Efek Penghambatan yang Ditingkatkan Secara Sinergis dari Pengiriman Bersama Lovastatin dan Doxorubicin yang Dimediasi Nanopartikel Pullulan ke Sel Kanker Payudara Triple-Negatif

Bahan dan Metode

Materi

Pullulan (200 kDa) berasal dari Hayashibara (Tokyo). LV dan DXR hidroklorida berasal dari J&K Scientific (Beijing). 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimida hidroklorida (EDCI) dan 4-dimetilaminopridin (DMAP) berasal dari Reagen Aladdin (Shanghai). Reagen lain seperti pelarut berasal dari Sinopharm Chemical Reagent Co. (Beijing). Garis sel kanker payudara MDA-MB-231 (TNBC) dan MDA-MB-453 (non-TNBC) dibeli dari Pusat Sumber Daya Sel, Institut Ilmu Biologi Shanghai. Reagen CellTiterBlue berasal dari Promega (Madison, WI, USA). Media Dulbecco yang dimodifikasi Eagle (DMEM) (Cat#SH30022.01) berasal dari HyClone (AS), dan serum janin sapi (FBS) (Cat#04-001-1ACS) berasal dari Biological Industries (Israel).

Sintesis LV-Grafted Pullulan (PLV)

Pertama, monoester asam suksinat LV (LV-SA) disintesis dengan langkah-langkah berikut. Singkatnya, 0,60 g suksinat anhidrida (SA, 6,0 mmol) dan 2,0 g LV (5,0 mmol) dilarutkan dalam 20 mL piridin anhidrat dan diaduk selama 48 h pada 50 °C. Larutan reaksi yang dihasilkan dituangkan perlahan-lahan ke dalam larutan HCl glasial 1500 mL pH 3 di bawah pengadukan konstan untuk mengendapkan sejumlah besar endapan putih, dan pH suspensi diatur ke pH 3 dengan HCI pekat, diikuti dengan penyaringan vakum. . Endapan dicuci dengan larutan HCl glasial pH-3, kemudian dengan ddH₂ O ke netral untuk menghasilkan produk mentah. Akhirnya, produk mentah direkristalisasi dari sistem pelarut aseton-air untuk mendapatkan LV-SA murni dan hasilnya adalah 72%. PLV diproduksi dengan mengkonjugasikan gugus asam karboksilat LV-SA dengan hidroksil pullulan pada rasio molar LV-SA terhadap pullulan 1/2, 1/3, dan 1/4. Singkatnya, 0,5 g (1,03 mmol) disiapkan LV-SA, 0,15 g DMAP (1,23 mmol) dan 0,24 g EDCI (1,23 mmol) dilarutkan dalam 20 mL dimetil sulfoksida (DMSO) dan diaduk pada 50 °C selama 4 h. Pullulan (0.33 g, 1/2; 0.50 g, 1/3; 0.67 g, 1/4) dilarutkan dalam DMSO untuk mendapatkan larutan 2% (b/v). Kemudian, larutan pullulan ditambahkan secara perlahan ke dalam larutan reaksi untuk reaksi pada suhu 50 °C selama 48 jam. Campuran reaksi ditempatkan ke dalam kantong dialisis (MWCO= 8~12 kDa) dan didialisis terhadap 25% etanol/air dan air. Kemudian sampel dibekukan-kering [32]. Konjugat PLV dengan rasio umpan LV terhadap pullulan yang berbeda dikarakterisasi dengan analisis FTIR menggunakan spektrofotometer FTIR (pelet KBr, Nicolet, TM Nexus 470-ESP, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Konjugat PLV juga dikonfirmasi oleh ¹ Spektroskopi H NMR (pelarut DMSO-d6, BRUKER AVANCE-500, Bruker, Billerica, MA, USA), dan derajat substitusi (DS) untuk LV untuk setiap konjugat dihitung.

Persiapan dan Karakterisasi NP

Sejumlah 50 mg konjugat PLV dilarutkan dalam 12,5 mL DMSO di bawah pengocokan lembut pada 37 °C (untuk mengembangkan konjugat sepenuhnya) untuk mendapatkan larutan konjugat 4 mg/mL. Sejumlah 5 mL larutan konjugasi diencerkan menjadi 2 mg/mL dengan DMSO untuk dialisis terhadap 1000 mL air suling selama 8 h dengan 10 kali pertukaran dengan menggunakan tas dialisis (8~14 kDa). Kemudian, larutan disonikasi dengan menggunakan sonifier tipe-probe (penyembur sel Ultrasonik GA92-IIDA, Instrumen Presisi Suzhou Jiangdong) pada 100 W dengan denyut (denyut pada 2,0 s, mati 2s) selama 2 menit dalam penangas air es . NP PLV rakitan sendiri diperoleh dan sampel disimpan pada suhu 4 °C. Untuk menyiapkan NP PLV/DXR, 2 mg DXR dilarutkan dalam 5 mL DMSO dan kemudian ditambahkan tetes demi tetes ke dalam larutan konjugat 5 mL, kemudian NP PLV/DXR disiapkan dengan metode yang sama. Dalam prosedur khas untuk menyiapkan NP PLV/DXR yang dimuat FITC, 1 mg DXR dilarutkan dalam 2 mL DMSO dan kemudian ditambahkan tetes demi tetes ke dalam larutan konjugat 2,5 mL. Kemudian, larutan FITC 1 mL (0,6 mg/mL) dalam DMSO ditambahkan tetes demi tetes, dan NP PLV/DXR yang dimuat FITC disiapkan dengan metode yang sama.

NP PLV, NP PLV / DXR, dan NP PLV / DXR yang dimuat FITC disaring melalui membran 0,45-μm, kemudian ukuran partikel, potensi zeta, dan indeks polidispersitas (PDI) ditentukan oleh hamburan cahaya dinamis (DLS, Zetasizer 3000 HS, Instrumen Malvern, Malvern, Inggris Raya). Fitur morfologi NP PLV diamati dengan mikroskop elektron transmisi (TEM; Tecnai G2 20 S-Twin, FEI Hong Kong) pada tegangan akselerasi 80 kV.

Penentuan Kapasitas Pemuatan dan Efisiensi Jebakan

Sebuah solusi PLV/DXR NP (5 mL) disonikasi selama 5 min (denyut pada 2.0 s, off 2.0 s) untuk melepaskan obat dari NP. Absorbansi DXR dalam larutan diukur pada 480 nm dengan menggunakan spektrofotometer UV-tampak (Shimadzu UV-2550, Kyoto, Jepang) untuk menghitung konsentrasi obat. Efisiensi enkapsulasi DXR (EE) dan kapasitas pemuatan (LC) dihitung sebagai berikut:

Pelepasan Obat In Vitro

Profil pelepasan DXR dari NP PLV/DXR diukur dalam larutan buffer fosfat 0,1 M pada 37 °C dengan metode dialisis seperti yang dijelaskan [33]. Biasanya, 6 mL PLV/DXR NPs (sama dengan 139,4 mg DXR) dipindahkan ke dalam tas dialisis (MWCO = 3500 Da) dan kemudian diinkubasi pada 37 °C dalam 15 mL PBS (pH 7.4 dan 5.4). Pada waktu yang telah ditentukan, 3 mL larutan buffer eksternal ditarik dan diganti dengan 3 mL PBS segar (pH 7,4 atau 5,4). Jumlah DXR yang dilepaskan diukur dengan spektrofotometri fluoresensi. Tingkat persentase pelepasan obat (Q %) dihitung sebagai berikut:

dimana A adalah berat NP, C _n adalah konsentrasi sampel pada Tn , V adalah total volume media rilis, V _n adalah volume sampel (2 mL), dan C _i adalah konsentrasi sampel pada T _i (i = 0, 0,5, 1,…n jam, keduanya V ₀ dan C ₀ sama dengan nol).

Budaya Sel

Garis sel kanker payudara manusia MDA-MB-231 dan MDA-MB-453 dikultur dalam media lengkap DMEM yang mengandung 10% FBS dalam kondisi lembab 37 °C, 5% CO₂ , dan normoksia (21% O₂ ). Sel-sel eksperimental semuanya berasal dari sel fase pertumbuhan logaritmik.

Sitotoksisitas In Vitro

Sel MDA-MB-231 dan MDA-MB-453 diunggulkan dalam pelat 96-sumur (4× 10 ³ sel / sumur dalam volume 100 L) ditanam di bawah kondisi kultur rutin selama 24 jam. Kemudian NP PLV/DXR dengan berbagai konsentrasi obat (rasio massa DXR dan LV adalah 8,13) ditambahkan dan diinkubasi selama 48 h. Akhirnya, 20 μL CellTiter Blue reagen (Promega) yang digunakan untuk mengukur proliferasi sel ditambahkan dan diinkubasi selama 1-4 h pada 37 °C. Absorbansi pada 530/590 nm diukur dengan menggunakan pembaca pelat mikro otomatis. Viabilitas sel dinyatakan sebagai persentase dari absorbansi untuk kelompok kontrol tanpa perlakuan.

Analisis Efek Sinergis In Vitro

Analisis isobole digunakan untuk menilai secara kuantitatif sinergisme dan antagonisme yang dihasilkan oleh obat berpasangan. Menurut prinsip kesetaraan dosis Tallarida dan model aditif Loewe, sebuah isobole dihasilkan, yang merupakan garis untuk menentukan efek aditif dari obat-obatan yang dipasangkan [34, 35]. Dalam praktiknya, seperti yang kami jelaskan sebelumnya [8], pertama-tama kami memperoleh kurva dosis-efek untuk DXR bebas dan LV bebas dan setelah mengubah dosis dan efek obat, menggunakan regresi linier untuk memperoleh persamaan regresi linier untuk menghitung dosis gabungan dari obat-obatan yang dipasangkan. obat yang memberikan efek tertentu. Data untuk memplot isobole diilustrasikan pada Tabel 1. Titik-titik pada isobole mengatur DXR/LV pada rasio yang berbeda untuk menghasilkan efek maksimum 50%. IC₅₀ dosis obat berpasangan yang terletak di bawah isobole menunjukkan efek sinergis, sedangkan IC₅₀ di atas isobola menunjukkan efek antagonis.

Serapan Seluler In Vitro

NP FITC PLV/DXR diperoleh dengan dialisis. Serapan seluler NP PLV/DXR FITC diuji dengan menggunakan pembaca pelat mikro fluoresensi. Sel MDA-MB-231 dan MDA-MB-453 diunggulkan (2 × 10 ⁵ /well) pada cawan 2,5 cm dan diinkubasi pada 37 °C selama 24 h. Sel kemudian diinkubasi dengan konsentrasi NP FITC PLV-DXR pada 37 °C selama 1, 2, dan 4  jam. Media kultur kemudian diangkat dan dicuci dua kali dengan PBS dingin. Sel difiksasi dengan paraformaldehyde 4% selama 5 menit dan dipasang pada slide dengan menggunakan media pemasangan yang mengandung DAPI. Kemudian, serapan NP seluler divisualisasikan dengan mikroskop fluoresensi.

Analisis Statistik

Data dinyatakan sebagai mean ± SD dan dianalisis dengan t . Siswa tes. Perbedaan dianggap signifikan secara statistik pada P < 0,05.

Hasil

Sitotoksisitas In Vitro dan Efek Sinergis DXR dan LV

Untuk mengevaluasi efek penghambatan LV dan DXR terhadap TNBC dan proliferasi sel non-TNBC, viabilitas sel dinilai dengan uji biru Alamar. Kami pertama-tama menentukan efek penghambatan LV dan DXR pada dua garis sel TNBC dengan tes obat gratis. Serangkaian rasio konsentrasi LV/DXR diperoleh dengan menetapkan konsentrasi satu obat konstan dan mengubah obat lain. Untuk lini sel MDA-MB-231, baik LV dan DXR memberikan penghambatan yang bergantung pada konsentrasi, tetapi LV memiliki efek penghambatan yang signifikan pada konsentrasi hingga 3,0 μM (Gbr. 1).

Sitotoksisitas free doxorubicin (DXR) dan free lovastatin (LV) pada sel kanker payudara. Sitotoksisitas in vitro dari kombinasi DXR, LV, dan DXR dan LV gratis terhadap MDA-MB-231 (a , b ) dan MDA-MB-453 (c , d ) sel kanker

IC₅₀ nilai untuk LV pada perlakuan DXR yang berbeda dan untuk DXR pada perlakuan LV yang berbeda ditunjukkan pada Tabel 2, dan kami juga memplot IC ini₅₀ nilai (Gbr. 2a) untuk secara visual mencerminkan efek gabungan DXR/LV. IC₅₀ untuk DXR gratis saja adalah 0,865 μM, dan untuk LV gratis saja adalah 10,07 μM. Ketika konsentrasi DXR meningkat dari 0,125 menjadi 0,625 μM (meningkat lima kali lipat), IC₅₀ untuk LV menurun dari 10,92 menjadi 0,28 μM (pengurangan 39 kali lipat), dan ketika konsentrasi DXR meningkat dari 0,625 menjadi 3,125 μM (peningkatan lima kali lipat), IC₅₀ nilai LV menurun dari 0,28 menjadi 0,0004085 μM (pengurangan 685 kali lipat). Demikian pula, ketika konsentrasi LV meningkat dari 1,0 menjadi 3,0 μM (peningkatan tiga kali lipat), IC₅₀ nilai DXR menurun dari 1,005 menjadi 0,3033 μM (pengurangan 3,3 kali lipat) dan ketika konsentrasi LV meningkat dari 3,0 menjadi 10 μM (peningkatan 3,3 kali lipat), IC₅₀ nilai DXR menurun dari 0,3033 menjadi 0,007196 μM (pengurangan 42 kali lipat). Jadi, untuk tingkat penghambatan yang sama dari proliferasi sel MDA-MD-231, DXR dapat secara signifikan mengurangi jumlah LV yang dibutuhkan, dan LV juga dapat secara signifikan mengurangi jumlah DXR yang dibutuhkan. Temuan ini penting untuk kemoterapi tumor karena DXR adalah obat kemoterapi yang sangat poten dengan efek samping yang tidak diinginkan dan harus disimpan dalam konsentrasi rendah, dan LV memiliki efek samping minimal [36]. Untuk sel MDA-MB-453, DXR menunjukkan penghambatan yang bergantung pada konsentrasi, tetapi LV tidak menunjukkan penghambatan yang signifikan pada konsentrasi yang diperiksa. Selain itu, DXR memiliki efek penghambatan yang signifikan pada sel MDA-MB-453 pada konsentrasi hingga 3,0 μM, yang jauh kurang efektif daripada sel MDA-MB-231 (Gbr. 1). Kami baru-baru ini menemukan bahwa LV secara selektif menghambat panel garis sel TNBC dibandingkan dengan garis sel non-TNBC [8]; oleh karena itu, kombinasi LV dan DXR bisa cocok untuk mengobati TNBC tetapi tidak untuk sel non-TNBC.

Sinergi DXR dan LV. IC₅₀ nilai untuk DXR dan LV dengan konsentrasi LV dan DXR yang berbeda dihitung dengan GraphPad Prism 7 (a ) dan metode isobola (b )

Untuk menilai lebih lanjut sinergisme DXR dan LV secara kuantitatif, kami menggunakan metode isobole. Dengan rasio DXR/LV yang berbeda untuk mencapai efek maksimal 50% (Tabel 1), kami memplot isobole yang menunjukkan efek aditif rasio DXR/LV (Gbr. 2b). IC₅₀ dosis DXR/LV pada 0,025/7,09, 0,3033/3,0, dan 0,625/0,28 (μM/μM) berada di bawah isobole, yang menunjukkan bahwa DXR/LV pada rasio ini akan menghasilkan efek sinergis. Dengan demikian, efek sinergis ini (1 + 1 > 2) selanjutnya akan mencapai dosis obat yang diminimalkan secara farmakologis secara statistik dengan kemanjuran obat yang dimaksimalkan [37]. Ketiga rasio sinergis ini tampaknya mewakili hasil ini:(1) dosis rendah DXR (0,025 μM) dapat lebih meningkatkan kemanjuran terapi LV karena 0,025 μM DXR dapat menghasilkan kemiringan negatif yang lebih besar untuk kurva dosis-efek LV (Gbr. . 2b); (2) dengan konsentrasi DXR yang tinggi, menambahkan sejumlah kecil LV dapat sangat membantu efek DXR terhadap sel MDA-MB-231 karena IC₅₀ untuk DXR saja adalah 0,865 μM, tetapi menambahkan hanya 0,28 μM LV mengurangi IC₅₀ DXR menjadi 0,625 μM, yaitu, 0,28 μM LV sepenuhnya menggantikan kemanjuran DXR 0,24 μM (Tabel 2); dan (3) ketika dosis LV sekitar 10 kali lipat dari DXR, rasio DXR/LV seharusnya memiliki efek sinergis terbaik karena titik (0,3033, 3.0) terjauh dari isobol (Gbr. 2b).

Sintesis dan Karakterisasi Struktural Konjugat PLV

Konjugat PLV amfifilik disintesis seperti yang ditunjukkan pada Skema 2. PLV diperoleh dengan esterifikasi pullulan dan LV. Struktur konjugat PLV dikonfirmasi oleh FTIR dan ¹ Spektrum H NMR (Gbr. 3). Menurut analisis FTIR (Gbr. 3a), konjugat PLV berhasil diproduksi. Untuk spektrum konjugat PLV, selain mempertahankan puncak karakteristik pullulan (1644, 1642, dan 1648 cm ⁻¹ ), puncak yang disempurnakan pada 1459 cm ⁻¹ dan 1360 cm ⁻¹ juga menunjukkan puncak getaran lentur –CH₃ dan –CH₂ –, masing-masing, untuk LV. Selanjutnya, kami mengamati pergeseran bilangan gelombang yang tinggi dari puncak serapan regangan –C=O (ikatan ester dalam LV) pada 1725 cm ⁻¹ dari konjugat PLV karena ikatan ester yang baru dihasilkan, dan puncak ini ditingkatkan dengan peningkatan rasio molar LV terhadap pullulan (Gbr. 3a).

Sintesis kimia konjugat PLV amfifilik. LV dan suksinat anhidrida (SA) bereaksi di bawah katalisis piridin untuk membentuk LV-SA pada 50 °L. Kemudian LV-SA dihubungkan ke pullulan oleh ikatan ester di bawah katalisis EDC dan DMAP untuk membentuk polimer PLV

Karakterisasi struktural konjugat pullulan-lovastatin (PLV). a Spektrum FTIR untuk pullulan, LV, PLV (1/2), PLV (1/3), dan PLV (1/4), memuncak pada 1644, 1642, dan 1648 cm ⁻¹ sebagai puncak karakteristik pullulan. Garis putus-putus pada 1360, 1459, dan 1725 cm ⁻¹ menunjukkan puncak getaran lentur –CH₃ – dan –CH₂ - untuk LV b ¹ Spektrum H NMR untuk pullulan, LV, PLV (1/2), PLV (1/3), dan PLV (1/4)

Kami mengkonfirmasi keberhasilan sintesis konjugat PLV dengan ¹ Spektrum H NMR (Gbr. 3b). ¹ Spektrum H-NMR menunjukkan puncak karakteristik pullulan dan puncak baru yang ditetapkan untuk CH₃ , CH₂ , dan proton CH dari bagian LV pada 0,5~2,7 ppm (bingkai merah), yang menunjukkan keberhasilan konjugasi LV ke pullulan. Kami menggunakan puncak karakteristik pullulan pada 4,94~5,14 ppm (a) sesuai dengan -1,6 dan -1,4 ikatan glikosidik proton C₁ untuk menentukan unit glukosa dalam pullulan [38]. Sinyal pada 4.12 ppm (b) berhubungan dengan proton dari C₁₃ di LV. Jadi, DS residu LV per 100 unit glukosa pullulan dihitung dengan rasio C₁₃ proton (4,05~4,15 ppm) dari LV menjadi proton gula (4,94~5,14 ppm) dengan persamaan berikut:DS = I _4,05~4,15 /Aku _4.94~5.14 × 100%. Data DS untuk LV ada di Tabel 3.

Karakterisasi NP PLV

Konjugat PLV yang disintesis dapat merakit sendiri menjadi misel dalam larutan berair. Ukuran rata-rata dan indeks polidispersitas (PDI) masing-masing adalah 177,2 nm dan 0,138, untuk NP PLV (1/2); 189,7 nm dan 0,160 untuk PLV (1/3) NP; dan 219,8 nm dan 0,050 untuk NP PLV (1/4) (Tabel 3; Gbr. 4a, b). Selain itu, potensi zeta untuk NP PLV (1/2), PLV (1/3), dan PLV (1/4) masing-masing adalah 11,66, 10,51, dan 8,30 mV. Ukuran NP PLV menurun dengan meningkatnya DS LV, tanpa perubahan signifikan dalam potensi zeta. Perubahan ukuran terutama dikaitkan dengan penguatan interaksi hidrofobik antara kelompok LV, yang menghasilkan pembentukan inti hidrofobik yang lebih kompak [39]. Kami sebelumnya mempelajari NP pullulan dengan nilai DS kolesterol yang berbeda dan menemukan bahwa sampai batas tertentu, semakin besar DS hidrofobik dari polimer amfifilik, semakin kecil ukuran NP yang terbentuk [33]. Dalam penelitian ini, karena DS gugus hidrofobik LV lebih besar, ukuran NP juga lebih kecil. Juga, gambar TEM (Gbr. 4c) menunjukkan bahwa NP umumnya berbentuk bola dengan monodispersitas yang baik. PLV (1/2) NP, dengan DS tertinggi yang mengarah ke pemuatan LV tertinggi dan ukuran terkecil, dipilih untuk eksperimen berikut.

Karakterisasi nanopartikel (NP). a Ukuran partikel dan distribusi PLV. b Potensi zeta dari PLV. c Gambar mikroskop elektron transmisi PLV ​​(1/2). d Ukuran partikel dan distribusi PLV/DXR dan PLV/DXR bermuatan FITC. e Potensi zeta dari PLV/DXR dan PLV/DXR bermuatan FITC. f Foto PLV, PLV/DXR, dan PLV/DXR yang dimuat FITC

NP PLV / DXR juga menunjukkan morfologi bola dan ukuran yang lebih besar, 225,6 nm, daripada NP PLV kosong. Efisiensi enkapsulasi dan kapasitas pemuatan NP PLV/DXR masing-masing adalah 20,92% dan 1,93%. Interaksi hidrofobik antara inti hidrofobik NP dan kelompok hidrofobik obat menentukan jumlah pemuatan obat di NP. Mempertimbangkan bahwa kelarutan air DXR hidroklorida yang digunakan dalam percobaan ini sedikit lebih besar, interaksi hidrofobik antara DXR dan inti hidrofobik NP lemah, yang menyebabkan jumlah DXR yang sebenarnya dienkapsulasi dalam NP lebih sedikit. Untuk lebih memperjelas penyerapan NP oleh sel tumor, FITC dimasukkan ke dalam NP PLV / DXR. Dengan pemuatan FITC, ukuran rata-rata NP PLV/DXR yang dimuat FITC adalah 253,8 nm dan potensi zeta rata-rata 15,09 mV (Gbr. 4d, e).

Pelepasan Obat In Vitro

Untuk mengungkapkan perilaku pelepasan DXR dari NP PLV/DXR, profil pelepasan DXR in vitro dinilai dalam PBS pada pH 7,4 dan 5,4, masing-masing meniru kondisi dalam jaringan fisiologis normal dan lingkungan mikro intraseluler. NP PLV/DXR menunjukkan dua fase pelepasan DXR:pelepasan cepat dalam 8 jam pertama dan pelepasan berkelanjutan setelahnya (Gbr. 5), yang konsisten dengan profil pelepasan NP tipikal. Selain itu, dengan penurunan pH dari 7,4 menjadi 5,4, pelepasan DXR kumulatif dipercepat secara signifikan masing-masing hingga 76,15% dan 97,90%, pada 72 h. Oleh karena itu, pelepasan DXR dari NP PLV/DXR sensitif terhadap pH sampai batas tertentu, yang sangat berguna dalam meningkatkan kemanjuran terapeutik dan mengurangi efek samping in vivo [40].

Profil pelepasan DXR secara in vitro dari PLV/DXR dalam saline buffer fosfat pada pH 7.4 vs 5,4 pada waktu yang berbeda setelah dialisis

Serapan Seluler dari NP PLV/DXR yang Dimuat FITC

Kami memperoleh gambar mikroskop fluoresensi sel MDA-MB-231 (Gbr. 6a) dan MDA-MB-453 (Gbr. 6b) masing-masing pada 0,5, 1, dan 4 h, setelah terpapar NP PLV/DXR yang dimuat FITC dan menemukan peningkatan intensitas fluoresensi merah dan hijau yang bergantung pada waktu dari 0,5 menjadi 4 jam setelah perawatan NP (Gbr. 6), yang menunjukkan serapan seluler yang bergantung pada waktu dari DXR dan NP yang dimuat FITC, masing-masing. Juga, jumlah FITC yang memasuki sel MDA-MB-231 lebih besar daripada yang memasuki sel MDA-MB-453. Kuantifikasi lebih lanjut dari intensitas fluoresensi mengungkapkan perbedaan yang signifikan dalam penyerapan DXR antara sel MDA-MB-231 dan MDA-MB-453 pada 1  jam setelah pengobatan NP (Gbr. 6c).

Penyerapan obat sel kanker payudara yang dimuat dalam NP PLV / DXR. Gambar mikroskop fluoresensi dari FITC-loaded PLV/DXR yang diambil oleh MDA-MB-231 (a ) dan MDA-MB-453 (b ) sel pada 0,5, 1, dan 4 h (biru untuk DAPI, merah untuk DXR, hijau untuk FITC). c Analisis kuantitatif serapan seluler DXR dalam sel MDA-MB-231 dan MDA-MB-453 setelah pengobatan PLV/DXR

Sitotoksisitas In Vitro NP PLV/DXR

Setelah mengkonfirmasi efek penghambatan DXR dan LV pada kelangsungan hidup sel MDA-MB-231 dan MDA-MB-453 dan menunjukkan efek sinergis DXR dan LV, kami menentukan sitotoksisitas in vitro NP PLV/DXR pada dua sel ini garis. Sel MDA-MB-231 dan MDA-MB-453 diinkubasi dengan NP PLV/DXR pada konsentrasi yang setara dengan DXR bebas. Sitotoksisitas NP PLV/DXR meningkat dengan meningkatnya konsentrasi DXR dan lebih besar untuk MDA-MB-231 daripada sel MDA-MB-453 (Gbr. 7a). Temuan ini konsisten dengan tren sitotoksisitas obat bebas (Gbr. 7b) dan menunjukkan bahwa memuat obat bebas di NP tidak mempengaruhi perilaku penghambatan obat. NP PLV/DXR memiliki efek penghambatan yang lebih tinggi pada proliferasi sel MDA-MB-231 daripada sel MDA-MB-453, yang konsisten dengan efek penghambatan preferensial LV pada TNBC. Penghambatan pertumbuhan sel MDA-MB-231 lebih besar dengan NP PLV/DXR daripada DXR bebas (IC₅₀ 0.6012 vs 0.865 μM), yang menunjukkan bahwa NP mungkin memfasilitasi serapan seluler dan retensi obat yang dimuat di dalam sel, menyebabkan peningkatan sitotoksisitas dibandingkan dengan obat bebas.

Sitotoksisitas in vitro obat yang diberikan NP vs obat bebas. Sitotoksisitas PLV/DXR (a ) dan DXR gratis (b ) terhadap sel MDA-MB-231 dan MDA-MB-453

Diskusi

Dalam penelitian ini, NP PLV/DXR disiapkan untuk profil pelepasan obat in vitro DXR yang dilepaskan secara berkelanjutan dalam 72 h, yang kuat pada pH 5.4 (97.9%). NP PLV/DXR lebih kuat menghambat proliferasi TNBC MDA-MB-231 daripada sel MDA-MB-453 non-TNBC. Kedua garis sel menunjukkan penyerapan NP yang bergantung pada waktu, tetapi sel MDA-MB-231 mengambil lebih banyak NP daripada sel MDA-MB-453. Dengan demikian, pengiriman bersama NP berbasis pullulan dari LV dan DXR dapat secara efisien menghambat proliferasi sel kanker payudara TNBC, yang mungkin menyarankan sistem pengiriman obat yang kuat untuk mengobati TNBC.

Baru-baru ini, penggunaan LV dalam pencegahan dan pengobatan TNBC telah mendapatkan pengakuan, dan penelitian lebih lanjut telah menunjukkan bahwa LV secara istimewa menghambat proliferasi sel TNBC dan menginduksi apoptosis [10, 41]. Namun, secara klinis, LV sebagian besar dalam sediaan oral, tetapi obat anti tumor lain untuk kemoterapi termasuk DXR sebagian besar dalam bentuk injeksi. Situasi ini menghasilkan kemanjuran kemoterapi yang tidak diinginkan untuk menggabungkan LV dan obat lain, untuk kesulitan dalam mencapai jaringan tumor pada dosis dan waktu yang diharapkan. Formulasi LV sebagai injeksi sulit dicapai karena sifatnya yang tidak larut dalam air. Oleh karena itu, sistem penghantaran nano diperlukan agar LV dapat digunakan untuk kemanjuran anti-tumor dan juga memungkinkan ko-enkapsulasi beberapa obat untuk kemoterapi kombinasi yang lebih mudah.

Kelompok kami baru-baru ini menyiapkan nanokomposit berbasis cerasome untuk merangkum LV, yang memecahkan masalah kelarutan air LV sampai batas tertentu, tetapi efisiensi pemuatan obat secara umum tidak tinggi (5~6%) [8]. Zhang dkk. mengembangkan nanokapsul konjugat camptothecin-floxuridine untuk memuat LV. Nanokapsul ini, terdiri dari dua obat kemoterapi yang disetujui oleh Food and Drug Administration AS, mencapai kapasitas pemuatan obat yang sangat tinggi untuk camptothecin-floxuridine (68,3%), tetapi efisiensi pemuatan untuk LV masih rendah (2,8%) [29]. Dalam penelitian ini, kami menggunakan LV untuk modifikasi hidrofobik pullulan untuk mendapatkan konjugat PLV amfifilik dan kemudian menyiapkan NP PLV/DXR, yang tidak hanya memecahkan masalah kelarutan LV dalam air, tetapi juga menghasilkan kapasitas pemuatan obat yang tinggi (15,69%). untuk LV dan 1,93% untuk DXR).

Strategi enkapsulasi dua atau lebih obat anti tumor ke dalam nanocarrier telah diterima secara luas untuk penghantaran obat yang efisien [42]. Sui dkk. menggunakan NP DXR-grafted-pullulan memuat sorafenib untuk mencapai kemoterapi sinergis melawan karsinoma payudara murine [30]. Penelitian kami menggunakan metodologi serupa untuk NP PLV/DXR, yang menunjukkan kemanjuran penghambatan yang lebih tinggi untuk sel MDA-MB-231 dibandingkan dengan DXR saja. Namun, NP PLV/DXR tidak menunjukkan efek sinergis, yang mungkin terkait dengan kelambatan endositosis NP dan pelepasan LV, yang perlu dipelajari lebih lanjut.

Indeks kombinasi telah banyak digunakan untuk mengukur efek sinergis dari dua obat [43,44,45]. Metode analisis isobologram yang digunakan dalam penilaian kuantitatif efek sinergis dapat secara efektif menghindari hasil positif palsu [35]. Dalam studi ini, kami menyaring rasio sinergi optimal dari berbagai rasio DXR/LV berdasarkan analisis isobologram.

Penelitian kami memberikan alasan untuk desain sistem pengiriman bersama yang lebih efisien untuk memperoleh efek penghambatan yang ditingkatkan secara sinergis pada TNBC. Karena pekerjaan kami adalah awal dan berdasarkan pada premis bahwa efek EPR layak, penyelidikan lebih lanjut tentang efektivitas in vivo dari sistem pengiriman bersama baru ini pada TNBC menggunakan model pertumbuhan tumor payudara ortotopik dan model xenograft yang diturunkan dari pasien diperlukan.

Kesimpulan

Dalam penelitian ini, kami mengembangkan NP muatan obat ganda baru dengan mencangkok LV secara kimia ke pullulan dan mengenkapsulasi DXR secara fisik, yang memiliki monodispersitas yang sangat baik, kapasitas pemuatan obat yang tinggi, dan perilaku pelepasan obat yang baik. NP PLV/DXR menunjukkan perilaku pelepasan sensitif pH yang berkelanjutan dari DXR. NP PLV/DXR lebih efektif menginternalisasi dan menghambat proliferasi TNBC MDA-MB-231 daripada sel MDA-MB-453 non-TNBC. Selain itu, kami mendemonstrasikan efek sinergis dari campuran DXR/LV gratis, yang menyediakan resimen kemoterapi kombinasi untuk pengobatan klinis TNBC yang potensial di masa depan.

Ketersediaan Data dan Materi

Kesimpulan yang dibuat dalam naskah ini didasarkan pada data yang semuanya disajikan dan ditampilkan dalam makalah ini.

Singkatan

¹ HNMR:

Resonansi magnetik nuklir proton

DLS:

Hamburan cahaya dinamis

DMAP:

4-Dimethylaminopryidine

DMEM:

Medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco

DMSO:

Dimetil sulfoksida

DS:

Derajat substitusi

DXR:

Doksorubisin

EDCI:

1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimida hidroklorida

EE:

Efisiensi enkapsulasi

EPR:

Peningkatan permeabilitas dan retensi

ER:

Reseptor estrogen

FBS:

Serum janin sapi

FTIR:

Inframerah transformasi Fourier

HER2:

Reseptor faktor pertumbuhan epidermis manusia 2

LC:

Kapasitas pemuatan

LV:

Lovastatin

LV-SA:

Monoester asam suksinat lovastatin

NP:

Partikel nano

PDI:

Indeks polidispersitas

PLV:

Lovastatin berkapsul pullulan

NPPLV/DXR:

Nanopartikel PLV yang mengandung doksorubisin

PR:

Reseptor progesteron

SA:

Anhidrida suksinat

TNBC:

Kanker payudara triple-negatif

Dinamika Magnetisasi Dimodulasi oleh Interaksi Dzyaloshinskii-Moriya di Persimpangan Terowongan Magnetik Torsi Putar-Transfer Antarmuka Ganda Pengaruh P-Doping Facile pada Karakteristik Listrik dan Optoelektronik Transistor Efek Medan WSe2 Ambipolar