Penilaian Toksisitas Nanopartikel PEG-PCCL dan Investigasi Awal terhadap Efek Antitumornya dari Pemuatan Paclitaxel

Metode

Bahan, Sel, dan Hewan

-kaprolakton (ε-CL, Alfa Aesar, AS), poli(etilena glikol) (PEG, Mn = 1000, Fluka, AS), heksametilen diisosianat (HMDI, Aldrich, AS), Palladium sur charbon (pd/c, Sigma , USA), Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Hyclone, USA), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, Sigma, USA), bovine serum albumin (BSA) , BR, BoAo Co. Ltd., China) digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut. Semua bahan adalah kelas reagen analitik.

Tikus Balb/C jantan (berusia 7–8 minggu, berat 20–25 g) dan kelinci Selandia Baru (berat 2,5–3,0 kg) dibeli dari Perusahaan biotek Chengdu DaShuo (Sichuan, Cina) dengan Sertifikat Kualitas No. SCXK2013– 24. Hewan-hewan itu dipelihara dalam lingkungan bebas patogen spesifik standar dengan makanan dan air ledeng yang cukup. Percobaan dilakukan sesuai dengan Panduan Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium (Departemen Sains dan Teknologi Cina, 2006). Semua prosedur percobaan hewan telah disetujui oleh Komite Etik untuk Hewan Laboratorium dari Pusat Medis China Barat Universitas Sichuan.

Sel hepatokarsinoma H22 tikus (H22), sel ginjal embrionik manusia (HEK293T), dan sel karsinoma hepatoma (Hep G2) diperoleh dari Departemen Imunologi, Sekolah Ilmu Kedokteran Dasar dan Kedokteran Forensik China Barat, Universitas Sichuan. HEK293T dan Hep G2 dikultur dalam media Eagle (DMEM) yang dimodifikasi Dulbecco (Hyclone, UT, USA), dilengkapi dengan 10% serum janin sapi (FCS) (Hyclone, UT, USA), dan antibiotik (penisilin 100 U/mL dan streptomisin 100 U/mL) pada 37 °C dalam 5% CO2.

Persiapan Micell PEG-PCCL dan PTX-Loaded PEG-PCCL

PEG-PCCL dan PTX-NPs dipasok oleh kooperator kami, Profesor Liu dari School of Microelectronics and Solid-state Electronics, University of Electronic Science and Technology of China. Kopolimer diblok PEG-PCCL disintesis dengan polimerisasi pembukaan cincin -CL dengan adanya homopolimer PEG dengan katalis Palladium sur charbon seperti diagram alir di bawah (Gbr. 1). Kopolimer PEG-PCCL yang diperoleh dimurnikan dan disimpan dalam kantong kedap udara sampai digunakan.

Diagram alir sintesis dipolimer PEG-PCCL

Untuk memuat PTX dalam nanopartikel PEG-PCCL, dispersi padat, teknik sederhana dan berharga tanpa pelarut organik beracun [19] dilakukan setelah PEG-PCCL disiapkan. Kemudian, larutan diuapkan pada suhu 60 °C di bawah tekanan yang dikurangi. Setelah penguapan alkohol, kopolimer homogen diperoleh. PTX dienkapsulasi oleh pembawa polimer sebagai bentuk amorf. Koevaporasi dilarutkan dalam air pada suhu 65 °C untuk menghasilkan larutan PTX-NPs, yang disaring dengan filter 0,22 nm untuk mendapatkan larutan yang jernih dan steril. Serbuk PTX-NPs didapat dari larutan lyophilized dari sistem freeze dry. Efisiensi penjeratan (EE) PTX ditentukan dengan metode sentrifugasi kolom mini [20]. Konsentrasi PTX yang tergabung dalam PEG-PCCL (C_I ) atau total obat dalam dispersi PEG-PCCL (C_T ) dianalisis dengan HPLC. EE (%) = (C_Saya / C_T ) × 100%.

Karakterisasi

Ukuran partikel dan potensi zeta PEG-PCCL diukur dengan penganalisis ukuran partikel laser (Malvern Nano-ZS 90). Mikroskop elektron transmisi (TEM, H-6009IV, Hitachi, Jepang) digunakan untuk menilai morfologi PEG-PCCL. Secara khusus, larutan nanopartikel ditempatkan pada kotak tembaga yang dilapisi dengan nitroselulosa, dan kemudian sampel diwarnai dengan asam fosfotungstat dan dikeringkan pada suhu kamar.

Uji Sitotoksisitas

Sitotoksisitas dinilai dengan uji kebocoran MTT dan LDH di Hep-G2 dan HEK293T. Metabolisme MTS dihitung dalam sel utuh sesuai dengan prosedur MTT [21]. Suspensi sel disiapkan oleh tripsin / EDTA (HyClone, UT, USA). Total 0,4 × 10 ⁴ sel diunggulkan di piring 96-sumur (Corning, MA, USA). Pelat diinkubasi selama 12 jam untuk memungkinkan sel menempel pada permukaan plastik pelat kultur. Kemudian, media dipindahkan dan 200 l media kultur segar atau media yang mengandung konsentrasi PEG-PCCL yang berbeda (dari 0 hingga 1 mg/mL) ditambahkan ke dalam sumur. Tidak ada FCS yang ditambahkan ke media selama periode pemaparan 24 jam. Tingkat kelangsungan hidup ditentukan oleh parameter sitotoksisitas, dan disajikan oleh persamaan:Tingkat kelangsungan hidup (%) = (OD_T /OD_C ) × 100. Di sini, OD_T dan OD_C mengacu pada nilai absorbansi (diukur dengan pembaca spektrofotometer pada 570 nm) masing-masing sel yang diberi perlakuan nanopartikel PEG-PCCL atau PEI dan sel yang tidak diberi perlakuan.

Kebocoran LDH dalam media kultur diperiksa menggunakan kit uji LDH (Biotech, China). Semua pengukuran spektrometri kelompok yang diperlakukan dengan nanopartikel dikoreksi dengan kontrol bebas sel. Untuk studi morfologi, sel HepG2 diunggulkan dan diekspos dengan cara yang sama seperti pada uji sitotoksisitas. Sel difiksasi dalam paraformaldehyde 4% dan diamati di bawah mikroskop elektron transmisi (TEM).

Uji Apoptosis

Apoptosis ditentukan oleh Annexin V-FITC dan pewarnaan ganda PI [22]. Secara singkat, sel HepG2 diunggulkan dalam pelat 12-sumur dengan kepadatan 4 × 10 ⁴ sel/sumur dan diobati dengan PEG-PCCL (0,5 mg/mL) dan PEI (0,5 mg/mL) selama 48 jam. Kemudian, sel dicuci dengan cold phosphate-buffered saline (PBS) tiga kali diikuti dengan inkubasi Annexin V-FITC selama 15 menit dan pewarnaan PI selama 15 menit lagi pada suhu 4°C dalam gelap. Sel yang diwarnai diamati di bawah mikroskop fluoresensi (Olympus Co. Ltd., Tokyo, Jepang) dalam waktu 30 menit.

Uji Hemokompatibilitas

Hemokompatibilitas PEG/PCCL dievaluasi menurut uji hemolisis sel darah merah (RBC) in vitro yang dilaporkan sebelumnya [23]. Sampel darah mencit dikumpulkan, dan eritrosit dilarutkan dalam PBS (larutan RBC 2%). Garam fisiologis, PEI, atau PEG-PCCL 0,5 mg/ml dicampur dengan larutan sel darah merah 2%. Kontrol hemolisis positif dibuat dengan menambahkan volume yang sama dari suspensi eritrosit dan air suling. Setelah campuran dipertahankan selama 1 dan 3 jam pada 37°C dan kemudian disentrifugasi pada 2000 r/menit selama 5 menit, supernatan dideteksi dengan pembaca lempeng mikro (Bio-Rad, CA, USA) pada 570 nm. Persentase hemolisis dihitung dengan persamaan:hemolisis % = (OD_T –OD_NC )/(OD_PC –OD_NC ) × 100. Di sini, OD_T , OD_NC , dan OD_PC mengacu pada nilai absorbansi sampel, kontrol negatif, dan kontrol positif, masing-masing. Selain itu, hemolisis in vivo diuji dengan menghitung jumlah sel darah merah dari sampel darah yang dikumpulkan melalui vena ekor mencit yang diberi saline normal, PEI (20 mg/kg), atau PEG-PCCL (20 mg/kg) selama 3 jam.

Flebitis Kelinci

Vena di kedua telinga kelinci digunakan untuk membandingkan infiltrasi sel inflamasi dan degenerasi epidermal [24, 25]. Kelinci secara acak dibagi menjadi dua kelompok; masing-masing diberi 1 ml salin fisiologis atau 0,5 mg/ml PEG-PCCL melalui vena aurikularis. Kelinci dibunuh oleh overdosis kloral hidrat (4%, Sigma, USA) pada 24 jam setelah infus nanopartikel. Dua sampel vena telinga, termasuk regio 10-15 mm dari ujung kateter baik secara proksimal maupun distal, diperoleh. Vena ini difiksasi dalam larutan paraformaldehyde 4%. Kemudian dibuat potongan melintang parafin dan diwarnai dengan hematoxylin dan eosin (HE). Pemeriksaan histopatologi dilakukan secara membabi buta. Temuan dinilai sesuai dengan kriteria yang ditunjukkan pada tabel yang didasarkan pada Kuwahara [17] dengan penambahan degenerasi epidermal.

Tes Fungsi Hepatorenal

Setelah 7 hari pemberian PEG-PCCL (0,5 mL, 20 mg/kg) pada tikus, sampel darah diekstraksi dari pleksus vena orbital (2 mL) dan segera disentrifugasi pada 1300 g, 4 °C. Supernatan ditarik. Kemudian, parameter biokimia serum [26], termasuk aspartat aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase (ALP), bilirubi, kreatinin, asam urat, dan albumin dievaluasi menggunakan penganalisis otomatis biokimia hewan (Dri-Chem 3000 , Fuji Photo, Tokyo, Japan), yang merupakan indikator tidak langsung dari fungsi hati dan ginjal.

Pemeriksaan Histopatologi

Perubahan histopatologi paru, hati, dan ginjal diperiksa dengan pewarnaan H&E pada 24 jam, 48 jam, dan 7 hari setelah injeksi PEG-PCCL, larutan PEI, atau salin normal (0,5 mL, 20 mg/kg) melalui tikus vena ekor. Organ-organ ini diperoleh setelah pengorbanan hewan. Bagian histopatologi dan pewarnaan H&E dilakukan seperti yang dijelaskan di tempat lain [26]. Perubahan histopatologi diamati di bawah mikroskop cahaya dan direkam dengan berbagai macam kamera (Leica, Co. Ltd., Jerman).

Konsentrasi Darah

Konsentrasi darah PTX dihitung menggunakan spektrofotometer (LAMBDA 950, PerkinElmer, China). Sampel darah diambil dari orbit tikus pada 0,08, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 6, 12, 24 jam setelah perawatan. Supernatan (100 L) dikumpulkan setelah disentrifugasi pada 1300 g selama 10 menit. Konsentrasi PTX dalam setiap sampel darah ditentukan dengan spektrofotometer pada 760 nm.

Model dan Pengobatan Tumor Tikus

Suspensi sel H22 (0,25 mL, 4 × 10 ⁶ sel/tikus) disuntikkan secara intraperitoneal ke tikus Balb/C pada hari ke 0. Ketika asites terbentuk (pada hari ke 3~5), tikus yang mengandung tumor dibagi secara acak menjadi tiga kelompok (n = 5) dan pengobatan dimulai. Tikus disuntik dengan salin normal, PEG-PCCL/PTX (20 mg/kg), atau PTX (10 mg/kg) secara intraperitoneal pada volume 0,5 mL pada hari ke 3 dan 10 untuk mengevaluasi kemanjuran anti tumor. Perimeter perut (AP) diukur setiap hari sehingga dapat dihitung persentase peningkatan AP (IPAP) sebagai berikut:IPAP = (P _n P ₀ )/P _n . Pada hari ke 10 mencit yang masih hidup dikorbankan dengan cara dislokasi serviks, asites dikumpulkan dan ditimbang. Waktu kelangsungan hidup tikus diamati hingga hari ke 20. Tikus yang mengandung tumor dieksekusi pada titik akhir dengan tanda-tanda bahaya, termasuk tingkat pernapasan yang tinggi, mengacak-acak bulu, postur membungkuk, aktivitas berkurang, dan pembentukan asites progresif [27]. Aktivitas anti-tumor dievaluasi secara komprehensif dengan hari-hari kelangsungan hidup, perimeter perut, dan volume asites. Tikus diberi makan di bawah kondisi laboratorium standar.

Analisis Statistik

Analisis statistik dilakukan dengan SPSS 19.0 (IBM, NY, USA). Setiap perlakuan eksperimental diulang secara independen setidaknya tiga kali. Data disajikan sebagai mean ± standar deviasi (SD). Analisis varians (ANOVA) digunakan untuk analisis statistik. Tingkat setiap temuan flebitis dianalisis dengan uji jumlah peringkat Wilcoxon. Uji Dunnett digunakan untuk membandingkan intervensi individu. Signifikansi statistik ditunjukkan pada P < 0,05.

Hasil

Morfologi, Diameter, dan Potensi Zeta PEG-PCCL

Hasil dari laser particle size analyzer menunjukkan bahwa diameter rata-rata PEG-PCCL adalah 97 ± 2,6 nm. Hasil TEM PEG-PCCL (Gbr. 2) mengungkapkan bahwa PEG-PCCL berbentuk bola dan seragam dalam larutan. Potensi zeta rata-rata PEG-PCCL adalah 18.4 mV. Metode sentrifugasi kolom mini menunjukkan EE% adalah 55,98%.

Karakteristik PEG-PCCL:Citra TEM. Bilah skala adalah 100 nm

Sitotoksisitas

Sitotoksisitas PEG-PCCL dievaluasi dengan membandingkan PEI, kendaraan skala nano yang khas, dalam garis sel HEK293T dan Hep-G2. Dalam rentang konsentrasi (dari 0 hingga 1 mg/mL) PEG-PCCL atau PEI, viabilitas sel HEK293T (Gbr. 3a) dan sel tumor (Hep-G2) (Gbr. 3b) diturunkan dalam konsentrasi yang bergantung tata krama. Sel embrio tampak lebih sensitif pada konsentrasi 0,25 mg/mL, sedangkan sel tumor di atas 1 mg/mL. Dibandingkan dengan PEI, PEG-PCCL menunjukkan sitotoksisitas yang lebih rendah, terutama pada konsentrasi yang lebih tinggi, yaitu 0,75 dan 1 mg/mL (P = 0.023). Uji LDH menunjukkan bahwa tingkat kematian pada sel embrionik dan sel tumor meningkat dengan waktu pemaparan; (i) masing-masing 19 dan 42% pada 24 dan 48 jam pada 0,5 mg/mL PEG-PCCL (Gbr. 3c) lebih rendah dari PEI. (ii) Sel tumor menunjukkan tingkat kematian yang sedikit lebih rendah (32%) pada waktu 48 jam ketika sel terpapar PEG-PCCL dibandingkan dengan PEI (P = 0.037) (Gbr. 3d).

Sitotoksisitas PEG-PCCL dibandingkan dengan PEI. a , b Uji MTT menunjukkan tingkat kelangsungan hidup 293 T dan konsentrasi HepG2 secara dependen dibandingkan dengan kelompok kontrol negatif (PEI). c , d Uji kebocoran LDH 293 T dan HepG2 yang terpapar PEG-PCCL dan PEI setelah 48 jam. *P < 0,05 versus grup PEI

SEM

Gambar mikroskop elektron sel Hep-G2 utuh dan sel yang diperlakukan dengan nanopartikel PEG-PCCL ditunjukkan pada Gambar 4. Dalam sel Hep-G2 utuh, ada mikrovili (Mv) yang melimpah di setiap permukaan, dan nukleus (N) terletak lebih ke arah basis daripada bagian apikal. Banyak mitokondria (Mt), kompleks Golgi (Go), dan retikulum endoplasma kasar (RER) didistribusikan di sitoplasma. Dalam sel yang diobati dengan PEG-PCCL, vesikel pinositotik pasti meningkat. Tidak ada perubahan histopatologi yang signifikan yang diamati, dan N bulat dan organel sitoplasma termasuk Mt, RER, dan Go masih utuh.

mikrograf elektron. a , b Sel HepG2 normal. c , d Sel diperlakukan dengan nanopartikel PEG-PCCL melalui SEM (pemindaian mikroskop elektron). Panah gelap menunjuk pada vesikel pinositotik

Apoptosis

Penurunan yang signifikan dari viabilitas sel mungkin berkorelasi dengan karakteristik ukuran partikel, kimia permukaan, dan konsentrasi [28], yang mendorong minat kami pada mekanisme yang mendasari kematian sel yang diamati dalam sel HepG2. Untuk menentukan apakah kematian sel dikaitkan dengan apoptosis atau nekrosis, sel HepG2 diperlakukan dengan PEI atau PEG-PCCL untuk pewarnaan bersama Annexin V dan PI. Seperti yang diamati di bawah mikroskop fluoresensi (Gbr. 5), sel-sel yang diobati dengan PEI atau PEG-PCCL menunjukkan apoptosis lebih awal dibandingkan dengan kelompok kontrol kosong, seperti yang ditunjukkan oleh fluoresensi hijau yang diwarnai oleh annexin V. Sel-sel yang diobati dengan PEI menunjukkan apoptosis yang lebih kuat daripada sel-sel yang dirawat dengan PEI. PEG-PCCL, yang sejalan dengan hasil uji MTT sebelumnya.

Pewarnaan FITC-Annexin V mewakili apoptosis sel. Sel HepG2 yang diinkubasi dengan nanopartikel pada konsentrasi 0,5 mg/mL selama 48 jam dan kemudian diwarnai bersama dengan propidium iodida (merah) dan annexin V (hijau) dicitrakan pada × 40

Biokompatibilitas

Hemolisis

Karena nanopartikel biokompatibel dirancang untuk tujuan aplikasi endovaskular, penyelidikan hemokompatibilitas dan sitotoksisitas endotel diperlukan. Uji in vitro menunjukkan bahwa, selama 3 jam pengamatan, hemolisis meningkat seiring waktu, di mana PEG-PCCL menunjukkan rasio hemolisis yang lebih rendah daripada salin normal (Gbr. 6a). Tes in vivo mengungkapkan kecenderungan serupa. Sebaliknya, PEI menyebabkan hemolisis parah baik in vitro maupun in vivo (Gbr. 6b).

Rasio hemolisis dan jumlah sel (× 10 ⁹ /L) sampel darah dalam 3 jam. In vitro (a ) in vivo (b ) *P < 0,05 versus kelompok kontrol negatif

Flebitis Kelinci

Pemeriksaan histopatologi (Gbr. 7) menggambarkan endotel vaskular yang utuh tanpa nekrosis krondrosit pada kartilago aurikularis. Sedikit edema pada bagian proksimal vena diamati. Sehubungan dengan hilangnya sel endotel vena dan infiltrasi sel inflamasi, co-infus (Tabel 1) kelompok yang diobati dengan PEG-PCCL setelah 12 dan 24 jam cenderung meningkat, tetapi peningkatannya tidak signifikan secara statistik ( P> 0,05).

Fotomikrograf vena telinga setelah infus 24 jam diwarnai dengan H&E. a , b Kelompok infus dengan salin normal. c , d Kelompok infus dengan PEG-PCCL. Jarum mewakili tulang rawan aurikularis. (Gambar kiri × 10, gambar kanan × 40)

Toksisitas Organ

Untuk mengevaluasi toksisitas akut PEG-PCCL pada organ utama, pemeriksaan histopatologi pada paru, hati, dan ginjal dilakukan setelah pemberian PEG-PCCL intravena pada 0,5 mg/mL selama 3 hari pada tikus (n = 5). Normal saline dan PEI digunakan sebagai kontrol. Hasil penelitian menunjukkan bahwa PEI menyebabkan peradangan ringan dan penebalan interstitium lobular dan kariopiknosis hepatosit (Gbr. 8). Meskipun, dibandingkan dengan kelompok salin normal, tidak ada perubahan histopatologi yang terlihat pada semua organ yang diperiksa pada kelompok yang diobati dengan PEG-PCCL (Gbr. 7); fungsi hepatorenal diperiksa untuk konfirmasi lebih lanjut dari nontoksisitasnya (Tabel 2).

Gambar mikroskopis cahaya pewarnaan H&E dari paru-paru, hati, dan ginjal. Gambar dikumpulkan dari tikus yang diberi intravena dengan NS, PEI, dan PEG-PCCL. Jarum mewakili kariopiknosis hepatosit. (Gambar kolom kiri, × 10; gambar kolom kanan × 40)

Studi Farmakokinetik

Studi farmakokinetik dilakukan setelah injeksi intravena 10 mg/kg PTX Taxol® atau 20 mg/kg PEG-PCCL/PTX (PP + PTX) (rasio pemuatan 50%). Puncak konsentrasi plasma (Cmax) adalah 312 ± 2,59 μg/mL (PTX) dan 283 ± 2,79 g/Ml (PP + PTX). Waktu konsentrasi maksimum (Tmax) dan area di bawah kurva konsentrasi-waktu plasma adalah 0,54 ± 0.20 jam, 52.00 ± 4.30 μg h/mL dan 4 ± 1.22 h, 282.21 ± 21.08 μg h/mL untuk PTX dan PTX-NPs , masing-masing. Kurva waktu konsentrasi darah ditunjukkan pada Gambar. 9.

Kurva konsentrasi-waktu darah. Pada tikus setelah diberikan secara intravena dengan PTX atau PP + PTX. (n = 6)

Pengaruh PEG-PCCL/PTX pada Tikus Bertumor

Untuk menyelidiki efek anti-tumor dari PEG-PCCL/PTX in vivo, (i) peningkatan persentase perimeter perut (IPAP) tikus pembawa tumor H22 dihitung setiap hari (Gbr. 10a). Pada hari ke-3, asites mulai terbentuk dan IPAP masing-masing kelompok meningkat secara dramatis, di mana kelompok PP/PTX dan kelompok PTX, dibandingkan dengan kelompok NS, menunjukkan peningkatan yang lebih lambat seiring waktu. (ii) Asites dikumpulkan pada hari ke 10, dan volumenya diukur (Gbr. 10b). Dibandingkan dengan kelompok NS, volume asites dari kedua kelompok PTX dan kelompok PP/PTX berkurang secara signifikan (P = 0,0005 dan P = 0,0052), di mana grup PP/PTX menunjukkan volume yang lebih rendah daripada grup PTX (P = 0,0138). (iii) kelangsungan hidup masing-masing kelompok diamati selama 20 hari sejak hari 0. Kelompok PP/PTX dan kelompok PTX memiliki umur yang lebih panjang dan tingkat kelangsungan hidup yang lebih tinggi daripada kelompok NS.

Efek anti-tumor PP/PTX pada tikus yang mengandung tumor H22. a Tikus Balb/C (n = 5) diinjeksi secara intraperitoneal dengan PP/PTX atau PTX pada hari ke-3. b Asites dari setiap kelompok (n = 5) dikumpulkan pada hari ke 10. c Kelangsungan hidup setiap kelompok (n = 10) diamati setiap hari. *P < 0,05, **P < 0.01, ***P < 0.001

Diskusi

Banyak polimer, termasuk PEI, telah diusulkan menjadi pembawa obat kimia dan biofarmasi untuk konjugasi yang tepat. PEI adalah polimer kationik yang diselidiki secara luas dan telah dianggap sebagai standar emas dalam pengujian efisiensi transfeksi [29]. Namun, efek samping (misalnya, sitotoksisitas) menghambat PEI untuk diterapkan dalam penggunaan medis. Untuk mencari bahan berbasis nano yang lebih aman dan efektif, kami telah berhasil menyiapkan kandidat baru untuk pengiriman obat; PEG-PCCL dicirikan oleh hidrofilisitas tinggi dan stabilitas yang menguntungkan karena efek ikatan hidrogen. Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk menilai toksisitas in vivo dan in vitro dari PEG-PCCL, yang membuka jendela terapi yang berpotensi untuk mengobati kanker.

Sejak peningkatan permeabilitas dan efek retensi dianggap sebagai mekanisme pengiriman tumor-selektif, obat berukuran nano telah mendapat perhatian yang cukup besar [30, 31]. Nanopartikel dengan diameter yang lebih kecil memiliki imunokompatibilitas yang lebih baik [32] dan penyerapan yang lebih sedikit oleh hati, waktu sirkulasi darah yang lebih lama, dan bioavailabilitas yang lebih tinggi [33]. Dipolimer kami memiliki ukuran yang sesuai (97 ± 2,6 nm) (Gbr. 2) untuk meresap ke dalam dan keluar dari pembuluh darah tumor serta menghindari sistem imun inang, sedangkan polimer kationik dengan potensi zeta positif dilaporkan bersifat toksik [34]. Toksisitas PEG-PCCL dengan potensi zeta negatif ini seharusnya dihindari secara ideal. Memang, dalam penilaian toksisitas dalam penelitian ini, ada sedikit masalah toksisitas dengan PEG-PCCL. Hasil serupa juga dilaporkan oleh lab lain [35,36,37].

Eksperimen in vitro mengungkapkan properti bebas toksisitas untuk PEG-PCCL. Seperti yang diamati di bawah SEM (Gbr. 4), (i) vesikel pinositotik yang dikenali oleh panah gelap menunjukkan endositosis yang bertanggung jawab [38]. (ii) Nukleus lengkap dan organel utuh (Mt, RER, dan Go) menunjukkan sedikit sitotoksisitas dan biokompatibilitas PEG-PCCL yang baik pada tingkat sel. Dalam uji MTT dan uji kebocoran LDH (Gbr. 3), PEI dan PEG-PCCL menyebabkan tren viabilitas sel yang serupa dalam cara yang bergantung pada dosis dan waktu di kedua sel 293 T dan sel HepG2, PEG-PCCL dipamerkan lebih rendah sitotoksisitas terutama pada konsentrasi yang lebih tinggi (P < 0,05). Hasil ini menunjukkan bahwa ikatan kovalen karboksil tidak meningkatkan toksisitas ekstra. Hemolisis in vitro diterima secara luas sebagai metode yang berguna dan dapat diandalkan untuk mengevaluasi kompatibilitas darah NP. Dalam uji hemolisis in vitro, PEG-PCCL menunjukkan rasio hemolisis yang lebih rendah daripada salin normal (Gbr. 6a). Ini mungkin karena potensi negatif PEG-PCCL yang melindungi sel darah. Tes hemolisis in vivo mengungkapkan kecenderungan yang sama. Sebaliknya, PEI menunjukkan hemolisis parah. Secara kolektif, nanopartikel PEG-PCCL bersifat hemokompatibel karena tidak menunjukkan efek hemolitik baik model in vitro maupun in vivo (Gbr. 6b).

Sifat PEG-PCCL yang tidak berbahaya selanjutnya dibuktikan dengan eksperimen in vivo. Since phlebitis induced by intravenously administered antineoplastic agents [24] is frequently seen in clinical practice, we tested the inflammatory reaction after PEG-PCCL injection. In the rabbit phlebitis study (Fig. 7), little inflammatory infiltration or tissue edema was observed, indicating that the new formulation of chemotherapeutic drugs captured by PEG-PCCL is biocompatible, and that co-infusion of PEG-PCCL could be a favorable candidate as intravenous drug deliverer. Meanwhile, in the H&E staining assay (Fig. 8), no obvious histopathological changes of organs were observed in PEG-PCCL nanoparticles treatment group compared to normal group. Further hepatorenal function was investigated for safety evaluation (Table 2), in which no significant differences were shown between normal saline group and PEG-PCCL group. Consequently, it is evident that PEG-PCCL is a kind of safe and non-toxic nanoparticles with potentiality to be applied in targeting intervention.

Furthermore, preliminary evaluation of drug-loaded effect in regard of pharmacokinetics and anti-tumor was carried out in H22 tumor-bearing mice. In the pharmacokinetic study (Fig. 9), Tmax of PP + PTX was 4 ± 1.22 h, which exhibited better persistence than that of PTX (0.54 ± 0.20 h). PP + PTX also performed larger area under the plasma concentration-time curve than PTX. These results showed that PEG-PCCL/PTX lasted longer than PTX alone in blood, which indicated higher stability and more delayed release of PEG-PCCL/PTX. However, the EE% of PEG-PCCL was dissatisfactory (55.98%) and sustained drug release was less than ideal (4 ± 1.22 h). Therefore, more research is needed to modify the nanoparticle to achieve a higher EE and longer drug release. For example, adjusting the proportion of PEG and PCCL can be considered [39]. Although no metastasis was seen in abdominal organs in our model, tissue distribution and concentration of PTX-NPs should be investigated in further study to find out the possible side effects. Moreover, the combination of PEG-PCCL and PTX made an improvement in life expectancy and a reduction in tumor ascites formation (Fig. 10). Notably, the anti-tumor effect was enhanced when PTX was loaded with PEG-PCCL, suggesting a possibility of a promising drug carrier. Besides, nanoparticles may be beneficial to confront anti-tumor drug resistance. Modification with folate [40] has been reported to overcome TLR4 driven chemotherapy resistance, and its co-encapsulation of anti-tumor agents [41] could be a promising option. Nanoparticle modified by additional Fe₃ O₄ [42] may be more easily guided to its targets under the applied magnetic field, which would lower chemotherapeutic drugs-induced systemic toxicity [43].

Conclusions

PEG-PCCL nanospheres showed less cytotoxicity and better biocompatibility than mature medical nanoparticles (PEI) at the therapeutical concentration. PEG-PCCL-loaded PTX revealed higher stability and slower release in tumor mice. These results suggest that PEG-PCCL is a potential candidate of biocompatible drug vehicle for hydrophobic drugs.

Menumbuhkan struktur nano emas untuk penyerapan seluler selektif bentuk Fungsi Ganda Perangkat V/SiOx/AlOy/p++Si sebagai Selektor dan Memori