapat dipekatkan ke sisi magnet dan larutan berair menjadi transparan. Ketika magnet diambil, rGO@Fe₃ O₄ mikrosfer tersebar merata lagi setelah dikocok perlahan, menunjukkan bahwa rGO@Fe₃ O₄ mikrosfer yang memiliki kemampuan dispersi air yang baik. Kemampuan dispersi air yang sangat baik dan properti respons magnetik membantu aplikasi rGO@Fe₃ yang ditargetkan secara magnetis. O₄ sebagai pembawa obat dalam pengobatan kanker.

Analisis Efek Fototermal

Mempertimbangkan penetrasi yang lebih dalam ke dalam jaringan dan lebih sedikit kerusakan pada jaringan NIR di sekitarnya, terapi fototermal yang responsif terhadap NIR sering digunakan untuk pengobatan tumor. Oleh karena itu, perilaku transformasi fototermal rGO@Fe₃ O₄ larutan berair pada konsentrasi yang berbeda dan kepadatan daya yang berbeda dicatat di bawah iradiasi laser NIR pada 808 nm selama 5 min. Gambar 3a, b menunjukkan bahwa kenaikan suhu rGO@Fe₃ O₄ sangat tergantung pada konsentrasi dan kepadatan daya laser. Saat konsentrasi mikrosfer mencapai 1 mg mL⁻¹ , suhu dinaikkan dari 27,9 menjadi 70,3 °C di bawah penyinaran laser NIR selama 5 menit pada 2 W cm⁻² , sedangkan suhu untuk kelompok PBS baru naik dari 31,7 menjadi 36,2 °C. Efisiensi konversi fototermal yang tinggi dari rGO@Fe₃ O₄ akan memiliki potensi besar untuk terapi fototermal tumor menurut laporan sebelumnya bahwa degenerasi protein dan kerusakan DNA dalam sel akan terjadi (terjadi) pada paparan 50 °C selama 4 hingga 6 menit [21, 37]. Untuk secara intuitif menampilkan perilaku transformasi fototermal rGO@Fe₃ O₄ , termografi IR dilakukan dan hasilnya ditunjukkan pada Gambar. 4c. rGO@Fe₃ O₄ larutan dengan konsentrasi 1 mg mL⁻¹ dengan cepat meningkat menjadi 70,3 °C setelah penyinaran NIR selama 5 menit, sedangkan kelompok air tidak memiliki perubahan yang jelas, yang konsisten dengan hasil termometri. Selanjutnya, stabilitas fototermal rGO@Fe₃ O₄ dipelajari dengan melakukan prosedur nyala/mati laser dengan laser 808 nm pada 2 W cm⁻² selama enam siklus (Gbr. 3d). Peningkatan suhu yang identik diperoleh, menunjukkan stabilitas fototermal NIR yang sempurna dari rGO@Fe₃ O₄ komposit. Hasil ini menunjukkan bahwa rGO@Fe₃ O₄ mikrosfer sangat menjanjikan sebagai agen fototermal untuk terapi fototermal pada kanker.

Efek fototermal rGO@Fe3O4. a Perubahan suhu yang bergantung pada konsentrasi rGO@Fe₃ O₄ larutan pada konsentrasi yang berbeda (0,0625, 0,125, 0,25, 0,5, dan 1 mg mL⁻¹ ) di bawah penyinaran 808 nm pada 2 W cm⁻² selama 5 menit. b Respons suhu yang bergantung pada daya sebesar 0,25 mg mL⁻¹ rGO@Fe₃ O₄ larutan di bawah penyinaran laser NIR 808 nm selama 5 mnt (1 W cm⁻² , 1,5 W cm⁻² , 2 W cm⁻² ). c Gambar termal inframerah rGO@Fe₃ O₄ larutan pada interval 0, 1, 2, 3, 4, dan 5 min distimulasi pada 808 nm (2 W cm⁻² ). d Peningkatan suhu rGO@Fe₃ O₄ (0,25 mg mL⁻¹ ) solusi selama 6 siklus hidup/mati laser berturut-turut di bawah penyinaran 808 nm pada 2 W cm⁻²

Luas permukaan dan ukuran pori mikrosfer rGO@Fe3O4, perilaku pemuatan dan pelepasan DOX. a Isoterm adsorpsi-desorpsi nitrogen dari rGO@Fe₃ O₄ . b Distribusi ukuran pori rGO@Fe₃ O₄ . c Spektrum FTIR rGO@Fe₃ O₄ dan rGO@Fe₃ O₄ /DOX. d , e SEM dan pemetaan citra N, Fe, dan O dari rGO@Fe₃ O₄ /DOX mikrosfer. f Kurva kinetika pelepasan obat diperoleh pada nilai pH yang berbeda dari rGO@Fe₃ O₄ mikrosfer. g Kurva kinetik pelepasan DOX yang responsif terhadap NIR

Pemuatan dan Pelepasan Obat

Luas permukaan dan ukuran pori rGO@Fe₃ O₄ dievaluasi dengan analisis BET dan BJH (Gbr. 2a, b). N₂ Jenis kurva adsorpsi-desorpsi adalah tipe IV isotermal, dan luas permukaan dan ukuran pori adalah 120,7 m² g⁻¹ , 2-8 nm dan 1,012 cm³ g⁻¹ , masing-masing. Hasil penelitian menunjukkan bahwa rGO@Fe₃ O₄ memiliki saluran mesopori dan distribusi ukuran pori rata-rata, menunjukkan potensi besar untuk pemuatan obat anti-tumor. Kemudian, rGO@Fe₃ O₄ mikrosfer dengan struktur berpori disajikan untuk memuat model obat kemoterapi doxorubicin hanya dengan mencampur dan sedikit sonikasi. Analisis ATR-FTIR selanjutnya memverifikasi penggabungan stabil DOX di rGO@Fe₃ O₄ karena resonansi karakteristik gugus -COOH dan benzena DOX pada 1726 cm⁻¹ dan 1618 cm⁻¹ (Gbr. 4c). Pengamatan pemindaian mikroskop elektron (SEM) menunjukkan bahwa sinyal baru dari elemen N yang ditetapkan ke DOX didistribusikan secara merata di mikrosfer setelah pemuatan DOX (Gbr. 4d, e). Selain itu, efisiensi pemuatan DOX (LE) dan kapasitas pemuatan (LC) dari rGO@Fe₃ O₄ /DOX masing-masing adalah 92,15% dan 18,43%. LC yang sangat tinggi dari rGO@Fe₃ O₄ /DOX daripada banyak pembawa obat dapat berkontribusi pada luas permukaan dan ukuran pori yang sangat tinggi [19]. LE rGO@Fe yang tinggi₃ O₄ /DOX dapat dikaitkan dengan dua aspek, salah satunya adalah rGO@Fe₃ O₄ dapat berinteraksi dengan DOX melalui penumpukan –π yang kuat antara ikatan hibridisasi sp2 dari rGO@Fe₃ O₄ dan bagian kina dari DOX [21], dan satu lagi mungkin mereka dapat membentuk ikatan hidrogen antara gugus asam karboksilat (–COOH), hidroksil (–OH) dari rGO@Fe₃ O₄ dan amina (–NH₂ ), gugus hidroksil (–OH) dari DOX. Kemudian, kami memantau perilaku pelepasan DOX di PBS pada pH 7,4, 6,5, dan 5,4, untuk meniru lingkungan ekstraseluler tumor dan jaringan normal. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 4f, laju pelepasan DOX dipercepat ketika pH disesuaikan dari 7,4 menjadi 5,4, dan pelepasan DOX berkelanjutan pada pH 5.4 dapat mencapai 73% setelah pengobatan 98 h. Oleh karena itu, profil rilis kumulatif DOX dari rGO@Fe₃ O₄ menunjukkan cara yang bergantung pada pH. Pelepasan yang dipercepat ini dalam kondisi asam dapat disebabkan oleh protonasi parsial gugus hidroksil dan amina DOX, yang menyebabkan kelarutan obat yang lebih tinggi dan melemahnya ikatan hidrogen antara DOX dan graphene [38]. Lebih lanjut, kami juga mempelajari perilaku pelepasan DOX yang responsif terhadap NIR secara in vitro. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 4g, pelepasan DOX dipercepat oleh radiasi NIR dan laju pelepasan DOX mencapai 85%. Perilaku responsif terhadap rangsangan pH dan NIR ini memainkan peran penting dalam penghantaran obat yang efektif menuju lokasi tumor.

Serapan Sel In Vitro

Untuk memverifikasi kemampuan penargetan magnetik Fe₃ O₄ di rGO@Fe₃ O₄ mikrosfer, percobaan serapan seluler dengan atau tanpa perlakuan medan magnet diselidiki secara kualitatif dengan mikroskop pemindaian laser confocal (CLSM). Sel Hela diinkubasi dengan rGO@Fe₃ O₄ /DOX selama 4 h dan inti Hela diwarnai dengan DAPI. Hasil pada Gambar 5 menunjukkan bahwa noda hitam sesuai dengan rGO@Fe₃ O₄ mikrosfer dan sinyal fluoresensi merah intraseluler yang jelas ditugaskan untuk DOX diamati di rGO@Fe₃ O₄ kelompok dengan perlakuan medan magnet. Sebaliknya, bintik hitam lebih sedikit dan fluoresensi DOX yang lebih lemah dapat ditemukan ketika rGO@Fe₃ O₄ kelompok tanpa pembebanan medan magnet. Penjelasannya mungkin bahwa bintik hitam yang dikaitkan dengan rGO@Fe₃ O4 yang diinternalisasi ke dalam sel dapat dipromosikan oleh magnet. Hasil penelitian menunjukkan bahwa Fe3O4 dalam rGO@Fe₃ O4/DOX dapat secara khusus menargetkan sel Hela secara efisien dan secara signifikan meningkatkan internalisasi sel mikrosfer, menunjukkan kemampuan penargetan magnetik yang menguntungkan dari sistem penghantaran obat dalam terapi kanker.

Evaluasi target magnetik mikrosfer rGO@Fe3O4-DOX. Gambar CLSM dari rGO@Fe₃ O₄ /DOX menginkubasi sel HeLa dengan dan tanpa magnet (sisipan menunjukkan gambar pada perbesaran tinggi)

Analisis Sitotoksisitas In Vitro

Biokompatibilitas rGO@Fe₃ O₄ dievaluasi menggunakan uji CCK-8 terhadap sel Hela. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6a, setelah inkubasi dengan rGO@Fe₃ O₄ pada berbagai konsentrasi yang berbeda, viabilitas sel juga lebih tinggi dari 90% bahkan pada konsentrasi tinggi hingga 200 μg mL⁻¹ , hasilnya menunjukkan bahwa rGO@Fe₃ O₄ menunjukkan biokompatibilitas tinggi dan dapat berfungsi sebagai platform pengiriman obat yang efisien. Kemanjuran terapi fototermal rGO@Fe₃ O₄ diselidiki lebih lanjut setelah inkubasi dengan sel Hela selama 24 jam dan 48 jam di bawah iradiasi cahaya NIR (laser NIR 808 nm, 10 menit). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6b, fototoksisitas jelas bergantung pada dosis pada stimulasi NIR, dan viabilitas sel menurun dari 90,37 menjadi 35,52% pada 24 jam, dan dari 93,77 menjadi 31,75% pada 48 jam, menyiratkan bahwa rGO@Fe₃ O₄ memiliki fototoksisitas yang sangat baik dan sangat menjanjikan dalam terapi fototermal. Untuk memperkirakan kemanjuran terapi sinergis dari fototermal-kemoterapi, sitotoksisitas rGO@Fe₃ O₄ /DOX terhadap sel Hela dengan dan tanpa iradiasi NIR dipelajari. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6c, d, viabilitas sel menunjukkan cara yang bergantung pada konsentrasi dan waktu. Sekitar 65% dan 80% sel Hela dibunuh oleh rGO@Fe₃ O₄ /DOX tanpa penyinaran NIR dan DOX pada 24 h, penurunan kemampuan membunuh tumor dari rGO@Fe₃ O₄ /DOX dibandingkan dengan DOX gratis mungkin karena perilaku pelepasan DOX yang tertunda dari rGO@Fe₃ O₄ /DOX mikrosfer. Setelah penyinaran laser NIR (laser NIR 808 nm, 10 min), rGO@Fe₃ O₄ /DOX dengan kelompok laser membunuh lebih dari 86% sel pada dosis setara DOX (30 μg mL⁻¹ ). Hasil serupa dapat diamati setelah sel perlakuan yang sama selama 48 h, penurunan viabilitas sel DOX, rGO@Fe₃ O₄ /DOX, rGO@Fe₃ O₄ /DOX with NIR irradiation group was 80%, 76%, and 90%, respectively, indicating a synergistic effect of the combined photothermal therapy and chemotherapy.

The biocompatibility and the therapeutic efficacy of single photothermal therapy or combined photothermal-chemotherapy. a Cell viability of Hela cells cultured with rGO@Fe₃ O₄ for 24 h and 48 h. b Cell viability of Hela cells cultured with or without NIR irradiation at different concentrations of rGO@Fe₃ O₄ for 24 h and 48 h. (c , d ) Cell viability of Hela cells cultured with free DOX, rGO@Fe₃ O₄ /DOX microspheres for 24 h and 48 h with and without NIR irradiation (808 nm, 2 W cm⁻² ) (*p <0,05, **p <0,01, ***p <0.001)

Conclusions

In summary, we explored a facile strategy to construct rGO-based drug delivery platform rGO@Fe₃ O₄ /DOX for synergistic photothermal-chemotherapy. rGO@Fe₃ O₄ /DOX microsphere exhibited excellent NIR-triggered PTT effect and perfect NIR photothermal stability. Fe₃ O₄ on the microspheres ensured excellent tumor cells targeting ability. DOX could be encapsulated into rGO@Fe₃ O₄ with an ultrahigh drug-loading capacity and a pH-responsive drug release behavior could be simultaneously achieved. In addition, an enhanced antitumor efficiency was achieved when a combination of chemotherapy and photothermal therapy. Therefore, this multifunctional drug delivery platform could be a promising candidate for tumor targeting and combinatorial cancer therapy in the future.