Sintesis Mudah dari Nanopartikel Iridium Bebas Ligan dan Biokompatibilitas In Vitronya
Abstrak
Nanopartikel anorganik densitas tinggi telah menunjukkan harapan dalam aplikasi medis yang memanfaatkan radiasi termasuk pencitraan sinar-X dan sebagai penambah dosis radiasi untuk radioterapi. Kami telah mengembangkan metode sintetis berair untuk menghasilkan nanopartikel iridium (IrNPs) kecil (~ 2 nm) dengan mereduksi iridium(III) klorida menggunakan zat pereduksi borohidrida. Tidak seperti metode sintesis berbasis larutan lainnya, IrNP seragam dan monodispersi diproduksi tanpa menggunakan surfaktan atau ligan pelarut lainnya. Nanopartikel ini sangat kristalin seperti yang diamati oleh difraksi sinar-X dan mikroskop elektron transmisi resolusi tinggi (TEM). Uji toksisitas metabolik in vitro menggunakan sel hepatosit dan makrofag menunjukkan bahwa IrNPs dan iridium(III) klorida dapat ditoleransi dengan baik pada konsentrasi hingga 10 μM iridium. Selanjutnya, IrNPs dinilai dalam uji hemolitik dan ditemukan tidak memiliki dampak yang signifikan pada sel darah merah bila terkena konsentrasi hingga 100 M. Secara keseluruhan, hasil ini mendukung potensi aplikasi in vivo dari nanomaterial ini.
Latar Belakang
Nanopartikel logam mulia adalah andalan nanoteknologi yang muncul karena sifat optik, elektronik, dan katalitik permukaannya yang menarik. Dalam nanomedicine, biomaterial unik ini telah menarik perhatian yang signifikan karena kemampuan untuk menyesuaikan interaksi biologis mereka melalui modifikasi permukaan untuk berbagai aplikasi [1]. Nanopartikel emas (AuNPs) telah diselidiki secara ekstensif untuk aplikasi penginderaan dan terapeutik [2, 3], sementara logam mulia lainnya, termasuk perak, telah menemukan kegunaan khusus seperti anti-mikroba [4]. Namun, nanopartikel terdiri dari elemen platinoid, yang umumnya digunakan untuk sifat katalitik permukaannya [5], belum diperiksa secara menyeluruh untuk aplikasi biomedis. Stabilitas permukaan yang luar biasa dan kompatibilitas biologis yang diketahui dari elemen-elemen ini, serta potensi sifat fisik barunya pada skala nano, menjadikannya alternatif unik untuk AuNP.
Radiasi energi tinggi digunakan secara luas dalam pengobatan termasuk dalam pencitraan diagnostik dan terapi radiasi. Oleh karena itu, bahan fungsional yang berinteraksi dengan radiasi, seperti nomor atom tinggi dan nanopartikel kepadatan tinggi, dapat meningkatkan kinerja modalitas ini. Mayoritas studi kimia dan teknik hingga saat ini telah berfokus pada AuNPs untuk meningkatkan interaksi radiasi, meskipun bismut dan hafnium telah diperiksa untuk aplikasi diagnostik dan terapeutik masing-masing [6, 7].
Di sini, kami menyajikan metode sintetis untuk menghasilkan iridium nanopartikel (IrNPs), yang diprediksi memiliki redaman radiasi yang kuat karena kepadatannya yang tinggi. Iridium adalah salah satu logam yang paling tidak reaktif, umumnya dianggap kompatibel secara biologis, dan memiliki kerapatan unsur 22,56 g/cm
3
(kedua setelah osmium, yang dikenal sangat beracun). Sebuah isotop iridium,
192
Ir, adalah pemancar gamma brakiterapi yang umum digunakan, dan sebagian dari keberhasilan bahan ini adalah karena densitasnya yang tinggi, yaitu banyaknya atom dalam volume kecil bahan. Dalam penelitian ini, kami menyajikan sintesis IrNPs dan biokompatibilitas in vitro mereka serta ion iridium, yang sebelumnya belum pernah dievaluasi dalam garis sel yang dipilih. IrNP baru ini belum mudah dieksplorasi untuk tujuan medis meskipun bahan kimianya kelembaman dan kepadatannya yang unggul. Meskipun iridium adalah bahan yang relatif mahal seperti logam mulia lainnya, nilainya saat ini sebagai komoditas kira-kira tiga perempat harga emas dan setengah dari rhodium, menjadikannya alternatif ekonomi yang menarik.
Metode
Sintesis IrNP
Semua reaksi sintesis dilakukan pada suhu kamar dalam kondisi aerobik dalam air murni 18 MΩ. Stok 20 mM iridium (III) klorida (Acros Organics) disiapkan dengan sonikasi mandi dan diaduk setidaknya selama 20 menit untuk menghasilkan larutan yang jernih secara optik. Suatu larutan 1,0 M borana morfolina (Alfa Aesar) juga dibuat dengan sonikasi mandi. Untuk sintesis skala yang lebih besar dengan volume total 500 mL, 25 mL larutan iridium (III) klorida digunakan (diencerkan hingga 1,0 mM) dan 5,0 mL borana morfolina ditambahkan (konsentrasi 10 mM akhir) dengan pengadukan cepat. Solusinya secara bertahap berubah dari coklat tua menjadi hitam selama 30 menit. Nanopartikel dibiarkan stabil setidaknya selama 60 menit. Larutan koloid ini langsung ditambahkan ke filter spin sentrifugal (Amicon Ultra-4, selulosa regenerasi 10k MWCO), dan nanopartikel dikumpulkan pada 4000×g dan dicuci dengan air murni. Nanopartikel kemudian disuspensikan dalam air, melewati filter jarum suntik (Millex-MP 0,22 μm EO), dan disimpan untuk kuantifikasi.
Karakterisasi Nanopartikel
Untuk analisis spektroskopi fotoelektron sinar-X (XPS), nanopartikel disuspensikan dalam asam nitrat volume yang sama, dikumpulkan dengan sentrifugasi dalam tabung mikrosentrifugasi (5 menit, 17 rcf), dan disuspensikan dalam air sebelum analisis. Mikroskop elektron transmisi (TEM) dilakukan pada FEI Tecnai F-20 TEM yang beroperasi pada 200 kV. IrNP yang dimurnikan dijatuhkan pada karbon berlubang Cu yang didukung kisi-kisi TEM (Ted Pella) dan dikeringkan pada suhu kamar semalaman. Analisis difraksi garis dilakukan dengan menggunakan analisis perangkat lunak ImageJ. Untuk analisis difraksi sinar-X (XRD), IrNP pekat diteteskan pada slide kaca dan dikeringkan pada suhu kamar. Data XRD dikumpulkan dalam geometri sinar terfokus (Bragg–Brentano) pada sistem difraksi sinar-X Rigaku Ultima IV menggunakan radiasi Cu Kα monokromatisasi grafit. Pemindaian dilakukan pada rentang sudut 20–80 ° 2θ pada kecepatan pemindaian 0,1 ° / menit pada suhu kamar. Hamburan cahaya dinamis (DLS) dilakukan pada Malvern Nano ZSP dalam kuvet polistiren sekali pakai. Nanopartikel tersuspensi dalam air, dan data dilaporkan sebagai didistribusikan oleh nomor. Spektrum absorbansi UV-Vis dikumpulkan pada Tecan M200 Pro dalam pelat 96-sumur hitam dan volume larutan total 100 μL. Konsentrasi iridium disesuaikan untuk menggambarkan puncak absorbansi relatif. Analisis XPS dilakukan pada PHI Versaprobe II yang dilengkapi dengan penganalisis elektron hemisfer dan sumber sinar-X aluminium Kɑ (1486,7 eV). Analisis spektrum dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak Multipak. Kalibrasi energi pengikatan dilakukan menggunakan puncak C1 pada 284,6 eV, dan pemasangan puncak didasarkan pada puncak asimetris dan latar belakang Shirley yang berulang, menghasilkan nilai khi-kuadrat 1,13. Spektrometri massa plasma yang digabungkan secara induktif (ICP-MS) dari larutan IrNPs dan iridium(III) klorida dinilai sebelum uji toksisitas biologis. Lima puluh mikroliter setiap larutan IrNP dicerna dalam 50 L aqua regia (3:1 M asam nitrat pekat menjadi asam klorida) semalaman pada suhu 70 °C dalam tabung pencernaan. Sampel kemudian diencerkan dalam 5,0 mL asam nitrat 1% untuk analisis. ICP-MS dilakukan pada Agilent 7900 menggunakan helium sebagai gas tumbukan. Kurva kalibrasi dibuat menggunakan 100–0,1 μg/mL larutan stok iridium (dalam 1% HCl), dan semua sampel diencerkan sedemikian rupa sehingga konsentrasi diukur dalam kisaran puluhan ppb.
Analisis Sitotoksisitas
Garis sel HepG2 dan J774A.1 diunggulkan pada 2 × 10
5
sel per sumur (100 μL) dalam pelat 96-sumur (DMEM dengan 10% FBS) dan dibiarkan mengendap selama 24 jam. Nanopartikel iridium, garam iridium, air, atau DMSO ditambahkan pada volume 10% (volume tambahan 10 μL). Sel kemudian diinkubasi selama 24 atau 48 jam. Untuk analisis viabilitas, media dihilangkan, dan sel dicuci sekali dalam PBS. Seratus mikroliter media kultur dengan 10% Alamar Blue (Thermo Scientific) diinkubasi dengan sel selama 2 jam. Media kemudian dilapisi ulang menjadi pelat 96-sumur hitam, dan fluoresensi dibaca (ex530/em590) pada Tecan M200 Pro. Semua data dilakukan dalam rangkap empat, dan eksperimen diulang pada hari-hari independen untuk mengkonfirmasi tren umum. Uji hemolitik dilakukan seperti yang dilaporkan sebelumnya [8].
Hasil
Sintesis dan Karakterisasi Nanopartikel Iridium
Dalam sintesis ini, kami membentuk unsur IrNPs dari garam iridium(III) klorida melalui reduksi dengan kelebihan molar 10 kali lipat borana morfolina dalam air. Reaksi mudah terukur hingga beberapa liter, dan partikel terbentuk pada suhu kamar di bawah kondisi aerobik. Metode sintetis ini menghasilkan IrNP seragam kecil (2–3 nm) (Gbr. 1a) dengan tingkat kristalinitas tinggi seperti yang diamati oleh pencitraan TEM resolusi tinggi. Pola difraksi yang diperoleh dari TEM selanjutnya mengkonfirmasi identitas nanocrystals, dengan jarak garis 0,22 nm yang menunjukkan kisi difraksi iridium (Gbr. 1b). Pola difraksi sinar-X sangat cocok dengan pola difraksi unsur iridium (Nomor Kartu PDF:9008470, Gbr. 1c). Saat disintesis, IrNP stabil secara koloid dalam air dan tetap tersuspensi dalam larutan selama beberapa bulan pada suhu kamar (Gbr. 1d).
a Nanopartikel iridium berukuran 2-3 nm dengan pencitraan TEM, dengan b dengan parameter kisi yang sangat kristal. c Spektrum XRD cocok dengan unsur iridium, dan d partikel memiliki ukuran hidrodinamik 5 nm dalam air menurut DLS
Nanocrystals terbentuk selama 30 menit seperti yang diamati dengan perubahan warna dari prekursor iridium(III) kuning muda menjadi larutan nanopartikel hitam gelap (Gbr.2). Ketika terkena lingkungan dasar, IrNPs ini membentuk oksida iridium yang diprediksi, yang tampak biru. Kondisi asam, seperti inkubasi dalam asam nitrat murni, tampaknya tidak mempengaruhi kristalinitas partikel atau integritas bahan; Namun, itu tidak menginduksi flokulasi dan presipitasi. Selain itu, agregasi juga diamati dalam larutan yang relevan secara biologis (salin buffer fosfat dan media kultur jaringan) selama berjam-jam, menunjukkan bahwa modifikasi permukaan lebih lanjut akan diperlukan untuk aplikasi biomedis di masa depan. Analisis spektroskopi fotoelektron sinar-X dari IrNP yang dibilas dalam asam nitrat dan tersuspensi dalam air menunjukkan permukaan iridium(0) yang dominan, meskipun analisis pemasangan puncak data menunjukkan oksidasi permukaan 20% (Gbr. 3). Tidak ada orientasi kristalit yang disukai dari partikel yang diamati, baik dengan XRD atau XPS. Atau, pengenalan surfaktan tiol ke larutan reaksi selama proses sintesis (sebelum nukleasi) mengakibatkan penghambatan pembentukan partikel.
Iridium(III) klorida tampak kuning pucat dengan puncak absorbansi pada 324 dan 386 nm. IrNPs adalah penyerap spektrum luas dan tampak hitam. Iridium oksida (diprediksi), dihasilkan dari IrNP teroksidasi yang diolah dalam larutan basa, tampak biru-ungu ungu dengan puncak absorbansi pada 584 nm
Spektroskopi fotoelektron sinar-X (XPS) dari IrNPs merupakan keadaan permukaan iridium yang dominan, dengan sekitar 20% kontaminasi permukaan oksida
Sitotoksisitas Iridium
Kami mengevaluasi kompatibilitas biologis in vitro dari IrNP yang tidak tertutup dan membandingkannya dengan garam iridium(III) klorida dalam dua jenis sel mamalia. HepG2, garis sel karsinoma hepatosit, digunakan untuk mengevaluasi potensi toksisitas pada hati. Sel makrofag J774A.1 digunakan untuk mengevaluasi toksisitas pada sistem fagosit mononuklear. Sel diinkubasi dengan IrNPs atau iridium(III) klorida (dinormalisasi untuk konsentrasi total iridium) selama 24 atau 48 jam dan dicuci untuk menghilangkan iridium ekstraseluler, dan aktivitas metabolisme dievaluasi menggunakan uji Alamar Blue (Gbr. 4). Sel HepG2 menunjukkan peningkatan aktivitas metabolisme dengan adanya iridium(III) pada 24 jam (hingga viabilitas 115%), tetapi responsnya dikurangi hingga 48 jam, dengan 500 μM iridium(III) mengurangi viabilitas hingga 90%. Sel HepG2 mengalami penurunan viabilitas seluler, dari 94 menjadi 78% dengan adanya 50 μM IrNP pada 24 dan 48 jam. Menariknya, sel J774A.1 menunjukkan peningkatan aktivitas metabolisme sebagai respons terhadap IrNP pada konsentrasi 50 M dengan viabilitas 122% pada 24 jam; namun, setelah 48 jam, fungsi seluler normal dilanjutkan (kelangsungan 98%), menunjukkan stimulasi metabolik sementara sebagai respons terhadap bahan nano. Sel J774A.1 yang diinkubasi dengan 500 μM IrNPs selama 24 jam menunjukkan respons metabolik yang tampaknya netral, tetapi penurunan viabilitas pada konsentrasi ini setelah 48 jam menunjukkan bahwa ini adalah hasil toksisitas dan stimulasi metabolik yang muncul sebagai respons viabilitas netral. Selain itu, kami mengevaluasi biokompatibilitas in vitro IrNP dengan darah melalui uji hemolitik dan menemukan bahwa IrNP tidak menginduksi hemolisis yang signifikan saat diinkubasi dengan eritrosit dalam PBS pada suhu 37 °C selama 1 jam (File tambahan 1:Gambar S1).
Viabilitas seluler sel HepG2 dan J774A.1 yang diinkubasi dengan nanopartikel Ir(0) atau garam Ir(III) selama 24 atau 48 jam. *Nilai signifikan secara statistik (p < 0,05) relatif terhadap sel yang tidak diobati
Diskusi
Berbagai proses sintetis telah diperiksa untuk menghasilkan iridium skala nano untuk aplikasi katalitik, termasuk reduksi garam iridium oleh hidrida dan gas hidrogen [9,10,11,12,13], radiasi UV dan gamma [14,15,16,17], dan pengurangan poliol atau alkohol [18,19,20]. Namun, banyak dari metode sintetis ini dirancang untuk integrasi iridium ke substrat atau dukungan untuk reaksi kimia dan tidak kompatibel dengan aplikasi biologis [21]. Baru-baru ini, aerosol
192
Ir dipekerjakan sebagai model bahan skala nano untuk toksisitas paru-paru dan dipilih karena kelembamannya yang luar biasa [22, 23]. Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk memeriksa pembersihan dan translokasi partikel halus yang dihirup dari paru-paru; namun, ini juga menyoroti biokompatibilitas elemen ini.
Kami mengevaluasi kompatibilitas biologis in vitro dari IrNPs yang tidak tertutup dan membandingkannya dengan garam iridium(III) klorida dalam dua jenis sel mamalia yang diharapkan mengakumulasi konsentrasi tertinggi dari nanopartikel yang disuntikkan. Toksisitas Iridium(III) dalam sel J774A.1 mengikuti kurva dosis-respons toksisitas normal; 100 μM iridium(III) mengurangi viabilitas seluler menjadi 93 dan 66%, dan 500 μM menghasilkan 40 dan 10% viabilitas seluler masing-masing pada 24 dan 48 jam. Data ini mencerminkan respons spesifik sel yang menarik terhadap iridium(0) dan iridium(III), dan kami mengantisipasi untuk mengeksplorasi lebih lanjut efek ini secara in vivo. IrNP yang lebih kecil dan bahan nano anorganik yang kurang larut lainnya diharapkan akan ditranslokasikan ke ginjal dan hati, dengan tempat tinggal sementara yang singkat di ginjal, dan tempat tinggal yang lebih lama di hati, yang selanjutnya dapat berdampak pada profil toksisitas spesifik sel. Ekskresi diharapkan melalui feses untuk partikel iridium yang lebih besar, meskipun kami berharap ukuran yang sangat kecil dari IrNP ini dapat dengan mudah disaring melalui sistem ginjal jika stabilitas koloid in vivo dapat dipertahankan [23].
Dalam persiapan untuk aplikasi in vivo, kompatibilitas darah dari IrNP dievaluasi dengan uji hemolitik. Memanfaatkan darah tikus utuh, kami mengevaluasi efek IrNP ini pada pecahnya eritrosit dan potensi pelepasan hemoglobin. Meskipun studi mendalam tentang IrNP modifikasi permukaan akhir perlu dievaluasi, bahan penyusun IrNP saat ini tidak menimbulkan respons hemolitik yang dapat dideteksi hingga konsentrasi yang sangat tinggi (500 μM).
Kesimpulan
Kami menyimpulkan dari studi ini bahwa iridium(0) nanocrystals dapat dengan mudah disintesis dengan reduksi borohidrida berair sederhana dari iridium(III) klorida, yang menghasilkan 2-3 nm nanopartikel sangat kristal yang stabil secara koloid dalam air dengan hidrodinamik sekitar 5 nm. ukuran. Selama paparan akut, partikel ini tidak beracun pada konsentrasi hingga 50 M iridium (dibandingkan dengan 10 M untuk iridium klorida) di hepatosit, merangsang aktivitas metabolisme dalam sel makrofag, dan tidak menimbulkan respons hemolitik pada konsentrasi praktis. Nanopartikel bebas ligan ini dapat berfungsi sebagai blok bangunan atau inti untuk IrNP yang dimodifikasi permukaan selanjutnya untuk digunakan dalam aplikasi biologis dan medis. Penyelidikan lebih lanjut dari sifat fungsional nanomaterial densitas tinggi ini dengan adanya sinar-X atau radiasi lainnya memberikan peluang untuk agen terapeutik dan diagnostik baru.
Singkatan
AuNP:
Nanopartikel emas
DLS:
Hamburan cahaya dinamis
ICP-MS:
Spektrometri massa plasma yang digabungkan secara induktif
