Pergeseran Spektral Merah dalam Deteksi Kolorimetri Sensitif Tuberkulosis oleh Kompleks Antigen-Antibodi ESAT-6:Strategi Baru dengan Nanopartikel Emas

Latar Belakang

Tuberkulosis (TB) disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis , salah satu penyakit penyebab kematian utama pada manusia, dan awalnya menyerang paru-paru. Akibatnya, menyebar ke bagian lain dari tubuh seperti ginjal, tulang belakang, dan otak dan menjadi lebih parah ketika kekebalan menurun. Untuk menyelamatkan orang dengan tindakan pencegahan, adalah wajib untuk mengidentifikasi dan mengobati TB pada tahap laten. Di bawah tahap ini, pasien telah terinfeksi oleh M. TBC; Namun, patogen tidak aktif. Ada berbagai metode yang digunakan untuk mendeteksi TB pada stadium laten, antara lain uji kulit TB dan uji interferon-gamma. Pada kebanyakan kasus, tes kulit TB saja tidak dapat mendeteksi infeksi TB aktif, dan pasien perlu dikonfirmasi dengan tes pendukung lainnya, seperti rontgen dada, sitologi sputum, dan kultur sputum [1]. Tetapi tes ini membutuhkan langkah-langkah laboratorium yang lebih keras dan memakan waktu beberapa bulan untuk menyelesaikannya; oleh karena itu, mengembangkan metode yang lebih mudah dan efisien untuk mendeteksi TB pada tahap awal adalah wajib.

Uji kolorimetri berbasis nanopartikel emas (GNP) menunjukkan perhatian besar di bidang biosensor karena karakteristik fisik dan kimianya yang unik, seperti koefisien kepunahan yang lebih tinggi pada panjang gelombang yang terlihat dan resonansi plasmon permukaan yang dapat diubah. Solusi GNP monodispersi menampilkan koefisien kepunahan tinggi dan menunjukkan spektrum di wilayah yang terlihat. Jika GNP memiliki ruang yang tepat di antara mereka, mereka akan tampak sebagai larutan berwarna merah dan akan berubah menjadi biru ketika mereka dikumpulkan di bawah kondisi ion divalen yang tersedia [2]. Dengan adanya ion yang sesuai, ruang di antara GNP akan terisi, mencapai tahap agregasi, dan menampilkan pergeseran spektral menuju panjang gelombang yang terlihat yang disebut 'pergeseran merah'. Dengan memanfaatkan pergeseran spektral ini, banyak tes kolorimetri telah dihasilkan untuk mendeteksi penyakit, seperti HIV dan influenza [3, 4]. Jenis tes ini mengandalkan urutan oligonukleotida untai tunggal, dan aptamer telah banyak digunakan sebagai molekul yang cocok untuk mendeteksi target [5, 6]. Sekuens DNA atau RNA untai tunggal dapat mengikat pada permukaan GNP melalui koordinasi antara atom emas dan nitrogen dalam basa DNA [7,8,9]. GNP yang dimodifikasi dengan oligonukleotida stabil di bawah kondisi garam yang lebih tinggi. Ketika analit tersedia, oligonukleotida akan dipisahkan dari emas dan dikumpulkan dengan adanya ion divalen kemudian menampilkan larutan biru. Uji GNP yang didemonstrasikan lebih murah, memakan waktu lebih sedikit untuk deteksi, lebih mudah untuk difungsikan, dan menunjukkan deteksi visual dengan sensitivitas yang baik [10,11,12,13,14]. Karena sikap positif ini, uji kolorimetri berbasis GNP telah diperluas untuk mendeteksi molekul yang lebih kecil termasuk DNA, RNA, protein, sel utuh, dan ion logam. Beberapa aptamer tersedia untuk mendeteksi analit ini dengan menggunakan uji kolorimetri berbasis GNP aptamer yang disederhanakan, menunjukkan pergeseran spektral merah [15,16,17,18,19].

Meskipun tes kolorimetri telah didokumentasikan dengan baik dengan aptamer, DNA atau RNA, mereka juga memiliki dampak negatif dalam beberapa kasus karena kinerjanya yang buruk dengan urutan yang lebih panjang dan kegagalan dengan probe dan analisis target interaktif [20,21,22]. Ini mungkin karena muatan yang lebih tinggi pada biomolekul yang membuat interaksi yang lebih kuat dengan permukaan GNP secara elektrostatik, yang pada akhirnya membuat molekul target tidak dapat melepaskan molekul probe yang terpasang pada permukaan GNP. Untuk mengatasi rintangan ini, di sini, kami memperkenalkan uji kolorimetri berbasis antibodi satu langkah untuk mendeteksi protein ESAT-6. Protein ESAT-6 adalah protein sekretaris awal, diidentifikasi sebagai antigen penting dalam tuberkulosis [23,24,25]. Mendiagnosis protein ESAT-6 pada tahap awal, adalah wajib untuk mengobati penyakit dan menghindari penyebaran. Gambar 1a, b mengilustrasikan strategi yang dirancang untuk mendeteksi ESAT-6 oleh antibodinya menggunakan uji pergeseran spektral merah kolorimetri berbasis GNP. Berikut ini adalah langkah-langkah yang terlibat dalam metode deteksi ini:(i) antibodi poliklonal anti-ESAT-6 telah dicampur sebelumnya dengan antigen ESAT-6/CFP-10, (ii) GNP ditambahkan ke larutan ini, (iii) NaCl ditambahkan ditambahkan, dan (iv) deteksi visual dan analisis pergeseran spektral merah dengan spektroskopi UV dilakukan. Dengan langkah-langkah ini, kami melakukan analisis kritis untuk menjelaskan interaksi berbasis muatan antara GNP dan protein yang dikomplekskan dan menyimpulkan kesesuaian antigen-antibodi pra-pencampuran untuk pengujian kolorimetri. Untuk eksperimen kontrol, kultur filtrat protein-10 (CFB-10) digunakan sebagai pengganti ESAT-6 (Gbr. 1).

Representasi skema untuk deteksi ESAT-6 dengan uji kolorimetri berbasis antibodi pra-kompleks satu langkah. a Strategi untuk antibodi anti-ESAT-6 pra-kompleks ESAT-6. b Strategi untuk antibodi anti-ESAT-6 CFP-10 pra-kompleks (eksperimen kontrol)

Metode

Reagen dan Biomolekul

Target antigenik sekretori awal (ESAT-6) dan protein filtrat kultur 10 kDa (CFP-10) diperoleh dari Sino Biological Inc. (Beijing, China). Anti-ESAT-6 dibeli dari Santa Cruz Biotechnology (USA). Nanopartikel emas dengan diameter 15 nm diperoleh dari Sigma Aldrich (USA). Air deionisasi yang dihasilkan oleh sistem deionisasi RO (18,3 MΩ·cm SASTEC (M) Sdn. Bhd) digunakan untuk seluruh eksperimen.

Optimasi Ion Divalen ke GNP Agregat

Untuk mendeteksi ESAT-6 dalam penelitian ini, ion divalen (NaCl) digunakan untuk memvisualisasikan agregasi GNP. Untuk mengoptimalkan kondisi yang sesuai dengan NaCl, konsentrasi yang berbeda (konsentrasi akhir menjadi 50 hingga 800 mM) ditambahkan ke volume konstan (20 μl) GNP [one optical density (OD)]. Setelah 15 menit, perubahan warna difoto menggunakan kamera digital SONY. Pergeseran spektral dengan perubahan ini dipantau oleh Nanofotometer.

ESAT-6 Biofouling pada Permukaan GNP:Validasi Spesifisitas

Untuk memvalidasi pengikatan non-spesifik (biofouling) ESAT-6 pada permukaan GNP, konsentrasi yang berbeda (konsentrasi akhir menjadi 1,5 hingga 100 nM) ditambahkan ke 20 μl GNP. Setelah 30 menit, konsentrasi optimal NaCl ditambahkan ke setiap tabung dan kemudian diamati perubahan warna dan pergeseran spektral seperti yang dilakukan pada percobaan di atas. Demikian pula, biofouling juga diuji dengan CFP-10.

Optimasi Konsentrasi Antibodi Anti-ESAT-6 Wajib pada Permukaan GNP

Untuk mengoptimalkan konsentrasi antibodi anti-ESAT-6 yang diperlukan untuk mengevaluasi eksperimen saat ini, konsentrasi antibodi anti-ESAT-6 yang berbeda (konsentrasi akhir menjadi 30 hingga 500 nM) dicampur secara terpisah dengan 20 μl GNP. Setelah 30 menit inkubasi, volume optimal NaCl ditambahkan ke setiap tabung, foto diambil, dan perubahan spektral dicatat setelah 15 menit.

Deteksi ESAT-6 oleh Pergeseran Spektral Merah Kolorimetri Berbasis Antibodi

Untuk mengembangkan deteksi kolorimetri ESAT-6 dengan perubahan spektral pergeseran merah kolorimetri berbasis antibodi, 1 μl 1 μM ESAT-6 (volume akhir akan menjadi 500 nM) awalnya dicampur dengan 1 μl konsentrasi antibodi anti-ESAT-6 yang optimal . Setelah 30 menit inkubasi, 20 l GNP ditambahkan ke setiap tabung dan kemudian menunggu selama 30 menit. Kemudian, konsentrasi NaCl optimal ditambahkan, dan perubahan spektral diukur di bawah panjang gelombang 400 hingga 800 nm. Demikian pula, konsentrasi ESAT-6 lainnya (0 hingga 500 nM) dititrasi dengan konsentrasi antibodi anti-ESAT-6 yang dioptimalkan sama. Untuk memeriksa batas deteksi, ESAT-6 diuji dari picomolar terendah (dari 1,25 pM) hingga urutan nanomolar (500 nM). Konsentrasi molekul lain (antibodi anti-ESAT-6, GNP dan NaCl) dijaga konstan.

Hasil dan Diskusi

Uji kolorimetri berbasis antibodi yang menunjukkan perubahan spektral sebagai pergeseran merah diikuti di sini untuk mendeteksi ESAT-6. Gambar 1a menunjukkan representasi skema dari uji kolorimetri berbasis antibodi satu langkah; dengan adanya ESAT-6, perubahan warna dalam larutan GNP diharapkan menjadi biru dengan pergeseran spektral merah setelah kehilangan stabilitas GNP di bawah konsentrasi tinggi ion divalen, NaCl, sedangkan, tanpa ESAT-6, GNP stabil karena perlekatan antibodi anti-ESAT-6 pada permukaan GNP dan menyebabkan mempertahankan warna merah aslinya bahkan pada konsentrasi NaCl yang tinggi. Strategi ini dikonfirmasi dengan menggunakan CFP-10 non-spesifik terhadap antibodi anti-ESAT-6 dan seharusnya menampilkan solusi GNP warna merah (Gbr. 1b). Karena CFB-10 juga merupakan protein utama dalam menyebabkan tuberkulosis, di sini, kami digunakan sebagai protein kontrol [26]. Umumnya, untuk jenis pengujian berbasis GNP ini, GNP berukuran 13 hingga 15 nm sangat cocok untuk mencapai sensitivitas yang lebih tinggi [27], dan meningkatkan ukuran GNP tidak sesuai untuk mencapai batas deteksi yang baik. Hal ini disebabkan oleh alasan bahwa peningkatan ukuran GNP membutuhkan jumlah antibodi yang lebih tinggi untuk mengikat permukaan GNP. Jika jumlah antibodi yang lebih tinggi mengikat pada permukaan, itu mengarah ke hasil negatif palsu. Di sini, kami ingin menggunakan GNP 15 nm dan mencapai sensitivitas maksimal ke tingkat sub-pikomolar.

Optimasi Ion Divalen untuk Agregasi GNP Terkendali

Untuk optimasi deteksi ini, kami menggunakan NaCl untuk agregasi GNP. Ketika kami menyaring konsentrasi NaCl yang diperlukan seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2, konsentrasi NaCl yang berbeda ditambahkan ke GNP, warna larutan mulai tampak biru, menunjukkan agregasi dengan 100 mM NaCl. Dan juga dari spektrum, terlihat jelas bahwa hanya dengan GNP agregat (konsentrasi NaCl dari 100 hingga 800 mM), terjadi pergeseran merah pada panjang gelombang ~ 600 nm, sedangkan GNP terdispersi (konsentrasi NaCl dari 0 hingga 50 mM) masih mempertahankan spektrumnya pada ~ 500 nm. Namun, ada perubahan spektral puncak yang tidak signifikan dengan 50 mM NaCl. Dari hasil ini, disimpulkan bahwa kami membutuhkan setidaknya 100 mM NaCl untuk agregasi GNP, tetapi untuk mendapatkan sensitivitas yang ditingkatkan, kami menggunakan konsentrasi NaCl yang lebih tinggi (800 mM) untuk eksperimen lebih lanjut. Sebelumnya, kisaran NaCl yang serupa untuk agregasi GNP ditunjukkan oleh Gopinath et al. [10].

Optimalisasi ion divalen. Dari 0 hingga 800 mM NaCl dicampur dengan GNP konstan (1 OD). Setelah 15 menit, dipindai pada panjang gelombang 400 hingga 800 nm. Pemotretan dilakukan dengan kamera digital seperti pada gambar inset. Perubahan spektrum dan warna ditunjukkan dengan agregasi GNP dengan 100 mM NaCl. Puncak ditunjukkan dengan bola berwarna masing-masing

Optimasi Antibodi ESAT-6 untuk Dispersi GNP

Setelah dilakukan optimasi NaCl, selanjutnya kami menentukan konsentrasi antibodi anti-ESAT-6 yang sesuai untuk melakukan eksperimen. Karena sensitivitas sangat tergantung pada konsentrasi antibodi, diperlukan konsentrasi antibodi anti-ESAT-6 yang sesuai untuk menginduksi dispersi GNP. Gagasan di baliknya adalah, jika konsentrasi antibodi minimal yang diinginkan, ia dapat dengan mudah dikomplekskan dengan penambahan target dan tidak ada molekul bebas untuk dilekatkan pada GNP, sedangkan, jika beberapa antibodi tersedia, ketika kami mencoba mendeteksi konsentrasi rendah ESAT-6, hanya sejumlah kecil antibodi yang dikomplekskan. Kemudian, antibodi yang tersisa mengikat pada permukaan GNP dan menginduksi stabilitas GNP, yang menyebabkan sensitivitas yang lebih rendah. IgG antibodi memiliki berat molekul yang lebih tinggi (~ 150 kDa), membuat antibodi bebas mudah terikat pada permukaan GNP melalui interaksi elektrostatik atau ikatan ion/hidrogen antara gugus anion yang diakhiri permukaan pada permukaan GNP [28]. Karena berat molekul yang lebih tinggi, jumlah antibodi lebih sedikit, dan di sini, ia diseimbangkan dengan berat molekul 6 kDa ESAT-6, yang memiliki lebih banyak molekul bahkan pada konsentrasi yang lebih rendah. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3a, pertama-tama kami menambahkan dari konsentrasi terendah antibodi anti-ESAT-6 (30 nM) dan meningkat hingga konsentrasi maksimum (500 nM) ke GNP. Ditunjukkan bahwa 30 nM antibodi anti-ESAT-6 dengan GNP berada dalam transisi agregasi bahkan dengan 800 mM NaCl, karena tidak memiliki cukup antibodi yang tersedia di permukaan GNP, tetapi dari 60 nM antibodi anti-ESAT-6, larutan telah mempertahankan warna merahnya karena jumlah antibodi anti-ESAT-6 yang cukup mengikat pada permukaan GNP. Sampai konsentrasi maksimum diuji (500 nM), warna GNP tetap berwarna merah dengan stabilitas tinggi. Setelah memutuskan konsentrasi yang sesuai untuk menjadi 60 nM antibodi, untuk memeriksa stabilitas antibodi anti-ESAT-6 dan konjugat GNP, kami mencoba meningkatkan konsentrasi NaCl. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3b, konjugat GNP antibodi yang disiapkan (antibodi 60 nM dengan GNP) sangat stabil bahkan dengan penambahan 1 M NaCl. Spektrum pada Gambar. 3c juga menunjukkan hasil yang sama seperti deteksi visual; konjugat GNP antibodi anti-ESAT-6 yang disiapkan mempertahankan puncaknya pada ~ 520 bahkan dengan konsentrasi NaCl yang tinggi dan, pada saat yang sama, hanya GNP yang mengarah ke agregat dengan 800 mM NaCl dengan puncak maksimum pada ~ 500 nm.

Optimalisasi dan stabilitas antibodi ESAT-6. Konsentrasi antibodi anti-ESAT-6 yang berbeda diuji menggunakan 800 mM NaCl. a Agregasi atau dispersi GNP dengan antibodi anti-ESAT-6 (0 hingga 500 nM); Panah menunjukkan daerah transisi untuk konsentrasi antibodi yang optimal. b Stabilitas 60 nM GNP kompleks antibodi dengan konsentrasi NaCl berbeda (0,012 hingga 1000 mM). c Spektrum untuk kompleks yang berbeda. Puncak ditunjukkan dengan bola berwarna masing-masing

Deteksi ESAT-6 Menggunakan Antibodi Prakompleks dengan Pergeseran Spektral Merah Kolorimetri dan Validasi Biofouling ESAT-6

Karena antibodi dari 60 nM menunjukkan stabilitas yang sangat baik, pada awalnya, kami mencoba mendeteksi kompleks ESAT-6 dengan 60 nM antibodi anti-ESAT-6. ESAT-6 adalah protein dengan berat molekul lebih kecil dengan ukuran 6 kDa dan dipilih dengan baik untuk pengujian berbasis kolorimetri. Sebelum melakukan percobaan deteksi, kami memeriksa biofouling ESAT-6 pada permukaan GNP; karena ada kemungkinan pengikatan ESAT-6 dengan GNP, hal itu dapat menyebabkan positif palsu atau negatif palsu. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 4, pada ESAT-6 dengan konsentrasi hingga 100 nM, GNP tidak stabil pada 800 mM NaCl, menunjukkan bahwa ESAT-6 tidak mengikat secara elektrostatis ke permukaan GNP. Non-fouling ini juga mengisyaratkan bahwa komposisi asam amino ESAT-6 memainkan peran penting dalam pengujian ini. Setelah konfirmasi ini, kami mendeteksi ESAT-6 yang telah dikomplekskan sebelumnya dengan 60 nM antibodi anti-ESAT-6. Konsentrasi ESAT-6 yang berbeda dikomplekskan dengan konsentrasi antibodi yang konstan (60 nM) dan kemudian ditambahkan ke GNP. Terakhir, 800 mM NaCl ditambahkan untuk mengevaluasi agregasi dengan pergeseran spektral merah. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5a (inset), deteksi ESAT-6 dari 0,5 nM hingga 500 nM telah mengkonfirmasi perubahan warna yang jelas dengan transisi dibandingkan dengan kontrol (dengan hanya antibodi 60 nM). Warna larutan telah berubah dari merah menjadi biru bahkan pada 0,5 nM dan lebih intensif pada 15 nM, dan mungkin karena saturasi penuh dengan ESAT-6. Tampaknya tidak ada antibodi yang tersisa untuk berikatan dengan GNP bahkan pada 0,5 nM. Mengacu pada representasi grafis dari Gambar. 5a, 15 hingga 500 nM ESAT-6 menunjukkan saturasi lengkap. Jelas dibuktikan dari Gambar 5b bahwa spektrum eksperimen kontrol (tanpa protein ESAT-6) menunjukkan profil yang bagus pada ~ 500 nm, sedangkan dengan ESAT-6 dengan 0,5 dan 500 nM, spektrumnya bergeser merah. Dari hasil ini, disimpulkan bahwa kami dapat mendeteksi protein ESAT-6 dari 0,5 nM dan masih turun ke konsentrasi yang lebih rendah karena munculnya warna biru yang jelas.

Uji pengotoran ESAT-6 pada permukaan GNP. Konsentrasi ESAT-6 yang berbeda dicampur dengan GNP, dan setelah 30 menit, 800 mM NaCl ditambahkan. Representasi diagram juga ditampilkan. Munculnya warna biru menunjukkan agregasi

Deteksi ESAT-6 pada konsentrasi yang lebih tinggi. a Representasi grafis untuk deteksi ESAT-6. Konsentrasi ESAT-6 yang berbeda dicampur dengan 60 nM antibodi, dan setelah 30 menit inkubasi, GNP ditambahkan. Kemudian 800 mM NaCl ditambahkan untuk menginduksi perubahan warna. ESAT-6 dari 0,5 nM terdeteksi dengan perubahan warna yang jelas (merah menjadi biru). Pemotretan dilakukan dengan kamera digital seperti pada gambar inset. b Perubahan spektral pada panjang gelombang dari 400 menjadi 800 nm. Puncak ditunjukkan dengan bola berwarna masing-masing

Batas Deteksi ESAT-6 oleh Pergeseran Spektral Merah Kolorimetri

Karena 60 nM antibodi anti-ESAT-6 menunjukkan peningkatan yang nyata untuk deteksi ESAT-6, untuk mengetahui batas deteksi, kami menyempurnakan ESAT-6 hingga ke picomolar terendah (1,25 pM hingga 5000 pM ). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6a, dari 1,25 pM ESAT-6, ada inisiasi warna biru karena pembentukan kompleks antara ESAT-6 dan antibodi. Dari 2,5 pM, warna larutan yang berubah menjadi biru semakin intensif dan mempertahankan perubahan warna dengan konsentrasi lebih lanjut. Dalam percobaan kontrol (tanpa ESAT-6) warna larutan tampak merah, mendukung spesifisitas percobaan saat ini (Gbr. 6a). Hasil ini juga dikonfirmasi oleh spektrum seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6b. Dengan larutan kontrol, tidak ada perubahan spektrum, tetapi dari 1,25 hingga 5 nM protein ESAT-6, spektrum bergeser merah menuju 600 nm. Pada 5 nM ESAT-6, ada pergeseran spektral lengkap yang diamati dengan puncak maksimum. Berdasarkan hasil eksperimen tersebut, kita dapat menyimpulkan bahwa batas deteksi ESAT-6 berada di sekitar picomolar terendah (1,25 pM) menggunakan antibodi prakompleks ESAT-6.

Batas deteksi ESAT-6 dengan uji kolorimetri berbasis antibodi. a Representasi grafis untuk deteksi ESAT-6. Konsentrasi ESAT-6 yang berbeda dicampur dengan 60 nM antibodi, dan setelah 30 menit inkubasi, GNP ditambahkan. Kemudian ditambahkan 800 mM NaCl untuk menginduksi perubahan warna. Protein ESAT-6 dititrasi dari 1,25 pM menjadi 5000 pM. Pemotretan dilakukan dengan kamera digital seperti pada gambar inset. b Perubahan spektral pada panjang gelombang dari 400 menjadi 800 nm. Puncak ditunjukkan dengan bola berwarna masing-masing

Menyesuaikan dengan Spesifisitas

Karena kami dapat mendeteksi ESAT-6 dengan 60 nM antibodi anti-ESAT-6, selanjutnya, kami mencoba deteksi yang sama dengan sedikit konsentrasi antibodi anti-ESAT-6 menjadi 75 nM. Hasil yang diperoleh ada pada Gambar 7a. Telah ditemukan bahwa sedikit perubahan warna terjadi menggunakan antibodi pra-kompleks 75 nM pada 850 pM ESAT-6. Kami meningkatkan konsentrasi ESAT-6 menjadi 100 nM, dan kami dapat mengamati perkembangan perubahan warna menjadi biru. Dengan eksperimen ini, batas deteksi tercatat berada dalam kisaran nanomolar menggunakan antibodi prakompleks 75 nM. Akhirnya, untuk mengkonfirmasi spesifisitas pengikatan ESAT-6, kami juga menguji uji serupa menggunakan pra-kompleks protein anti-ESAT-6 dan CFP-10 dari M. TBC . Hasilnya terlihat jelas bahwa hanya ESAT-6 yang memiliki spesifisitas dan CFP-10 dapat menjadi kontrol yang sesuai (Gbr. 7b). Secara keseluruhan, dari hasil di atas, disadari bahwa optimalisasi konsentrasi antibodi adalah wajib untuk meningkatkan sensitivitas uji kolorimetri.

Deteksi ESAT-6 dengan antibodi anti-ESAT-6 75 nM. a Representasi untuk perubahan warna. Konsentrasi ESAT-6 yang berbeda dicampur dengan 75 nM antibodi, dan setelah 30 menit inkubasi, GNP ditambahkan. Kemudian ditambahkan 800 mM NaCl untuk menginduksi perubahan warna. ESAT-6 dari 0,85 nM terdeteksi dengan perubahan warna yang jelas (merah menjadi biru). Pemotretan dilakukan dengan kamera digital. b Perubahan spektral pada panjang gelombang dari 400 menjadi 800 nm. Puncak ditunjukkan dengan bola berwarna masing-masing. Uji spesifisitas dilakukan menggunakan CFP-10 dan terbukti sebagai kontrol negatif

Kesimpulan

Tuberkulosis (TB) adalah penyakit yang mengancam jiwa utama bagi manusia, dan identifikasi TB pada tahap awal ditunjukkan untuk mencegah penyebaran dan mengobati penyakit. Dalam penelitian ini, kami memilih target antigenik sekretori awal (ESAT-6), salah satu protein utama dalam TB. Kami memperkenalkan uji pergeseran spektral merah kolorimetri langkah tunggal berbasis antibodi menggunakan nanopartikel emas, dan ditemukan batas deteksi 1,25 pM. Spesifisitas uji ini dijelaskan dengan menggunakan protein kontrol (CFP-10), dan tidak menunjukkan perubahan warna setelah menambahkan GNP. Di sisi lain, ESAT-6 saja tidak terikat pada GNP. Dengan bukti ini, keberadaan antibodi ESAT-6 dan anti-ESAT-6 pra-kompleks ditunjukkan dengan keandalan uji pergeseran spektral merah kolorimetri. Strategi ini sederhana dan cepat untuk mendeteksi jenis analit yang serupa sebagai satu langkah. Selanjutnya, pengujian ini dapat diperluas dengan molekul kecil yang dikomplekskan dengan antibodi yang sesuai agar sesuai untuk deteksi titik perawatan. Metodologi ini pasti akan bekerja dengan protein dan peptida berukuran lebih kecil. Dengan protein berukuran lebih besar, tergantung pada muatan asam amino, mungkin ada variasi.

Singkatan

CFP-10:

10 kDa protein filtrat kultur

DNA:

Asam nukleat deoksiribosa

ESAT-6:

6 kDa target antigenik sekretori awal

GNP:

Nanopartikel emas

NaCl:

Natrium klorida

O.D:

Satu kepadatan optik

RNA:

Asam nukleat ribosa

TB:

Tuberkulosis

UV:

Ultraviolet

Sebuah Struktur Mikro Cluster Nanocone Baru dengan Sifat Anti-refleksi dan Superhidrofobik untuk Perangkat Fotovoltaik Curcumin-loaded chitosan–bovine serum albumin nanopartikel berpotensi meningkatkan fagositosis Aβ 42 dan polarisasi makrofag termodulasi pada penyakit Alzheimer