Menggunakan Nanopartikel Bermuatan Omniscan sebagai Agen Kontras MRI Bertarget Tumor pada Karsinoma Sel Skuamosa Oral dengan Strategi Stimulasi Gelatinase

Bahan dan Metode

Materi

Metoksi-polietilenglikol-NHS (mPEG-NHS, Mn 5000) dibeli dari Beijing Jiankai Technology Co (Beijing, Cina). Peptida yang dapat dibelah gelatinase (urutan:H2N-PVGLIG-COOH) disintesis oleh Shanghai HD Biosciences Co (Shanghai, Cina). Omniscan (Injeksi Gadodiamide) dibeli dari GE Healthcare (Irlandia). Kolagenase IV dibeli dari Sigma (AS).

Sintesis NP Gelatinase-Stimuli Bermuatan Banyak

Kopolimer yang dapat dibelah gelatinase mPEG-Pep-PCL dan mPEG-PCL tanpa peptida disintesis dengan kopolimerisasi pembukaan cincin seperti yang sama pada penelitian kami sebelumnya [17]. Omni-NPs diformulasikan dengan teknik penguapan pelarut emulsi ganda. Secara singkat, 10 mg kopolimer mPEG-Pep-PCL dilarutkan dalam 1 mL diklorometana (DCM). Kemudian, 0,1 mL, 0,2 mL, dan 0,3 mL Omn ditambahkan masing-masing. Campuran ini diemulsikan dalam 3 mL larutan polivinil alkohol (PVA) 3% (b/v) berair dengan sonikasi (XL2000, Misonix, Farmingdale, NY, USA) selama 60 s untuk mendapatkan emulsi minyak/air (o/w) . Emulsi ini kemudian diemulsikan dalam larutan berair 5 mL yang mengandung 0,5% (b/v) dengan sonikasi PVA selama 60 s. Emulsi w/o/w yang terbentuk diaduk perlahan pada suhu kamar dalam lemari asam sampai pelarut organik menguap. Solusi yang dihasilkan disaring untuk menghilangkan obat-obatan yang tidak tergabung. Blank-NP disiapkan dengan cara yang sama seperti yang dijelaskan, tanpa menambahkan Omn. NP mPEG-PCL (Con-Omn-NPs) yang dimuat dengan omni (Con-Omn-NPs) disintesis dengan 10 mg kopolimer mPEG-PCL dan 0,2 mL Omn mengikuti langkah yang sama.

Pengukuran Ukuran Partikel dan Pemeriksaan Morfologi NP

Ukuran partikel dan stabilitas Omn-NP dan blank-NP diukur dengan hamburan cahaya dinamis (DLS) (Brookhaven Instruments Corporation, USA). Omni-NP dan blank-NP disimpan pada suhu kamar. Ukuran partikel ditentukan oleh DLS setiap 2 hari untuk mengevaluasi stabilitas Omni-NPs (total selama 6 hari). Nilai adalah rata-rata pengukuran rangkap tiga untuk sampel tunggal. Pemeriksaan morfologi Omni-NPs dan blank-NPs dilakukan dengan menggunakan transmission electron microscope (TEM) (JEM-100S, JEOL, Japan). Satu tetes suspensi NP yang diencerkan dengan benar ditempatkan pada kisi tembaga yang ditutupi dengan membran nitroselulosa dan dikeringkan di udara pada suhu kamar. Sampel diwarnai negatif dengan larutan natrium fosfotungstik 1% (b/v) sebelum pengamatan.

Konten Pemuatan Obat dan Efisiensi Enkapsulasi

Kandungan drug loading dan efisiensi enkapsulasi Omni-NPs dianalisis dengan menghitung konsentrasi ion gadolinium. Satu mililiter Omn-NPs dipecah dengan asam nitrat pekat, dan kemudian campuran diencerkan dengan asam nitrat encer. Sampel diuji dengan Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectrometry (ICP-AES, Optima 5300DV, PerkinElmer, USA).

Perubahan Makroskopik dan Perubahan Morfologi Mikroskopis NP dalam Respons Kolagenase

NP mPEG-PCL (Con-Omn-NPs) dan mPEG-Pep-PCL NPs (Omn-NPs) yang dimuat dengan omni (Omn-NPs) diinkubasi dengan larutan Hank yang mengandung kolagenase IV (0,34 mg/mL) pada 37 °C selama 24  jam. Perubahan dalam transparansi solusi diamati dengan mata telanjang.

Evaluasi morfologi mikroskopis Con-Omn-NPs dan Omni-NPs (diinkubasi dengan atau tanpa kolagenase) dilakukan dengan menggunakan TEM. Untuk TEM, satu tetes suspensi NP ditempatkan pada kisi tembaga yang ditutupi dengan membran nitroselulosa dan dikeringkan di udara sebelum pengamatan.

Dalam V itro C elular U ambil

Garis karsinoma sel skuamosa mulut manusia (HSC3) disediakan oleh Rumah Sakit Kesembilan Shanghai. Sel-sel tumor diunggulkan dalam piring 24-sumur dengan kepadatan 5 × 10 ⁵ sel per sumur dan dikultur selama 24 jam. Kemudian NP mPEG-Pep-PCL berisi Coumarin-6 (12,5 μg/mL dihitung dengan coumarin-6) ditambahkan ke dalam media kultur dan diinkubasi selama 0,5 dan 1  jam pada 37 °C. Media kultur disedot dan dicuci tiga kali dengan PBS. Sel diimobilisasi selama 20 menit dengan etanol absolut (1 mL per sumur), kemudian dicuci tiga kali dengan PBS. Sel-sel diamati dengan sitokimia imunofluoresen dan mikroskop pemindaian laser confocal (LSM710, Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Berlin, Jerman). Panjang gelombang eksitasi dan emisi adalah 460 nm untuk kumarin-6.

Hewan

Semua percobaan hewan dilakukan dengan kepatuhan penuh terhadap pedoman dalam Panduan Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium yang diterbitkan oleh Institut Kesehatan nasional AS (publikasi NIH No.85-23, direvisi 1985) dan telah disetujui oleh Dewan Peninjau Etika untuk Studi Hewan Rumah Sakit Stomatologi Nanjing, Fakultas Kedokteran Universitas Nanjing. Tikus BALB/c (5–6 minggu, 18–22 g) dibeli dari Model Animal Research Center of Nanjing University. Kesehatan hewan, termasuk berat badan dan kondisi kulit, dipantau dua kali seminggu. Ulserasi, pengurangan mobilitas hewan dan penurunan berat badan, tidak diamati selama percobaan.

Pendirian Model OSCC

Sel tumor dikultur dalam medium Eagle's Modified Dulbecco (DMEM) dengan 10% serum janin sapi (FBS), penisilin 100 U/mL, dan streptomisin 100 mg/mL pada suhu 37 °C dalam atmosfer yang dilembabkan yang mengandung 5% CO ₂ dan 95% udara. Untuk membuat model xenograft OSCC manusia, sel OSCC manusia HSC3 (1 × 10 ⁶ sel dalam 50 μL phosphate buffer saline (PBS)) diinokulasikan secara subkutan ke ketiak kanan mencit telanjang (3 mencit per kelompok). Kami mengukur dimensi tumor setiap hari dengan jangka sorong. Ketika diameter tumor kira-kira 0,4-0,5 cm, tikus siap untuk eksperimen pencitraan MR in vivo.

Studi MRI di Vivo dengan Omni-NPs dan Omn sebagai Agen Kontras

Untuk penelitian in vivo, kami membagi mencit menjadi dua kelompok (A dan B). Tikus dalam kelompok A disuntikkan Omn-NPs melalui vena ekor sementara tikus dalam kelompok B disuntik dengan konsentrasi Omn yang sama dengan NP yang dimuat. Kedua kelompok dipindai menggunakan pemindai MRI Bruker Biospin 7.0 T (Bruker BioSpin, Ettlingen, Jerman). Parameter ditetapkan sebagai berikut:bidang pandang (FOV), 3,5 × 2,5 cm; ketebalan irisan, 0,8 mm; TR, 745,2 ms; TE, 7,5 ms. Irisan aksial mouse diperoleh menggunakan urutan gema spin berbobot T1. Gambar diperoleh sebelum dan pada titik waktu yang berbeda setelah pemberian dua agen kontras secara intravena.

Ekspresi MMP2/9 pada Tumor dan Jaringan Normal

Setelah pemeriksaan MRI in vivo, jaringan tumor, jantung, hati, limpa, paru-paru, ginjal, dan jaringan otot dari mencit model OSCC dipilih untuk pewarnaan imunohistokimia (IHC) untuk MMP2 dan MMP9. Semua jaringan dibedah dan difiksasi dalam formalin buffer netral 10%, secara rutin diproses menjadi parafin, dan dipotong pada ketebalan 5 μm. Pemeriksaan IHC untuk ekspresi semi-kuantitatif (−, +, dan ++) dari MMP2/9 dilakukan menggunakan mikroskop optik.

Analisis Statistik

Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan t . Siswa tes. Data terdaftar sebagai mean ± SD, dan nilai p <0,05 dianggap signifikan secara statistik.

Hasil dan Diskusi

Karakterisasi Nanopartikel mPEG-Pep-PCL

¹ H NMR(CDCl₃ )spektra kopolimer mPEG-Pep-PCL menegaskan bahwa peptida berhasil terkonjugasi dengan mPEG dan konjugat mPEG-Pep berhasil terkonjugasi dengan PCL (Gbr. 1a). Rasio mol blok hidrofilik terhadap blok hidrofobik (mPEG/PCL) dalam kopolimer mPEG-Pep-PCL adalah sekitar 0,95 berdasarkan rasio integral -CH2-O- (4,04 ppm) di segmen PCL terhadap -CH2-CH2-O ( 3.65 ppm) di segmen mPEG dari ¹ Pengukuran H NMR.

a ¹ Spektrum resonansi magnetik nuklir H (300 MHz, 25 C) dari PEG-Pep-PCL dalam CDCl3. b Diameter dan indeks polidispersitas NP kosong dan NP bermuatan Omn (0,1 mL, 0,2 mL, 0,3 mL). c Stabilitas NP bermuatan Omn (0,1 mL, 0,2 mL, 0,3 mL). d Mikrograf TEM dari NP kosong dan NP yang dimuat Omn. Bilah kesalahan mewakili standar deviasi dari tiga pengukuran terpisah

Ukuran Partikel dan Stabilitas NP

Ukuran partikel dan indeks polidispersitas (PDI) ditentukan oleh DLS (Gbr. 1b). Tidak ada perbedaan signifikan dalam ukuran partikel di antara ketiga Omni-NP yang ditemukan (p> 0,05), sedangkan perbedaan yang signifikan ditemukan antara Omni-NP dan blank-NP (p <0,05). Untuk PDI, tidak ada perbedaan signifikan yang ditemukan di antara Omni-NP ini (p> 0,05), tetapi terdapat perbedaan yang signifikan antara Omni-NP dan blank-NP (p <0,05).

Untuk stabilitas Omn-NP, tidak ada presipitasi dan perubahan ukuran yang jelas diamati di ketiga Omni-NP (Gbr. 1c), yang menunjukkan bahwa Omn-NP stabil.

Studi Morfologi NP

Mikrograf TEM dari blank-NPs dan Omni-NPs disajikan pada Gambar. 1d. Bentuk oblate juga dapat diamati pada NP kosong dan Omni-NP dan Omn-NP jauh lebih kecil daripada NP kosong karena ukurannya yang berbeda. Selain itu, Omn di NP dapat dibedakan dengan jelas, yang muncul sebagai partikulat gelap di NP. Partikel Omni ini dapat diamati tersebar di dalam NP.

Konten Pemuatan Obat dan Efisiensi Enkapsulasi

Kandungan drug loading dan efisiensi enkapsulasi ketiga Omn-NP ditunjukkan pada Tabel 1. Hasil penelitian menunjukkan bahwa 0,3 mL Omn memiliki drug loading tertinggi tetapi efisiensi enkapsulasi cukup rendah, dan 0,1 mL Omn memiliki efisiensi enkapsulasi tertinggi dan relatif dekat. pemuatan obat dengan 0.2 mL dan 0.3 mL Omn. Mempertimbangkan pemuatan obat dan efisiensi enkapsulasi, 0,1 mL Omni-NP digunakan dalam studi MRI in vivo final. Efisiensi enkapsulasi yang rendah juga menunjukkan bahwa dalam sistem reaksi, Omn yang kami tambahkan cukup untuk NP.

Perubahan Morfologis Makroskopik dan Mikroskopis Omn-NP dan Con-Omn-NP sebagai Respons terhadap Kolagenase IV

Untuk memverifikasi pembelahan NP dalam menanggapi gelatinase (kolagenase IV), perubahan morfologi makroskopik dan mikroskopis dari Omn-NPs dan Con-Omn-NPs setelah inkubasi dengan larutan Hank yang mengandung 2 mg/mL kolagenase IV dievaluasi. A1 dan B1 menunjukkan larutan transparan Con-Omn-NPs sebelum dan sesudah inkubasi dengan kolagenase IV, dan A2 dan B2 menunjukkan tidak ada perubahan yang ditemukan untuk morfologi mikroskopis Con-Omn-NPs menggunakan TEM sebelum dan sesudah inkubasi. C1 dan D1 menunjukkan larutan Omni-NPs sebelum dan sesudah inkubasi dengan kolagenase IV. D1 menunjukkan bahwa cairan menjadi keruh karena pengendapan terjadi dalam larutan Omni-NP setelah 24 h. D2 menunjukkan gambar TEM dari Omn-NPs sebagai respons terhadap kolagenase IV, struktur NP dipecah (Gbr. 2). Hasil ini menunjukkan NP kami adalah rangsangan gelatinase:pembelahan peptida akan memecah NP, dan obat yang dimuat akan dilepaskan. Dan fitur membelah peptida untuk melepaskan obat yang dimuat juga ditunjukkan melalui pelepasan obat dan dalam penelitian kami sebelumnya [12, 18].

a1 , a2 , b1 , b2 , c1 , c2 , d1 , d2 Perubahan morfologi makroskopik dan mikroskopis dari NP mPEG-PCL (Con-Omn-NPs) dan NP mPEG-Pep-PCL (Omn-NPs) yang dimuat dengan Omn (Omn-NPs) setelah inkubasi dengan kolagenase IV

Studi Serapan Seluler In Vitro

Serapan seluler NP kumarin-6-load ditunjukkan pada Gambar. 3. Fluoresensi hijau dari kumarin-6 ditunjukkan dalam sitoplasma sel HSC3, menunjukkan bahwa kumarin-6 memasuki sitosol bersama-sama dengan NP. Karena kumarin-6 awalnya terperangkap dalam NP, yang menunjukkan bahwa NP kami dapat secara efektif menembus penghalang membran sel dan mendistribusikan dalam sitoplasma sel melalui endositosis.

a, b Studi serapan seluler HSC3 in vitro dari nanopartikel. Gambar mikroskop confocal sel HSC3 setelah inkubasi dengan NP yang mengandung kumarin-6

MR Imaging Di Vivo dengan Omni-NPs dan Omn sebagai Agen Kontras

Gambar diperoleh sebelum Omn-NPs dan Omn diberikan secara intravena dengan dosis 0,025 mmol/kg (Gd ³⁺ ) dari 2 kelompok. Gambar pasca kontras kemudian diperoleh pada 5 menit, 15 menit, 30 menit, 60 menit, 90 menit, 120 menit, 150 menit, dan 180 menit setelah injeksi (Gbr. 4a). Sinyal tumor-to-background (TBR) ) rasio dihitung dan digunakan sebagai indikator terukur untuk evaluasi menggunakan Omni-Nps dibandingkan dengan Omn. Hasil penelitian menunjukkan bahwa TBR maksimum untuk Omn-NPs adalah 2,23 ± 0,10 dan 1,48 ± 0,01 untuk Omn, waktu puncak 30 min untuk Omn-NP dan 5 min untuk Omn, dan waktu durasi peningkatan sinyal 180 min untuk Omn- NP dan 30 min untuk Omn (Gbr. 4b). Ada perbedaan yang signifikan untuk TBR maksimum dan waktu retensi antara kedua kelompok (p <0,05). Meskipun Omn-NP kami memiliki pemuatan obat yang relatif rendah, pencitraan MR in vivo yang ditingkatkan secara superior ditunjukkan dibandingkan dengan Omn saja. Ini juga membuktikan bahwa Omni-NP kami adalah stimulasi gelatinase dan spesifik tumor.

a , b Gambar MRI aksial dan bagan garis rasio tumor-ke-latar belakang model xenograft OSCC manusia pada posisi tumor yang ditunjukkan diperoleh dengan urutan pembobotan T1. Bilah kesalahan mewakili standar deviasi dari tiga pengukuran terpisah

Meskipun teknik pencitraan baru-baru ini canggih seperti tomografi terkomputasi emisi foton tunggal [19], tomografi emisi positron (PET) [20], dan citra optik [21] digunakan dalam diagnosis OSCC, MRI masih yang paling banyak digunakan dan dapat diandalkan. alat untuk staging tumor kepala dan leher menurut sistem staging kanker TNM [1] dan gadolinium chelates masih merupakan agen kontras MRI yang paling banyak digunakan [22].

Untuk mencapai tujuan penargetan tumor khusus untuk agen kontras MRI, strategi penargetan aktif dan pasif telah digunakan [2, 23, 24]. Penargetan aktif [12] telah menjadi area fokus yang luas dalam diagnosis kanker. Ligan penargetan, seperti aptamer [25], peptida [8], antibodi [6], dan folat [26], dikonjugasikan ke kompleks Gd multimerik makromolekul dan supramolekul untuk mengikat reseptor tertentu yang diekspresikan secara berlebihan oleh sel tumor atau pembuluh darah. Namun, sifat biokompatibilitas dan biodegradabilitas dari makromolekul dan supramolekul ini tidak jelas, dan non-biodegradabilitasnya menghalangi aplikasi klinik. Namun, Omn-NP kami terdiri dari PEG, PCL, peptida pembelahan gelatinase, dan Omn. PEG dan PCL memiliki sifat biokompatibilitas dan biodegradabilitas yang sangat baik, dan Omn adalah agen kontras MRI yang banyak digunakan secara klinis; oleh karena itu, Omni-NP kami diharapkan memiliki keamanan hayati yang sangat baik.

Modifikasi polimer dengan mPEG hidrofilik dapat memperpanjang sirkulasi darah dan meningkatkan akumulasi NP pada tumor. PEGylation dapat mengurangi kepatuhan protein serum dan menciptakan permukaan siluman untuk memperpanjang waktu sirkulasi dengan menghindari penyerapan oleh sistem retikuloendotelial [12, 17]. Konsentrasi obat yang dienkapsulasi secara khusus meningkat di lokasi tumor dan waktu peningkatan lama yang signifikan diamati dalam penelitian ini. Oleh karena itu, waktu titik puncak TBR jauh lebih lambat dan periode latensi pencitraan jauh lebih lama pada kelompok Omni-NPs daripada pada kelompok Omn.

Selain itu, peningkatan spesifisitas dan perpanjangan waktu peningkatan durasi akan meminimalkan dosis ion gadolinium yang disuntikkan, dan dengan demikian, mengurangi risiko fibrosis sistemik nefrogenik, yang menjadi perhatian dalam desain agen kontras berbasis gadolinium [27, 28].

Pewarnaan IHC untuk MMP2 dan MMP9

Hasil pewarnaan IHC untuk MMP2 dan MMP9 jaringan normal dari organ dan jaringan tumor ditunjukkan pada Gambar 5. Hasil menunjukkan tingkat ekspresi MMP2 dan MMP9 pada jaringan tumor adalah (++), sedangkan pada sebagian besar jaringan normal adalah (− ). Dalam jaringan tumor, plasma sel dan matriks ekstraseluler terlihat berwarna coklat, menunjukkan tingkat ekspresi MMP2/9 yang lebih tinggi.

a , b Pewarnaan IHC untuk MMP2 dan MMP9 pada jaringan normal dan tumor model tikus xenograft dari garis karsinoma sel skuamosa oral manusia

Keluarga matrix metalloproteinase (MMP), memainkan peran kunci dalam invasi kanker dan metastasis, MMP2/9, yang juga dikenal sebagai kolagenase IV dan gelatinase A/B, telah dilaporkan sebagai MMP terkait kanker yang paling penting. Studi telah mengungkapkan korelasi antara ekspresi gelatinase dan hasil yang buruk dari banyak tumor, termasuk OSCC [29, 30]. Ekspresi tinggi MMP2/9 juga diamati dalam penelitian kami. Karena MMP tidak diragukan lagi merupakan target antikanker yang penting karena ekspresinya yang luas dan hubungannya yang dekat dengan kanker. Oleh karena itu, Omni-NP kami dapat digunakan di hampir semua tumor. Kesederhanaan dan universalitasnya memiliki potensi aplikasi klinis yang baik.

Kesimpulan

Dalam penelitian ini, kami merancang dan mensintesis sistem pengiriman agen kontras MRI bertarget tumor baru untuk menebus cacat agen kontras yang saat ini digunakan di klinik. Rasio tumor-to-background MRI T1 yang lebih tinggi dan waktu sirkulasi darah yang berkepanjangan ditemukan untuk Omn-NPs daripada Omn pada model tikus OSCC. Studi ini menunjukkan bahwa Omni-NPs menjanjikan sebagai agen kontras MRI spesifik tumor untuk meningkatkan spesifisitas dan memperpanjang waktu sirkulasi dalam jaringan tumor. Mempertimbangkan sifat biokompatibilitas dan biodegradabilitas yang sangat baik dari PEG dan PCL, dan Omn adalah agen kontras MRI yang banyak digunakan secara klinis, sistem pengiriman agen kontras MRI yang ditargetkan tumor ini memiliki potensi aplikasi klinis yang baik. Selain itu, upaya lebih lanjut akan dilakukan untuk meningkatkan konten pemuatan obat dan efisiensi enkapsulasi Omn di NP kami untuk sensitivitas yang lebih baik.

Ketersediaan Data dan Materi

Data yang mendukung temuan penelitian ini tersedia dari penulis terkait berdasarkan permintaan.

Singkatan

NP:

Nanopartikel

Omn:

Omniscan

OSCC:

Karsinoma sel skuamosa rongga mulut

MMP:

Matriks metaloproteinase

Hm:

Gadolinium

mPEG:

Metoksi-poli(etilen glikol)

PCL:

Poli (ε-kaprolakton)

Semangat:

Peptida

Omn-NP:

NP mPEG-Pep-PCL yang dimuat di Omniscan

Con-Omn-NPs:

NP mPEG-PCL yang dimuat di Omniscan

MRI:

Pencitraan resonansi magnetik

EPR:

Peningkatan permeabilitas dan retensi

DCM:

Diklorometana

PVA:

Alkohol polivinil

DLS:

Hamburan cahaya dinamis

PDI:

Indeks polidispersitas

TEM:

Mikroskop elektron transmisi

ICP-AES:

Spektrometri Emisi Plasma-Atom Terpasang Secara Induktif

DMEM:

Medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco

FBS:

Serum janin sapi

IHC:

Imunohistokimia

PBS:

Garam penyangga fosfat

Strategi Optimasi 4H-SiC Terpisah Muatan Penyerapan dan Perkalian Struktur Fotodioda Longsor untuk Efisiensi Deteksi Ultraviolet Tinggi Oksidasi Katalitik Bebas Pelarut Benzil Alkohol atas Bimetal Au-Pd yang Diendapkan pada TiO2:Perbandingan Rutile, Brookite, dan Anatase