Studi Toksisitas Nanopartikel Perovskit pada Sel Epitel Saluran Udara

Abstrak

Penelitian tentang toksisitas nanopartikel telah berkembang selama beberapa tahun terakhir karena prevalensinya yang meningkat dalam bahan sehari-hari yang umum. Berbagai nanopartikel telah dilaporkan untuk mempromosikan dan menginduksi sekresi lendir, yang berpotensi menyebabkan kerusakan saluran napas dan komplikasi pernapasan. Lanthanum strontium manganit (LSM) adalah nanopartikel yang banyak digunakan dalam sel bahan bakar teroksidasi surya (SOFC) karena konduktivitas listriknya yang tinggi, aktivitas elektrokimia yang tinggi untuk O₂ reaksi reduksi, stabilitas termal yang tinggi dan kompatibilitas elektrolit SOFC, dan yang paling penting, stabilitas mikrostruktur dan kinerja jangka panjangnya. Sangat sedikit penelitian yang dilakukan pada toksisitas LMS, sehingga efeknya pada sel saluran napas diselidiki dalam penelitian ini. Setelah merawat sel trakea dengan peningkatan konsentrasi LSM yang berkisar hingga 500 g/ml, kami menemukan bahwa ia memiliki efek moderat pada viabilitas sel, produksi ROS, sitokrom C, dan ekspresi caspase 3. Meskipun dampaknya minimal pada karakteristik penginduksi apoptosis yang dinyatakan, LSM menggambarkan efek penghambatan pada sekresi lendir. Kami memperoleh tren penurunan sekresi lendir dengan peningkatan konsentrasi pengobatan LSM. Secara keseluruhan, kemajuan LSM dalam SOFC memerlukan studi toksisitas, dan meskipun tidak menunjukkan toksisitas yang signifikan terhadap sel trakea, LSM mengurangi sekresi lendir, dan berpotensi mengganggu pembersihan jalan napas.

Pengantar

Lanthanum strontium manganit (LSM) adalah nanopartikel yang dilengkapi dengan struktur kristal berbasis perovskit. Ini mengambil bentuk umum "ABO3," di mana lantanum dan strontium berada di situs A dan mangan di B. Ini mengarah ke rumus umum La_1 − x Sr_x MnO₃ , di mana x berarti tingkat doping strontium yang bergantung pada aplikasi nanopartikel. LSM dapat digunakan dalam bentuk bubuk sebagai tape casting, semprotan udara/termal/plasma, dan untuk aplikasi sel bahan bakar [1,2,3,4].

Dalam upaya baru-baru ini untuk mengurangi polusi dan menciptakan ekonomi berbasis hidrogen, banyak penelitian telah difokuskan pada sel bahan bakar oksida padat (SOFC) [5, 6]. Pada gilirannya, perovskit LSM telah menarik perhatian penelitian karena perannya yang signifikan dalam SOFC sebagai salah satu bahan elektroda terpentingnya [4, 7]. Nanopartikel LSM adalah partikel logam permukaan tinggi berbentuk bola yang muncul sebagai bubuk kristal berwarna coklat atau hitam. Meskipun banyak penelitian tentang sifat mekanik dan listrik LSM telah dilakukan [1, 3, 8, 9], sangat sedikit penelitian yang berfokus pada efek biologisnya [10,11,12]. Banyak nanopartikel telah menggambarkan kecenderungan untuk meningkatkan sekresi dan akumulasi lendir, sehingga terkait dengan penyakit pernapasan [13, 14]. Penelitian nanopartikel LSM menunjukkan ide yang menjanjikan untuk aplikasi biomedis [15,16,17]. Baru-baru ini, penelitian tentang LSM telah menunjukkan potensinya untuk terapi anti-kanker [12, 18, 19]. Dengan prosedur sintesis yang benar dan modifikasi permukaan, LSM memiliki kemampuan untuk menjadi agen kontras MRI dan hipertermia serta pembawa obat [20,21,22]. Namun, kemungkinan toksisitas harus dinilai sebelum aplikasi medis lebih lanjut. Hanya ada penelitian terbatas tentang efek toksisitas perovskit [10, 23], dan sejauh ini tidak ada efek toksisitas signifikan yang telah dilaporkan.

Dalam penelitian ini, kami menyelidiki toksisitas nanopartikel LSM, saat terpapar sel epitel trakea primer untuk menentukan kisaran konsentrasi toksisitas. Kami kemudian menganalisis produksi spesies oksigen reaktif (ROS) dan kerusakan mitokondria bersama dengan respons sekresi lendir dengan mikroskop fluoresen [24]. Tingkat perkembangan apoptosis dengan atau tanpa nanopartikel LSM diperiksa dengan uji sitokrom C dan caspase 3 [25].

Hasil dan Diskusi

Karakterisasi NP dan Uji Viabilitas Sel

Toksisitas nanopartikel tergantung pada sifat fisiknya, seperti geometri, distribusi ukuran, dan luas permukaan. Sebelum percobaan toksisitas, karakteristik ini dianalisis menggunakan SEM. Nanopartikel LSM menggambarkan kekasaran permukaan yang signifikan dan didistribusikan dalam agregat dengan berbagai ukuran, berdiameter sekitar 35 nm hingga 200 nm (Gbr. 1).

Citra SEM karakteristik fisik LSM. Ukuran partikel tunggal berdiameter sekitar 35 nm dan agregasi ukuran LSM bervariasi dari 200 nm hingga beberapa m

Kami telah melakukan banyak percobaan toksisitas pada sel saluran napas trakea dengan berbagai NP dalam penelitian kami sebelumnya [26, 27], oleh karena itu garis sel ini dipilih untuk penelitian biologis ini. Untuk menilai toksisitas keseluruhan LSM pada sel trakea, uji viabilitas sel CCK8 kolorimetri dilakukan [25, 27]. Seperti yang terlihat pada Gambar. 2; uji viabilitas sel, ada perubahan dramatis dalam populasi yang terjadi dari 50 menjadi 100 μg/ml konsentrasi LSM. Namun, pada konsentrasi LSM yang lebih besar dari 100 μg/ml, populasi dipertahankan pada kisaran yang relatif stabil, tidak menunjukkan perubahan yang signifikan.

Viabilitas sel trakea setelah peningkatan konsentrasi LSM, ditampilkan di sini sebagai Log[ng/ml]. Uji viabilitas sel CCK8 kolometrik digunakan untuk mengukur, dan rata-rata per kenaikan konsentrasinya dihitung. (n> 6)

Produksi Pelepasan ROS dan Musin

Produksi ROS memicu apoptosis, sehingga berkontribusi pada sitotoksisitas nanopartikel. Menurut Gambar. 3; Produksi ROS, peningkatan konsentrasi LSM tidak terlalu mempengaruhi produksi ROS. Konsentrasi LSM 250 μg/ml paling berbeda dari kontrol, tetapi penyimpangannya tidak signifikan, yang menunjukkan bahwa LSM tidak memiliki efek yang luar biasa pada produksi ROS.

Produksi ROS sel trakea setelah meningkatkan konsentrasi LSM. Rasio produksi ROS per setiap perlakuan konsentrasi LSM dihitung dibandingkan dengan kelompok kontrol. (n> 100)

Dari Gambar 4; bata lendir, setelah perawatan 15 menit, tidak ada efek signifikan pada viabilitas sel, dan dengan meningkatnya konsentrasi LSM, sekresi musin menurun. Pelepasan musin berkurang hingga 40% saat sel diperlakukan dengan LSM 500 μg/ml, dan berpotensi dapat dikurangi lebih lanjut dengan konsentrasi LSM yang lebih tinggi. Pengurangan ini menunjukkan bahwa LSM memiliki efek penghambatan pada pelepasan lendir.

Hasil sekresi musin setelah perawatan 15 menit untuk meningkatkan konsentrasi LSM. Rasio dihitung untuk setiap konsentrasi LSM dengan membandingkannya dengan kelompok kontrol. Penilaian sekresi musin permukaan sel dilakukan dengan ELLA (enzyme-linked lectin assay). (*:n> 6, p < 0,05)

Kerusakan Mitokondria dan Proses Apoptosis

Tahap awal apoptosis biasanya diwakili oleh kerusakan mitokondria. Untuk menganalisis fenomena ini, pewarna JC-1 digunakan sebagai indikator potensial membran mitokondria. Rasio intensitas yang diinduksi oleh pewarna JC-1 berkorelasi dengan hilangnya integritas mitokondria, dan menurut Gambar 5, saat konsentrasi LSM meningkat, kerusakan mitokondria meningkat secara signifikan setelah 100 μg/ml perlakuan LSM. Meskipun hasil menunjukkan bahwa kerusakan mitokondria signifikan setelah 100 μg/ml pengobatan LSM, caspase3 dan sitokrom C menunjukkan sedikit penurunan, seperti yang dijelaskan di bawah ini. Hasil ini menunjukkan bahwa LSM dapat menyebabkan kerusakan mitokondria tetapi sel masih memiliki kemampuan untuk tetap berada pada tingkat rendah dalam perkembangan apoptosis dan mengurangi ekspresi penanda apoptosis.

Hasil intensitas fluoresen pewarna indikator JC-1 dalam empat kondisi perlakuan yang berbeda pada sel trakea untuk menunjukkan integritas mitokondria. (*, **, ***:n> 100, p < 0,05)

Apoptosis juga dapat diukur melalui ekspresi sitokrom C dan caspase 3. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6a; hasil apoptosis pada sitokrom C, ada penurunan moderat tingkat apoptosis antara konsentrasi LSM dan kelompok kontrol yang berbeda. Tren yang sama ini dapat dilihat pada Gambar. 6b; hasil apoptosis pada caspase 3, menunjukkan toksisitas yang sangat minimal akibat LSM. Secara keseluruhan, kerusakan mitokondria dan hasil apoptosis pada sel trakea saluran napas karena LSM sangat rendah, menunjukkan bahwa LSM tidak memiliki efek toksik yang signifikan pada sel epitel trakea.

Mengukur hasil apoptosis melalui a ekspresi sitokrom C, b ekspresi caspase 3. Rasio diperoleh per perlakuan konsentrasi LSM dibandingkan dengan kelompok kontrol (HBSS). (*:n> 100, P < 0,05)

Kesimpulan

Studi nanotoksisitas baru-baru ini telah menarik banyak perhatian pada efek toksik NP karena penggunaannya yang luas dalam produk industri dan komersial. Perhatian utama dari nanotoksisitas adalah karena generasi ROS. Misalnya, TiO₂ NP dianggap sebagai sejenis bahan karsinogenik karena sejumlah besar ROS yang dihasilkan dapat menyebabkan kematian sel dan mutasi [28]. Ada berbagai jenis bahan dan senyawa yang diklasifikasikan sebagai perovskit yang telah dilaporkan dalam beberapa tahun terakhir dalam berbagai aplikasi yang berbeda. Ini adalah studi pertama untuk menentukan toksisitas LSM pada sel epitel saluran napas yang merupakan salah satu jalur utama sel untuk mengambil NP. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh LSM terhadap sel trakea dalam upaya menilai toksisitasnya. Hasil penelitian menunjukkan bahwa LSM tidak memiliki pengaruh yang signifikan terhadap perkembangan apoptosis yang diukur dengan ekspresi sitokrom C dan caspase 3, integritas mitokondria yang diukur dengan fluoresensi JC-1, kelangsungan hidup sel, dan produksi ROS. Namun, pengobatan menunjukkan efek penekanan pada sekresi lendir, penurunan produksi lendir sebagai konsentrasi LSM meningkat. Pada akhirnya, melalui hasil yang diperoleh dari penelitian ini, LSM ditemukan tidak beracun terhadap sel epitel saluran napas, tidak menyebabkan perubahan signifikan pada tahap apoptosis, selain itu menurunkan sekresi lendir yang dapat membahayakan kelangsungan hidup sel. Ini menunjukkan potensi LSM untuk mengganggu pembersihan lendir saluran napas. Dalam penelitian kami, kami menunjukkan potensi toksisitas NP LSM dan hasilnya menunjukkan bahwa potensi risiko efek toksik relatif lebih rendah daripada NP lain yang telah digunakan untuk aplikasi industri dan komersial. Namun, penelitian lebih lanjut harus dilakukan untuk menentukan apakah LSM dapat digabungkan dengan aman sebagai bahan aktif dalam produk penyimpanan energi dan surya komersial.

Bahan dan Metode

Kultur Sel Primer Trakea

Sel epitel primer trakea diisolasi dari epitel bronkial sapi normal mengikuti protokol yang diterbitkan sebelumnya [26]. Sel ditumbuhkan dan dipelihara dalam medium bebas serum (SFM) yang dilengkapi dengan faktor pertumbuhan epidermal rekombinan manusia prakualifikasi 1–53 (EGF 1–53) dan ekstrak hipofisis sapi (BPE) (Thermo Fisher). Sel trakea primer dikultur dalam pelat Falcon 15 cm yang dilapisi kolagen () dan diinkubasi dalam inkubator yang dilembabkan pada suhu 37 °C, 5% CO₂ . Jumlah sel dilakukan dengan menggunakan pengecualian trypan blue (Sigma) dan Bright-Line Hemocytometer. Sel dilewatkan ketika pertemuan mencapai 80%.

Persiapan Sel

Sel diunggulkan pada 5 × 10⁴ sel per sumur dalam pelat 96 sumur berlapis kolagen (75% pertemuan) untuk uji viabilitas sel, 5 × 10⁵ sel per lubang dalam pelat 4 lubang berlapis kolagen (75% pertemuan) untuk Ca²⁺ sinyal, ROS dan analisis mitokondria. Setelah penyemaian, sel diinkubasi selama 24 jam dalam SFM yang dilengkapi dengan EGF 1–53 dan BPE (Thermo Fisher) rekombinan manusia prakualifikasi. Setelah inkubasi 24 jam, media dikeluarkan dari sel dan kultur dibilas dengan saline buffer fosfat dua kali. Pencucian PBS diganti dengan nanopartikel yang disonikasi dalam Ca²⁺ berisi Hanks atau Ca^2 + - Hanks gratis.

Uji Viabilitas Sel

Penentuan fotokolorimetri sitotoksisitas dinilai menggunakan pewarna CCK-8 (Dojindo Laboratories, Tokyo, Jepang) [27, 25]. CCK-8, menjadi non-radioaktif, menawarkan penentuan kolorimetri persentase sel yang layak mengalami berbagai konsentrasi NP. Kit uji ini mengukur aktivitas metabolisme dehidrogenase dalam sel yang layak untuk mengubah garam Tetrazolium WST-8 menjadi formazan yang larut dalam air. Dibuat dengan menambahkan CCK-8 dalam HBSS dalam pengenceran 1:10. Sel dibilas dengan HBSS dan 100 L pewarna dimasukkan ke dalam setiap sumur. Kemudian, sel-sel diinkubasi dalam suhu 37 °C, 5% CO₂ inkubator selama 6 jam. Absorbansi diukur dengan menggunakan pembaca pelat Thermo Multiscan EX (pembaca pelat Thermo Multiskan EX, VWR, CA, USA) pada kerapatan optik 450 nm (referensi 650 nm). Rata-rata dihitung dari tiga set data terpisah untuk setiap konsentrasi, termasuk kontrol yang tidak diberi perlakuan, dari tiga eksperimen independen dan ditabulasi sebagai persentase dari kontrol yang tidak diberi perlakuan.

Viabilitas sel dihitung dengan \( \frac{OD_{450\mathrm{treatment}}-{OD}_{650\mathrm{treatment}}}{O{D}_{450\mathrm{control}}-O {D}_{650\mathrm{control}}}\ast 100\% \).

Lanthanum Strontium Manganit Nanoparticle

Lantanum strontium manganit (La_0,15 Sr_0,85 MnO₃ ) (LSM) nanopartikel (35 nm, 99,5%) (Nanostructured&Amorphous Materials Inc.) digunakan dalam penelitian ini. Semua sampel NP disonikasi sebelum digunakan. Konsentrasi yang digunakan adalah 500 μg/ml, 250 g/ml, 100 μg/ml, dan 50 μg/ml. Kisaran konsentrasi yang digunakan ditentukan mengikuti konsentrasi TiO₂ NP ditemukan dalam laporan sebelumnya (Dowding et al. 2014; Dowding et al. 2012; Gurr et al. 2005; Hirst et al. 2009; Niu et al. 2011). NP LSM dilarutkan dengan solusi Hanks (Invitrogen, CA, USA) sebelum diuji satu per satu dan disonikasi selama kurang lebih 5 menit segera sebelum digunakan.

Memindai Mikroskop Elektron

LSM NP disiapkan menjadi 5 μg/ml dan diteteskan pada wafer silikon bersih dan dikeringkan dengan udara untuk menghilangkan sisa air. Ukuran NP dikonfirmasi secara independen menggunakan mikroskop elektron pemindaian (Gemini SEM, Zeiss).

Produksi Spesies Oksigen Reaktif Intraseluler

Spesies oksigen reaktif (ROS) produksi dievaluasi dengan mikroskop fluoresensi menggunakan oksidasi pewarna CM-H2DCFDA (Invitrogen, CA, USA) [24]. Sel (1 × 105 sel/sumur) dikultur selama 24 jam sebelum dibilas dengan larutan PBS. Sampel diwarnai dengan menerapkan buffer pemuatan yang mengandung 2 M pewarna CM-H2DCFDA yang dilarutkan dalam medium selama 30 menit. Sampel yang diwarnai dicuci dengan PBS tiga kali dan disisihkan selama 5 menit waktu pemulihan untuk esterase seluler untuk menghidrolisis gugus AM atau asetat dan membuat pewarna responsif terhadap oksidasi. Buffer Hanks, yang mengandung LSM NP pada konsentrasi mulai dari 0 hingga 500 g/ml dalam 50 g/ml, kemudian diinkubasi dengan sel selama 15 menit dalam 37 °C diikuti dengan pencucian PBS. Gambar fluoresen dari ROS yang dihasilkan dalam sel ditangkap dan dianalisis dengan menghitung rasio peningkatan intensitas fluoresen antara perlakuan yang berbeda dan kelompok kontrol.

Pengukuran Kerusakan Mitokondria

Potensi trans-membran dalam mitokondria dinilai menggunakan polikromatik 5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidoazolyl-carbocyanio iodide (JC-1 Sigma) [25]. JC-1 adalah kation fluoresen lipofilik yang dapat dimasukkan ke dalam membran mitokondria, di mana ia bergantung pada agregat keadaan potensial membran. Agregasi mengubah sifat fluoresensi JC-1, bergeser dari fluoresensi hijau ke merah. Membran mitokondria utuh yang diwarnai dengan JC-1 menunjukkan fluoresensi mitokondria merah yang jelas yang dapat dideteksi dengan mikroskop fluoresensi. Kerusakan potensial membran mitokondria menghasilkan penurunan selanjutnya dalam fluoresensi hijau dan peningkatan fluoresensi merah. Sebelum stimulasi NP, sel dicuci dengan PBS dua kali dan diinkubasi dengan reagen pewarnaan JC-1 (1:1000) dalam media pada suhu 37 ° C selama 30 menit, diikuti dengan pencucian dengan PBS dan perawatan sel. Potensi membran mitokondria terdeteksi oleh mikroskop fluoresensi pada interval waktu 10 menit.

Pengukuran [Ca²⁺ <_c

Semua percobaan dilakukan dalam kondisi gelap. Sel diisi dengan pewarna Rhod-2 AM (1 μM) (K _d = 570 nM, _Ex = 552 nm, dan _Em = 581 nm) (Invitrogen, CA, USA) selama 45 mnt. Sel-sel kemudian dicuci dengan PBS dua kali sebelum diinkubasi dengan buffer Hanks, dan diperlakukan dengan konsentrasi NP yang sesuai. Semua Ca²⁺ percobaan pensinyalan dilakukan dalam keadaan termo-regulasi pada 37 °C yang dipasang pada mikroskop Nikon (Nikon Eclipse TE2000-U, Tokyo, Jepang) [24, 25, 27] (Chen et al. 2011).

Sekresi Musin dan ELLA

Sel-sel diunggulkan pada 1 × 10⁶ sel per sumur di piring 6-sumur dan dikultur selama 24 jam. Sel primer trakea kemudian dibilas dengan PBS dan distimulasi selama 15 menit dengan konsentrasi LSM NP yang sesuai (500 g/ml, 250 g/ml, dan 100 g/ml) yang disiapkan dalam PBS. Supernatan yang mengandung musin yang disekresikan dikumpulkan dan disentrifugasi sebentar pada 8000 rpm untuk menghilangkan sisa NP. Supernatan kemudian diinkubasi dalam plat 96-sumur (Nunc MaxiSorp, VWR, CA, USA) semalaman pada suhu 4°C. Setelah itu, pelat 96-sumur dicuci dengan PBST (PBS + 0,05% Tween-20) dan kemudian diblokir dengan BSA 1%. Pelat 96-sumur dicuci lagi dengan PBST dan diinkubasi dengan lektin (Wheat germ agglutinin, WGA) (Sigma-Aldrich, MO, USA), terkonjugasi ke horseradish peroxidase (HRP; 5 mg/ml) (Sigma-Aldrich, MO, USA), pada 37 °C selama 1 jam. Substrat, 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB; Sigma-Aldrich, MO, USA), ditambahkan ke setiap sumur pada suhu kamar, diikuti oleh H₂ JADI₄ (Sigma-Aldrich, MO, USA) untuk menghentikan reaksi. Kerapatan optik diukur pada 450 nm (Chen et al. 2011; Kemp et al. 2004).

Persiapan Immunosorbent Assay (ELISA)

Sel-sel diunggulkan dengan kepadatan 1 × 10⁶ kepadatan sel dalam piring 6-sumur dan dikultur selama 24 jam. Sel trakea kemudian dibilas dengan PBS. Sel distimulasi selama 2 jam dengan konsentrasi LSM NP yang sesuai (0–500 g/ml) yang disiapkan dalam PBS. Pelisisan sel disiapkan oleh reagen lisat sel Peirce RIPA, dan lisat dikumpulkan dan dipindahkan ke tabung mikrosentrifugasi. Sampel disentrifugasi pada ~ 14,000×g selama 15 menit untuk melepaskan puing-puing sel dan NP. Supernatan kemudian diinkubasi dalam cawan 96-sumur semalaman pada suhu 4°C. Setelah itu, pelat 96-sumur dicuci dengan PBST (PBS + 0,05% Tween-20) dan kemudian diblokir dengan BSA 1%. Pelat 96-sumur dicuci lagi dengan PBST dan diinkubasi dengan anti-caspase 3 kelinci, antibodi bentuk aktif (Millipore, antibodi poliklonal) dan anti-sitokrom C tikus (Invitrogen, antibodi monoklonal) pada suhu kamar selama 2 jam. Kemudian gunakan antibodi sekunder (anti-kelinci dan anti-tikus terkonjugasi lobak peroksidase, HRP, Millipore) dan diikuti dengan prosedur yang sama seperti ELLA untuk mengukur intensitas absorbansi [25].

Analisis Gambar

Analisis gambar dilakukan dengan mikroskop fluoresen Nikon Eclipse TE2000-U terbalik. Setiap foto diambil pada perbesaran × 10 dan dianalisis menggunakan PCI Sederhana (Compix Inc., Imaging Systems, Sewickle, PA, USA). Data yang ditunjukkan untuk konsentrasi kalsium sitosol diwakili oleh fluoresensi Rhod-2. Gambar diambil setiap 0,5 s dan secara otomatis dikonversi ke skala abu-abu untuk analisis. PCI sederhana memberikan intensitas piksel (nilai abu-abu rata-rata) dari area yang dipilih, masing-masing dengan fluoresensi rata-rata per bingkai untuk 200 sel lebih dari 100 s (~ 200 bingkai) segera setelah stimulasi partikel nano. Data yang ditampilkan untuk pewarnaan imunofluoresensi adalah representasi ekspresi protein setelah 1-2 jam perawatan graphene. Semua eksperimen dilakukan dan dikuatkan secara independen setidaknya tiga kali.

Analisis Statistik

Data disajikan sebagai mean ± SD. Setiap percobaan dilakukan secara independen setidaknya tiga kali. Signifikansi statistik ditentukan menggunakan analisis uji ANOVA satu arah dengan p nilai < 0,05 (GraphPad Prism 4.0, GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA).