Multi-mode biodegradable tumor-microenvironment sensitif nanopartikel untuk pencitraan kanker payudara yang ditargetkan

Abstrak

Agen kontras ultrasound (AS) yang diisi gas dengan mudah runtuh di dalam tubuh, dan gas dapat dengan mudah meluap, yang membatasi efektivitas pencitraan AS. Untuk mengatasi masalah ini, sistem multi-mode penghasil gas injeksi dikembangkan yang membawa zat kontras negatif MR Fe₃ O₄ , pewarna fluoresen Cy5.5, dan CO₂ melepaskan donor (Na₂ CO₃ ). Nanopartikel dapat terus menghasilkan karbon dioksida (CO₂ ) gas dalam jaringan tumor asam dalam tubuh, memberikan tumor sinyal gema yang kuat di bawah pencitraan ultrasonik. Selain itu, nanopartikel memberikan efek yang sangat baik untuk MR dan pencitraan fluoresensi dari jaringan tumor. Hasilnya menunjukkan bahwa sistem NP yang responsif terhadap pH ini memberikan efek yang baik dalam pencitraan MR/US/fluorescent. Studi ini memberikan referensi yang berguna untuk pencitraan tumor multi-mode.

Pengantar

Dalam praktek klinis, microbubbles terutama diterapkan sebagai agen kontras ultrasound untuk pencitraan real-time dari berbagai organ dan pembuluh darah [1,2,3]. Agen kontras ultrasound tradisional biasanya terdiri dari bahan seperti lipid atau protein yang membungkus udara atau gas perfluorokarbon. Spesies gas yang dienkapsulasi dalam mikrosfer memiliki stabilitas yang rendah dalam darah dan waktu paruh yang pendek karena difusi cepat dari cacat gelembung mikro [4,5,6]. Selain itu, karena ukuran partikel gelembung mikro berisi gas biasanya besar (sekitar 1 hingga 8 μm), sulit bagi gelembung mikro untuk menembus ke dalam lingkungan tumor inang melalui ekstravasasi jaringan. Oleh karena itu, aplikasi gelembung berukuran mikron saat ini dalam pencitraan intravaskular terbatas [7]. Agen kontras ultrasound yang ideal umumnya harus menunjukkan ukuran optimal untuk transportasi melalui ruang vaskular jaringan, durasi efek akustik yang memadai, penargetan dan biokompatibilitas yang baik, dan ekskresi yang mudah dari tubuh [8, 9]. Konsep "penghasil nanopartikel gas" telah diusulkan dalam penelitian sebelumnya, dan nanopartikel tersebut memiliki potensi untuk digunakan dalam pencitraan kontras ultrasound [10,11,12]. Nanopartikel penghasil gas ini lebih unggul daripada gelembung mikro berisi gas saat ini dalam kinerjanya, dan gas yang dihasilkan secara terus-menerus memungkinkan pencitraan ultrasound yang intens. Nanopartikel penghasil gas dapat meningkatkan permeasi dan retensi, dan mereka dapat bersirkulasi secara stabil dalam darah dan secara efektif terakumulasi dalam jaringan tumor [13, 14].

Masih merupakan tantangan untuk mendeteksi tumor kecil dan tersembunyi dengan metode pencitraan tradisional, seperti magnetic resonance imaging (MRI), computed tomography (CT), dan ultrasound, yang dibatasi oleh waktu akuisisi yang lama, dosis radiasi yang tinggi, dan sensitivitas yang buruk [15 , 16]. Hal ini diperlukan untuk mengintegrasikan metode pencitraan yang berbeda dan mengembangkan teknologi pencitraan multi-modal untuk mencapai sinergi mengintegrasikan untuk deteksi dini kanker [17,18,19]. Oksida besi superparamagnetik (Fe₃ O₄ ) nanopartikel dapat digunakan sebagai agen kontras MRI negatif dalam pencitraan T2-weighted [20, 21]. Biaya₃ O₄ memiliki sifat keseluruhan yang menarik, termasuk ukuran partikel kecil, penetrasi kuat, magnetisasi tinggi, metabolisme yang baik, dan toksisitas yang relatif rendah [22, 23]. Biaya₃ O₄ agen kontras untuk diagnosis MRI kanker stadium awal telah dipelajari secara ekstensif karena relaksasi dan kontrasnya yang tinggi [24,25,26]. Selain itu, pencitraan fluoresensi waktu nyata memiliki resolusi yang sangat baik dan dapat menjadi metode yang berharga untuk menentukan stadium tumor, memandu reseksi tumor, dan memantau efek pengobatan [27, 28].

Di sini, nanopartikel ini terutama dienkapsulasi oleh asam poli (laktat-co-glikolat) (PLGA), yang telah disetujui oleh Food and Drug Administration (FDA) untuk digunakan sebagai bahan biosafe [29, 30]. Partikel PLGA dimodifikasi dengan peptida RGD untuk memungkinkan pengikatan integrin αvβ3 pada permukaan sel kanker payudara dan dengan Cy5.5 sebagai pewarna fluoresen untuk pencitraan in vivo, dan mereka dienkapsulasi dengan Fe₃ O₄ untuk bertindak sebagai agen kontras T2-negatif di MRI (Skema 1a). Karena glikolisis yang diregulasi dalam jaringan tumor, yang dapat menghasilkan lebih banyak asam laktat dan proton di lingkungan ekstraseluler, pH jaringan tumor (6,8-7,2) lebih rendah daripada jaringan normal (pH 7.4) [31,32,33] . Jadi, kami merancang natrium karbonat (Na₂ CO₃ ) di PLGA untuk menghasilkan CO₂ gelembung pada pH yang lebih rendah dari jaringan tumor untuk pencitraan ultrasound. Untuk memverifikasi aplikasi menjanjikan mereka dalam pencitraan tumor, sifat komprehensif dari nanopartikel multi-mode ini untuk pencitraan in vitro secara sistematis ditandai, termasuk sitotoksisitas, spesifisitas penargetan, dan biodistribusi dalam jaringan tumor, dengan tiga mode pencitraan.

a Diagram skematis fungsi dalam Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NP melalui akumulasi yang ditargetkan ke dalam tumor dan menghasilkan CO₂ gelembung dalam jaringan tumor asam, diikuti oleh pencitraan MR / US / FI triple-modal dari kanker payudara. b Ilustrasi skema persiapan Fe₃ O₄ / Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NP.

Hasil dan diskusi

Sintesis dan karakterisasi Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP

Tidak₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP dirancang sebagai agen kontras multi-mode bertarget RGD dengan mengenkapsulasi polimer biokompatibel PLGA dengan Fe₃ O₄ dan Na₂ CO₃ dan agen bertarget integrin melalui ikatan kimia yang dapat terurai secara hayati (Skema 1b).

Gambar mikroskop elektron transmisi menunjukkan bahwa Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP adalah bola bening dengan partikel oksida besi yang tersebar merata terlihat di cangkang (Gbr. 1a). Ukuran hidrodinamik rata-rata NP diukur sebagai 117,6 nm dengan hamburan cahaya dinamis, dan indeks polidispersitas rata-rata adalah 0,234 (Gbr. 1b). Muatan permukaan NP dikonfirmasi oleh pengukuran potensial zeta menjadi 21,7 mV (Gbr. 1c). Pengukuran spektrum fluoresensi mengungkapkan bahwa Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD memiliki panjang gelombang emisi maksimum pada 685 nm, menunjukkan bahwa Cy5.5 berhasil dienkapsulasi dalam inti PLGA (Gbr. 1d). Nilai magnetisasi saturasi untuk Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD dan Gratis Biaya₃ O₄ NP masing-masing sama dengan 32,6 dan 42,5 emu/g (Gbr. 1e). Temuan ini menunjukkan karakteristik superparamagnetik dari nanopartikel pada suhu kamar. Spektrum FITR dari Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD menunjukkan bahwa vibrasi ulur N-H dan puncak serapan –OH muncul sekitar 3432 cm⁻¹ . Selain itu, kami menemukan peningkatan (1628 cm⁻¹ ) dari getaran regangan C =O. Dibandingkan dengan NP non-target, puncak karakteristik (karboksil) pada 1735 cm⁻¹ dari NP yang ditargetkan berkurang secara signifikan. Hasil penelitian menunjukkan adanya ikatan antara gugus karboksil pada permukaan mikrosfer dengan gugus amino pada peptida RGD. Pengikatan in vitro dari Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP ditunjukkan pada Gambar. 1f.

Gambar TEM (a ) Distribusi ukuran (b ) Potensi Zeta (c ) dari Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NP. d Spektrum emisi fluoresensi Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD dan Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/cRGD NP. e Kurva histeresis magnetik Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NP dan Fe₃ O₄ NP. f FTIR spektrum Fe yang ditargetkan₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD dan NP PLGA yang tidak ditargetkan

Pengikatan in vitro NP Na2CO3/Fe3O4@PLGA/Cy5.5/RGD

vβ3 integrin umumnya sangat diekspresikan pada sel-sel endotel tumor kanker payudara dan dapat meningkatkan metastasis tumor [33,34,35,36]. Imunofluoresensi seluler untuk ekspresi v integrin dalam sel MDA-MB-231 jauh lebih tinggi daripada di sel MCF-7; Sel A549 berfungsi sebagai kontrol positif (Gbr. 2a). Serapan seluler NP dipelajari oleh CLSM (Gbr. 2b). Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP menunjukkan tingkat pengikatan yang jauh lebih tinggi ke sel MD-MB-231 daripada NP yang tidak ditargetkan. Gambar fluoresensi juga mengungkapkan bahwa Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP terikat ke sitoplasma sel, dan gambar gabungan menunjukkan lokasi yang sama dengan ekspresi v integrin [37, 38].

a Gambar fluoresensi confocal dengan ekspresi v integrin pada sel MB231, A549, dan Mcf-7. Biru dan hijau masing-masing mewakili fluoresensi DAPI dan v. b Gambar fluoresensi confocal dari sel MB231 yang diinkubasi dengan Fe₃ targeted yang ditargetkan O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NP dan NP yang tidak ditargetkan. Biru, merah, dan hijau, masing-masing mewakili DAPI, Cy5.5, dan v fluoresensi. c Viabilitas relatif sel MB231 yang diinkubasi dengan konsentrasi Fe₃ . yang berbeda O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NP

Uji sitotoksisitas

Sitotoksisitas in vitro dari Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP diperkirakan dalam sel MDA-MB-231 menggunakan uji CCK8, sementara sel A549 dan MCF-7 yang diobati dengan NP digunakan sebagai kontrol (Gbr. 2c). Pada kisaran konsentrasi Fe 5-80 μg/mL, viabilitas sel A549 dan sel MB231 tidak berkurang secara signifikan, dan keduanya berada di atas 70%. Sebaliknya, sel MCF-7 menunjukkan penurunan viabilitas sel yang signifikan hingga sekitar 50% pada konsentrasi Fe yang lebih tinggi dari 40 μg/mL. Hasil CCK8 menunjukkan bahwa Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP menunjukkan sitotoksisitas yang jauh lebih rendah dalam sel MDA-MB-231 selama rentang konsentrasi tertentu.

Pencitraan kontras in vitro

Kami menggunakan phantom gel agar untuk mempelajari kinerja Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP in vitro pada nilai pH yang berbeda (Gbr. 3a). Gambar kontras ultrasound Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP ditingkatkan secara signifikan pada pH asam lemah (pH 6.8) dibandingkan dengan pH 7.2, kemungkinan karena pH 7.2 tidak menghasilkan CO yang cukup₂ gelembung untuk pencitraan ultrasound. Sebaliknya, ketika NP berada di lingkungan asam yang lemah, gelembung yang cukup dapat dihasilkan untuk pencitraan ultrasound. Karakteristik ini relevan dengan tumor, yang menunjukkan heterogenitas jaringan yang tinggi dan tingkat pH yang beragam (pH 6,8-7,2) in vivo [32, 39, 40]. Intensitas sinyal dari gambar ultrasound kemudian dianalisis (Gbr. 3b). Rasio intensitas sinyal dari kelompok NP yang tidak ditargetkan (pH =7), NP yang tidak ditargetkan (PH =5), NP yang ditargetkan (PH =7), dan NP yang ditargetkan (PH =5) relatif terhadap intensitas sinyal dari kelompok kosong adalah 112%, 145%, 167%, dan 178 ± 4%, masing-masing, yang dengan jelas menunjukkan bahwa kelompok NP yang ditargetkan (PH =5) memiliki sinyal AS terkuat.

a Gambar ultrasonik dari NP yang ditargetkan dan NP yang tidak ditargetkan direkam pada nilai pH yang berbeda (7,2 dan 6,8), PBS sebagai kontrol. b Laju intensitas sinyal dihitung dengan sampel/kosong, sampel mewakili intensitas gema dari NP yang ditargetkan dan non-target, dan kosong mewakili intensitas gema PBS. c Gambar MR berbobot T2 dari Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NP dengan konsentrasi Fe berbeda (0,0625, 0,125, 0,25, 0,5, dan 1 mM). d Relativitas transversal (r2) adalah 19,597 mM⁻¹ s⁻¹ untuk Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NP

Untuk studi MRI in vitro, sebagai konsentrasi Fe dalam Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP meningkat, intensitas sinyal pembobotan T2 menunjukkan penurunan yang signifikan, menunjukkan kemungkinan NP ini untuk digunakan sebagai agen kontras T2 MR (Gbr. 3c). Laju relaksasi transversal (r2) dari Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP dihitung menjadi 19,597 mM⁻¹ s⁻¹ . Meskipun laju relaksasi transversal (r2) dari Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP lebih rendah daripada banyak agen superparamagnetik MRI lainnya, komposisi Fe₃ O₄ dapat meningkatkan r2, yaitu 2,94 kali lebih tinggi dari r2 partikel SPIO yang digunakan secara klinis.

Pencitraan kontras ultrasonografi Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP

Untuk menunjukkan potensi Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP untuk pencitraan ultrasound pada tumor, kami memberikan injeksi Na₂ vena ekor CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP ke tikus telanjang xenograft kanker payudara dan memantau gambar ultrasound sebagai fungsi waktu (Gbr. 4a). Sebelum injeksi, gambar tumor, hati, dan daerah subkutan direkam. Segera setelah injeksi, area jaringan tumor tidak menunjukkan peningkatan kontras. Peningkatan area tumor diamati mulai 30 menit setelah injeksi dan berlangsung selama 90 menit. Hasil USG in vivo menunjukkan bahwa Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/ RGD NP menghasilkan gelembung yang cukup dalam jaringan tumor asam untuk menghasilkan reflektifitas echogenic untuk pencitraan ultrasound. Sebagai kontrol, kami juga memperoleh gambar hati dan jaringan subkutan pada waktu yang berbeda setelah injeksi NP yang ditargetkan. Sepanjang periode pengamatan, tidak ada peningkatan signifikan yang ditemukan di area injeksi subkutan, dan peningkatan di hati, yang menurun seiring waktu, secara signifikan lebih rendah daripada tumor (Gbr. 4b). Hasil ini menunjukkan bahwa Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP yang bersirkulasi dalam tubuh pada pH fisiologis tidak menghasilkan CO dalam jumlah besar₂ gelembung untuk peningkatan kontras ultrasound.

a Pencitraan ultrasonografi in vivo tumor, hati, dan area subkutan pada waktu yang berbeda setelah injeksi Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NP. b Laju intensitas gema sebagai fungsi waktu dihitung dengan jaringan/kosong, jaringan mewakili intensitas gema tumor, hati, atau area subkutan, blanko mewakili intensitas gema sebelum injeksi

MRI Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP

Untuk MRI in vivo, untuk menunjukkan bahwa NP dapat digunakan untuk pencitraan spesifik tumor, Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP disuntikkan langsung ke tumor dan otot. Hasil menunjukkan bahwa area tumor menunjukkan penurunan yang signifikan pada kontras T2-MR setelah injeksi NP yang ditargetkan, dan intensitas sinyal menurun secara signifikan dari 8875 pada 0 min menjadi 5972 pada 120 min setelah injeksi (Gbr. 5a, b). Namun, dengan jumlah nanopartikel yang sama yang disuntikkan, area otot subkutan menunjukkan penurunan sinyal T2 yang jauh lebih rendah. Temuan ini menunjukkan efektivitas Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP dengan agen kontras T2-MR bertarget integrin yang hipersensitif untuk digunakan dalam pencitraan bertarget tumor. Pada kelompok injeksi vena ekor, pencitraan T2-MR juga menunjukkan penurunan kontras yang jelas pada tumor pada 24 jam pasca injeksi, menunjukkan akumulasi tumor yang tinggi dari Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP (Gbr. 5c, d). Selain itu, penurunan sinyal T2 diamati di hati dan ginjal, menunjukkan bahwa ion besi di NP dapat dengan cepat dibersihkan dari tubuh. Oleh karena itu, MRI mengungkapkan bahwa Fe yang dibungkus PLGA₃ O₄ nanopartikel menunjukkan penargetan tumor pasif yang efisien melalui efek peningkatan permeabilitas dan retensi (EPR), terutama penargetan yang dimediasi RGD, tetapi dapat terurai dan dengan cepat diekskresikan secara in vivo.

a Gambar T2-MR in vivo dari jaringan subkutan normal dan tumor sebelum dan sesudah injeksi Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NP. b Intensitas sinyal rata-rata di otot dan tumor untuk injeksi Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NP. c Gambar T2-MR pada aksial dan koronal tikus tumor MDA-MB-231 sebelum dan sesudah injeksi Fe₃ intravena O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NP. d Rasio intensitas sinyal dihitung dengan jaringan/otot, jaringan mewakili intensitas sinyal tumor, hati, dan ginjal sebelum dan sesudah injeksi NP yang ditargetkan, otot mewakili intensitas sinyal otot pada saat yang sama

Pencitraan dan histologi fluoresensi

Dua ratus mikroliter NP disuntikkan secara intravena ke tikus untuk pencitraan fluoresensi in vivo. Pada kelompok yang disuntik dengan NP bertarget RGD, sinyal fluoresensi Cy5.5 secara bertahap meningkat di area tumor dan mencapai puncaknya pada 4 jam setelah injeksi, menunjukkan bahwa Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP dapat terakumulasi secara efektif di tumor. Pada kelompok yang tidak ditargetkan, NP didistribusikan ke seluruh tubuh setelah injeksi dan dibersihkan dengan cepat, dan mereka tidak terakumulasi dalam tumor untuk jangka waktu yang lama (Gbr. 6a). Tikus kemudian dibedah, dan organ utama serta tumor dikumpulkan untuk pencitraan fluoresensi in vitro, yang mengungkapkan serapan tumor yang tinggi dari NP yang ditargetkan (Gbr. 6b, c). Intensitas fluoresensi Cy5.5 pada tumor tikus yang disuntik dengan NP yang ditargetkan adalah 1,5 kali lipat dari pada tikus yang disuntik dengan NP yang tidak ditargetkan.

a Pencitraan fluoresensi fluoresensi in vivo hewan pada 0, 0,5, 1, 2, dan 3 jam pasca injeksi setelah injeksi NP yang ditargetkan dan tidak ditargetkan. b Gambar fluoresensi ex vivo tumor dan organ utama (hati, limpa, paru-paru, jantung, dan ginjal) dikumpulkan dari hewan. c Intensitas fluoresensi rata-rata dari berbagai organ dan tumor

Selanjutnya, penargetan khusus tumor dari Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP diverifikasi oleh pencitraan fluoresensi jaringan dari bagian tumor beku (Gbr. 7a). Pewarnaan imunofluoresensi bagian tumor dengan antibodi terhadap v dan 3 integrin mengungkapkan ekspresi signifikan vβ3 integrin dalam jaringan tumor. Fluoresensi integrin v dan 3 digabungkan dengan fluoresensi Cy5.5 dari Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP untuk mendapatkan gambar imunostaining yang mengungkapkan kolokalisasi. Hasil imunofluoresensi pada jaringan tumor menunjukkan bahwa Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP secara khusus mengikat integrin vβ3 pada kanker payudara ganas MB231. Selain itu, pewarnaan H&E Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP dibandingkan dengan kelompok yang tidak ditargetkan menunjukkan bahwa semua bagian jaringan organ memiliki morfologi patologis normal dan tidak ada respons kerusakan histopatologis (Gbr. 7b). Semua hasil sitotoksisitas dan analisis histologis di atas menunjukkan bahwa Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP tidak menyebabkan toksisitas signifikan terhadap jaringan organ utama in vivo, dan biokompatibilitasnya yang baik dapat dikaitkan dengan PLGA.

a Pencitraan fluoresen bagian beku tumor MDA-MB-231 dari tikus yang disuntik dengan NP yang ditargetkan dan tidak ditargetkan. Hijau, merah, ungu, dan biru masing-masing mewakili fluoresensi v, 3, Cy5.5, dan DAPI. b Irisan tumor bernoda H&E yang dikumpulkan dari tikus setelah injeksi NP yang ditargetkan dan yang tidak ditargetkan

Kesimpulan

Kesimpulannya, hasil di atas menunjukkan pendekatan yang kreatif dan sukses untuk MRI kanker payudara melalui penargetan magnetik dan sistem penghasil gas yang diaktifkan di lingkungan mikro tumor. Tidak₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP menunjukkan kinerja pencitraan yang sangat baik dan biokompatibilitas yang baik dalam mode pencitraan MR/ultrasound/fluorescent. Pekerjaan kami menunjukkan potensi kuat untuk diagnosis tumor dengan pencitraan multi-modal yang ditingkatkan.

Bahan dan metode

Materi

Poli (asam laktat-co-glikolat) (PLGA) (laktida:glikolida =75:25, Mw =20.000), pewarna Cyanine5.5, dan polivinil alkohol (PVA) dibeli dari Sigma-Aldrich Company (Shanghai, Cina). Peptida RGD disintesis khusus oleh GenicBio BioTech Co. Ltd. (Shanghai, Cina). Biaya₃ O₄ nanopartikel dan natrium karbonat (Na₂ CO₃ ) dibeli dari Xian Ruixi Biological Technology Co. Ltd. (Henan, Cina). Diklorometana (CH₂ Kl₂ ) dan dimetil sulfoksida (DMSO) diperoleh dari Solarbio Company (Beijing, Cina). Semua bahan kimia memiliki tingkat analitis.

Sintesis Fe3O4/Na2CO3@PLGA/Cy5.5/cRGD nanopartikel

Pertama, 12,5 mg PLGA dan 0,25 mL kloroform dicampur bersama. Kemudian, 5 μL Cy5.5, 15 μL nanopartikel magnetik termodifikasi asam oleat didispersikan dalam kloroform (OA@Fe₃ O₄ , 10 mg/mL), 5 μL natrium karbonat (Na₂ CO₃ ), dan 1,5 mL larutan PVA 1% ditambahkan secara berurutan dan diemulsi dengan prosesor ultrasonik selama 2 min. Kemudian, 12,5 mL larutan PVA 0,3% ditambahkan dan diaduk selama 3-4 h pada suhu kamar, dan 12,5 mL larutan PVA 0,4% ditambahkan untuk diaduk (500 rpm/menit) semalaman untuk menghilangkan sisa pelarut organik. Larutan di atas mengalami beberapa pencucian ultrafiltrasi dengan ddH₂ O dan kemudian diencerkan dengan buffer PB (pH =7,4) hingga volume akhir 1,25 mL. Selanjutnya, 0,25 mg EDC dan 1,25 mg NHS ditambahkan ke larutan campuran di atas. Campuran diaduk selama 30 menit pada 25 ° C dan kemudian, dicuci tiga kali dengan ultrafiltrasi dan disuspensikan kembali dalam larutan buffer PB (pH =7,4). Selanjutnya, 1,25 mg cRGD ditambahkan ke dalam larutan dan diaduk pada suhu 4 °C semalaman. Untuk menghilangkan EDC, NHS, dan sisa cRGD, larutan transparan disaring dengan tabung ultrafiltrasi. Akhirnya, Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NP disuspensikan kembali dalam 1,25 mL air deionisasi dan disimpan pada 4 °C.

Karakterisasi nanopartikel

Diameter dinamis dan potensi zeta nanopartikel diukur dengan Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, UK). Morfologi nanopartikel diperoleh dengan menggunakan mikroskop elektron transmisi FEI Tecnai F20. Pemuatan Cy5.5 direkam oleh spektrometer fluoresensi Hitachi F-7000. FTIR dilakukan dengan menggunakan spektrometer inframerah transformasi fourier (Alpha II, Bruker, Swiss). Magnetometer sampel bergetar (VSM, Lake Shore 7410) diterapkan untuk menentukan kurva histeresis nanopartikel dan Fe₃ bebas. O₄ .

Sel dan hewan

Sel kanker payudara manusia MDA-MB-231 disediakan dengan baik oleh Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences. Sel dipertahankan pada 37 °C dalam 95% udara dan 5% CO₂ . Tikus BALB/c betina (4 minggu) dibeli dari Shanghai Slaccas Laboratory Animal Co. Ltd. dan dipelihara menurut protokol yang disetujui oleh Pusat Hewan Laboratorium Universitas Kedokteran Guangxi. Eksperimen hewan diikuti dengan Panduan Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium, yang dirilis oleh Komite Etik Hewan Pusat Hewan Laboratorium, Universitas Kedokteran Guangxi. Sel kanker payudara MDA-MB-231 ditransplantasikan ke sisi kanan tikus BALB/c (2 × 106 dalam sel 200 μl per tikus) dan dibiarkan tumbuh selama 10–14 hari (diameter rata-rata 5 mm) sebelum pencitraan.

Ekspresi seluler v integrin

Imunofluoresensi seluler dilakukan untuk mengkonfirmasi ekspresi tinggi integrin v dalam sel MDA-MB-231. Sel A549 dan MCF-7 digunakan sebagai kontrol. Sel diunggulkan ke dalam cawan kultur dasar kaca 35 mm (MatTek, AS) pada 2 × 10⁴ sel mL⁻¹ selama 24 jam. Setelah inkubasi, sel difiksasi selama 20 menit pada suhu kamar dengan paraformaldehida 4%. Kemudian, mereka diinkubasi dengan antibodi anti-integrin v monoklonal kelinci (ab179475, Abcam) pada suhu 4 °C semalaman dan antibodi IgG anti-kelinci selama 1 jam pada suhu kamar. Akhirnya, sel diwarnai dengan DAPI. Gambar diperoleh dengan mikroskop pemindaian laser confocal (TCS SP8, Leica, Jerman).

Untuk menilai kemanjuran penargetan nanopartikel, studi serapan seluler dilakukan dengan menggunakan mikroskop pemindaian laser confocal (CLSM). Sel diunggulkan ke dalam cawan kultur dasar kaca 35 mm (MatTek, AS) pada 2 × 10⁴ sel mL⁻¹ selama 24 jam. Kemudian, sel diinkubasi dengan NP bertarget RGD (30 μg mL⁻¹ , 0,5 mL) pada pH 7,4 selama 2 jam, dan NP yang tidak ditargetkan digunakan sebagai kontrol. Setelah inkubasi, sel difiksasi dengan paraformaldehyde 4% selama 20 menit dan kemudian diinkubasi dengan antibodi v. Melalui kolokalisasi, kami memverifikasi pengikatan nanopartikel yang ditargetkan ke integrin pada sel.

pengujian CCK8

Biokompatibilitas Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD nanopartikel dievaluasi dengan studi sitotoksisitas. Sel MDA-MB-231, A549, dan MCF-7 diunggulkan ke pelat 96-sumur pada 5 × 10³ sel mL⁻¹ selama 24 jam. Kemudian 0,1 mL Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ Suspensi @PLGA/Cy5.5/RGD NP pada konsentrasi Fe 5, 10, 20, 40, dan 80 μg/mL ditambahkan ke masing-masing sumur dan diinkubasi selama 24 h. Akhirnya, 10 μL larutan CCK8 ditambahkan, dan suspensi diinkubasi selama 1 h lagi. Hasilnya ditentukan oleh pembaca lempeng mikro (Thermo Scientific, USA) pada 450 nm.

Pencitraan ultrasound dengan kontras

Pencitraan ultrasonografi nanopartikel dilakukan dengan menggunakan sistem ultrasound Vevo 2100 (Fujifilm Visual Sonics Inc., Kanada). NP bertarget RGD dan non-target ditambahkan ke model agarosa, dan PBS digunakan sebagai kontrol. Gambar direkam dalam mode B dan mode CEUS dengan buffer pH 7,2 dan 6,8 yang berbeda. Area yang diinginkan digambar, dan nilai abu-abu rata-rata diukur dalam gambar mode-B.

Untuk pencitraan ultrasound in vivo, tikus dibius dengan isoflurane 2% (Hebei Yipin Pharmaceutical Co., Ltd., China), dan suhu tubuh dipertahankan pada 37 °C dengan bantalan yang dipanaskan. Sebanyak 200 μL NP bertarget RGD disuntikkan melalui vena ekor. Hewan kontrol menerima injeksi subkutan dengan jumlah NP yang sama. Gambar ultrasonik direkam menggunakan transduser 7-MHz untuk terus memperoleh gambar ultrasound dari tumor, hati, dan daerah subkutan. Zona fokus akustik ditempatkan di tengah tumor dengan penampang terbesar, dan bidang pandang yang berisi tumor dan jaringan yang berdekatan diperoleh.

Pencitraan resonansi magnetik

Pemeriksaan MRI Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP dilakukan menggunakan 3.0 T MR (GE Healthcare, USA) dan animal coil (RF TECH LIMITED, China). NP dengan konsentrasi Fe yang berbeda 0,031, 0,063, 0,125, 0,25, 0,5, dan 1 mM dipindai dalam tabung Eppendorf 1 mL, dan PBS digunakan sebagai kontrol. T2 MRI dilakukan untuk setiap tabung menggunakan urutan FSE berbobot T2 (ketebalan irisan 3 mm, TR/TE 2000/74.4 ms, 8 × 8 cm FOV, dan matriks 320 × 256). Relaksivitas (r2) dihitung dengan penyesuaian linier dari waktu relaksasi terbalik sebagai fungsi konsentrasi Fe.

Untuk MRI in vivo, tikus secara acak dibagi menjadi dua kelompok (n =3) untuk pemindaian MR yang menerima (1) injeksi lokal Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP dalam otot subkutan dan jaringan tumor atau (2) injeksi vena ekor Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP. Gambar dasar tikus diambil sebelum injeksi nanopartikel. Untuk kelompok satu, jumlah NP yang sama disuntikkan ke dalam jaringan subkutan dan tumor, dan pemindaian MRI dilakukan setiap 30 menit untuk merekam transisi sinyal jaringan. Untuk kelompok dua, pencitraan tumor dilakukan pada posisi aksial dan koronal, dan parameter MR sama dengan yang digunakan untuk pencitraan in vitro. Intensitas sinyal (SI) di wilayah yang diinginkan (ROI) diukur dan dibandingkan dengan sinyal jaringan pada waktu yang berbeda sebelum dan sesudah injeksi.

Pencitraan fluoresensi tumor

Untuk pencitraan fluoresensi in vivo, sistem pencitraan fluoresensi in vivo (FX PRO, Bruker, Swiss) digunakan untuk pemindaian, dan tikus secara acak dibagi menjadi dua kelompok (n =3):(1) TN bertarget RGD dan (2) TN non-target. Gambar diambil setiap 30 menit selama 4 jam setelah injeksi. Selanjutnya, organ dan tumor penting diambil dan dicitrakan, dan distribusi fluoresensi di organ tubuh diamati. Analisis kuantitatif intensitas fluoresensi dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak pencitraan molekuler (Bruker, Swiss). These important organs then underwent H&E staining to evaluate the tissue toxicity. Frozen tumour sections were also subjected to fluorescence immunostaining with antibodies against αv integrin and β3 integrin.