SPIO Meningkatkan Presentasi Silang dan Migrasi DC dan SPIO Anionik Mempengaruhi Efek Nanoadjuvant Terkait dengan Interleukin-1β
Abstrak
Nanopartikel oksida besi superparamagnetik (SPIO) telah disintesis dan dieksplorasi untuk digunakan sebagai pembawa berbagai nanoadjuvant melalui pemuatan ke dalam sel dendritik (DC). Dalam penelitian kami, nanopartikel homogen dan superparamagnetik rentan terhadap internalisasi oleh DC dan DC yang berdenyut SPIO menunjukkan biokompatibilitas dan kapasitas yang sangat baik untuk presentasi silang ovalbumin (OVA). Di sini, kami menemukan bahwa DC yang dimuat SPIO dapat mendorong pematangan dan migrasi DC secara in vitro. SPIO dilapisi dengan 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTS) dan asam meso-2,3-dimercaptosuccinic (DMSA), yang masing-masing menghadirkan muatan positif dan negatif. Kami bertujuan untuk menyelidiki apakah muatan permukaan SPIO dapat memengaruhi presentasi silang antigen DC. Selain itu, pembentukan interleukin-1β (IL-1β) diperiksa setelah perawatan dengan SPIO bermuatan berlawanan untuk mengidentifikasi mekanisme nanoadjuvant. Kesimpulannya, hasil kami menunjukkan bahwa SPIO biokompatibel dan dapat menginduksi migrasi DC ke kelenjar getah bening sekunder. SPIO dilapisi dengan APTS (SPIO/A
+
) menunjukkan potensi ajuvan yang sangat baik untuk mempromosikan presentasi silang antigen dan aktivasi sel T dan melampaui nanopartikel berlapis DMSA (SPIO/D
−
). Proses ini mungkin terkait dengan sekresi IL-1β. Studi kami memberikan wawasan tentang modifikasi prediktif nanoadjuvant, yang akan berharga dalam desain vaksin DC dan dapat mengarah pada penciptaan adjuvant baru untuk aplikasi dalam vaksin bagi manusia.
Latar Belakang
Ajuvan telah diterapkan secara luas untuk penggunaan klinis dan eksperimental, dan mereka telah lama dianggap sebagai agen stimulasi imun, depot pasif, atau kendaraan yang mampu meningkatkan respons imun yang diperlukan [1, 2]. Dalam beberapa dekade terakhir, banyak kelas beragam senyawa telah digunakan sebagai adjuvant, termasuk nanopartikel, produk mikroba, emulsi, sitokin, polimer, dan liposom [3,4,5]. Evolusi nanopartikel sebagai adjuvant imun (nanoadjuvants) mewakili area pengiriman antigen yang luar biasa berdasarkan pembesaran respons imun. Di antara semua jenis nanopartikel, superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIO) memiliki biokompatibilitas yang baik, arsitektur permukaan yang tepat, dan konjugasi ligan yang fleksibel [6]. Sifat-sifat ini membuatnya dapat diterapkan di banyak bidang biomedis yang berbeda, seperti pencitraan resonansi magnetik (MRI), pengiriman obat yang ditargetkan, dan terapi hipertermia [7, 8].
Sel dendritik (DC), sel penyaji antigen profesional utama (APC), memainkan peran penting dalam imunitas adaptif yang dimediasi sel di mana memori imunologis dihasilkan setelah respons primer terhadap antigen spesifik, dan memori ini mengarah pada respons yang ditingkatkan. untuk pertemuan berikutnya dengan antigen itu [9, 10]. Selain itu, DC dapat mempromosikan presentasi antigen eksogen oleh kompleks histokompatibilitas utama kelas I (MHC-I), sebuah proses yang disebut presentasi silang, dan kemudian mengaktifkan limfosit T sitotoksik (CTLs) [11]. Antigen terlarut yang ditujukan untuk presentasi silang diinternalisasi oleh endositosis yang dimediasi reseptor dan kemudian ditransfer ke sitoplasma untuk degradasi proteasomal dan pemuatan peptida. Vaksin DC konvensional menyebabkan respon imun moderat karena transportasi antigen terlarut yang relatif tidak memuaskan. Oleh karena itu, nanoadjuvant telah dieksplorasi sebagai pembawa antigen terlarut untuk meningkatkan presentasi silang di DC dalam banyak studi penelitian [12,13,14].
Bahan pelapis memainkan peran penting dalam stabilisasi dan fungsionalisasi selanjutnya dari suspensi SPIO berair [15]. Dalam penelitian sebelumnya, SPIO bermuatan positif ditunjukkan untuk memfasilitasi kemampuan presentasi silang DC untuk meningkatkan respon imun, dan mereka melampaui efek rekan mereka yang bermuatan berlawanan [16, 17]. Mekanisme di mana SPIO bermuatan berbeda dapat mempengaruhi presentasi silang antigen DC belum diklarifikasi. Interleukin-1β (IL-1β), sebuah prototypic proinflamasi sitokin yang berpartisipasi dalam imunitas bawaan, dapat disekresikan oleh sel imun, seperti DC, ketika merasakan pola molekul terkait patogen (PAMPs) dan pola molekul terkait kerusakan (DAMPs) [ 18]. Produksi IL-1β secara ketat dimediasi oleh inflammasome, terutama NLRP3 (NACHT, LRR, dan domain PYD yang mengandung protein 3). Aktivasi NLRP3 menginduksi produksi caspase-1, yang kemudian memecah pro-IL-1β yang tidak aktif menjadi bentuk aktif IL-1β [19]. Nanopartikel anorganik tertentu, seperti silika, karbon nanotube berdinding ganda, dan titanium dioksida, dapat menginduksi pembentukan inflammasome [20,21,22]. Studi sebelumnya telah melaporkan korelasi antara muatan permukaan nanopartikel magnetit dan efisiensi selulernya [23]. Di sini, kami berspekulasi bahwa muatan permukaan yang berbeda pada DC yang dimuat SPIO juga dapat mempengaruhi sekresi IL-1β, dan tujuan kami adalah untuk menyelidiki hubungan antara muatan permukaan ini dan fungsi presentasi silang DC.
Metode dan Bahan
Persiapan SPIO
Untuk mempersiapkan SPIO, metode kopresipitasi yang mudah digunakan seperti yang dilaporkan sebelumnya [24]. Singkatnya, larutan campuran FeCl3 dan FeSO4 (rasio molar Fe
3+
:Fe
2+
=2:1) disiapkan di bawah atmosfer nitrogen dan diaduk dengan energik pada 37 °C selama 30 menit. Endapan Fe3 . berwarna hitam O4 nanopartikel terbentuk dan segera dicuci lima kali dengan air suling menggunakan pemisahan magnetik. Fe3 O4 kemudian didispersikan dalam air suling hingga konsentrasi 3 mg/mL pada pH 3. Akhirnya, suspensi diangin-anginkan (dengan udara) pada suhu 95 °C dan SPIO berwarna coklat dipisahkan.
SPIO dilapisi dengan DMSA (SPIO/D
−
) dan SPIO dilapisi dengan APTS (SPIO/A
+
) dibuat dengan melapisi SPIO dengan asam meso-2,3-dimercaptosuccinic (DMSA) dan 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTS), masing-masing. Untuk SPIO/D
−
, larutan DMSA dalam air dengan rasio molar 1:40 ditambahkan ke 100 mL larutan SPIO. Setelah reaksi 4 jam dengan pengadukan terus menerus, SPIO/D
−
dipisahkan pada kecepatan 500 rpm pada 50 °C. Untuk SPIO/A
+
, APTS ditambahkan ke larutan SPIO pada rasio molar 0,2:1 dengan pengadukan kuat selama 5 jam. Kemudian, endapan dilarutkan dengan magnet permanen dan dicuci dengan air deionisasi, dan larutan diperlakukan menggunakan gelombang ultrasonik. Solusi yang dihasilkan dicuci berulang kali dengan air, dan SPIO/A
+
akhirnya dikeringkan menjadi bubuk pada suhu 37 °C di bawah vakum.
Tikus
Tikus C57BL/6 dan protein fluoresen hijau yang ditingkatkan (EGFP)-transgenik C57BL/6 tikus dibeli dari Model Animal Research Center Universitas Nanjing dan ditempatkan dalam kondisi spesifik bebas patogen (SPF) di Laboratorium Pusat, Universitas Nanjing. Semua percobaan hewan dilakukan sesuai dengan protokol yang disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan dari Sekolah Kedokteran, Universitas Nanjing, Cina.
Budaya Sel
DC murine dihasilkan dari sumsum tulang tikus seperti yang dijelaskan sebelumnya [25]. Singkatnya, monosit sumsum tulang tikus C57BL/6 berusia 8 minggu dipisahkan dari tulang paha dan tibianya. Selanjutnya, sel-sel dikultur dalam RPMI-1640 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) bersama dengan 10% serum janin sapi (FBS), 10 ng/mL faktor perangsang koloni granulosit-makrofag murine (GM-CSF; Gibco, USA), dan 1 ng/mL murine interleukin-4 (IL-4, PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA). Media kultur diganti dengan media segar setiap 2 hari. DC yang belum matang umumnya dikumpulkan pada hari ke-6. EGFP-DC berasal dari tikus C57BL/6 transgenik EGFP sesuai dengan metode yang disebutkan di atas.
Sel mononuklear darah perifer manusia (PBMC) beku yang dicairkan diistirahatkan semalaman dalam media lengkap, yaitu, X-VIVOTM 15 (Lonza Group Ltd., Basel, Swiss) =1:1. Setelah sentrifugasi gradien densitas, PBMC disuspensikan dalam medium selama 4 jam. DC manusia dari sel yang melekat dikultur pada suhu 37 °C dalam media yang mengandung GM-CSF manusia (100 ng/mL; Sistem R&D, Minneapolis, MN, USA) dan IL-4 manusia (10 ng/mL; PeproTech, Rocky Hill, NJ, AS). Setengah dari media diubah pada hari 2 dan 4. DC manusia yang belum matang dipanen pada hari ke 5. Cytomegalovirus virus Epstein-Barr dan sel T spesifik virus influenza (CEF) berasal dari sel tersuspensi, yang dikultur dalam media CMX yang mengandung MHC -Saya membatasi peptida CEF (20 ng/mL, Panatecs, Heilbronn, Jerman, PA-CEF-002) selama kurang lebih 48 jam. Sel T spesifik CEF diperluas dengan 1000 U/mL IL-2 manusia (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA, 200–02) dalam media CMX selama 12 hari. Untuk IL-2, media diganti dengan media baru setiap 3 hari.
Karakterisasi
Morfologi dan ukuran SPIO ditentukan menggunakan mikroskop elektron transmisi (TEM, Advanced Microscopy Techniques, Danvers, MA). Pola difraksi sinar-X (XRD) digunakan untuk mengidentifikasi spektrum katalis. Uji potensi zeta juga diukur untuk menentukan muatan permukaan nanopartikel yang dilapisi dengan polimer yang berbeda. SPIO/A
+
dan SPIO/D
−
nanopartikel disiapkan dengan nilai pH berkisar antara 3 hingga 8. Pengukuran potensial zeta dilakukan dengan penganalisis potensi zetasizer Nano ZS90 (Malvern, UK). Sifat magnetik nanopartikel dianalisis pada suhu 37 °C menggunakan magnetometer sampel bergetar (Lakeshore 7407).
Pengujian CPRG
B3 Garis sel T Z (CD8
+
Hibridoma sel T) dapat mengekspresikan gen LacZ ketika reseptor sel T-nya melibatkan epitop ovalbumin (OVA) 258-265 dengan adanya molekul H-2Kb MHC-I. DC (2 × 10
4
) dan OVA (100 μg/mL, Sigma-Aldrich) dikultur dengan SPIO, SPIO/A
+
, atau SPIO/D
−
pada 37 °C. Enam jam kemudian, DC dikultur bersama dengan B3 Z (2 × 10
5
) semalaman. Uji klorofenol red-β-galaktosidase (CPRG, Sigma-Aldrich, USA) dilakukan untuk menentukan produksi -galaktosidase dari B3 sel Z. Dalam pengujian ini, optical density (OD) pada 595 nm menunjukkan kemampuan antigen cross-presentation dari DC.
Uji Apoptosis Sel
Penyortiran sel yang diaktifkan fluoresensi (FCS) digunakan untuk mengeksplorasi efek dari konsentrasi SPIO yang berbeda pada kelangsungan hidup DC. Singkatnya, DC yang belum matang diinkubasi dengan SPIO yang ditandai dengan Annexin V dan PI (Biouniquer, CHN), dan ekspresi Annexin V dan PI di DC diperiksa melalui FCS.
Pencitraan Intensitas Fluoresensi Di Vivo
Untuk mengeksplorasi migrasi DC in vivo, TNF-α (60 ng/mouse) telah disuntikkan ke footpads dari kedua kaki belakang (n = 8). Setelah 24 jam, EGFP-DC berlabel SPIO (2 × 10
6
) dalam 40 L phosphate-buffered saline (PBS) disuntikkan ke alas kaki kiri tikus C57BL/6, dan EGFP-DC yang tidak berlabel dalam jumlah yang sama disuntikkan ke sisi kanan. Untuk memeriksa tingkat EGFP-DC yang bermigrasi ke kelenjar getah bening, sistem pencitraan Maestro (CRi, Woburn, MA, USA) digunakan. Kelenjar getah bening yang dibedah diamati menggunakan filter eksitasi 484 nm dan filter emisi 507 nm. Gambar fluoresen yang menampilkan fluoresensi hijau kemudian dianalisis dengan perangkat lunak Gambar Hidup (v 2.50; Caliper Corporation, Newton, MA, USA). Analisis mikroskop confocal digunakan untuk menentukan imunohistokimia. Kelenjar getah bening yang dibekukan dipotong menjadi bagian setebal 5 m dan kemudian difiksasi, dan bagian tersebut diinkubasi dengan antibodi protein fluoresen hijau (GFP) (Invitrogen), dengan antibodi kambing Alexa Fluor 488 nm (Invitrogen) yang digunakan sebagai antibodi sekunder. Mikroskop pemindaian laser confocal (Fluoview, Fv10i; Olympus) digunakan untuk mengamati sampel.
Human DC Antigen Cross-Presentation Assay In Vitro
DC manusia yang berbudaya (2 × 10
4
) diunggulkan ke dalam piringan dasar bulat dengan 96 lubang tempat SPIO/A
+
dan SPIO/D
−
nanopartikel (100 μg/mL) dikombinasikan dengan protein pp65 cytomegalovirus (CMV) (1 μg/mL, MACS) ditambahkan, dan protein CMV pp65 dan peptida CEF (1 μg/mL, Think peptides) digunakan secara terpisah sebagai kontrol. Setelah 6 jam, sel T spesifik CEF (2 × 10
5
) ditambahkan ke DC manusia selama 12 jam. Brefeldin A (10 μg/ml, Sigma-Aldrich, USA) disimpan dalam media selama 6 jam. Setelah stimulasi dan aktivasi, sel T spesifik CEF dikumpulkan dan diwarnai dengan antibodi manusia terhadap CD3, CD4, CD8, dan IFN-γ (Invitrogen, USA). Setelah pewarnaan, sampel dianalisis dengan flow cytometer LSR II yang dibuat khusus (BD, Franklin Lakes, NJ, USA). Data yang terkumpul dianalisis dengan perangkat lunak FlowJo (Tree Star, Ashland, OR, USA).
Uji Imunosorben Terkait-Enzim
Kit SET-Go Ready IL-1β enzim-linked assay (ELISA) tikus (eBioscience, USA) dan kit IL-1β ELISA manusia (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) digunakan untuk menentukan sekresi IL -1β oleh DC. Pelat ELISA (Costar, USA) dilapisi dengan 100 μL/sumur IFN-γ digunakan untuk menangkap antibodi semalaman pada suhu 4 °C dan diblokir dengan buffer ELISA. Sampel dan standar kemudian ditambahkan ke dalam sumur dan diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37°C. IFN-γ terbiotinilasi terdeteksi. Sampel diukur menggunakan pembaca pelat mikro dengan setelan OD 450 nm (BioTek, AS).
Analisis Statistik
Data dianalisis menggunakan Paket Statistik untuk Ilmu Sosial (SPSS 13.0, Chicago, IL, USA). Hasilnya disajikan sebagai mean ± SD, dan perbedaan antara kelompok kontrol dan kelompok uji dinilai dengan analisis varians satu arah, t tes, dan analisis varians faktor ganda. Perbedaan di *P < 0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Hasil
Karakterisasi SPIO
Morfologi dan ukuran SPIO yang disintesis diamati melalui TEM. Gambar TEM menunjukkan bahwa SPIO memiliki ukuran rata-rata 8,7 nm dan bentuk bola (Gbr. 1a). Analisis XRD menunjukkan enam puncak yang sangat cocok dengan standar -Fe2 O3 refleksi (Gbr. 1b). Hasil vibrasi magnetometer menunjukkan bahwa SPIO yang diperoleh memiliki sifat superparamagnetik, dengan magnetisasi saturasi 60,4 emu/g lebih baik dari Fe3 O4 (Gbr. 1c). Plot DLS menunjukkan bahwa distribusi ukuran SPIO adalah 22 nm dalam larutan (Gbr. 1d). Untuk mengkonfirmasi bahwa DC mengandung SPIO, pewarnaan biru Prusia dilakukan untuk memverifikasi bahwa DC mengandung besi (Gbr. 1e).
Karakterisasi SPIO. a Gambar TEM dari SPIO yang diperoleh. b Pola XRD katalis nanopartikel menunjukkan bahwa material tersebut adalah -Fe2 O3 . c Kurva magnetisasi SPIO dan Fe yang diperoleh3 O4 nanopartikel. d Diameter hidrodinamik SPIO. e Morfologi DC berlabel 50 μg/mL SPIO setelah 12 jam inkubasi:DC tidak berlabel dan DC berlabel biru Prusia
SPIO Diaktifkan Cross-Presentation DC
Untuk mempelajari lebih lanjut efek DC berlabel SPIO pada aktivasi sel T dalam sistem murine, tingkat B3 Aktivasi sel T Z ditentukan dengan memeriksa produksi -galaktosidase dengan uji CPRG. Konsentrasi tetap 100 g/mL OVA dan lima rasio dosis SPIO (1, 5, 10, 25, dan 50 g/mL setelah 6 jam) diadopsi dalam penelitian ini. Saat konsentrasi SPIO meningkat, tingkat aktivasi B3 Sel Z meningkat secara bertahap dan mencapai stabilitas pada 25 μg/mL (Gbr. 2a). Untuk menyelidiki apakah viabilitas DC yang diberi label dengan berbagai konsentrasi SPIO dipengaruhi, DC dan DC berlabel SPIO dianalisis melalui FCS setelah pewarnaan Annexin V dan PI. Hasilnya menunjukkan bahwa persentase total Annexin V/PI DC pada konsentrasi SPIO 10, 25, dan 50 g/mL tidak berbeda secara signifikan, sedangkan persentase sel apoptosis meningkat setelah dimuat dengan 100 g/mL SPIO (Gbr. 2b ). Molekul kostimulatori permukaan DC yang diberi label dengan berbagai konsentrasi SPIO diamati oleh FCS. Ekspresi CD80 dan CD86 memiliki peningkatan yang dapat dideteksi pada 25 μg/mL dibandingkan dengan yang tanpa pelabelan SPIO (Gbr. 2c). DC berlabel 25 μg/mL SPIO tidak menunjukkan perubahan apoptosis sel pada titik waktu yang berbeda (Gbr. 2d). Kami menggunakan 25 μg/mL dalam eksperimen berikut.
Pengaruh presentasi silang DC dan biokompatibilitas setelah pelabelan dengan SPIO. a Presentasi silang DC ditingkatkan pada konsentrasi SPIO yang berbeda. b DC apoptosis dan DC berlabel SPIO diperiksa oleh FCS pada konsentrasi yang berbeda (10, 25, 50, dan 100 μg/mL). c Fenotipe DC, termasuk CD11c
+
CD80
+
dan CD11c
+
CD86
+
setelah diberi label dengan SPIO (10, 25, 50 μg/mL). DC yang distimulasi dengan LPS (1 μg/mL) digunakan sebagai kontrol positif. d DC apoptosis yang dimuat dengan 25 μg/mL SPIO yang diperiksa oleh FCS pada titik waktu yang berbeda (6, 12, 18, dan 24 jam)
Pelabelan EGFP-DC dengan Sinyal EGFP yang Ditingkatkan SPIO di Kelenjar Getah Bening Sekunder
EGFP-DC berhasil diturunkan dari tikus transgenik EGFP in vitro, dan gambar mikroskop fluoresensi confocal menunjukkan bahwa hampir semua EGFP-DC menunjukkan fluoresensi hijau (Gbr. 3a). Untuk menyelidiki apakah fluoresensi hijau EGFP-DC dapat dipengaruhi oleh SPIO, FCS dilakukan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekspresi fluoresensi EGFP tidak melemah setelah pelabelan SPIO (Gbr. 3b, c). Kemudian, EGFP-DC berlabel SPIO 25 μg/mL disuntikkan ke alas kaki belakang sisi kanan tikus C57BL/6 dan EGFP-DC yang tidak berlabel disuntikkan ke sisi yang berlawanan. Sinyal EGFP diukur di kelenjar getah bening poplitea (PLN) dan kelenjar getah bening inguinal (ILN), yang masing-masing merupakan kelenjar getah bening sentinel dan kelenjar getah bening sekunder. Hasil penelitian menunjukkan bahwa migrasi EGFP-DC berlabel SPIO dan EGFP-DC tidak berlabel di kelenjar getah bening sentinel mencapai puncaknya pada hari ke-7. Perbedaan sinyal EGFP yang signifikan tidak diamati antara kedua kelompok, sedangkan penurunan yang signifikan terdeteksi. pada kelompok PLN pada hari ke-14. Sinyal EGFP yang terdeteksi pada kelompok ILN konsisten dengan sinyal EGFP-DC berlabel SPIO pada hari ke-4 dan hari ke-7, yang menunjukkan bahwa DC berlabel SPIO bermigrasi ke kelenjar getah bening sekunder node (Gbr. 3d–f).
Migrasi dan lokasi EGFP-DC setelah pelabelan dengan SPIO. a Mikroskop confocal pemindaian laser EGFP-DC berlabel 25 μg/mL SPIO nanopartikel setelah 12 jam inkubasi. b , c Intensitas fluoresensi EGFP-DC berlabel SPIO setelah 12 jam. Pencitraan optik in vitro kelenjar getah bening drainase setelah transfusi kembali EGFP-DC berlabel SPIO pada hari yang berbeda. TNF-α pertama kali disuntikkan ke alas kaki mouse terlebih dahulu untuk mempromosikan migrasi EGFP-DC. d –e Pencitraan optik in vitro dan analisis intensitas sinyal kelenjar getah bening pada hari yang berbeda setelah injeksi EGFP-DC dengan atau tanpa SPIO. f Sel-sel positif EGFP dari kelenjar getah bening yang mengering dideteksi dengan mikroskop laser confocal
SpIO Murine DC yang Dibebankan Dibebankan Berbeda dengan Presentasi Silang DC Murine
SPIO dilapisi dengan APTS atau DMSA. Untuk memverifikasi muatan permukaan SPIO, kami mengukur karakteristik potensial zeta. Potensi zeta SPIO/A
+
dan SPIO positif, sedangkan potensi zeta SPIO/D
−
menunjukkan muatan negatif dalam larutan ketika nilai pH adalah 7 (Gbr. 4a). Ultrastruktur DC berlabel SPIO yang dilapisi dengan polimer bermuatan berbeda diamati melalui TEM. DC yang diobati dengan SPIO tampak padat elektron dibandingkan dengan sel yang tidak diobati, dan banyak SPIO dikelompokkan bersama dalam sitoplasma. SPIO/A
+
ditelan oleh endosom di sitoplasma, sedangkan jumlah SPIO/D yang lebih tinggi
−
ditemukan di sitoplasma DC, dan hampir semua nanopartikel ini dikelilingi oleh beberapa struktur membran berlapis yang menyerupai lisosom (Gbr. 4b). Kami memeriksa apakah SPIO yang bermuatan berlawanan dapat memicu tingkat IL-1β yang berbeda. Menurut hasil kami, DC dimuat dengan SPIO/A
+
dan SPIO/D
−
menginduksi sekresi IL-1β yang bergantung pada dosis. Terlepas dari konsentrasinya, kami menemukan bahwa SPIO/D
−
menginduksi tingkat IL-1β yang jauh lebih tinggi daripada SPIO/A
+
(Gbr. 4c). Karena korelasi yang jelas antara IL-1β dan jalur TLR3, untuk mempelajari lebih lanjut efek IL-1β pada aktivasi sel T, DC diturunkan dari tikus knockout TLR3 dan dikultur bersama dengan SPIO/A
+
, SPIO/D
−
, dan OVA. DC dimuat dengan SPIO/A
+
+ OVA dapat secara efektif mengaktifkan B3 Sel T Z, yang berarti bahwa molekul TLR3 di DC pasti diperlukan untuk presentasi silang (Gbr. 4d).
SPIO yang dilapisi dengan muatan berbeda mempengaruhi presentasi silang DC dan sekresi IL-1β. a Potensi zeta bergantung pH dari SPIO yang dilapisi dengan molekul bermuatan berbeda. b Lokasi nanopartikel dengan muatan berbeda di DC di bawah TEM. c IL-1β yang diinduksi oleh SPIO dilapisi dengan molekul bermuatan berbeda. d Presentasi silang SPIO/A
+
+OVA dan SPIO/D
−
+ OVA oleh DC melalui jalur TLR3
SPIO Dimodifikasi dengan Pelapis Bermuatan Berlawanan Mempromosikan Presentasi Silang Antigen oleh DC Manusia dan Dipengaruhi oleh IL-1β
Untuk mengeksplorasi hubungan antara IL-1β dan presentasi silang, kami memilih inhibitor caspase-1 YVAD dan menemukan bahwa itu dapat secara signifikan menghambat sekresi IL-1β dari DC manusia setelah pra-perawatan dengan 50 M lipopolisakarida (LPS) selama 3 jam (Gbr. . 5a). Selain itu, kami menemukan bahwa YVAD dapat menghambat sekresi IL-1β dari DC manusia yang disebabkan oleh SPIO/A
+
dan SPIO/D
−
(Gbr. 5b). Kami kemudian menyelidiki apakah DC manusia dapat digunakan sebagai APC yang efektif dan cross-present CMV pp65 ke sel T spesifik CEF. Untuk mengukur presentasi silang antigen, pewarnaan intraseluler (ICS) diperkenalkan untuk menentukan persentase CD3 spesifik antigen
+
CD8
+
IFN-γ
+
dan CD3
+
CD4
+
IFN-γ
+
sel T oleh FCS. DC dimuat dengan SPIO/A
+
dikombinasikan dengan protein CMV pp65 menginduksi lebih banyak CD3
+
CD8
+
IFN-γ
+
dan CD3
+
CD4
+
IFN-γ
+
Sel T daripada DC yang dimuat dengan SPIO/D
−
. Data kami menunjukkan bahwa caspase-1 inhibitor YVAD secara signifikan meningkatkan respons sel T yang diinduksi oleh SPIO/D
−
+ protein CMV pp65, sedangkan sebagian menghambat respons sel T yang diinduksi oleh SPIO/A
+
+ protein CMV pp65 (Gbr. 5c, d). Hasil ini menunjukkan bahwa aktivasi IL-1β tingkat sedang diperlukan untuk presentasi silang yang efisien dan bahwa aktivasi IL-1β tingkat tinggi menekan presentasi silang di DC.
SPIO yang dilapisi dengan muatan berlawanan mempengaruhi fungsi DC manusia melalui jalur IL-1β. a Setelah pra-perawatan oleh LPS selama 3 jam, DC manusia diinkubasi dengan peningkatan konsentrasi YVAD (1, 10, 25, dan 50 M), dan kemudian supernatan dikumpulkan untuk ELISA IL-1β. b YVAD dapat menghambat sekresi IL-1β dari DC manusia melalui SPIO/D
−
. SPIO/A
+
, dan SPIO/D
−
mempengaruhi presentasi silang DC yang dipengaruhi oleh IL-1β. c CD3
+
CD8
+
IFN-γ
+
dan d CD3
+
CD4
+
IFN-γ
+
Sel T dianalisis dengan pewarnaan intraseluler menggunakan FCS
Diskusi
Imunoterapi telah menjadi fokus penelitian dalam studi klinis dan eksperimental sejak perkembangan bioteknologi. Namun, uji klinis sebelumnya dari vaksin DC tradisional yang dirancang untuk memperoleh kekebalan belum menginduksi respon imun yang cukup [26]. Nanopartikel mewakili jenis adjuvant, dan dapat mempromosikan fungsi DC untuk mengaktifkan sel T [27]. Fitur paling khas dari SPIO kami termasuk biokompatibilitasnya dan penerapan pelabelan DC sebagai adjuvant imun. Gambar TEM menunjukkan bahwa SPIO kami memiliki ukuran rata-rata 8,7 nm dalam keadaan kering dan berbentuk bulat (Gbr. 1a). Pewarnaan biru Prusia menunjukkan bahwa SPIO rentan untuk difagosit oleh DC (Gbr. 1e), sehingga menunjukkan efisiensi konsumsi.
SPIO telah dilaporkan memiliki aplikasi biomedis yang luas, seperti dalam pelabelan seluler, pengiriman obat, MRI, dan hipertermia magnetik [28], yang semuanya merupakan aplikasi yang memerlukan biokompatibilitas. Oleh karena itu, apakah DC berlabel SPIO memiliki pengaruh pada apoptosis DC harus diselidiki. Data kami menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan dalam apoptosis DC ketika DC diberi label dengan SPIO kurang dari 50 g/mL (Gbr. 2b). Dalam penelitian berikut, kami memilih protein OVA sebagai protein model dan B3 Sel T Z sebagai sel T efektif untuk mengamati apakah SPIO dapat mempengaruhi presentasi silang DC. Hasil kami menunjukkan bahwa DC berlabel SPIO dapat secara nyata memfasilitasi presentasi silang OVA dan aktivasi B3 sel T Z. Molekul permukaan CD80 dan CD86, yang merupakan penanda DC dewasa, adalah dua faktor kostimulatori penting yang diperlukan untuk aktivasi sel T. Pada 25 μg/mL, B3 . yang diaktifkan Sel Z T meningkat dengan dosis nanopartikel dan akhirnya stabil (Gbr. 2a). Selain itu, ekspresi CD80 dan CD86 pada permukaan DC mencapai maksimum (Gbr. 2c). Oleh karena itu, kami mengadopsi konsentrasi 25 μg/mL dan menemukan bahwa apoptosis DC tidak tergantung waktu (Gbr. 2d), yang membuktikan fungsi nanoadjuvant dan biokompatibilitas SPIO yang sangat baik.
Untuk menguji pengaruh SPIO pada migrasi DC, kami menggunakan EGFP-DCs, yang menampilkan fluoresensi hijau di bawah mikroskop fluoresensi confocal, untuk dikultur bersama dengan 25 μg/mL SPIO selama 12 jam. Kami mengamati bahwa ekspresi fluoresensi EGFP tidak melemah setelah pelabelan SPIO. Pada akhirnya, migrasi DC ke organ limfoid sekunder adalah parameter kunci untuk menilai efektivitas vaksin berbasis DC. Dalam penelitian kami sebelumnya, selama 24 jam pertama, DC berlabel SPIO tidak terdeteksi dalam jumlah yang signifikan di kelenjar getah bening sekunder [29]. Untuk menentukan lebih lanjut apakah fenomena ini berubah seiring waktu, EGFP-DC berlabel dan tidak berlabel dikumpulkan dan disuntikkan ke bantalan kaki tikus untuk mengevaluasi potensi SPIO dalam migrasi DC. Hasil kami menunjukkan bahwa fluoresensi hijau muncul di ILN pada hari ke 4 dan 7 (Gbr. 3d-f) sehingga menunjukkan bahwa SPIO dapat memfasilitasi migrasi EGFP-DC ke kelenjar getah bening sekunder. Properti ini dapat diterapkan untuk membatasi metastasis tumor dan mengaktifkan lebih banyak sel CTL di lebih banyak kelenjar getah bening.
Dalam penelitian kami, kami telah mengeksplorasi sifat ajuvan dari SPIO yang bermuatan berlawanan dan kemungkinan mekanisme yang mendasari perubahan fungsi DC. Muatan permukaan nanopartikel oksida besi telah terbukti memiliki pengaruh pada efisiensi serapan seluler [30, 31]. Dalam penelitian kami sebelumnya, kami melaporkan bahwa SPIO kationik dapat meningkatkan presentasi silang antigen dan, karenanya, aktivasi sel T, sementara SPIO anionik dikaitkan dengan autophagy. [16] Beberapa nanopartikel logam dapat menginduksi respon inflamasi [32, 33]. Nanopartikel besi oksida telah dilaporkan mengaktivasi NLRP3, memecahkan membran lisosom, melepaskan cathepsin B, dan menginduksi sekresi IL-1β [34]. Dengan demikian, kami berhipotesis bahwa nanopartikel SPIO yang bermuatan berlawanan dapat melayani fungsi yang berbeda dalam merangsang produksi IL-1β di DC murine dan manusia. Pada Gambar 4a, analisis potensi zeta kami menunjukkan bahwa SPIO berlapis APTS membawa muatan positif, sedangkan SPIO berlapis DMSA membawa muatan negatif. Di bawah TEM, kami menemukan bahwa SPIO bermuatan berbeda dikelompokkan di posisi berbeda di sitoplasma (Gbr. 4b). Untuk menyelidiki perbedaan antara presentasi silang SPIO/A
+
dan SPIO/D
−
, kami menjelajahi sekresi IL-1β di DC murine yang diinduksi oleh nanopartikel bermuatan berbeda. Kami menilai respons DC murine setelah pengobatan dengan SPIO/A
+
dan SPIO/D
−
. Paparan SPIO/D
−
menginduksi aktivasi nyata sekresi IL-1β dibandingkan dengan paparan SPIO/A
+
(Gbr. 4c). Fenomena ini sebagian mengungkapkan bahwa presentasi silang antigen yang diinduksi oleh SPIO/D
−
tidak seefisien yang diinduksi oleh SPIO/A
+
. Selain analisis CPRG peningkatan B3 Aktivasi sel T Z setelah kokultur DC murine dengan SPIO/A
+
+OVA menunjukkan bahwa nanopartikel bermuatan positif dapat bekerja lebih baik bila digunakan sebagai adjuvant imun. Toll-like receptors (TLRs) are of importance for triggering immune responses, such as TLR3, and they can ultimately result in the production of inflammasomes, the activation of caspase-1 protein, and secretion of cytokine IL-1β [35]. To demonstrate whether TLR3 is related to the antigen cross-presentation influenced by our nanoadjuvant, TLR3 knockout DCs were employed in our study. TLR3
−/−
DCs loaded with SPIO/A
+
+OVA and SPIO + OVA effectively stimulated the B3 Z T cell activation (Fig. 4d), which indicates that the TLR3 molecule in DCs was necessary for cross-presentation. Collectively, these results elucidated that differently charged polymers on the surface of nanoparticles should be considered when investigating their synergistic effects on activated immune responses.
Our data show that the oppositely charged nanoparticles could induce the production of IL-1β, whereas SPIO/D
−
could hyperactivate the secretion of IL-1β. However, compared with SPIO/A
+
, SPIO/D
−
induced a lower level of B3 Z T cell activation. Therefore, we speculate that aberrant IL-1β production may contribute to cellular dysfunction in DCs. Most studies on nanomaterial adjuvants exploit DCs from mice, whereas few have used DCs from humans [36, 37]. To further verify our hypothesis, we used YVAD, which has been proven to be an effective caspase-1 inhibitor (Fig. 5a, b), to suppress IL-1β secretion from human DCs. CMV pp65 protein was selected as the model antigen, and CEF-specific T cells expanded in vitro were used as responder cells. The CMV pp65 protein is an immunological dominant protein that readily activates CD8
+
and CD4
+
T cells to produce cytokines, particularly IFN-γ [38]. CEF peptide was used as a positive control to verify that the addition of YVAD would not affect the activation of T cells because it can be presented to the T cells directly. Intriguingly, with the use of YVAD, the T cell responses in the SPIO/A
+
group were slightly restrained, while the responses in the SPIO/D
−
group increased (Fig. 5c, d). The influence of IL-1β on DC cross-presentation provided conclusive evidence that a low level of IL-1β induced by SPIO/A
+
is needed for antigen cross-presentation, and a high level of IL-1β in the cytosol will inhibit the function of DCs.
Conclusions
As shown in the graphical abstract in Fig. 6, SPIO can promote the maturation, migration, and cross-presentation of DCs. Moderate IL-1β activity is partly related to the antigen cross-presentation of DCs. In addition, negatively charged nanoparticles can activate excessive IL-1β and subsequently inhibit the functions of DCs. In summary, our results indicate that SPIO exhibit many biological properties and have promising adjuvant potential. These findings will help identify the optimal choice of nanoadjuvants for the development of DC vaccines in the future.
Graphical abstract of SPIO as a nano-adjuvant for DCs. SPIO enhances the function of DCs by promoting the loading of DCs; thus, SPIO-labeled DCs can migrate to the ILNs active in an immune organ and may offer a new approach in cancer immunotherapy. Anionic-charged SPIOs activate protective IL-1β responses by triggering caspase-1 in DCs, thereby impairing antigen presentation to active T cells
