Sintesis Yellow-Fluorescent Carbon Nano-dots oleh Microplasma untuk Pencitraan dan Inaktivasi Fotokatalitik Sel Kanker
Abstrak
Dalam beberapa tahun terakhir, nanopartikel multifungsi dengan fungsi diagnostik dan terapeutik gabungan menunjukkan harapan besar dalam pengobatan nano. Dalam studi ini, kami melaporkan sintesis ramah lingkungan dari titik nano karbon fluoresen seperti titik kuantum karbon (CQD) oleh mikroplasma menggunakan o -fenilendiamin. CQD yang dihasilkan menunjukkan puncak serapan yang lebar pada 380–500 nm dan memancarkan fluoresensi kuning cerah dengan puncak pada 550 nm. CQD dengan cepat diambil oleh sel kanker HeLa. Ketika tereksitasi di bawah cahaya biru, sinyal fluoresensi kuning cerah dan spesies oksigen reaktif (ROS) yang intens diproduksi secara efisien, memungkinkan pencitraan sel kanker fluoresen simultan dan inaktivasi fotodinamik, dengan penurunan 40% dalam viabilitas sel relatif. Selanjutnya, sekitar 98% sel aktif setelah inkubasi dengan 400 μg mL
−1
CQD dalam kegelapan, yang mengungkapkan biokompatibilitas CQD yang sangat baik. Oleh karena itu, CQD yang baru disiapkan terbukti menjadi bahan yang mungkin efektif dan aman digunakan untuk bioimaging in vivo dan terapi kanker yang dipandu pencitraan.
Pengantar
Kanker masih menjadi penyebab utama kematian di dunia [1]. Nanopartikel multifungsi dengan fungsi diagnostik dan terapeutik memiliki aplikasi yang menjanjikan dalam pengobatan nano. Terapi dipandu gambar simultan adalah konsep baru dalam pengobatan kanker dan menunjukkan harapan besar sehubungan dengan optimalisasi efisiensi terapeutik. Ini dapat memberikan informasi yang berguna mengenai ukuran dan lokasi tumor, jendela waktu yang optimal untuk fototerapi, dan kemanjuran terapeutik [2,3,4]. Terapi fotodinamik (PDT) telah digunakan untuk mengobati berbagai jenis kanker dan penyakit lain karena selektivitas spatiotemporal dan sifatnya yang non-invasif [5, 6]. Fotosensitizer yang ideal umumnya memiliki karakteristik sebagai berikut:(1) generasi yang sangat efisien dari spesies oksigen reaktif (ROS), (2) biokompatibilitas yang baik, dan (3) kelarutan dalam air [7]. Namun, aplikasi PDT saat ini dibatasi oleh kelarutan air yang buruk, ketidakstabilan, dan panjang gelombang eksitasi fotosensitizer yang kurang optimal. Oleh karena itu, diperlukan pembangkitan pengganti fotosensitizer dengan kelarutan air yang baik dan biokompatibilitas dengan metode yang ramah lingkungan dan berbiaya rendah.
Titik kuantum karbon (CQDs) telah mendapat perhatian yang luar biasa karena sifat menguntungkan yang unik, seperti sintesis sederhana dan ramah lingkungan, toksisitas rendah, biokompatibilitas yang luar biasa, kelarutan air yang sangat baik, dan stabilitas cahaya [8]. CQD memiliki kegunaan potensial dalam pencitraan seluler, biosensing, pengiriman obat yang ditargetkan, dan aplikasi biomedis lainnya [9,10,11,12,13]. Ada dua pendekatan utama untuk sintesis titik karbon, pendekatan bottom-up dan top-down. Metode top-down termasuk oksidasi elektrokimia, ablasi laser, oksidasi kimia, dan metode sintesis ultrasonik. Metode bottom-up terdiri dari perlakuan hidrotermal, sintesis gelombang mikro, dan dekomposisi termal [14,15,16,17]. Namun, suhu tinggi, tekanan tinggi, dan asam kuat yang dibutuhkan selalu menyebabkan konsumsi energi yang besar, proses yang rumit, dan kerusakan lingkungan yang tak terhindarkan. Oleh karena itu, metode sintetik baru yang ramah lingkungan muncul seiring dengan perkembangan zaman. Seperti yang telah dilaporkan, CQD dapat diproduksi hanya dalam beberapa menit menggunakan metode cair-mikroplasma tanpa kondisi suhu tinggi, masukan energi yang besar, dan prosedur yang melelahkan [18,19,20]. Mikroplasma menyediakan lingkungan fisikokimia yang unik untuk studi dasar dan aplikasi yang melibatkan bahan canggih. Lingkungan kimia dan elektronik yang disediakan oleh mikroplasma sangat tidak seimbang dan dapat menyimpan energi. Dalam lingkungan ini, sejumlah besar elektron, ion, radikal bebas, dan zat aktif tereksitasi lainnya dapat diproduksi [21, 22]. Meskipun o -phenylenediamine adalah bahan baku untuk sintesis karbon nano-dots, belum digunakan dalam sintesis mikroplasma [23,24,25].
Dalam penelitian ini, o -phenylenediamine digunakan sebagai bahan baku untuk mensintesis CQDs dengan pengobatan mikroplasma. CQD yang dihasilkan oleh metode ini berukuran seragam (berdiameter sekitar 3,2 nm) dan menunjukkan puncak emisi sekitar 550 nm. Kami menunjukkan bahwa CQD yang baru disintesis dapat menghasilkan sejumlah besar ROS dalam kondisi cahaya. Secara in vitro, CQD dapat diserap oleh sel tumor HeLa dan memancarkan cahaya kuning di bawah eksitasi panjang gelombang biru pada 420–500 nm dengan toksisitas rendah. Kami juga mengamati inaktivasi sel tumor HeLa di bawah iradiasi pada 460 nm. Hasil ini menunjukkan bahwa CQD yang baru disiapkan mungkin merupakan bahan yang menjanjikan untuk bioimaging in vivo, terapi kanker yang dipandu pencitraan atau ditargetkan.
Hasil dan Diskusi
Karakterisasi CQD
CQD kuning-emisi dalam penelitian ini disiapkan dengan cara yang mudah dan ramah lingkungan dengan metode mikroplasma menggunakan o -phenylenediamine sebagai prekursor karbon. Meskipun metode pemrosesan mikroplasma telah dilaporkan digunakan untuk sintesis titik nano karbon, ada penelitian relatif yang jarang. Gambar 1A menunjukkan gambar mikroskop elektron transmisi (TEM) dari partikel CQD. Partikel yang dihasilkan oleh mikroplasma berbentuk siklo-tajam atau oval dengan diameter rata-rata 3,2 nm. Seperti yang ditunjukkan pada gambar resolusi tinggi Gbr. 1A (inset), jarak kisi dalam CQD adalah 0,21 nm, yang termasuk dalam bidang grafit (1,1,0). Spektrum Raman menunjukkan bahwa mode D, disebut sebagai mode yang diinduksi gangguan, terletak sekitar 1342 cm
−1
dan mode G berpusat di sekitar 1507 cm
−1
, masing-masing, karena hasil sp
3
dan sp
2
-hibridisasi karbon (Gbr. 1E). Diketahui bahwa intensitas mode D dibandingkan dengan mode G tergantung pada ukuran kristal mikro grafit dalam sampel. Semakin tinggi ketidakteraturan sampel menyebabkan semakin tinggi rasio intensitas ID/IG dan semakin kecil kristal mikro grafit. Lebih lanjut, mode D dan G bubuk CQD juga dapat dilihat sebagai serpihan grafit kecil dengan rasio intensitas ID/IG (0,77) yang relatif tinggi.
Karakterisasi CQD. A Gambar TEM dari CQD (inset, gambar TEM resolusi tinggi); B Distribusi ukuran CQD; C spektrum penyerapan UV-vis dari CQDs; D Spektrum FL dari CQD dengan panjang gelombang eksitasi dari 400 hingga 500 nm dalam peningkatan 20 nm; E , B Spektrum Raman CQD dan spektrum FTIR CQD
FTIR dan XPS adalah alat yang ampuh untuk mengkarakterisasi komposisi kimia dan struktur bahan berbasis karbon. Data FTIR untuk CQD direkam dalam kisaran 400–4000 cm
−1
, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1F. Spektrum FTIR mengungkapkan bahwa CQD terutama mengandung amina (3052 dan 3324 cm
−1
), OH (3200 cm
−1
), C=O (1595 cm
−1
), C–N/C–O (1200 cm
−1
), C=C (1500 cm
−1
) dan CH (748 cm
−1
) gugus fungsi atau ikatan kimia [26, 27]. Komponen permukaan CQD, sebagaimana ditentukan oleh XPS, konsisten dengan hasil FTIR. Spektrum penuh yang disajikan pada Gambar. 2A menunjukkan tiga puncak tipikal:C 1s (285 eV), N 1s (400 eV), dan O 1 (531 eV).
Spektrum XPS dari CQD. A Spektrum XPS skala penuh dari CQD; B Resolusi tinggi C 1s spektrum; C resolusi tinggi dari N 1s spektrum; D Resolusi tinggi O 1s spektrum
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2B–D, a C 1s analisis mengungkapkan keberadaan sp
2
/sp
3
karbon (C–C/C=C, 284,8 eV), karbon nitrit (C–O/C–N, 285,9 eV), dan karbon karbonil (C=O, 287,7 eV). N 1s pita didekonvolusi menjadi tiga puncak pada 399,3, 400,3, dan 401,7 eV, yang masing-masing sesuai dengan N pirolat, N grafit, dan N amino. O 1s pita berisi puncak masing-masing pada 531,6 dan 533,1 eV untuk C–O dan C=O [28, 29]. Yang penting, keberadaan gugus fungsi di atas ini memberi CQD kelarutan yang menguntungkan. Selanjutnya, sifat optik CQD diselidiki menggunakan spektroskopi fluoresensi dan penyerapan UV-Vis. Spektrum emisi fluoresensi CQD ditunjukkan pada Gambar 1C. CQD yang disiapkan menunjukkan perilaku emisi fluoresensi yang bergantung pada eksitasi. Ketika tereksitasi pada panjang gelombang 400 hingga 500 nm, puncak emisi fluoresensi maksimum bergeser merah dari 473 menjadi 519 nm dan intensitas fluoresensi menurun tajam [30]. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1D, spektrum UV-vis CQD menampilkan puncak serapan yang kuat dalam rentang panjang gelombang 400-490 nm. CQD menunjukkan dua puncak penyerapan karakteristik pada 280 dan 420 nm, yang mengacu pada transisi –π* (aromatik C=C) dan n–π* (karboksil dan/atau C–N), masing-masing [31, 32]. Oleh karena itu, sifat optik CQD ini memberikan kelayakan untuk pencitraan biologis simultan dan inaktivasi fotodinamik.
Bioimaging dan sitotoksisitas CQD
Untuk menilai kemampuan CQD untuk bioimaging dan pelabelan sel, pencitraan seluler in vitro menggunakan CQD diselidiki pada sel HeLa dengan mikroskop pemindaian laser confocal (CLSM). Sel Hela diinkubasi dengan 200 μg mL
−1
CQD selama 6 jam, lalu disiapkan untuk deteksi CLSM. Hasilnya, sel HeLa menunjukkan fluoresensi kuning cerah yang merata di seluruh sel (Gbr. 3A). Lebih penting lagi, perlu diperhatikan bahwa konsentrasi CQD rendah sebesar 200 μg mL
−1
sudah cukup untuk memberi label sel Hela dengan fluoresensi kuning, yang selanjutnya menentukan kemungkinan CQD dalam pencitraan sel. Seperti yang telah dilaporkan, nanopartikel karbon selalu menunjukkan emisi yang kuat hanya di wilayah cahaya biru, sedangkan emisi panjang gelombang panjang biasanya lemah. Di bawah eksitasi UV, jaringan biologis sering menunjukkan autofluoresensi biru dan rentan untuk menerima photodamage, yang secara serius menghambat aplikasi analisis pencitraan biologis dari nanopartikel karbon dengan emisi panjang gelombang pendek [33]. Oleh karena itu, pengembangan nanopartikel karbon dengan emisi panjang gelombang panjang menjadi perhatian luas. Dalam penelitian ini, CQD yang disiapkan menunjukkan fluoresensi kuning cerah di bawah eksitasi cahaya 400-450 nm. Fluoresensi kuning yang tereksitasi dengan demikian memungkinkan CQD digunakan untuk mendeteksi tumor yang dalam. Namun, masih ada jalan panjang sebelum aplikasi praktis dalam pencitraan kanker manusia.
Penerapan CQD. A Pencitraan CLSM sel HeLa berlabel CQD; B Uji sitotoksisitas in vitro dari CQDs; C Viabilitas relatif sel HeLa yang diinkubasi dengan larutan kontrol atau CQD (200 μg mL
−1
) dan terkena cahaya biru (460 nm, 30 mW cm
−2
) selama 5 mnt, 10 mnt, dan 15 mnt; D IC50 CQD tereksitasi pada sel Hela setelah terpapar cahaya biru selama 10 dan 15 menit (*P < 0,05)
Selain karakteristik luminesensi, biokompatibilitas tinggi, dan toksisitas rendah selalu diperlukan jika CQD dimaksudkan untuk dikembangkan sebagai reagen bio-label yang potensial. Untuk aplikasi biomedis, bahan harus sangat biokompatibel pada dosis yang direkomendasikan. Untuk memeriksa sitotoksisitas, sel HeLa diperlakukan dengan CQD pada konsentrasi akhir mulai dari 0 hingga 400 μg mL
−1
selama 24 jam. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3B, lebih dari 95% sel bertahan seperti yang ditentukan oleh uji MTT (3-(4,5-dimethylthiazolyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide), yang mengungkapkan bahwa CQD praktis non- beracun.
Data ini menunjukkan bahwa CQD yang baru dihasilkan dengan fluoresensi kuning tereksitasi memiliki sitotoksisitas rendah dan biokompatibilitas tinggi, yang memfasilitasi prospek pencitraan biologis yang menjanjikan.
Kemanjuran Terapi Fotodinamik
Penonaktifan Sel Kanker
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3C, viabilitas tidak berbeda antara sel HeLa yang diobati dengan CQD atau cahaya biru saja. Perawatan simultan dengan CQD dan cahaya biru secara nyata mengurangi viabilitas sel sel Hela, tergantung pada durasi paparan foto. Setelah iradiasi pada 460 nm selama 15 menit, CQD menunjukkan aktivitas antitumor yang luar biasa; viabilitas sel HeLa menurun sekitar 40% pada konsentrasi 200 μg mL
−1
. Untuk mendeteksi lebih lanjut efek dari CQD yang tereksitasi, uji MTT diimplementasikan untuk mengevaluasi konsentrasi penghambatan setengah maksimal (IC50) dari CQD yang tereksitasi ke sel Hela. Akibatnya, IC50 CQD setelah dieksitasi pada sel Hela adalah sekitar 427,5 μg mL
−1
(95% CI 366.7–498.7 μg mL
−1
) setelah penyinaran 10 menit dan kira-kira 255,1 μg mL
−1
(95% CI 220.9–249.8 μg mL
−1
) setelah terpapar cahaya biru selama 15 mnt.
Hasil ini menunjukkan bahwa CQD yang tereksitasi dapat secara efektif membunuh sel tumor seperti beberapa obat antikanker klinis, seperti Photofrin [34], yang mendorong nilai CQD yang menjanjikan dalam terapi antitumor yang dipandu pencitraan.
Pembuatan ROS dari CQD
Selama PDT, sel kanker dapat dibunuh oleh ROS sitotoksik yang dihasilkan oleh fotosensitizer endositosis di bawah kondisi iradiasi yang sesuai [35, 36]. ROS dapat menonaktifkan sel target dengan apoptosis atau nekrosis dengan sedikit efek samping melalui PDT pada beberapa penyakit [37,38,39,40]. Inspeksi Gambar. 4A menunjukkan bahwa reagen ROS memancarkan fluoresensi merah, menunjukkan generasi ROS. Selain itu, sinyal merah ROS tumpang tindih dengan fluoresensi CQD, yang berarti bahwa generasi ROS terkait erat dengan penyerapan CQD oleh sel tumor. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4B, dibandingkan dengan kontrol dan tanpa kelompok iradiasi laser, kelompok eksperimen di bawah iradiasi laser 460 nm selama 15 menit menunjukkan generasi ROS yang jelas. Hasil kami menunjukkan bahwa CQD dapat secara signifikan meningkatkan produksi ROS intraseluler di bawah iradiasi laser 460 nm dan memiliki potensi besar untuk aplikasi di PDT. Pada prinsipnya, CQD dapat tereksitasi dari keadaan dasar (S0 pada Gambar 4C) ke keadaan tereksitasi (Sn pada Gambar 4C), dan efisiensi proses ini ditentukan oleh intensitas sumber cahaya dan koefisien pemadaman. . Setelah relaksasi yang dimediasi pelarut, CQD tetap pada tingkat getaran terendah dari keadaan tereksitasi singlet pertama. Karena relaksasi vibrasi yang cepat setelah eksitasi, energi foton yang dipancarkan dari keadaan tereksitasi singlet pertama (S1 pada Gambar 4C) lebih rendah daripada energi foton eksitasi, menghasilkan peningkatan panjang gelombang. Pencitraan fluoresensi memanfaatkan transisi CQD dari S0 ke Sn ke S1 [41]. CQD dicerna oleh sel tumor HeLa dan memancarkan fluoresensi ketika diterangi oleh sumber panjang gelombang yang sesuai, sehingga memungkinkan sel untuk diberi label. S1 dapat kembali ke keadaan S0 dengan fluoresensi atau dengan persilangan antarsistem ke keadaan tereksitasi triplet non-fluoresen (T1 pada Gambar 4C) [7, 42]. Gugus fluoresen T1 sangat aktif dalam reaksi transfer elektron, menghasilkan radikal bebas superoksida dan selanjutnya mengakibatkan degradasi gugus fluoresen. Energi dari T1 yang ditransfer ke molekul oksigen akan menghasilkan agen pengoksidasi oksigen singlet tereksitasi yang lebih kuat dari oksigen molekuler keadaan dasar. Radikal superoksida dan oksigen singlet, serta ROS lainnya, termasuk OH dan H2 O2 , bereaksi dengan molekul biologis terdekat untuk menghasilkan fototoksisitas, yang menyebabkan kematian sel. Setelah CQD diambil oleh sel HeLa, iluminasi menghasilkan transfer status singlet ke status triplet melalui antarsistem, dan proses transfer energi menghasilkan ROS dan akhirnya menyebabkan kematian sel. Di bawah sumber panjang gelombang yang sesuai, CQD mengalami dua jenis transfer energi. Fluoresensi dipancarkan untuk menandai sel tumor HeLa, dan sel HeLa dibunuh oleh ROS. Data eksperimental kami mengungkapkan biokompatibilitas yang baik dari CQD yang baru diproduksi dalam gelap dan efisiensi pembunuhan tumor dalam kondisi terang. Oleh karena itu, CQD dapat digunakan sebagai fotosensitizer untuk sel dan jaringan tumor.
Generasi ROS intraseluler. A Gambar fluoresensi HeLa, (a) Gambar transmisi medan terang, (b) Gambar fluoresensi CQD yang dikumpulkan dalam kisaran 400–450 nm, (c) Gambar fluoresensi reagen deteksi ROS yang ditangkap dalam kisaran 510–530 nm, dan (d ) gambar yang digabungkan; B Produksi ROS intraseluler untuk berbagai konsentrasi CQD dengan atau tanpa penyinaran selama 15 menit; C diagram tingkat energi yang disederhanakan menunjukkan fluoresensi potensial dan jalur transfer energi kematian sel. (S0, keadaan dasar molekul fluorofor; S1, keadaan tereksitasi singlet pertama; Sn (n> 1); T1, keadaan tereksitasi triplet pertama; Ex, eksitasi dengan penyerapan foton; FL, fluoresensi)
Selain itu, masih menjadi masalah yang belum terpecahkan bagaimana CQD dapat menargetkan tumor secara akurat dan membunuh sel tumor secara lebih efektif. Kelimpahan gugus hidrofilik fungsional permukaan yang ada (karboksil, karbonil, epoksi, hidroksil, hidroksil, dll.) memungkinkan titik-titik karbon berkonjugasi dengan antibodi spesifik yang dapat secara tepat menargetkan tumor, dan ini membutuhkan tumor yang memiliki biomarker spesifik. Secara bersamaan, titik-titik karbon juga dapat berfungsi sebagai alat untuk pengiriman obat dan gen karena rasio luas permukaan terhadap volumenya yang tinggi [43]. Mempertimbangkan biokompatibilitas yang sangat baik, ukuran kecil untuk internalisasi oleh sel tumor, kaya akan bagian fungsional permukaan dan potensi bioimaging, titik karbon (termasuk CQD) diyakini menjadi kandidat theranostik yang menjanjikan untuk terapi tumor. Namun, masih ada tantangan dan banyak masalah yang belum terselesaikan untuk aplikasi titik karbon dalam pengobatan nano dan bioimaging. Lebih banyak upaya harus dilakukan untuk mempromosikan terjemahan nanomedicine terkait titik karbon dari bangku ke samping tempat tidur di masa depan.
Kesimpulan
Singkatnya, kami mensintesis CQD photoluminescent menggunakan o -phenylenediamine dengan metode plasma. Disemangati oleh laser biru, CQD dengan diameter sekitar 3,2 nm memancarkan fluoresensi kuning. Hasil Raman, UV–vis, FTIR, dan XPS menunjukkan bahwa lebih banyak atom karbon yang terlibat dalam sp
2
hibridisasi, membentuk kelompok organik baru. CQD yang disintesis dengan metode plasma terbukti menjadi pemeriksaan yang efektif dalam eksperimen pencitraan sel, dan fluoresensi kuning yang dipancarkan oleh CQD dapat dengan jelas menandai sel HeLa. Selain itu, CQD yang disintesis menunjukkan kelarutan yang baik, tidak beracun, dan biokompatibilitas tinggi, yang dapat mempercepat kemampuan bio-imaging mereka. Selain itu, CQD yang tereksitasi dapat secara efektif membunuh sel Hela dengan menghasilkan ROS, yang secara jelas menunjukkan sitotoksisitas fotodinamik CQD yang memuaskan secara in vitro dan mendukung aplikasinya dalam PDT.
Metode Eksperimental
Sintesis Titik Kuantum Karbon
Sistem pemrosesan mikroplasma diringkas dalam File tambahan 1:Gambar S1. Pipa stainless berongga dengan diameter dalam 180 μm dihubungkan ke sumber listrik arus searah tegangan tinggi (Tianjin Dongwen High-Voltage Supply Co., Ltd., Tianjin, China) dan dijaga pada ketinggian 2 mm di atas permukaan pipa. larutan. Elektroda Pt (DJS-1; Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China) dihubungkan ke katoda sumber listrik dan direndam dalam larutan. Kemudian, 400 mg o -phenylenediamine (Shanghai, Cina) dilarutkan dalam 40 mL air deionisasi, dan 20 mL o Larutan -phenylenediamine ditambahkan ke dalam cawan Petri dan diaduk menggunakan magnetic stirrer. Selama perawatan mikroplasma, gas argon (Ar) mengalir melalui pipa dengan laju aliran 60 sccm, dan arus DC dijaga pada 17 mA. Setelah 10 menit perawatan plasma, produk berwarna hitam kecoklatan didialisis menggunakan membran dialisis (penghentian berat molekul, 500 Da) terhadap 2 L air deionisasi selama 12 jam dan selanjutnya disaring melalui membran ultrafiltrasi 0,22 m. Akhirnya, CQD murni diperoleh dengan pengeringan beku.
Karakterisasi Struktur, Komposisi, dan Sifat Optik CQD
Ukuran dan morfologi CQD dicirikan oleh TEM menggunakan sistem JEM-2100F (JEOL, Tokyo, Jepang). Spektroskopi fluoresensi dilakukan menggunakan Perkin Elmer LS 55 Luminescence Spectrometer (Waltham, MA, USA). Spektrum serapan UV/Vis diukur menggunakan spektrofotometer Varian Cary 50 UV-VIS (Palo Alto, CA, USA). Spektrum FTIR diperoleh dengan menggunakan spektroskop Nicolet 6700 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), dan spektroskopi Raman dilakukan menggunakan spektrometer mikro-Raman 800 UV (Invia-reflex, UK). Eksperimen XPS dilakukan menggunakan sistem Axis Ultra DLD (Shimadzu/Kratos Analytical Ltd., Kyoto, Jepang).
Uji Kultur Sel dan Sitotoksisitas
Sel HeLa (ATCC, Manassas, VA, USA) dikultur di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) yang mengandung 10% FBS dan 1% penisilin-streptomisin pada 37 °C dalam 5% CO2 yang dilembabkan suasana. Untuk studi sitotoksisitas CQD, sel dihitung dan diunggulkan dalam pelat 96 sumur yang berisi 200 μL media lengkap dengan kepadatan 6000 sel per sumur. Setelah 24 jam kultur, sel diinkubasi dengan CQD pada konsentrasi 0, 25, 50, 100, 200, dan 400 μg mL
−1
selama 24 jam berikutnya, dan kemudian, viabilitas sel dideteksi menggunakan uji MTT untuk menilai sitotoksisitas CQD. Secara singkat, larutan ini diganti dengan 100 L larutan uji MTT (0,5 mg mL
−1
) dan diinkubasi selama 4 jam dalam inkubator dalam gelap. Supernatan dihilangkan dan kristal dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO). Akhirnya, absorbansi masing-masing sumur diukur pada 490 nm. Kepadatan optik terkait dengan viabilitas sel dengan mengasumsikan viabilitas 100% untuk sampel kontrol tanpa CQD.
Uji MTT juga digunakan untuk menilai IC50 CQD tereksitasi pada sel Hela. Secara singkat, sel Hela di pelat 96-sumur diinkubasi dengan CQD pada konsentrasi 0, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400, 800, 1600, 3200, dan 6400 μg mL
−1
selama 24 jam dalam inkubator, diperlakukan dengan cahaya pada 460 nm selama 10 menit atau 15 menit secara terpisah, dan kemudian dibiakkan selama 24 jam. Viabilitas sel setiap sumur dideteksi menggunakan uji MTT dan data digunakan untuk evaluasi IC50.
Pencitraan Sel
Sel pada konsentrasi 2 × 10
4
mL
−1
diunggulkan dalam cawan confocal (diameter = 15 mm), dikultur selama 24 jam, dan dicuci dengan PBS dua kali untuk memastikan tidak ada sel mati. Solusi CQD (200 μg mL
−1
; pH 7) ditambahkan dan sel diinkubasi selama 6 jam. Sel-sel kemudian dicuci dengan PBS tiga kali untuk menghilangkan CQD yang tidak terikat dan difiksasi dengan paraformaldehyde 4%. Kemudian, sampel diamati menggunakan CLSM (LSM510, Zeiss, Jerman) dengan eksitasi pada panjang gelombang mulai dari 400 hingga 450 nm.
Terapi Fotodinamik dan Pengukuran ROS
Untuk menyelidiki efek antitumor, sel HeLa diinkubasi dengan 200 μg mL
−1
CQD selama 24 jam pada 37 °C dalam gelap dan diperlakukan dengan cahaya pada 460 nm (30 mW cm
−2
) selama 5, 10, dan 15 mnt. Setelah 24 jam inkubasi, uji MTT standar dilakukan untuk menentukan viabilitas sel relatif. Generasi ROS intraseluler dideteksi secara kimiawi menggunakan metode spektrofotometri dengan Fluorometric Intracellular Ros Assay Kit (sigma, USA). Sel dikultur dalam cawan confocal (diameter = 15 mm) semalaman untuk perlekatan sel. Kemudian, sel diinkubasi dengan 200 μg mL
−1
CQD selama 4 jam. Selanjutnya ditambahkan 100 L/sumur Campuran Reaksi Induk. Setelah inkubasi selama 1 jam, sel difiksasi dengan paraformaldehyde 4% selama 10 menit, dan gambar fluoresensi sel diamati dengan CLSM. Sedangkan untuk deteksi produksi ROS, sel dikultur dalam pelat 96-sumur dengan media kultur 200 μL. Setelah inkubasi 24 jam, media diganti dengan 100 μL larutan CQDs pada konsentrasi 0, 100, 200 μg mL
−1
, dan sel-sel diinkubasi selama 4 jam lagi. Selanjutnya, sampel dicuci tiga kali dengan PBS, diiradiasi selama 15 menit atau tidak, dan diinkubasi dengan 100 μL/well Master Reaction Mix selama 1 jam. Terakhir, intensitas fluoresensi dideteksi menggunakan pembaca fluoresensi (eksitasi 520 nm, emisi 605 nm).
Analisis Statistik
Eksperimen yang terlibat dalam penelitian ini diulang sebanyak tiga kali, dan analisis statistik dilakukan dengan menggunakan SPSS19.0. Perbedaan antara kedua kelompok dibandingkan dengan menggunakan Mann–Whitney U tes. IC50 CQD tereksitasi pada sel Hela dievaluasi dengan menggunakan regresi nonlinier. P < 0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Ketersediaan data dan materi
Semua data dan bahan penelitian saat ini tersedia dari penulis terkait atas permintaan yang wajar.
