Pengiriman Baru Mitoxantrone dengan Nanopartikel Pullulan yang Dimodifikasi Secara Hidrofobik untuk Menghambat Sel Kanker Kandung Kemih dan Pengaruh Ukuran Nano-obat pada Efisiensi Penghambatan
Abstrak
Mengurangi dosis obat kemoterapi melalui peningkatan efisiensi pengiriman menggunakan nanopartikel baru memiliki potensi besar untuk pengobatan kanker. Di sini, kami fokus pada peningkatan pengiriman mitoxantrone dengan menggunakan polimer pullulan tersubstitusi kolesterol (CHPs) dan memilih ukuran obat nano yang sesuai untuk menghambat pertumbuhan sel kanker kandung kemih. Kami mensintesis tiga jenis CHP, bernama CHP-1, CHP-2, CHP-3. Struktur kimianya diidentifikasi oleh NMR, dan tingkat substitusi kolesterol masing-masing adalah 6,82%, 5,78%, dan 2,74%. Diameternya adalah 86,4, 162,30, dan 222,28 nm. Kami menguji laju pelepasan mitoxantrone dalam saline buffer fosfat selama 48 jam:laju pelepasan adalah 38,73%, 42,35%, dan 58,89% untuk ketiga CHP. Tingkat substitusi hidrofobik dalam polimer dikaitkan dengan proses perakitan mandiri nanopartikel, yang memengaruhi ukurannya dan oleh karena itu laju pelepasan obat. Pelepasan tiga nanopartikel yang memuat obat secara signifikan dipercepat dalam media pelepasan asam. Semakin besar nanopartikel, semakin besar kecepatan pelepasan obat. Pada 24 jam, IC50 nilainya adalah 0,25 M, untuk penghambatan terbaik mitoxantrone pada sel kanker kandung kemih.
Percobaan 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide (MTT) menunjukkan bahwa nanopartikel CHP-3 yang mengandung obat dengan ukuran terbesar adalah yang paling beracun untuk kanker kandung kemih sel. Immunofluorescence dan flow cytometry mengungkapkan bahwa nanopartikel CHP-3 yang mengandung obat dengan ukuran terbesar memiliki efek terkuat dalam mempromosikan apoptosis sel kanker kandung kemih. Selain itu, ketiga nanopartikel yang mengandung obat semuanya dapat menghambat migrasi sel MB49, dengan nanopartikel CHP-3 berukuran besar yang memiliki penghambatan paling kuat.
Latar Belakang
Kemoterapi adalah pengobatan umum untuk tumor. Namun, karena kurangnya spesifisitas jaringan, efek terapeutik kemoterapi terbatas dan seringkali memiliki efek samping yang kuat [1, 2]. Oleh karena itu, penelitian penggunaan sediaan nanopartikel (NP) untuk meningkatkan target kemampuan obat kemoterapi telah meningkat [3,4,5].
Setelah secara pasif menargetkan jaringan tumor melalui efek peningkatan permeabilitas dan retensi (EPR), obat-nano seperti obat anti-tumor molekul kecil bermuatan NP terutama mengerahkan kemanjurannya dalam dua cara:(1) dengan dilepaskan di jaringan tumor dan memasuki jaringan tumor. sel dalam bentuk bebas untuk mengerahkan kemanjuran dan (2) dengan diambil oleh sel dalam bentuk mikropartikel dan dilepaskan di dalam sel untuk mengerahkan efek farmakodinamik [6, 7]. Ketika agen nano-farmasi secara pasif ditargetkan ke tumor, yang mana dari dua metode yang memainkan peran utama atau apakah keduanya memainkan peran utama pada saat yang sama dan apakah faktor lain yang terlibat adalah masalah yang kompleks. Karena aktivitas metabolisme jaringan tumor, iskemia dan hipoksia dan akumulasi asam laktat dan karena cairan ekstraseluler jaringan tumor menunjukkan keasaman yang lemah, banyak obat nano menunjukkan peningkatan pelepasan di lingkungan asam, untuk meningkatkan kemanjuran [8]. Efisiensi pelepasan obat nano-obat dalam lingkungan asam terkait erat dengan sifat fisikokimia nanomaterial dan juga dipengaruhi oleh ukuran NP [9,10,11]. Setelah NP secara pasif menargetkan jaringan tumor, karena sel tumor memiliki fungsi fagositosis, sediaan nanofarmasi memasuki sel terutama melalui pinositosis dan proses kompleks yang dimediasi oleh protein membran sel [12, 13]. Di bawah degradasi lisozim intraseluler, nanofarmasi melepaskan obat dan memberikan kemanjuran [14].
Efisiensi serapan sel target dalam jaringan target terkait erat dengan sifat nanomaterial, modifikasi permukaan, morfologi, muatan, dan ukuran NP [15,16,17,18]. Serapan sel sangat bergantung pada ukuran NP. Internalisasi (endositosis) NP Her-gold sangat tergantung pada ukuran, penyerapan paling efektif terjadi pada NP dalam kisaran 25 hingga 50 nm [19]. NP yang sangat kecil atau besar akan memiliki penyerapan yang tidak efisien. Ukuran 40 hingga 50 nm adalah titik kritis untuk endositosis yang dimediasi reseptor [20]. Selain itu, ukuran NP mempengaruhi sitotoksisitas. Dalam membandingkan NP 45 dan 90 nm, ukuran NP polimer berbanding terbalik dengan sitotoksisitas [21]. Ukuran NP mempengaruhi pelepasan obat dalam jaringan tumor dan juga efisiensi penyerapan sel dan pada akhirnya memainkan peran penting dalam kemanjuran obat.
Adhesi lokal polisakarida meningkatkan lokalisasi dan fungsi penargetan. Lingkungan asam sel kanker eksternal menyebabkan pelepasan sebagian obat nano polisakarida, memicu efek terapeutik ganda dari NP yang mengandung obat dan obat bebas setelah penargetan pasif jaringan tumor [22, 23].
Pullulan yang tidak beracun mudah terdegradasi di dalam tubuh, dan kolesterolnya merupakan zat intrinsik di dalam tubuh sehingga aman dan cocok sebagai pembawa obat-obatan [24, 25]. Polimer pullulan (CHP) yang dimodifikasi secara hidrofobik kolesterol, yang memiliki gugus kolesteril hidrofobik dan rantai gula hidrofilik, dapat merakit sendiri menjadi struktur seperti nanosfer dengan inti pusat hidrofobik dan cangkang hidrofilik [26, 27]. Polimer amfifilik merakit diri menjadi NP dalam struktur sferoid, dengan inti hidrofobik yang dibentuk oleh gugus hidrofobik seperti gugus kolesteril [28].
Mitoxantrone, antibiotik antrasiklin aktif antikanker spektrum luas yang dapat menyisipkan DNA dan menghambat topoisomerase II, adalah obat antitumor klasik. Namun, karena kardiotoksisitasnya, penggunaan mitoxantrone terbatas. Mitoxantrone dimuat ke pusat hidrofobik NP CHP dengan interaksi hidrofobik untuk membentuk persiapan nanometer CHP yang memiliki efek penargetan pasif melalui efek EPR. Dibandingkan dengan obat bebas, NP CHP yang mengandung obat menunjukkan pengurangan efek toksik obat dan peningkatan efisiensi antikanker [29, 30]. Kolesteril gugus hidrofobik dalam polimer CHP mendorong pembentukan struktur inti NP, dan dalam kisaran tertentu, semakin tinggi derajat substitusi gugus hidrofobik, semakin kecil ukuran NP [31, 32]. Stabilitas CHP lebih unggul setidaknya 2 bulan tanpa perubahan ukuran dan potensi zeta yang signifikan, dan nanopartikel pullulan dapat menargetkan jaringan tumor untuk membunuh sel kanker dengan efek EPR [33, 34].
Dalam penelitian ini, kami menggunakan NP pullulan (CHP) yang dimodifikasi secara hidrofobik dengan kolesterol sebagai pembawa obat antitumor untuk memuat mitoxantrone. Ukuran berbeda dari NP pullulan yang mengandung mitoxantrone dihasilkan dengan mensintesis polimer CHP dalam rasio muatan suksinat anhidrida kolesterol (CHS) yang berbeda untuk mempelajari efek ukuran NP pada pelepasan obat yang berkelanjutan, pelepasan obat dalam lingkungan asam, toksisitas terhadap kanker kandung kemih sel, efisiensi penyerapan sel, dan migrasi sel. Eksperimen ini mengevaluasi rentang ukuran NP dengan penargetan pasif untuk menyaring NP yang sesuai sebagai pembawa obat dan untuk efisiensi obat yang lebih kuat.
Bahan dan Metode
Reagen dan Instrumen
Mitoxantrone berasal dari Aladdin Chemistry (Shanghai); tas dialisis (BioSharp, USA, 8000~12,000 Da) berasal dari Tianjin Junyao Biotechnology. Reagen lainnya berasal dari Beijing Xinze Technology.
Kami menggunakan Spektrofotometer Fluoresensi F-4500 Jepang, kromatografi dikroisme melingkar J-810 (Jasco Co., Jepang), penganalisis ukuran partikel (MALVERN, Nano 2S-90, Jepang), dan mikroskop elektron proyeksi (JEM-100CXII, Jepang) .
Sintesis dan Karakterisasi Polimer CHP dan Perhitungan Derajat Substitusi Kolesterol
Sintesis CHS suksinat anhidrida telah dilaporkan sebelumnya [35]. Sebanyak 0,5 g sampel pullulan dilarutkan dalam 15 mL dimetil sulfoksida terdehidrasi sebagai cadangan. CHS (satuan gula/CHS = 0.20, 0,15, 0,05 mmol/mmol), 4-dimetilpiridin (DMAP∕CHS = 1 mmol/mmol), dan 1-(3-dimethylaminop ropyl)-3-etil-karbodiimida hidroklorida (EDC∕ CHS = 1,2 mmol/mmol) dilarutkan secara terpisah dalam 10 mL DMSO, diaduk pada suhu kamar, dan diaktifkan selama 1 jam; reaksi aktivasi diteteskan ke dalam larutan pullulan; dan reaksi dihentikan setelah 48 jam. Reaksi diteteskan ke dalam 200 mL etanol absolut, dan kemudian terbentuk endapan putih. Penyaringan dilakukan dengan pengisapan, dan produk dicuci dengan etanol, tetrahidrofuran, dan dietil eter dalam jumlah yang sesuai dan kemudian dikeringkan pada suhu 80 °C. Tiga jenis polimer CHP dengan derajat substitusi kolesterol yang berbeda diperoleh:CHP-1, CHP-2, dan CHP-3 [36]. Polisakarida pullulan dan polimer CHP 10–20 mg dilarutkan oleh DMSO-d6 dalam kondisi ultrasonik, dan
1
Spektrum H NMR diperiksa. Derajat substitusi kolesterol dalam polimer CHP ditentukan berdasarkan ikatan glikosidik -1,4 dan -1,6 serta luas daerah di bawah puncak metilen.
Persiapan dan Karakterisasi NP CHP yang Mengandung Obat
Sintesis NP CHP yang mengandung mitoxantrone seperti yang dijelaskan [37, 38], NP yang mengandung obat diperoleh dengan dialisis dengan masing-masing 40 mg dari tiga NP CHP yang diganti dengan berbagai tingkat kolesterol dan 4 mg mitoxantrone untuk cadangan. NP berisi obat yang baru disiapkan atau NP yang mengandung obat tersebar dalam air suling setelah liofilisasi diteteskan ke kisi tembaga dengan film pendukung karbon, dan kertas saring dikeringkan. Kotak ditempatkan dalam desikator, kemudian 2% (w /dengan ) asam fosfotungstat (2%) ditambahkan, yang negatif setelah pengeringan secara alami, dan diamati dengan mikroskop elektron transmisi (TEM) [38]. Larutan NP yang mengandung obat yang baru disiapkan atau NP yang mengandung obat yang didispersikan dalam air suling setelah liofilisasi dituangkan ke dalam kuvet dan ditempatkan dalam penganalisis ukuran partikel untuk dideteksi. Setiap sampel diproses tiga kali untuk mendapatkan ukuran NP yang genap dan potensial.
Pengukuran Drug Loading dan Efisiensi Enkapsulasi dari Drug-Loaded CHP NPs
Konten pemuatan obat (LC%) dan efisiensi enkapsulasi (EE%) dari NP CHP yang mengandung mitoxantrone diukur seperti yang dijelaskan [31, 39] sebagai berikut:
Tiga jenis NP yang mengandung mitoxantrone ditempatkan dalam phosphate-buffered saline (PBS) dan dalam media pelepasan pH = 6.8 dan 4.0. Pelepasan mitoxantrone dipelajari secara in vitro dengan dialisis, dan persentase pelepasan terakumulasi (Q%) dihitung seperti yang dijelaskan [40].
Garis Sel dan Kondisi Kultur
Garis sel kanker kandung kemih murine MB49 yang disediakan oleh Dr. P Guo (Institute of Urology, Xi'an Jiaotong University, Xi'an, Shaanxi, China) dikultur di DMEM (Lonza) yang dilengkapi dengan 10% serum janin sapi (Hyclone, Logan , UT, USA) dan 1% penisilin-streptomisin pada 37 °C di udara lembab yang mengandung 5% CO2 .
Uji Viabilitas Sel
Viabilitas sel dinilai dengan uji berbasis tetrazolium. Secara singkat, sel diunggulkan pada 2 × 10
4
per sumur di piring kultur 96-sumur dan dibiarkan menempel selama 24 jam. Kepadatan pembibitan yang berbeda dioptimalkan pada awal percobaan. Sel diperlakukan dengan konsentrasi mitoxantrone yang berbeda selama 24 jam dalam inkubator. Mitoxantrone pada 0,0078, 0,0156, 0,03125, 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5, dan 1 M dilarutkan dalam DMEM yang dilengkapi dengan serum sapi janin 1%. Sejumlah 50 μL MTT tetrazolium salt (Sigma) yang dilarutkan dalam larutan seimbang Hank pada 2 mg/mL ditambahkan ke setiap sumur dengan perlakuan yang ditunjukkan dan diinkubasi dalam CO2 inkubator selama 5 jam. Akhirnya, media diaspirasi dari masing-masing sumur dan 150 L DMSO (Sigma) ditambahkan untuk melarutkan kristal formazan. Absorbansi masing-masing sumur diperoleh dengan menggunakan pembaca pelat Dynatech MR5000 pada panjang gelombang uji 490 nm dan panjang gelombang referensi 630 nm.
IC50 nilai untuk mitoxantrone ditentukan oleh kurva dosis-respons. Tiga konsentrasi NP (0,0625, 0,125, 0,25 μM) dengan tiga derajat substitusi dibandingkan dengan MTT. Prosedur percobaannya sama dengan mitoxantrone.
Penilaian Apoptosis
Laju apoptosis sel ditentukan dengan flow cytometry dengan Annexin V-FITC/propidium iodide (PI). Secara singkat, sel yang dirawat dicuci dua kali dengan PBS dingin, kemudian disuspensikan kembali dalam buffer pengikat pada 2 × 10
6
sel/mL sesuai dengan instruksi pabrik. Kemudian, 5 L Annexin V-FITC dan 5 M PI ditambahkan ke dalam suspensi sel 100 L dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar dalam gelap. Setelah menambahkan 300 μL binding buffer, sel berlabel dideteksi oleh flow cytometry dalam waktu 1 jam.
Semua sel apoptosis awal (Annexin V-FITC-positif [berwarna hijau], PI-negatif), sel nekrotik (Annexin V-FITC-negatif, PI-positif), sel apoptosis akhir (ganda positif), serta sel hidup ( negatif ganda) dideteksi dengan flow cytometry (FCM) dan dianalisis dengan menggunakan perangkat lunak Cell Quest (Becton Dickinson). Panjang gelombang eksitasi laser argon adalah 488 nm dan panjang gelombang emisi 530 nm (FL-1 channel) untuk fluorescein isothiocyanate (FITC) dan 670 nm (FL-3 c3 channel) untuk PI. Juga, apoptosis diperiksa dengan mikroskop fluoresensi. Pertama, 1,0 × 10
5
sel-sel diunggulkan dalam pelat kultur 96-sumur dan setelah 24 jam, sel diperlakukan seperti di atas, kemudian 24 jam kemudian, buffer pengikat 100 μL, 1 L Annexin V-FITC, dan 1 LPI ditambahkan ke dalam sel pada suhu kamar dalam gelap selama 15 menit, disimpan pada suhu rendah, dan diamati dengan mikroskop fluoresensi.
Uji Migrasi Sel
Total 8 × 10
5
sel diunggulkan dalam piring enam sumur dan dibiarkan mencapai pertemuan penuh. Monolayer terluka dengan menggunakan tongkat koktail. Sel diinkubasi dengan DMEM bebas serum seperti yang ditunjukkan. Gambar digital diambil pada 0, 6, 12, 24, dan 48 jam. Area rata-rata dihitung dengan menggunakan Gambar J dan percobaan diulang tiga kali.
Hasil dan Diskusi
Konjugat CHP dan Derajat Substitusi Kolesterol
1
Nilai NMR H untuk CHP (DMSO-d6 dengan TMS, ppm) adalah 2,53 ppm (2 gugus metilen, –OCH2 CH2 HAI-). Gambar 1 menunjukkan
1
Spektrum H NMR, mengkonfirmasikan bahwa kolesterol secara kimiawi terikat pada rantai panjang pullulan melalui lengan pengatur jarak suksinat. Spektrum untuk ketiga NP CHP yang disintesis pada rasio umpan yang berbeda (a, b, c) menunjukkan puncak karakteristik pullulan; -1-4 dan -1,6 ikatan glikosidik adalah ∂4,68 (1Hα1–6 ), 5,05 (1Hα1-4 ), dan 2,53 (2 gugus metilen, –OCH2 CH2 O–), masing-masing, yang juga mudah dibedakan. Puncak karakteristik baru muncul pada 0,40 hingga 2,40 (hidrogen pada kerangka kolesterik), yang menegaskan bahwa ketiga polimer CHP berhasil disintesis. Daerah di bawah puncak mencerminkan jumlah atom, dan derajat substitusi kolesterik dapat dihitung sebagai berikut [41]:
Spektrum NMR untuk CHP-1 (a ), CHP-2 (b ), dan CHP-3 (c )
dimana jumlah dari A ∂4.68 dan A ∂5.05 mewakili jumlah unit gula, A∂ 2,53 adalah jumlah atom hidrogen dalam –OCH2 CH2 O– dari kolesteril suksinat, dan A∂ 2,53 /4 adalah jumlah –OCH2 CH2 O–, yaitu jumlah kolesterol dalam suksinat anhidrida CHS. Jadi, rumus di atas menunjukkan derajat substitusi kolesterik dalam molekul CHP sebagai jumlah gugus kolesteril per 100 unit glukosa. Rasio pakan yang dihitung dan rasio molar unit gula kolesteril dan pullulan berturut-turut adalah 1/5, 3/20, dan 1/20, dan derajat substitusi ketiga CHP-1, CHP-2, dan CHP-3 yang disintesis. polimer adalah 6,82%, 5,78%, dan 2,74%, masing-masing. Derajat substitusi kolesterol pada rantai pullulan meningkat dengan meningkatnya rasio pakan. Namun, tingkat substitusi yang sebenarnya lebih rendah dari kedua rasio pakan.
Rantai pullulan mungkin ada sebagai rantai yang fleksibel dan melingkar dalam pelarut, dan setelah penambahan sejumlah kolesterol tertentu, kolesterol yang dicangkokkan menunjukkan hambatan sterik molekul yang lebih besar, yang mempengaruhi reaksi esterifikasi langsung lebih lanjut dari suksinil kolesterol dan gugus hidroksil. pada rantai pullulan. Kesulitan reaksi meningkat secara signifikan, sehingga tingkat substitusi menjadi lebih kecil.
NP CHP yang Diisi Obat dan Ukurannya
Ukuran tiga NP CHP kosong untuk CHP-1, CHP-2, dan CHP-3 adalah 79,1, 104,9, dan 166,8 nm. Pada tingkat substitusi tertentu, hidrofobisitas diperkuat dengan meningkatnya derajat substitusi kolesterol. Semakin kuat hidrofobisitas, semakin baik NP teragregasi CHP membentuk inti hidrofobik yang lebih kompak, yang menurunkan ukuran NP [42]. Gambar 2 menunjukkan ukuran NP CHP berisi obat. Ukuran partikel untuk CHP-1, CHP-2, dan CHP-3 masing-masing adalah 86,4, 162,30, dan 222,28 nm. Dalam rasio obat dan bahan yang sama, ukuran partikel NP yang mengandung obat dengan tingkat substitusi yang tinggi dari gugus hidrofobik polimer adalah kecil, tetapi diameter partikel NP yang memuat obat lebih besar daripada obat yang tidak dienkapsulasi. -mengandung NP kosong dengan derajat substitusi yang sama. Saat mitoxantrone memasuki inti hidrofobik, ukuran partikel NP meningkat. Pada Gambar. 2d, potensi zeta dari NP CHP yang mengandung obat adalah 1.12 mV. Gambar. 2e adalah gambar TEM yang menunjukkan bahwa NP yang mengandung obat berbentuk bola.
Gambar ukuran NP dimuat dengan mitoxantrone (CHP-1 (a ), CHP-2 (b ), CHP-3 (c )), gambar potensial (CHP-2 (d )), dan gambar TEM (CHP-2 (e ))
Pelepasan Obat dari NP yang Diisi Obat dengan Ukuran Berbeda dan Di Bawah Media Asam Berbeda
Ketika rasio obat dan polimer CHP adalah sama, pemuatan obat dan efisiensi penjeratan dari NP CHP-1, CHP-2, dan CHP-3 yang dimuat obat adalah 8,17% dan 88,92%; 7,62% dan 82,28%; dan 4,83% dan 50,67%, masing-masing. Semakin tinggi substitusi hidrofobik kolesterik pada polimer CHP, semakin kecil ukuran partikel yang terbentuk dan semakin tinggi pula efisiensi drug loading dan entrapment. Gambar 3 menunjukkan profil pelepasan obat untuk tiga NP CHP yang mengandung obat. Di PBS, obat dilepaskan selama 48 jam. Tingkat pelepasan untuk CHP-1, CHP-2, dan CHP-3 masing-masing adalah 38,73%, 42,35%, dan 58,89%. Ketiga NP menunjukkan sifat pelepasan berkelanjutan, tetapi semakin kecil ukuran NP, semakin kuat hidrofobisitas dan semakin lambat pelepasan obat. Pada pH 6,8, laju pelepasan obat untuk CHP-1, CHP-2, dan CHP-3 masing-masing adalah 43,82%, 49,48%, dan 64,18%. Dalam kondisi asam lemah, NP CHP melepaskan obat secara berkelanjutan, tetapi laju pelepasan meningkat secara signifikan. Pada pH 4.0, setelah pelepasan obat 48 jam, laju pelepasan obat untuk CHP-1, CHP-2, dan CHP-3 masing-masing adalah 51,25%, 56,23%, dan 75,46%. Pelepasan obat NP CHP secara signifikan lebih cepat pada pH yang lebih rendah, terutama untuk NP CHP-3, yang terbesar dari tiga NP CHP.
Pelepasan mitoxantrone (MTO) dari NP pullulan dalam saline buffer fosfat (kotak hitam:CHP-1, lingkaran putih:CHP-2, segitiga hitam mengarah ke bawah:CHP-3), pada pH 6,8 (segitiga putih mengarah ke atas:CHP- 1, berlian hitam:CHP-2, kotak putih:CHP-3) dan dalam pH 4.0 (segitiga hitam:CHP-1, berlian putih:CHP-2, lingkaran hitam:CHP-3) pada 37 °C in vitro
Sitotoksisitas dari NP CHP yang Dimuat Mitoxantrone
Pada uji MTT (Gbr. 4), IC50 nilai mitoxantrone untuk menghambat pertumbuhan sel kanker kandung kemih adalah 0,25, 0,20, dan 0,06 M pada 24, 48, dan 72 jam, masing-masing (Tabel 1). Kami menganggap 24 jam sebagai waktu pemberian dosis.
Pengaruh pengobatan dengan mitoxantrone dan NP pada proliferasi sel garis sel kanker kandung kemih MB49. Viabilitas sel dinilai dengan uji berbasis tetrazolium dengan pengobatan 24, 48, dan 72 jam dengan mitoxantrone dan obat nano dari 0 hingga 0,5 μg/mL pada lini sel kanker kandung kemih murine MB49
Dengan konsentrasi NP mitoxantrone bebas dan mitoxantrone-CHP yang sama dengan pemberian yang sama, hasil eksperimen MTT pada Gambar 5 menunjukkan bahwa konsentrasi mitoxantrone bebas lebih toksik bagi sel kanker kandung kemih daripada NP mitoxantrone-CHP. Dalam membandingkan NP mitoxantrone-CHP dengan tiga derajat substitusi kolesterol, efek sitotoksik yang paling kuat adalah CHP-3, diikuti oleh CHP-2, dan yang terlemah adalah CHP-1.
Sitotoksisitas mitoxantrone gratis dan NP CHP yang mengandung mitoxantrone pada 24 jam (kotak biru:mitoxantrone, lingkaran merah muda:CHP-1, segitiga hijau:CHP-2, segitiga merah mengarah ke bawah:CHP-3)
Meskipun efek toksik dari berbagai konsentrasi mitoxantrone-CHP NPs pada sel kanker kandung kemih serupa, terutama CHP-2 dan CHP-3, efek CHP-1 berkurang secara signifikan. Setiap konsentrasi CHP-1 menunjukkan fenomena ini. Jadi, semakin besar ukuran mitoxantrone-CHP NP, semakin kuat sitotoksisitasnya.
Efek terapeutik NP memiliki dua bagian:(1) penyerapan NP seluler dan (2) NP dilepaskan di luar sel dan obat-obatan memasuki sel secara bebas untuk mengerahkan kemanjurannya. Karena mitoxantrone bebas memiliki efek yang lebih kuat daripada NP mitoxantrone-CHP, CHP-3 memiliki efek terapeutik yang lebih kuat daripada dua NP CHP lainnya pada dosis obat yang sama. Pelepasan CHP-3 adalah yang tercepat, dan efek terapeutik NP CHP bergantung terutama pada toksisitas mitoxantrone bebas dalam sel setelah pelepasan sediaan nano-farmasi.
Apoptosis Sel NP Mitoxantrone-CHP
Kami menggunakan imunofluoresensi dan flow cytometry untuk membandingkan efek konsentrasi yang sama dari mitoxantrone 0,2 g/mL dan tiga NP CHP yang mengandung obat pada apoptosis sel MB49. Mitoksantron bebas lebih kuat untuk apoptosis daripada ketiga NP mitoxantrone-CHP (Gbr. 6). Namun, CHP-3 memiliki efek paling kuat, dan yang terlemah adalah CHP-1. Hasil MTT sebelumnya dikonfirmasi lebih lanjut.
Apoptosis mitoxantrone dan nanodrugs pada 24 jam pada sel kanker kandung kemih MB49(a DMSO, b mitoxantrone, c CHP-3, d CHP-2, e CHP-1):A. Pewarnaan ganda Annexin V-FITC/PI terdeteksi dengan mikroskop fluoresensi, sel-sel apoptosis awal menunjukkan pewarnaan Annexin V-FITC-positif (hijau), sel-sel nekrotik adalah PI-positif (merah), dan sel-sel apoptosis akhir menunjukkan pewarnaan ganda positif (kuning). B. Tingkat apoptosis ditentukan oleh FCM. Sel hidup (Q3), tingkat apoptosis awal (Q4), tingkat apoptosis akhir (Q2), sel nekrotik (Q1). Semakin besar pewarnaan sel, semakin tinggi tingkat apoptosis
Migrasi Sel NP CHP yang Dimuat Mitoxantrone
Kemampuan 24 dan 48 jam dari mitoxantrone bebas dan tiga NP CHP untuk menghambat migrasi sel MB49 diamati dengan perbandingan dengan kontrol (Gbr. 7). Penghambatan migrasi tidak secara signifikan lebih kuat untuk mitoxantrone bebas daripada tiga NP CHP. Pada uji MTT dan uji apoptosis, penghambatan migrasi lebih kuat untuk obat bebas daripada ketiga NP CHP, terutama karena obat bebas lebih mudah masuk ke sel untuk membunuh sel kanker. Dalam percobaan migrasi sel juga, obat bebas dapat menghambat migrasi sel lebih efisien daripada nano-farmasi CHP, yang mungkin karena beberapa obat-nano CHP tidak difagosit antar sel, yang menghasilkan resistensi migrasi sel kanker. Selain itu, ketiga NP CHP tidak berbeda dalam menghambat migrasi sel kanker, sehingga resistensi sterik yang dibentuk oleh NP berperan penting dalam migrasi sel. Oleh karena itu, CHPNPs yang mengandung obat menghambat sel kanker dalam dua cara:(1) pelepasan ekstraseluler adalah cara yang dominan, dimana obat-nano melepaskan obat di luar sel dan membunuh sel kanker sebagai obat bebas, dengan NP CHP-3 menjadi lebih toksik. daripada NP CHP lainnya, dan (2) NP CHP di luar sel kanker menciptakan resistensi sterik, sehingga menghalangi migrasi sel kanker.
Mitoxantrone saja dan NP mitoxantrone yang dimuat-CHP menunjukkan gangguan migrasi pada tes penyembuhan luka. a DMSO, b mitoxantrone, c CHP-3, d CHP-2, e CHP-1. Gambar menunjukkan celah wilayah yang tergores pada waktu yang berbeda; A0 , A24 , dan A48 mewakili 0, 24, dan 48 jam pengobatan DMSO, masing-masing
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyaring NP CHP ukuran yang sesuai sebagai pembawa obat dan untuk memberikan bukti eksperimental untuk tindakan terapeutik NP CHP. Kami mensintesis tiga macam sterol-substituted pullulan polymers (CHPs), CHP-1, CHP-2, dan CHP-3, dengan derajat substitusi kolesterol masing-masing 6,82%, 5,78%, 2,74%, dan diameter 86,4, 162,30, dan 222,28 nm. Laju pelepasan obat dari tiga jenis NP mitoxantrone-CHP selama 48 jam berturut-turut adalah 38,73%, 42,35%, dan 58,89%. Tingkat substitusi hidrofobik dalam polimer dikaitkan dengan proses perakitan sendiri NP, yang memengaruhi ukurannya dan karenanya laju pelepasan obat. Dalam media pelepasan asam, pelepasan dipercepat secara signifikan. Semakin besar NP, semakin besar kecepatan pelepasan obat. Pada 24 jam, IC50 nilai adalah 0,25 M, untuk efek penghambatan terbaik mitoxantrone pada pertumbuhan sel kanker kandung kemih. NP CHP-3 yang mengandung obat dengan ukuran terbesar adalah yang paling beracun bagi sel kanker kandung kemih dan NP CHP-3 memiliki efek terkuat dalam mempromosikan apoptosis sel. Semua NP dapat menghambat migrasi sel MB49, tetapi NP CHP-3 ukuran besar memiliki penghambatan yang paling kuat.
Polimer amfifilik dapat merakit sendiri menjadi NP dalam larutan berair; contohnya adalah polisakarida pullulan dan kitosan, yang dapat dimodifikasi menjadi polimer amfifilik dengan modifikasi hidrofobik molekul kecil dan dirakit sendiri menjadi NP bola dalam larutan berair dengan gugus hidrofobik sebagai inti dan cangkang rantai gula hidrofilik [43, 44]. Selama perakitan sendiri, kelompok hidrofobik adalah kekuatan pendorong untuk pembentukan NP dan kunci untuk pembentukan struktur cangkang dan inti mereka. Sifat dan berat molekul gugus hidrofilik juga memiliki efek penting pada pembentukan dan ukuran NP [45, 46]. Ketika polimer yang sama dimodifikasi dengan fraksi kecil dari gugus hidrofobik, tingkat substitusi hidrofobik harus moderat, dan hanya dalam kisaran tertentu substitusi hidrofobik dapat dirakit sendiri menjadi NP. Jika tingkat substitusi hidrofobik terlalu tinggi, hidrofobisitas polimer terlalu kuat, yang tidak kondusif untuk perakitan sendiri. Jika substitusi hidrofobik terlalu rendah, gaya penggerak hidrofobik terlalu kecil untuk membentuk NP [47].
Dalam penelitian ini, kami berhasil mensintesis tiga jenis polimer CHP dengan berbagai tingkat substitusi kolesterol dengan merancang rasio umpan yang sesuai, dan semuanya dapat dirakit sendiri menjadi NP dengan ukuran tertentu. Selama perakitan sendiri polimer CHP, obat hidrofobik seperti mitoxantrone dapat tertanam di pusat hidrofobik NP untuk membentuk NP yang mengandung obat (Gbr. 8). Ukuran NP yang mengandung obat terkait dengan tingkat substitusi polimer CHP:semakin tinggi tingkat substitusi, semakin kecil ukurannya. Tingkat substitusi polimer juga mempengaruhi jumlah obat yang dimuat ke dalam NP setelah perakitan sendiri. Ketika rasio polimer obat adalah sama, semakin tinggi derajat substitusi, semakin besar beban obat [48]. Juga, rasio polimer terhadap obat mempengaruhi efisiensi enkapsulasi dan pemuatan obat. Hanya ketika rasio umpan berada dalam kisaran yang tepat, pemuatan obat dan efisiensi enkapsulasi akan relatif tinggi [31]. Pelepasan obat NP secara langsung mempengaruhi efek terapeutiknya, yang terkait erat dengan jenis nanomaterial, muatan permukaan dan gugus hidrofobik NP, nilai pH media pelepas, dan adsorpsi protein human serum albumin (HSA) in vivo [49, 50]. The drug release of mitoxantrone-loaded CHP NPs showed slow release. The drug release of CHP NPs with large size was faster and that of NPs in an acid environment was faster. The drug release rate of larger-sized NPs was more obvious and faster.
The self-assembly of mitoxantrone-loaded CHP nanoparticles (NPs)
Cancer chemotherapy is the main way to treat cancer currently, but the chemotherapy drugs are not tissue-specific and are toxic to normal tissues, and some cause great damage to immune cells, which harms the overall treatment effect [51, 52]. Nanomedicine can passively target cancer tissues via the EPR effect, thereby reducing drug deposition in non-target tissues and reducing toxicity and side effects. In this study, we used bladder cancer cells as model cancer cells, and we discuss the effects of NPs and NPs size on bladder cancer. The antitumor effect was stronger for free mitoxantrone than CHP NPs; however, if the whole drug is given, mitoxantrone is not tissue-specific. The deposition and wasting of tissues and the toxicity and side effects caused by these drugs will not be as effective as nano-drug treatments. Therefore, the toxic effects on cancer cells and the inhibition of cell migration was better with the free drug than drug-loaded NPs, which does not indicate that the overall therapeutic effect of CHP nanometers is not as good as that of free mitoxantrone. We point out the effect of hydrophobic degree of substitution on the size of nanoscale drugs and the effect of nano size on drug loading, drug release, cytotoxicity and cancer cell migration. After the NPs are passively targeted to cancer tissue via the EPR effect, the therapeutic effectiveness of drug-loaded NPs is mainly derived from the release of drugs in the tissue and the release of NPs to cells (Fig. 9). The therapeutic effect of CHP NPs is whether its extracellular or intracellular release plays the dominant role. From the cell experiments, the size of CHP NPs has a strong effect:with large size, drugs are released more, but the amount of the drug is the same. Therefore, the therapeutic effect of CHP-NPs may depend mainly on the release in the tissue instead of cell uptake.
The treatment efficacy of mitoxantrone-loaded CHP NPs by mainly location release in tumor tissue
Many classical NPs are used as drug carriers, and the CHP NPs we prepared are superior to others. For example, biogenetic NPs (such as exosome, extracellular vesicles-mimetic, modularized extracellular vesicles) are difficult to prepare [53]. The target distribution of common liposomes is not ideal and its instability is still a problem [54]. Inorganic NPs such as quantum dot NPs are very stable, but as foreign matter, their biocompatibility is poor, which may cause side effects to humans [55]. CHP NPs are easy to prepare and we can control their size by controlling the degree of hydrophobic substitution [48]. Because they can be directly degraded by amylase in vivo, they have good biocompatibility [56]. In addition, CHP NPs have good stability and excellent drug release properties [57].The disadvantage is that they will inevitably be swallowed in part by the mononuclear phagocytic system [58]. More research is needed to reduce the removal by the system and improve the effective blood concentration of NPs.
Conclusion
The size of mitoxantrone-loaded CHP NPs is related to the degree of cholesterol substitution in the polymer. The higher the hydrophobicity substitution degree, the smaller the size, and the greater the drug loading and encapsulation efficiency, and the slower the drug release. Under acidic conditions, the stronger the acidity, the faster the release of CHP NPs. Moreover, the release of NPs with larger size is best and larger-sized NPs can inhibit the growth of bladder cells and their migration better than smaller-sized NPs. CHP NPs kill cancer cells mainly by the release of nanoscale drugs outside the cell.
